RU2549463C1 - Method of determining botulinum neurotoxin of type a based immunodetection, combined with polymerase chain reaction - Google Patents

Method of determining botulinum neurotoxin of type a based immunodetection, combined with polymerase chain reaction Download PDF

Info

Publication number
RU2549463C1
RU2549463C1 RU2013153456/15A RU2013153456A RU2549463C1 RU 2549463 C1 RU2549463 C1 RU 2549463C1 RU 2013153456/15 A RU2013153456/15 A RU 2013153456/15A RU 2013153456 A RU2013153456 A RU 2013153456A RU 2549463 C1 RU2549463 C1 RU 2549463C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
dna
protein
type
bont
botulinum
Prior art date
Application number
RU2013153456/15A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Алена Константиновна Рябко
Анна Евгеньевна Хлынцева
Александр Владимирович Колесников
Игорь Георгиевич Шемякин
Иван Алексеевич Дятлов
Нина Михайловна Лунева
Арина Владимировна Козырь
Original Assignee
Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) filed Critical Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ)
Priority to RU2013153456/15A priority Critical patent/RU2549463C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2549463C1 publication Critical patent/RU2549463C1/en

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

FIELD: biotechnology.
SUBSTANCE: on paramagnetic particles bearing the immobilised bacterial protein G of the family Streptococcus, with the blocked solution Denhardt-DNA the protein BoNT/A is adsorbed using specific highly affinity polyclonal antibodies. The formation of the protein complex BoNT/A is detected with a biotin-conjugated antibody by a noncovalent conjugate of DNA fragments with neutravidin. PCR amplification of the DNA matrix is carried out with the fluorescence detection of the signal in real time. Registration of the presence of BoNT/A in the samples under study is carried out by the change in the level of fluorescence compared to the control ones.
EFFECT: effective method of determining the presence of the compound.
5 dwg, 1 tbl, 5 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к областям медицинской биохимии, диагностической медицинской микробиологии, прикладной иммунохимии и разработке диагностических тест-систем, касается разработки нового способа для высокочувствительного определения белка ботулинического нейротоксина типа А (BoNT/A) в инфицированных образцах биологического происхождения и контаминированных пищевых продуктах, представляет собой способ детекции белка BoNT/A при помощи высокоаффинных поликлональных антител к ботулотоксину типа А, комбинированный с амплификацией специфического сигнала за счет использования сопряженной с антителом ДНК-матрицы для проведения полимеразной цепной реакции.The invention relates to biotechnology, specifically to the fields of medical biochemistry, diagnostic medical microbiology, applied immunochemistry and the development of diagnostic test systems, relates to the development of a new method for highly sensitive determination of botulinum neurotoxin type A protein (BoNT / A) in infected samples of biological origin and contaminated food products is a method of detecting BoNT / A protein using high-affinity polyclonal antibodies to botulinum toxin type A, a combination of associated with the amplification of a specific signal through the use of an antibody-conjugated DNA template for the polymerase chain reaction.

Основной областью применения предлагаемого способа определения ботулинического нейротоксина типа А являются биомедицина, микробиологическая диагностика, микробиологические исследования, разработка средств ранней и высокоэффективной специфической диагностики ботулизма, санитарно-гигиенический контроль за наличием токсина возбудителя ботулизма в продуктах питания, предотвращение угрозы биотерроризма.The main field of application of the proposed method for the determination of botulinum neurotoxin type A is biomedicine, microbiological diagnostics, microbiological research, the development of early and highly effective specific diagnostics of botulism, sanitary and hygienic monitoring of the presence of botulinum toxin toxin in food, and the prevention of the threat of bioterrorism.

Ботулотоксины представляют собой нейротоксины белковой природы, продуцируемые анаэробными грамположительными спорообразующими бактериями Clostridium botulinum. Токсины ботулизма ответственны за развитие смертельно опасной интоксикации с преимущественно алиментарным путем инфицирования -ботулизма. Семейство ботулотоксинов содержит семь серологически и биохимически отличных типов токсина, секретируемых различными штаммами С.botulinum, и являющихся сильнейшими ядами из всех известных науке органических токсинов в целом, летальная доза которых (LD50) составляет 1-5 нг/кг массы тела. Также отмечены штаммы с одновременной комбинированной продукцией двух серотипов нейротоксинов [Montecucco С, Molgo J. // Current Opinion in Pharmacology. - 2005. - V.5, N. 3. - P. 274-279; Kukreja R, Singh BR. // Microbial Toxins: Current Research and Future Trends. - Caister Academic Press. - 2009 - ISBN 978-1-904455-44-8]. Вариабельность аминокислотных последовательностей различных типов токсинов может оставлять до 70%, однако все они имеют схожую конформацию и вызывают идентичные патофизиологические процессы в организме, но вместе с тем могут иметь неидентичные молекулярные мишени [Capek Р., Dickerson T.J. // Toxins. - 2010. - V.2. - Р. 24-53].Botulinum toxins are protein-derived neurotoxins produced by the anaerobic gram-positive spore-forming bacteria Clostridium botulinum. Botulism toxins are responsible for the development of deadly intoxication with a predominantly nutritional route of infection of botulism. The botulinum toxin family contains seven serologically and biochemically different types of toxin secreted by various strains of C. botulinum, and are the strongest poisons of all organic toxins known to science in general, the lethal dose of which (LD50) is 1-5 ng / kg body weight. Strains with simultaneous combined production of two serotypes of neurotoxins [Montecucco C, Molgo J. // Current Opinion in Pharmacology. - 2005. - V.5, N. 3. - P. 274-279; Kukreja R, Singh BR. // Microbial Toxins: Current Research and Future Trends. - Caister Academic Press. - 2009 - ISBN 978-1-904455-44-8]. The variability of amino acid sequences of various types of toxins can leave up to 70%, however, they all have a similar conformation and cause identical pathophysiological processes in the body, but at the same time they can have non-identical molecular targets [Capek R., Dickerson T.J. // Toxins. - 2010. - V.2. - R. 24-53].

Ботулинический нейротоксин продуцируется в форме неактивного гетеродимера с молекулярной массой 150 kDa, активируемого посредством протеолитического расщепления на легкую цепь (LC), которая представляет собой Zn-зависимую металлопротеазу (50 kDa), и тяжелую цепь (НС), состоящую из связывающего и транслокационного доменов (100 kDa). Легкая и тяжелая цепи связаны посредством дисульфидной связи и множества нековалентных взаимодействий между двумя пептидными цепями [Capek Р., Dickerson T.J. // Toxins. - 2Q10. - V.2. - Р. 24-53].Botulinum neurotoxin is produced in the form of an inactive heterodimer with a molecular weight of 150 kDa, activated by proteolytic cleavage into a light chain (LC), which is a Zn-dependent metalloprotease (50 kDa), and a heavy chain (NS), consisting of a binding and translocation domain ( 100 kDa). Light and heavy chains are linked through a disulfide bond and many non-covalent interactions between two peptide chains [Capek R., Dickerson T.J. // Toxins. - 2Q10. - V.2. - R. 24-53].

При интоксикация ботулотоксином происходит блокада выброса ацетилхолина в соматических и вегетативных нервных окончаниях, вызывая паралич мышц. Токсическое действие ботулотоксина проходит в три этапа. На первом этапе происходит специфическое связывание тяжелой цепи токсина с двумя рецепторами на поверхности нервного окончания. Токсин ассоциирует в первую очередь с ганглиозидом (полисиалоганглиозид) с последующей миграцией комплекса к белковому рецептору синаптических везикул - синаптотагмину 1 или 2 (SV1 или SV2) [Rummel A. et al. // Journal of Neurochemistry. - 2009. - V. 110. - P. 1942-1954]. После связывания комплекса с рецепторами инициируется рецепторно-опосредованный эндоцитоз. За эндоцитозом следует высвобождение протеолитического домена ботулотоксина в цитозоль посредством эндосомальной мембранной транслокации. Считается, что снижение значения pH в эндосоме является фактором, вызывающим последующие изменения в конформации токсина. В результате, тяжелая цепь токсина действует как транспортный канал и шаперон, обеспечивающий транслокацию легкой цепи через эндосомальную мембрану и в цитозоль. В цитозоле протеолитический домен действует как металлопротеаза и расщепляет белки SNARE-комплекса, которые выступают частью аппарата экзоцитоза, что приводит к ингибированию высвобождения нейромедиатора ацетилхолина [Simpson L.L. // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. - 2004. - V.44. - P. 167-193.; Capek P, Dickerson T.J. // Toxins. - 2010. - V.2. - P.24-53].With botulinum toxin intoxication, an acetylcholine release is blocked in the somatic and autonomic nerve endings, causing muscle paralysis. The toxic effect of botulinum toxin takes place in three stages. At the first stage, a specific binding of the toxin heavy chain to two receptors on the surface of the nerve ending occurs. The toxin is primarily associated with a ganglioside (polysialoganglioside), followed by migration of the complex to the synaptic vesicle protein receptor, synaptotagmin 1 or 2 (SV1 or SV2) [Rummel A. et al. // Journal of Neurochemistry. - 2009. - V. 110. - P. 1942-1954]. After binding of the complex to receptors, receptor-mediated endocytosis is initiated. Endocytosis is followed by the release of the proteolytic domain of botulinum toxin into the cytosol via endosomal membrane translocation. It is believed that a decrease in pH in the endosome is a factor causing subsequent changes in the toxin conformation. As a result, the toxin heavy chain acts as a transport channel and chaperone, which provides translocation of the light chain through the endosomal membrane and into the cytosol. In the cytosol, the proteolytic domain acts as a metalloprotease and breaks down the proteins of the SNARE complex, which are part of the exocytosis apparatus, which leads to inhibition of the release of the neurotransmitter acetylcholine [Simpson L.L. // Annu. Rev. Pharmacol Toxicol. - 2004 .-- V.44. - P. 167-193 .; Capek P, Dickerson T.J. // Toxins. - 2010. - V.2. - P.24-53].

Основные типы ботулинических нейротоксинов, вызывающие заболевание у человека, составляют типы А, В и Е, из них наиболее тяжелые случаи интоксикации связаны с BoNT/A. В этиологии ботулизма можно выделить две общие категории: первичная интоксикация и первичная инфекция, за которой следует вторичная интоксикация. При первичной интоксикации ботулинические токсины попадают в организм алиментарным путем, с контаминированными С.botulinum продуктами питания, при обработке и заготовке которых сложились условия, удовлетворяющие требованиям роста и развития вегетативной формы клостридий ботулизма. Зрелая культура клостридий подвергается автолизу, в результате чего ботулотоксин выделяется в среду. Таким образом, заражение происходит при употреблении в пищу продуктов, содержащих токсин.The main types of botulinum neurotoxins that cause disease in humans are types A, B and E, of which the most severe cases of intoxication are associated with BoNT / A. In the etiology of botulism, two general categories can be distinguished: primary intoxication and primary infection, followed by secondary intoxication. During primary intoxication, botulinum toxins enter the body through an alimentary route, with contaminated C. botulinum food products, during processing and preparation of which there are conditions that satisfy the requirements for the growth and development of the vegetative form of clostridia botulism. A mature culture of clostridia undergoes autolysis, as a result of which botulinum toxin is released into the medium. Thus, infection occurs when foods containing toxin are consumed.

При употреблении пищи, содержащей споры возбудителя ботулизма, способные прорастать в организме человека и колонизировать кишечник, происходит развитие первичной инфекции. В процессе роста, размножения и автолиза токсин выделяется в организм in situ, в результате чего развивается вторичная интоксикация [Simpson L.L. // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. - 2004. - V. 44.-P. 167-193].When eating food containing spores of the causative agent of botulism that can germinate in the human body and colonize the intestines, a primary infection develops. In the process of growth, reproduction and autolysis, the toxin is released into the body in situ, resulting in the development of secondary intoxication [Simpson L.L. // Annu. Rev. Pharmacol Toxicol. - 2004. - V. 44.-P. 167-193].

Инкубационный период развития симптомов ботулизма составляет от нескольких часов до пяти суток и зависит от типа и дозы токсина. При попадании ботулинических нейротоксинов в организм человека или при их накоплении вследствие первичной инфекции в первую очередь страдают скелетные мышцы, смертельную опасность представляет паралич дыхательных и висцеральных мышц, также наблюдаются нарушения со стороны вегетативной нервной системы. Выздоровление наступает медленно и может потребовать подключения к аппарату искусственной вентиляции легких, наибольшие сроки восстановительного периода наблюдаются при интоксикации BoNT/A.The incubation period for the development of symptoms of botulism ranges from several hours to five days and depends on the type and dose of the toxin. When botulinum neurotoxins enter the human body or when they accumulate as a result of a primary infection, skeletal muscles are the first to suffer, paralysis of the respiratory and visceral muscles is a mortal danger, and disorders of the autonomic nervous system are also observed. Recovery is slow and may require connection to a ventilator; the longest recovery periods are observed with BoNT / A intoxication.

Диагностика ботулизма на ранних этапах заболевания, а также определение токсина в подозрительных продуктах питания и своевременно примененная терапия обеспечивают благоприятный прогноз исхода заболевания. Применение в клинической практике специфичных и высокочувствительных диагностических тест систем, способных определять крайне низкие (менее 5 пг/мл) концентрации BoNT/A способно уменьшить риск летального исхода и ускорить выздоровление.Diagnosis of botulism in the early stages of the disease, as well as the determination of toxin in suspicious foods and timely treatment, provide a favorable prognosis of the outcome of the disease. The use in clinical practice of specific and highly sensitive diagnostic test systems capable of detecting extremely low (less than 5 pg / ml) BoNT / A concentrations can reduce the risk of death and accelerate recovery.

На сегодняшний день в рутинной лабораторной практике диагностики ботулизма применяют комбинацию культурального метода и мышиного летального теста, которая, несмотря на довольно высокую его чувствительность (20 пг/мл BoNT/A), не позволяет получить лабораторное подтверждение заболевания в короткие сроки.To date, in the routine laboratory practice of diagnosing botulism, a combination of the cultural method and the mouse lethal test is used, which, despite its rather high sensitivity (20 pg / ml BoNT / A), does not allow laboratory confirmation of the disease in a short time.

Известны методы, основанные на эндопептидазной активности ботулинического нейротоксина, такие как иммуноблоттинг, FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer - передача энергии посредством флуоресцентного резонанса), позволяющие определять все типы ботулинических токсинов в концентрации от 35 пг/мл до 150 нг/мл в зависимости от серотипа, используемого субстрата и времени экспозиции. Однако эти методы имеют ряд ограничений - они предъявляют высокие требования к условиям реакции, компоненты данных систем подвержены ингибированию, использование сложных матриц обуславливает высокую вероятность неспецифического взаимодействия и приводит к недостаточной специфичности детекции [Dorner М.В., Schulz К.М., Kull S., Dorner B.G.// Curr Top Microbiol Immunol. - 2013. - V. 364. -P. 219-255].Known methods based on the endopeptidase activity of botulinum neurotoxin, such as immunoblotting, FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer - energy transfer through fluorescence resonance), allowing to determine all types of botulinum toxins in a concentration of from 35 pg / ml to 150 ng / ml depending on the serotype used substrate and exposure time. However, these methods have a number of limitations - they make high demands on the reaction conditions, the components of these systems are inhibited, the use of complex matrices leads to a high probability of nonspecific interaction and leads to insufficient detection specificity [Dorner MV, Schulz K.M., Kull S ., Dorner BG // Curr Top Microbiol Immunol. - 2013. - V. 364. -P. 219-255].

Известно применение масс-спектрометрического метода для определения ботулинических нейротоксинов в формате эндопетдидазной масс-спектрометрии (Endopeptidase-Mass Spectrometry (Endopep-MS) Assay), который обладает высокой чувствительностью (0,05-50 пг/мл), но осуществление подобного типа анализа осложняется необходимостью проведения сложной пробоподготовки и моделирования специфической мишени [Barr J.R., Moura Н., Boyer А.Е. с соавт. // Emerg Infect Dis. - 2005, October. - V. 11. - N.10. - P. 1578-1583.].It is known to use a mass spectrometric method to determine botulinum neurotoxins in the format of endopetididase mass spectrometry (Endopeptidase-Mass Spectrometry (Endopep-MS) Assay), which has a high sensitivity (0.05-50 pg / ml), but the implementation of this type of analysis is complicated the need for complex sample preparation and modeling of a specific target [Barr JR, Moura N., Boyer A.E. et al. // Emerg Infect Dis. - 2005, October. - V. 11. - N.10. - P. 1578-1583.].

Известен традиционно применяемый в практике иммуноферментный анализ (ИФА) и его вариации (иммуноанализ на микросферах, Luminex® хМАР технология, электрохемилюминесценция, DIG-ELISA), однако данные методы не обладают достаточной чувствительностью (0,5-2 нг/мл) для успешного определения ботулотоксина типа А в клинических образцах, особенно в случаях интоксикации средней и легкой тяжести [Abbasova, S., Rudenko, N., Gorokhovatskii с соавт. // Russian Journal of Bioorganic Chemistry. - 2001. - V. 37. - N. 3. - P. 307-315; Dorner M.B., Schulz K.M., Kull S., Dorner B.G. // Curr Top Microbiol Immunol. - 2013. - V. 364. - P. 219-255; Ferreira, J L., Maslanka, S, Johnson, E., and Goodnough, M. // JAOAC International. - 2003. - V. 86. - P. 314-331].An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and its variations (immunoassay on microspheres, Luminex® xMAP technology, electrochemiluminescence, DIG-ELISA) are known, but these methods do not have sufficient sensitivity (0.5-2 ng / ml) for successful determination type A botulinum toxin in clinical samples, especially in cases of moderate and mild intoxication [Abbasova, S., Rudenko, N., Gorokhovatskii et al. // Russian Journal of Bioorganic Chemistry. - 2001. - V. 37. - N. 3. - P. 307-315; Dorner M.B., Schulz K.M., Kull S., Dorner B.G. // Curr Top Microbiol Immunol. - 2013 .-- V. 364. - P. 219-255; Ferreira, J L., Maslanka, S, Johnson, E., and Goodnough, M. // JAOAC International. - 2003. - V. 86. - P. 314-331].

Известно использование классической полимеразной цепной реакции (ПЦР), которое позволяет лишь определить наличие целевого микроорганизма в случае первичной инфекции или исследования подозрительных продуктов питания и сильно зависит от качества и количества детектируемой матрицы, однако, даже детекция специфических фрагментов генома С.botulinum не дает исчерпывающей информации о продукции токсина и его серотипе, так как были обнаружены штаммы С.botulinum, продуцирующие два типа токсина, а также штаммы, несущие ″молчащие″ гены токсина [Santos-Buelga, J. A., Collins М. D., and А. К. East. // Curr. Microbiol. - 1998. - V. 37. - Р. 312-318; G. Franciosa, F. Floridi, A. Maugliani, and P. Aureli. // Appl. Environ. Microbiol. - 2004. - V. 70. - P. 7192-7199].The use of the classical polymerase chain reaction (PCR) is known, which allows only to determine the presence of the target microorganism in the case of a primary infection or investigation of suspicious food products and is highly dependent on the quality and quantity of the detected matrix, however, even the detection of specific fragments of the C. botulinum genome does not provide comprehensive information about the production of the toxin and its serotype, since C. botulinum strains producing two types of toxin were found, as well as strains carrying “silent” toxin genes [Santos-Buelga, J. A., Collins M. D., and A. K. East. // Curr. Microbiol. - 1998. - V. 37. - R. 312-318; G. Franciosa, F. Floridi, A. Maugliani, and P. Aureli. // Appl. Environ. Microbiol. - 2004. - V. 70. - P. 7192-7199].

На данный момент большинство этих методов выявления ботулинических нейротоксинов находится на стадии экспериментальных разработок и не существуют в виде стандартизованных коммерчески доступных диагностических тест-систем.Currently, most of these methods for detecting botulinum neurotoxins are at the experimental stage and do not exist in the form of standardized commercially available diagnostic test systems.

Известен и активно разрабатывается подход к детекции биологических молекул, объединяющий преимущества специфичности иммунологической детекции с высокой чувствительностью полимеразной цепной реакции [US Patent 5665539]. Данный подход, получивший название иммуно-ПЦР, в своем простейшем варианте основан на иммобилизации антигена на твердой фазе с последующей детекцией его при помощи специфического антитела, ковалентно или нековалентно связанного с ДНК-матрицей, позволяющей провести амплификацию сигнала при помощи ПЦР. Оптимизированными вариантами данного способа являются иммобилизация на твердой фазе антитела к одному из эпитопов антигена и последующая детекция антигена антителом к его другому эпитопу [Komatsu М., Kobayashi D., Saito К. с соавт. // Clin. Chem. - 2001. -V. 47, N. 7. - Р. 1297-1301], повышение чувствительности за счет апмлификации ДНК-матрицы при помощи различных вариантов ПЦР в режиме реального времени с применением флуоресцентной метки [Canto C.L., Sumita L.M., Machado A.F. с соавт. // Rev. Inst. Med. Trop.Sao Paulo. - 2008. - V. 50, N. 1 - P. 61-63], внедрение улучшенных коньюгатов и модификаций матриц ДНК [Niemeyer СМ., Wacker R, and Adler М // Nucleic Acids Res. - 2003. - V. 31, N. 16. - P. 90] и др. Технология иммуно-ПЦР успешно применялась для детекции различных инфекционных патогенов, в частности, для детекции Шига-токсина патогенных штаммов E.coli [Не X., Qi W., Quinones В. с соавт. // Appl. Environ. Microbiol. - 2011. - V. 77, N. 11 - P. 3558-3564], вирусов [Barletta J., Bartolome A., and Constantine N.T. // J. Virol. Methods. - 2009. - V. 157, N. 2 - P. 122-132], стафилококкового энтеротоксина [Fischer A., von Eiff C, Kuczius Т. С соавт. // J. Mol. Med. (Berl). - 2007. - V. 85, N. 5. - P. 461-469] и др.A well-known and actively developed approach to the detection of biological molecules, combining the advantages of the specificity of immunological detection with high sensitivity polymerase chain reaction [US Patent 5665539]. This approach, called immuno-PCR, in its simplest form, is based on immobilization of the antigen on the solid phase, followed by its detection using a specific antibody covalently or non-covalently linked to a DNA matrix, which allows amplification of the signal by PCR. Optimized variants of this method are immobilization on an solid phase of an antibody to one of the epitopes of the antigen and subsequent detection of the antigen by the antibody to its other epitope [Komatsu M., Kobayashi D., Saito K. et al. // Clin. Chem. - 2001. -V. 47, N. 7. - P. 1297-1301], increased sensitivity due to the amplification of the DNA template using various variants of real-time PCR using a fluorescent label [Canto C. L., Sumita L. M., Machado A.F. et al. // Rev. Inst. Med. Trop.Sao Paulo. - 2008. - V. 50, N. 1 - P. 61-63], the introduction of improved conjugates and modifications of DNA matrices [Niemeyer CM., Wacker R, and Adler M // Nucleic Acids Res. - 2003. - V. 31, N. 16. - P. 90] and others. The technology of immuno-PCR has been successfully used for the detection of various infectious pathogens, in particular, for the detection of Shiga toxin pathogenic strains of E. coli [He X., Qi W., Quinones W. et al. // Appl. Environ. Microbiol. - 2011. - V. 77, N. 11 - P. 3558-3564], viruses [Barletta J., Bartolome A., and Constantine N.T. // J. Virol. Methods - 2009. - V. 157, N. 2 - P. 122-132], staphylococcal enterotoxin [Fischer A., von Eiff C, Kuczius T. S. et al. // J. Mol. Med. (Berl). - 2007. - V. 85, N. 5. - P. 461-469] and others.

Известен способ прямой детекции ботулотоксина типа А методом иммуно-ПЦР при использовании 96-луночного планшета, на поверхности лунок которого иммобилизирован токсин. После блокирования активных несвязанных центров планшета к образцам добавляют конъюгат моноклональных антител против BoNT/A с репортерной ДНК. Конъюгат образован через ковалентные связи амино- и сульфгидрильных групп антитела и матричной ДНК. Реакцию амплификации ДНК-матрицы проводят в планшете, результат детектируют проведением электрофореза в агарозном геле. Данный формат позволяет обнаруживать BoNT/A в количестве до 5 пг/мл буфера, но имеет высокую вероятность детекции неспецифических взаимодействий, а также не был адаптирован для проведения анализа в смешанных образцах [Wu НС, Huang YL, Lai SC с соавт. // Lett. Appl. Microbiol. - 2001. - V. 32. - P. 321-325].A known method for the direct detection of botulinum toxin type A by immuno-PCR using a 96-well plate, on the surface of the holes of which the toxin is immobilized. After blocking the active unbound centers of the plate, a conjugate of monoclonal antibodies against BoNT / A with reporter DNA is added to the samples. The conjugate is formed through covalent bonds between the amino and sulfhydryl groups of the antibody and template DNA. The amplification reaction of the DNA template is carried out in a tablet; the result is detected by agarose gel electrophoresis. This format allows detecting BoNT / A in an amount up to 5 pg / ml of buffer, but has a high probability of detecting nonspecific interactions, and was also not adapted for analysis in mixed samples [Wu NS, Huang YL, Lai SC et al. // Lett. Appl. Microbiol. - 2001. - V. 32. - P. 321-325].

Известны варианты метода детекции BoNT/A: непрямая и непрямая сэндвич иммуно-ПЦР. Постановку анализа проводят в 96-луночном планшете, связь детектирующего антитела и ДНК-матрицы осуществляют через взаимодействие биотин-стрептавидин, амплификационная смесь вносят в лунки планшета. Результат детектируют посредством электрофореза в агарозном геле. Непрямая иммуно-ПЦР позволяет определять до 50 фг BoNT/A на реакцию в чистом буфере. Однако использование в качестве твердой фазы поверхности планшета увеличивает вероятность неспецифического связывания компонентов реакции и получения ложноположительного ответа, а также данный метод не оптимизирован для анализа многокомпонентных проб [Chao H-Y, Wang Y-C, Tang S-S с соавт. // Toxicon. - 2004. - V. 43. - P. 27-34].Known variants of the BoNT / A detection method are: indirect and indirect immuno-PCR sandwich. The analysis is carried out in a 96-well plate, the connection of the detecting antibody and the DNA matrix is carried out through the interaction of biotin-streptavidin, the amplification mixture is introduced into the wells of the tablet. The result is detected by agarose gel electrophoresis. Indirect immuno-PCR allows up to 50 fg of BoNT / A to be detected in a clean buffer. However, the use of a tablet surface as a solid phase increases the likelihood of nonspecific binding of reaction components and obtaining a false-positive response, and this method is not optimized for the analysis of multicomponent samples [Chao H-Y, Wang Y-C, Tang S-S et al. // Toxicon. - 2004. - V. 43. - P. 27-34].

Известен наиболее технически близкий к заявленному метод иммуно-ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени по ″конечной точке″ (Endpoint RT-PCR) в формате непрямого сэндвич анализа для обнаружения ботулинических нейротоксинов типов А и В в полуобезжиренном молоке. Связывающие антитела иммобилизуют в лунках планшета, детектирующее антитело конъюгируют с матричной ДНК посредством связи биотин-стрептавидин. Наличие амплифицированной матрицы визуализируют ПЦР в режиме реального времени. Анализ позволяет определить до 3,75 пг BoNT/A в 1 мл молока, однако такая чувствительность недостаточна для детекции интоксикации ботулотоксином на ранних стадиях процесса, а также уступает по этому показателю предлагаемому способу определения токсина типа А возбудителя ботулизма [Rajkovic A., El Moualij В., Fikri Y. с соавт. // Food Anal Methods. - 2012. - V. 5. -Р. 319-326].Known the closest to the claimed method is immuno-PCR with fluorescence detection in real time by the “end point” (Endpoint RT-PCR) in the format of an indirect sandwich analysis for the detection of botulinum neurotoxins of types A and B in semi-skim milk. Binding antibodies are immobilized in the wells of the plate; a detecting antibody is conjugated to template DNA via a biotin-streptavidin linkage. The presence of an amplified matrix is visualized by real-time PCR. The analysis allows to determine up to 3.75 pg BoNT / A in 1 ml of milk, however, this sensitivity is insufficient to detect botulinum toxin intoxication in the early stages of the process, and also inferior in this indicator to the proposed method for determining the type A toxin of the botulism pathogen [Rajkovic A., El Moualij V., Fikri Y. et al. // Food Anal Methods. - 2012. - V. 5. -R. 319-326].

Изобретение решает задачу создания высокочувствительного способа идентификации ботулинического нейротоксина типа А на основе иммунодетекции, сопряженной с ПЦР в режиме реального времени, применимого для его выявления в образцах биологических жидкостей и тканей на ранних и поздних этапах развития ботулизма, а также в продуктах питания, употребимого для работы как с инфекционно опасными, так и с инактивированными пробами.The invention solves the problem of creating a highly sensitive method for identifying botulinum neurotoxin type A based on immunodetection coupled with real-time PCR, applicable for its detection in samples of biological fluids and tissues at the early and late stages of the development of botulism, as well as in food products used for work both with infectious and inactivated samples.

Поставленная задача решается за счет применения метода пробоподготовки, предусматривающего гомогенизацию исследуемого материала с раствором, содержащим ингибиторы протеаз и серии последовательных центрифугирований для удаления материала, затрудняющего проведение тестирования по методу иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией.The problem is solved by applying the method of sample preparation, which provides homogenization of the test material with a solution containing protease inhibitors and a series of sequential centrifugations to remove material that impedes testing by the method of immunodetection associated with PCR amplification.

Поставленная задача решается за счет способа детекции ботулинического нейротоксина типа А с помощью поликлональных антител, специфичных к рецептор-связывающему домену тяжелой цепи ботулотоксина А, одно из которых, иммобилизованое на твердом носителе (парамагнитных частицах) за счет взаимодействия с белком G бактерий рода Streptococcus, служит для связывания BoNT/A, находящегося в исследуемой пробе, а второе (биотинилированное) антитело детектирует BoNT/A и посредством мостика, образованного тетравалентной молекулой нейтравидина, связывается с биотинилированными фрагментами ДНК, используемыми в качестве субстрата для ПЦР-амплификации с флуоресцентной детекцией сигнала в режиме реального времени.The problem is solved by the method of detecting botulinum neurotoxin type A using polyclonal antibodies specific for the receptor-binding domain of the heavy chain of botulinum toxin A, one of which is immobilized on a solid support (paramagnetic particles) due to the interaction with Streptococcus bacteria protein G and serves to bind BoNT / A located in the test sample, and the second (biotinylated) antibody detects BoNT / A and binds to bi through the bridge formed by the tetravalent neutravidin molecule tinilirovannymi DNA fragments, used as a substrate for PCR amplification with fluorescence detection signal in real time.

Также поставленная задача решается за счет применения покрытых белком G бактерий рода Streptococcus парамагнитных частиц, которые позволяют иммобилизовать на поверхности частиц антитело к ботулотоксину типа А, провести специфическое связывание BoNT/A из жидких образцов, избавиться от содержащихся в образцах загрязнений на ранних этапах эксперимента и провести отделение ДНК-матрицы, применяемой для конечной ПЦР-амплификации, от других компонентов детекционного комплекса.The task is also solved by using paramagnetic particles coated with protein G of bacteria of the Streptococcus genus, which allow immobilization of an anti-botulinum toxin type A antibody on the particle surface, specific binding of BoNT / A from liquid samples, disposal of contaminants in the samples at the early stages of the experiment, and separation of the DNA matrix used for the final PCR amplification from other components of the detection complex.

Также поставленная задача решается за счет высокоаффинных поликлональных антител к рецептор-связывающему домену тяжелой цепи BoNT/A, которые позволяют добиться высокой специфичности анализа. Также поставленная задача решается за счет коньюгата ДНК с нейтравидином, образующего молекулярную ″сетку″, при использовании которой для детекции возможно увеличить количество матричных молекул ДНК, связанных с единичной молекулой биотинилированного антитела и, таким образом, амплифицировать сигнал.Also, the problem is solved by high-affinity polyclonal antibodies to the receptor-binding domain of the heavy chain BoNT / A, which allow to achieve high specificity of the analysis. Also, the problem is solved by conjugate of DNA with neutravidin, forming a molecular "network", using which, for detection, it is possible to increase the number of matrix DNA molecules associated with a single biotinylated antibody molecule and, thus, amplify the signal.

Также поставленная задача решается за счет блокировки поверхности твердой фазы раствором Денхардт-ДНК, которая препятствует неспецифической сорбции коньюгата ДНК-нейтравидин на поверхности магнитных частиц и пробирок стрипов и снижает вероятность ложноположительных результатов эксперимента.Also, the problem is solved by blocking the surface of the solid phase with a Denhardt-DNA solution, which prevents nonspecific sorption of the DNA-neutravidin conjugate on the surface of magnetic particles and strip tubes and reduces the likelihood of false positive experimental results.

Также поставленная задача решается за счет отделения ДНК-матрицы, применяемой для конечной ПЦР-амплификации, от прочих компонентов образованного детекционного комплекса посредством обработки специфической эндонуклеазой рестрикции, не нарушающей возможность проведения амплификации матричной ДНК с использованием специфичных праймеров в режиме реального времени по методу TaqMan, что способствует снижению фонового сигнала в эксперименте.Also, the problem is solved by separating the DNA matrix used for the final PCR amplification from other components of the formed detection complex by treatment with a specific restriction endonuclease that does not interfere with the possibility of matrix DNA amplification using specific primers in real time using the TaqMan method, which helps to reduce the background signal in the experiment.

Также поставленная задача решается за счет применения в анализе редко встречающейся в окружающей среде ДНК-матрицы, оптимизированной для проведения ПЦР-амплификации с флуоресцентной детекцией сигнала в режиме реального времени, что снижает вероятность возникновения ложноположительного сигнала при детекции, позволяет существенно повысить чувствительность метода и провести количественное определение содержания BoNT/A в исследуемых образцах.Also, the problem is solved by using a DNA matrix that is rarely found in the environment, which is optimized for real-time PCR amplification with fluorescence detection of the signal, which reduces the likelihood of a false-positive signal during detection, significantly increases the sensitivity of the method, and quantitatively determination of the content of BoNT / A in the studied samples.

Техническим результатом изобретения является создание эффективного высокочувствительного способа детекции ботулинического нейротоксина типа А, применимого для нужд клинической диагностики и мониторинга качества продуктов питания. Отличием предлагаемого способа является осуществление детекции на базе специфических поликлональных антител к рецептор-связывающему домену тяжелой цепи BoNT/A, одно из которых посредством биотин-нейтравидинового взаимодействия связывается с ДНК, служащей матрицей для проведения ПЦР-амплификации с флуоресцентной детекцией сигнала в режиме реального времени. С использованием разработанного способа можно детектировать BoNT/A в концентрации до 1 пг/мл.The technical result of the invention is the creation of an effective highly sensitive method for the detection of botulinum neurotoxin type A, applicable for the needs of clinical diagnosis and monitoring of food quality. The difference of the proposed method is the detection based on specific polyclonal antibodies to the receptor-binding domain of the BoNT / A heavy chain, one of which, through biotin-neutravidin interaction, binds to DNA, which serves as a matrix for real-time PCR amplification with fluorescence signal detection. Using the developed method, it is possible to detect BoNT / A at a concentration of up to 1 pg / ml.

В предлагаемом техническом решении специфичность узнавания BoNT/A обеспечивается за счет высокоаффинных поликлональных антител, взаимодействующих с эпитопом тяжелой цепи молекулы BoNT/A, а чувствительность обеспечивается использованием ДНК-матрицы в качестве субстрата для амплификации сигнала результата реакции. Антитела, используемые для изоляции токсина из образца, иммобилизуют на магнитных частицах, а антитела, применяемые для детекции токсина, подвергают биотинилированию для последующего присоединения коньюгата ДНК с нейтравидином.In the proposed technical solution, the recognition specificity of BoNT / A is ensured by high-affinity polyclonal antibodies interacting with the heavy chain epitope of the BoNT / A molecule, and sensitivity is provided by using a DNA matrix as a substrate for amplification of the signal of the reaction result. The antibodies used to isolate the toxin from the sample are immobilized on magnetic particles, and the antibodies used to detect the toxin are biotinylated for subsequent attachment of the DNA conjugate with neutravidin.

Предлагаемое техническое решение предусматривает использование нековалентного коньюгата ДНК с нейтравидином, который представляет собой молекулярную ″сетку″, образованную за счет взаимодействия биотина, находящегося на 5′-концах двухцепочечного фрагмента ДНК с тетравалетной молекулой нейтравидина. Наиболее эффективным является формирование таких комплексов в молярном соотношении биотинилированной ДНК к белку нейтравидина как 1:2. Нейтравидин является белком авидинового ряда, характеризующимся высокой специфичностью и эффективностью взаимодействия с биотином (константа аффинности 1015 л/моль). Применение молекулярной ″сетки″ вместо индивидуальных фрагментов биотинилированной ДНК повышает количество ДНК-матрицы, удерживаемой единичной молекулой антитела, и более чем в 10 раз увеличивает чувствительность метода.The proposed technical solution involves the use of a non-covalent conjugate of DNA with neutravidin, which is a molecular “network” formed by the interaction of biotin located at the 5′-ends of a double-stranded DNA fragment with a tetravalent neutravidin molecule. The most effective is the formation of such complexes in a molar ratio of biotinylated DNA to neutravidin protein as 1: 2. Neutravidin protein is avidin series, characterized by a high specificity and efficiency with biotin interaction (affinity constant October 15 l / mol). The use of a molecular ″ grid ″ instead of individual biotinylated DNA fragments increases the amount of DNA matrix held by a single antibody molecule and increases the sensitivity of the method by more than 10 times.

Существенным условием успешного использования заявленного способа является блокировка свободных валентностей связывания твердой фазы, которая осуществляется пятикратным раствором Денхардт, содержащим 1% ДНК спермы лосося для предотвращения неспецифического связывания с поверхностью коньюгата ДНК-нейтравидин.An essential condition for the successful use of the claimed method is the blocking of free valencies of solid phase binding, which is carried out by a five-fold Denhardt solution containing 1% salmon sperm DNA to prevent non-specific binding of DNA-neutravidin to the conjugate surface.

Важным достоинством предлагаемого способа определения BoNT/A является применение в качестве носителя комплекса парамагнитных частиц, которые допускают проведение автоматизации этого метода детекции с использованием роботизированных дозаторов и промывочных устройств и минимизирует контакт оператора с потенциально инфицированным материалом.An important advantage of the proposed method for determining BoNT / A is the use of a complex of paramagnetic particles as a carrier, which allow automation of this detection method using robotic dispensers and flushing devices and minimizes operator contact with potentially infected material.

К преимуществам заявленного способа определения ботулинического нейротоксина типа А относятся: 1) высокая чувствительность метода, позволяющая провести диагностику первичной или вторичной интоксикации ботулотоксином типа А на ранних стадиях заболевания ботулизмом, провести мониторинговые исследования на предмет наличия ботулотоксина типа А в продуктах питания, своевременно начать терапию пострадавшего, предотвратить возможность возникновения новых случаев заболевания или нейтрализовать последствия биотеррористической атаки; 2) гомологичность заявленного метода в части реагентов, материалов и оборудования стандартному иммуноферментному анализу и технологиям ПЦР-диагностики, применяемым в клинической практике; 3) высокая специфичность детекции BoNT/A, обеспечивающаяся примененным принципом иммунодетекции, и низкая вероятность получения ложноположительных сигналов по сравнению со стандартными методами ПЦР-диагностики; 4) возможность проведения быстрого автоматизированного анализа большого количества образцов; 5) дешевизна большинства используемых в анализе материалов; 6) возможность экстраполяции разработанного способа для детекции любых других патогенных и непатогенных молекул при подборе соответствующих специфических детектирующих антител.The advantages of the claimed method for determining botulinum neurotoxin type A include: 1) the high sensitivity of the method, which allows to diagnose primary or secondary intoxication with botulinum toxin type A in the early stages of botulism, monitor monitoring for the presence of botulinum toxin type A in food products, and timely start treatment of the victim , prevent the possibility of new cases of the disease or neutralize the effects of bioterrorist attacks; 2) the homology of the claimed method in terms of reagents, materials and equipment to standard enzyme immunoassay and PCR diagnostic technologies used in clinical practice; 3) the high specificity of BoNT / A detection, which is ensured by the applied immunodetection principle, and the low probability of receiving false-positive signals compared to standard PCR diagnostic methods; 4) the ability to conduct rapid automated analysis of a large number of samples; 5) the cheapness of most materials used in the analysis; 6) the possibility of extrapolating the developed method for the detection of any other pathogenic and non-pathogenic molecules in the selection of appropriate specific detecting antibodies.

Изобретение осуществляют следующим образом:The invention is as follows:

Поликлональные антитела, специфичные к рецептор-связывающему домену тяжелой цепи ботулинического токсина типа А, полученные иммунизацией рекомбинантым фрагментом тяжелой цепи токсина (Фиг. 1), связывают на парамагнитных частицах за счет взаимодействия с иммобилизованным на их поверхности белком G бактерий рода Streptococcus. Свободные валентности поверхности планшета или пробирки типа ″эппендорф″ и парамагнитных частиц блокируют пятикратным раствором Денхардт, содержащим 1% ДНК спермы лосося. Троекратно промывают планшет и частицы раствором, содержащим 20 мМ трис-НС1 pH 7,5, 100 мМ хлорида натрия и 5 мМ ЭДТА, помещая планшет или пробирки на магнитную плату для фиксации частиц за счет магнитного взаимодействияPolyclonal antibodies specific for the receptor-binding domain of the heavy chain of botulinum toxin type A, obtained by immunization with a recombinant fragment of the heavy chain of the toxin (Fig. 1), are bound on paramagnetic particles due to interaction with Streptococcus bacteria G protein immobilized on their surface. The free valencies of the surface of a tablet or tube of the п eppendorf ’type and paramagnetic particles are blocked with a five-fold Denhardt solution containing 1% salmon sperm DNA. The tablet and particles are washed three times with a solution containing 20 mM Tris-HC1 pH 7.5, 100 mM sodium chloride and 5 mM EDTA, placing the plate or tubes on a magnetic plate to fix the particles due to magnetic interaction

Проводят подготовку проб биологического материала или образцов продуктов питания. Для этого биологические жидкости центрифугируют с охлаждением и добавляют к супернатанту 1/10 раствора, содержащего 200 мМ трис-НС1, 1 М хлорида натрия и 50 мМ ЭДТА и ингибиторы протеаз. Твердые образцы продуктов питания гомогенизируют с раствором, содержащим 40 мМ трис-HCl pH 7,5, 200 мМ хлорида натрия и 10 мМ ЭДТА и ингибиторы протеаз, и инкубируют при встряхивании на шейкере в течение 10 минут, после чего удаляют твердые частицы центрифугированием.Samples of biological material or food samples are prepared. For this, biological fluids are centrifuged with cooling and 1/10 of a solution containing 200 mM Tris-HCl, 1 M sodium chloride and 50 mM EDTA and protease inhibitors is added to the supernatant. Solid food samples are homogenized with a solution containing 40 mM Tris-HCl pH 7.5, 200 mM sodium chloride and 10 mM EDTA and protease inhibitors, and incubated with shaking on a shaker for 10 minutes, after which the solids are removed by centrifugation.

Подготовленные пробы инкубируют с антителами, иммобилизованными на поверхности парамагнитных частиц в течение 1 часа. После трехкратной промывки частиц раствором, содержащим 20 мМ трис-HCl pH 7,5, 100 мМ хлорида натрия и 5 мМ ЭДТА, к ним добавляют биотинилированные антитела и инкубируют парамагнитные частицы с биотинилированными антителами при комнатной температуре со встряхиванием в течение 30 минут, после чего повторяют промывку парамагнитных частиц. К связанному на поврехности парамагнитных частиц сэндвичу ″антитело - ботулотоксин А - биотинилированное антитело″ добавляют раствор нековалентного коньюгата ДНК с нейтравидином (молекулярная ″сетка″) и инкубируют парамагнитные частицы с коньюгатом в течение 30 минут. Промывку поверхности частиц от несвязавшегося коньюгата с ДНК проводят раствором, содержащим 20 мМ трис-HCl pH 7,5, 300 мМ хлорида натрия.The prepared samples are incubated with antibodies immobilized on the surface of paramagnetic particles for 1 hour. After washing the particles three times with a solution containing 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM sodium chloride and 5 mM EDTA, biotinylated antibodies are added to them and paramagnetic particles with biotinylated antibodies are incubated at room temperature with shaking for 30 minutes, after which washing the paramagnetic particles is repeated. A sandwich ″ antibody - botulinum toxin A – biotinylated antibody ’is sandwiched with paramagnetic particles and added with a solution of non-covalent DNA conjugate with neutravidin (molecular ″ net’) and the paramagnetic particles with conjugate are incubated for 30 minutes. The surface of the particles was washed from an unbound DNA conjugate with a solution containing 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM sodium chloride.

После полного удаления промывочного раствора в лунки планшета или пробирки добавляют буферный раствор для эндонуклеазы рестрикции Sac I, содержащий фермент Sac I в концентрации 50 ед/мл. Рестрикцию проводят при 37°C в течение 1 часа, затем помещают планшет или пробирки на магнитную плату для фиксации частиц за счет магнитного взаимодействия и переносят супернатант из лунок планшета в пробирки для ПЦР.After complete removal of the wash solution, Sac I restriction endonuclease buffer solution containing Sac I enzyme at a concentration of 50 u / ml is added to the wells of the plate or tube. Restriction is carried out at 37 ° C for 1 hour, then the plate or tubes are placed on a magnetic plate to fix the particles due to magnetic interaction and the supernatant is transferred from the plate wells to PCR tubes.

В пробирки для ПЦР, содержащие продукты рестрикции, отобранные с парамагнитных частиц, обработанных рестриктазой Sac I, вносят 10 объемов смеси для амплификации, содержащей буфер для ПЦР-амплификации, праймеры, рекомбинантную Taq-полимеразу и пробу TaqMan для проведения реакции ПЦР в режиме реального времени. Детекция флуоресцентного сигнала проводится при температуре отжига праймеров 57°C и времени элонгации 1 минута с использованием прибора для ПЦР в режиме реального времени в течение 45 циклов амплификации.10 volumes of an amplification mixture containing a buffer for PCR amplification, primers, a recombinant Taq polymerase and a TaqMan sample for real-time PCR reaction are added to PCR tubes containing restriction products taken from paramagnetic particles treated with Sac I restrictase. . The fluorescence signal is detected at an annealing temperature of primers of 57 ° C and an elongation time of 1 minute using a real-time PCR device for 45 amplification cycles.

Отрицательные контрольные значения флуоресцении фиксируются в пробирках, не содержащих тестируемых образцов. Положительные контрольные значения флуоресценции регистрируются в лунках или пробирках, содержащих фиксированные количества белка ботулинического нейротоксина типа А, взятого в известной концентрации. Предел детекции BoNT/A составляет 1 пг токсина на 1 мл исследуемого раствора, или 10 фг на одну ПЦР-реакцию.Negative fluorescence control values are recorded in tubes that do not contain test samples. Positive fluorescence control values are recorded in wells or test tubes containing fixed amounts of type A botulinum neurotoxin protein taken at a known concentration. The detection limit of BoNT / A is 1 pg of toxin per 1 ml of the test solution, or 10 fg per PCR reaction.

Принципиальная схема осуществления изобретения приведена на фиг. 2.A schematic diagram of an embodiment of the invention is shown in FIG. 2.

Изобретение иллюстрируют следующие графические материалы:The invention is illustrated by the following graphic materials:

Фиг. 1. Аминокислотная последовательность рекомбинантного полипептида, соответствующего рецептор-связывающему домену тяжелой цепи нейротоксина ботулизма типа А, использованного для иммунизации кроликов для получения высокоспецифичных поликлональных антител к нейротоксину.FIG. 1. Amino acid sequence of a recombinant polypeptide corresponding to the receptor-binding domain of botulinum neurotoxin heavy chain type A, used to immunize rabbits to obtain highly specific polyclonal antibodies to neurotoxin.

Фиг. 2. Схема постановки эксперимента при определении ботулинического нейротоксина типа А способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией. Фиг. 3. Последовательности ДНК, используемые для синтеза ДНК-матрицы, а также для определения ботулинического нейротоксина типа А способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией в режиме реального времени.FIG. 2. Scheme of the experiment in determining the botulinum neurotoxin type A by immunodetection, coupled with PCR amplification. FIG. 3. DNA sequences used for the synthesis of the DNA template, as well as for the determination of botulinum neurotoxin type A by immunodetection, coupled with real-time PCR amplification.

Фиг. 4. Получение коньюгата биотинилированной ДНК с нейтравидином для определения ботулинического нейротоксина типа А способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией.FIG. 4. Obtaining a conjugate of biotinylated DNA with neutravidin for the determination of botulinum neurotoxin type A by immunodetection coupled with PCR amplification.

Фиг. 5. Типичные результаты определения ботулинического нейротоксина типа А способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией в режиме реального времени.FIG. 5. Typical results of the determination of botulinum neurotoxin type A by immunodetection, coupled with real-time PCR amplification.

Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его конкретного выполнения.For a better understanding of the invention, the following are examples of its specific implementation.

Пример 1. Получение биотинилированного антитела для определения ботулинического нейротоксина типа А способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией.Example 1. Obtaining biotinylated antibodies for the determination of botulinum neurotoxin type A by immunodetection, coupled with PCR amplification.

Выделение поликлональных антител для детекции ботулинического нейротоксина типа А проводят из сыворотки крови кроликов. Отобранную кровь подвергают центрифугированию при 10000 об/мин в течение 15 минут для удаления клеточного дебриса. К полученному супернатанту добавляют равный объем буфера, содержащего 40 мМ трис-HCl pH 7,5, 200 мМ хлорида натрия и проводят высаливание антитела из раствора добавлением насыщенного сульфата аммония до концентрации 50%, а затем выдерживают сульфатный раствор в течение 1 часа при температуре +4°C для формирования осадка. Полученный сульфатный осадок собирают центрифугированием при 12000 об/мин в течение 15 минут и растворяют в буфере, содержащем 50 мМ трис-HCl pH 7,5, 100 мМ хлорида натрия. Полученный белковый раствор центрифугируют при 12000 об/мин в течение 15 минут для удаления нерастворенных примесей и наносят на колонку Protein G (GE Healthcare, США), уравновешенную 10 объемами буфера, использованного для растворения белка. Колонку промывают 10 объемами того же буфера для удаления несвязавшегося белка и элюируют белок антитела раствором, содержащим 100 мМ глицин-HCl pH 2,6 и 100 мМ хлорида натрия. Приводят значение pH раствора к 8.0 добавлением раствора 1 М триса-основание с использованием pH-бумаги. Определяют концентрацию полученного белка антитела спектрофотометрически и анализируют его чистоту электрофорезом в денатурирующем полиакриламидном геле по методике Laemmli. Концентрация полученного белка составляет 1,6 мг/мл, электрофоретическая чистота белка не менее 95%. Полученный белок антитела троекратно диализуют против 100 объемов фосфатного буфера, содержащего 20 мМ Na2HPO4 и 100 мМ хлорида натрия для удаления аминогрупп. Готовят раствор NHS-биотина в DMSO из расчета 1 мг/мл и добавляют полученный раствор к раствору антитела в объемном соотношении 1:8. Проводят реакцию биотинилирования при +4°C в течение ночи со встряхиванием и троекратно диализуют против 100 объемов фосфатного буфера, содержащего 20 мМ Na2HPO4 и 100 мМ хлорида натрия для удаления не связавшегося биотина. Концентрацию конечного биотинилированного продукта определяют спектрофотометрически. Концентрация биотинилированных антител составляет 0,28 мг/мл.Isolation of polyclonal antibodies for the detection of botulinum neurotoxin type A is carried out from the blood serum of rabbits. The collected blood is centrifuged at 10,000 rpm for 15 minutes to remove cell debris. An equal volume of buffer containing 40 mM Tris-HCl pH 7.5, 200 mM sodium chloride was added to the obtained supernatant, and the antibody was salted out of the solution by adding saturated ammonium sulfate to a concentration of 50%, and then the sulfate solution was kept for 1 hour at + 4 ° C to form a precipitate. The resulting sulfate precipitate was collected by centrifugation at 12,000 rpm for 15 minutes and dissolved in a buffer containing 50 mm Tris-HCl pH 7.5, 100 mm sodium chloride. The resulting protein solution was centrifuged at 12,000 rpm for 15 minutes to remove undissolved impurities and applied to a Protein G column (GE Healthcare, USA), balanced with 10 volumes of buffer used to dissolve the protein. The column is washed with 10 volumes of the same buffer to remove unbound protein and the antibody protein is eluted with a solution containing 100 mM glycine-HCl pH 2.6 and 100 mM sodium chloride. The pH of the solution is adjusted to 8.0 by adding a solution of 1 M Tris-base using pH paper. The concentration of the obtained antibody protein is determined spectrophotometrically and its purity is analyzed by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis according to the Laemmli method. The concentration of the obtained protein is 1.6 mg / ml, the electrophoretic purity of the protein is not less than 95%. The resulting antibody protein is dialyzed three times against 100 volumes of phosphate buffer containing 20 mM Na 2 HPO 4 and 100 mM sodium chloride to remove amino groups. Prepare a solution of NHS-Biotin in DMSO at the rate of 1 mg / ml and add the resulting solution to the antibody solution in a volume ratio of 1: 8. The biotinylation reaction is carried out at + 4 ° C overnight with shaking and dialyzed three times against 100 volumes of phosphate buffer containing 20 mM Na 2 HPO 4 and 100 mM sodium chloride to remove unbound biotin. The concentration of the final biotinylated product is determined spectrophotometrically. The concentration of biotinylated antibodies is 0.28 mg / ml.

Полноту биотинилирования контролируют постановкой иммуноблота с детекцией биотинилированного антитела коньюгатом нейтравидин-пероксидаза (Pierce, США). При визуализации иммуноблота определяют полосы массой 22 kDa (легкая цепь lgG) и 55 kDa (тяжелая цепь), соответствующие полосам при электрофоретическом анализе очищенных антител до реакции биотинилирования.The completeness of biotinylation is monitored by setting up an immunoblot with the detection of a biotinylated antibody by a conjugate of neutravidin peroxidase (Pierce, USA). When visualizing the immunoblot, bands of 22 kDa (light chain IgG) and 55 kDa (heavy chain) corresponding to the bands in the electrophoretic analysis of purified antibodies prior to the biotinylation reaction are determined.

Пример 2. Приготовление проб для определения ботулинического нейротоксина типа А способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией.Example 2. The preparation of samples for determination of botulinum neurotoxin type A by immunodetection, coupled with PCR amplification.

Подготовку проб биологического материала проводят следующим образом. Отобранные согласно МУ ″Ботулизм″ N 824-69 от 22 октября 1969 г. образцы биологических жидкостей (промывные воды желудка, рвотные массы, кал, кровь, секционный материал - кусочки печени, обрезки тонкого кишечника, желудка с содержимым, кровь) центрифугируют при 5000 об/мин и температуре +4°C для освобождения от клеточного дебриса, отбирают супернатант и повторно центрифугируют его при 10000 об/мин в течение 15 минут. К супернатанту добавляют 1/10 стерильного раствора, содержащего 200 мМ трис-HCl, 1 М хлорида натрия, 50 мМ ЭДТА, а также добавляют 1/50 стерильного раствора ингибитора протеазы Complete™ Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free (Roche, Швейцария).The preparation of samples of biological material is as follows. Samples of biological fluids taken according to the MU “Botulism” N 824-69 dated October 22, 1969 (gastric lavage, vomit, feces, blood, sectional material — liver pieces, small intestine scrapings, stomach with contents, blood) are centrifuged at 5000 rpm and a temperature of + 4 ° C to relieve cell debris, the supernatant is taken and centrifuged again at 10,000 rpm for 15 minutes. 1/10 sterile solution containing 200 mM Tris-HCl, 1 M sodium chloride, 50 mM EDTA was added to the supernatant, and 1/50 sterile Complete ™ Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free protease inhibitor solution (Roche, Switzerland) was added.

К твердым образцам биологических тканей и продуктов питания добавляют раствор, содержащий 40 мМ трис-HCl pH 7,5, 200 мМ хлорида натрия и 10 мМ ЭДТА из расчета один объем раствора (в мл) на одну единицу массы твердого образца (в г), а также 1/25 раствора ингибитора протеазы ™ Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free и растирают в гомогенизаторе Дунса (20 ударов плотно прилегающего пестика) во льду. Полученный однородный гомогенат встряхивают на шейкере при температуре +4°C в течение 10 минут и удаляют твердые частицы центрифугированием при 10000 об/мин в течение 15 минут.To solid samples of biological tissues and food products add a solution containing 40 mm Tris-HCl pH 7.5, 200 mm sodium chloride and 10 mm EDTA at the rate of one solution volume (in ml) per unit mass of solid sample (in g), as well as 1/25 of the Protease Inhibitor Cocktail protease inhibitor ™ solution, EDTA-free, and triturated in a Duns homogenizer (20 strokes of a tight-fitting pestle) in ice. The resulting homogeneous homogenate is shaken on a shaker at a temperature of + 4 ° C for 10 minutes and solids are removed by centrifugation at 10,000 rpm for 15 minutes.

Материал, подлежащий исследованию, хранят при температуре +4°C до проведения анализа, но оптимально используют в течение трех суток. Консервирующие вещества к отобранным пробам не добавляют.The material to be studied is stored at a temperature of + 4 ° C until analysis, but is optimally used for three days. Preservatives are not added to the selected samples.

Пример 3. Приготовление коньюгата биотинилированной ДНК с нейтравидином для определения ботулинического нейротоксина типа А способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией.Example 3. The preparation of a conjugate of biotinylated DNA with neutravidin for the determination of botulinum neurotoxin type A by immunodetection, coupled with PCR amplification.

В качестве ДНК для получения коньюгата с нейтравидином и матрицы для последующей ПЦР-амплификации в режиме реального времени используют фрагмент геномной ДНК Fusarium avenaceum длиной 747 пар оснований и праймеры для амплификации фрагмента на 5′-концах модифицируют биотином (фиг. 3). Наработку биотинилированного фрагмента ДНК проводят ПЦР амплификацией при помощи Taq-полимеразы при температуре отжига праймеров 56°C и времени элонгации фрагмента 1 минута. Продукты ПЦР-реакции осаждают 3 объемами этанола с добавлением 1/10 объема ацетата натрия pH 5,2 и растворяют в 0,5 мл буфера, содержащего 20 мМ трис-HCl pH 7,5 и 300 мМ хлорида натрия, 5 мМ ЭДТА. Раствор ДНК центрифугируют для удаления нерастворенных примесей и наносят на гель-фильтрационную колонку Superdex-200 (GE-Healthcare, Великобритания), уравновешенную тем же буфером, для удаления побочных продуктов синтеза и не задействованных в синтезе олигонуклеотидов. Гель-фильтрацию проводят при скорости потока 0,5 мл/мин, выход разделяемых продуктов контролируют спектрофотометрически при длине волны 260 нм. Определяют содержание целевого фрагмента ДНК во фракциях гель-фильтрации электрофорезом в агарозном геле. Для дальнейшей работы отбирают фракции, содержащие фрагмент длиной 747 п. н. Фракции, содержащие синтезированный фрагмент, осаждают 3 объемами этанола с добавлением 1/10 объема ацетата натрия pH 5,2 и растворяют в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl, 100 мМ хлорида натрия и 5 мМ ЭДТА. Количество ДНК в полученном растворе определяют спектрофотометрически. Концентрация ДНК-матрицы составляет 48 мкг/мл.As a DNA to obtain a conjugate with neutravidin and a matrix for subsequent PCR amplification in real time, a F47arium avenaceum genomic DNA fragment of 747 base pairs in length is used, and primers for amplifying the fragment at the 5′-ends are modified with biotin (Fig. 3). The biotinylated DNA fragment is produced by PCR amplification using Taq polymerase at annealing temperature of primers 56 ° C and fragment elongation time of 1 minute. PCR reaction products precipitated with 3 volumes of ethanol with the addition of 1/10 volume of sodium acetate pH 5.2 and dissolved in 0.5 ml of buffer containing 20 mm Tris-HCl pH 7.5 and 300 mm sodium chloride, 5 mm EDTA. The DNA solution is centrifuged to remove undissolved impurities and applied to a Superdex-200 gel filtration column (GE-Healthcare, UK), equilibrated with the same buffer, to remove by-products of the synthesis and not involved in the synthesis of oligonucleotides. Gel filtration is carried out at a flow rate of 0.5 ml / min, the yield of the separated products is controlled spectrophotometrically at a wavelength of 260 nm. The content of the target DNA fragment in the gel filtration fractions was determined by agarose gel electrophoresis. For further work, fractions containing a 747 bp fragment are selected. Fractions containing the synthesized fragment are precipitated with 3 volumes of ethanol with the addition of 1/10 volume of sodium acetate pH 5.2 and dissolved in a buffer containing 20 mM Tris-HCl, 100 mM sodium chloride and 5 mM EDTA. The amount of DNA in the resulting solution is determined spectrophotometrically. The concentration of the DNA template is 48 μg / ml.

Готовят раствор нейтравидина (Pierce, США) из расчета 1 мг/мл и смешивают его с раствором ДНК в соотношении 2:1 соответственно. Смесь инкубируют при +4°C в течение ночи. Образование молекулярной ″сетки″ биотинилированной ДНК с нейтравидином контролируют электрофорезом ДНК в полиакриламидном геле по замедлению скорости миграции продуктов разделения против исходного фрагмента ДНК (фиг. 4). Полученный коньюгат биотинилированной ДНК с нейтравидином очищают от несвязанной ДНК и нейтравидина гель-фильтрацией на колонке Superdex-200 (GE-Healthcare, Великобритания), уравновешенной буфером, содержащим 20 мМ трис-HCl pH 7,5, 300 мМ хлорида натрия и 5 мМ ЭДТА. Содержание коньюгата во фракциях гель-фильтрации контролируют электрофорезом в агарозном геле. Оптимально определяют полосы, соответствующие ДНК длиной не менее 2988 п. н. при отсутствии фрагментов длиной 747 п. н. Очищенный коньюгат концентрируют с использованием Microcon YM-50 (Millipore, США). Спектрофотометрически определяют концентрацию коньюгата по ДНК и белку и на основании этих данных рассчитывают соотношение ДНК к белку в полученной молекулярной ″сетке″. Концентрация ДНК и белка составляет 32 мкг/мл и 14,6 мкг/мл соответственно, что указывает на молярное соотношение ДНК к белку как 1:2. К коньюгату добавляют глицерин до 50% и хранят по аликвотам при температуре -70°C.Prepare a solution of neutravidin (Pierce, USA) at the rate of 1 mg / ml and mix it with a solution of DNA in a ratio of 2: 1, respectively. The mixture was incubated at + 4 ° C overnight. The formation of a molecular ″ grid ″ of biotinylated DNA with neutravidin is controlled by polyacrylamide gel electrophoresis of DNA to slow the migration rate of separation products against the original DNA fragment (Fig. 4). The resulting conjugate of biotinylated DNA with neutravidin was purified from unbound DNA and neutravidin by gel filtration on a Superdex-200 column (GE-Healthcare, UK), equilibrated with buffer containing 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM sodium chloride and 5 mM EDTA . The conjugate content in the gel filtration fractions was controlled by agarose gel electrophoresis. The bands corresponding to DNA with a length of at least 2988 bp are optimally determined. in the absence of fragments 747 bp long The purified conjugate was concentrated using Microcon YM-50 (Millipore, USA). The concentration of the conjugate is determined spectrophotometrically from the DNA and the protein, and based on these data, the ratio of DNA to protein in the resulting molecular "grid" is calculated. The concentration of DNA and protein is 32 μg / ml and 14.6 μg / ml, respectively, indicating a molar ratio of DNA to protein as 1: 2. Up to 50% glycerol is added to the conjugate and stored in aliquots at a temperature of -70 ° C.

Пример 4. Постановка иммунодетекции ботулотоксина А и связывание его с ДНК-матрицей для последующей ПЦР-амплификации в режиме реального времени.Example 4. Immunodetection of botulinum toxin A and its binding to a DNA template for subsequent real-time PCR amplification.

Парамагнитные частицы с иммобилизованным белком G бактерий семейства Streptococcus (Protein G Magnetic Beads, New England Biolabs, США) наносят в лунки микропланшета или в пробирки типа ″эппендорф″ объемом 1,5 мл в количестве 10 мкл суспензии частиц на лунку/пробирку. В лунки иммунологического микропланшета или пробирки разносят раствор Денхардт (20 мМ трис-HCl, pH 7,5, 100 мМ хлорида натрия, 1% Ficoll 400, 1% поливинилпирролидон, 1% бычий сывороточный альбумин), содержащего 1% ДНК спермы лосося - в лунки микропланшета по 300 мкл, в пробирки по 1,5 мл - и инкубируют в течение 1 часа при 37°C для блокировки свободных валентностей поверхности. Помещают планшет на магнитную плату прибора ELx405 Magna (BioTek, США) и шестикратно промывают парамагнитные частицы, удерживаемые магнитным взаимодействием, буферным раствором, содержащим 20 мМ трис-HCl pH 7,5, 100 мМ хлорида натрия, 5 мМ ЭДТА в объеме 300 мкл. Микропробирки помещают на магнитный штатив Invitrogen DynaMag™-2 и отмывают аналогично внесением 1,5 мл отмывающего буфера с использованием шагового механического дозатора Ленпипет Степпер для внесения буферного раствора и аспиратора Gilson Safe Aspiration Station (Gilson, США) для отбора жидкости. В лунки микропланшета или пробирки разносят по 100 мкл подготовленных образцов, содержащих известное количество BoNT/A в различных концентрациях (десятикратные разведения от 10 нг/мл до 0,1 пг/мл) - в качестве положительного контроля и для построения калибровочной кривой, а также исследуемые образцы. В лунки, служащие отрицательным контролем, добавляют буферный раствор, содержащий 20 мМ трис-HCl pH 7,5, 100 мМ хлорида натрия, 5 мМ ЭДТА, либо экспериментальные образцы, заведомо не содержащие ботулотоксин А. В качестве контроля специфичности выступают образцы, содержащие 10 пг/мл белковых токсинов иной структуры: шига-токсин энтерогеморрагической Е. coli, дифтерийный токсин, токсин тканевого шока S. aureus, холерный токсин, стафилококковый энтеротоксин А. Инкубируют планшет или пробирки при встряхивании в течение 1 часа при комнатной температуре. Шестикратно промывают парамагнитные частицы раствором, содержащим 20 мМ трис-HCl pH 7,5, 100 мМ хлорида натрия, 5 мМ ЭДТА с применением прибора ELx405 Magna или использованием шагового механического дозатора Ленпипет и аспиратора Gilson Safe Aspiration Station. В лунки планшета или микропробирки добавляют по 100 мкл раствора, содержащего биотинилированные антитела, и инкубируют планшет при встряхивании в течение 30 минут при комнатной температуре. Шестикратно промывают парамагнитные частицы раствором, содержащим 20 мМ трис-HCl pH 7,5, 100 мМ хлорида натрия, 5 мМ ЭДТА с применением прибора ELx405 Magna или использованием шагового механического дозатора Ленпипет и аспиратора Gilson Safe Aspiration Station. В лунки планшета или пробирки добавляют по 100 мкл раствора 20 мМ трис-HCl pH 7,5, 300 мМ хлорида натрия, 5 мМ ЭДТА, содержащего коньюгат биотинилированной ДНК с нейтравидином в количестве 0,1 мкг ДНК на лунку/пробирку и инкубируют при встряхивании в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего десятикратно промывают парамагнитные частицы раствором, содержащим 20 мМ трис-HCl pH 7,5, 300 мМ хлорида натрия с применением прибора ELx405 Magna или использованием шагового механического дозатора Ленпипет и аспиратора Gilson Safe Aspiration Station.Paramagnetic particles with immobilized protein G of Streptococcus bacteria (Protein G Magnetic Beads, New England Biolabs, USA) are loaded into the microplate wells or 1.5 ml Eppendorf tubes in the amount of 10 μl of particle suspension per well / tube. A Denhardt solution (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM sodium chloride, 1% Ficoll 400, 1% polyvinylpyrrolidone, 1% bovine serum albumin) containing 1% salmon sperm DNA is delivered to the wells of an immunological microplate or test tube. 300 μl microplate wells, in 1.5 ml tubes, and incubated for 1 hour at 37 ° C to block free surface valencies. Place the tablet on the magnetic board of the ELx405 Magna device (BioTek, USA) and wash the paramagnetic particles, held by magnetic interaction, six times, with a buffer solution containing 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM sodium chloride, 5 mM EDTA in a volume of 300 μl. Microtubes were placed on an Invitrogen DynaMag ™ -2 magnetic tripod and washed in the same way by adding 1.5 ml of washing buffer using the Lenpipet Stepper step-by-step mechanical dispenser for adding the buffer solution and Gilson Safe Aspiration Station (Gilson, USA) for liquid sampling. 100 μl of prepared samples containing a known amount of BoNT / A in various concentrations (ten-fold dilutions from 10 ng / ml to 0.1 pg / ml) are dispensed into the wells of a microplate or test tube as a positive control and to construct a calibration curve, as well as test samples. A buffer solution containing 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM sodium chloride, 5 mM EDTA, or experimental samples obviously not containing botulinum toxin A are added to wells that serve as a negative control. Specimens containing 10 pg / ml of protein toxins of a different structure: Shiga toxin enterohemorrhagic E. coli, diphtheria toxin, tissue shock toxin S. aureus, cholera toxin, staphylococcal enterotoxin A. Incubate the plate or tubes with shaking for 1 hour at room temperature. The paramagnetic particles are washed six times with a solution containing 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM sodium chloride, 5 mM EDTA using an ELx405 Magna instrument or using a Lenpipet mechanical step metering device and Gilson Safe Aspiration Station. 100 μl of a solution containing biotinylated antibodies are added to the wells of the plate or microtubes, and the plate is incubated with shaking for 30 minutes at room temperature. The paramagnetic particles are washed six times with a solution containing 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM sodium chloride, 5 mM EDTA using an ELx405 Magna instrument or using a Lenpipet mechanical step metering device and Gilson Safe Aspiration Station. 100 μl of a solution of 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM sodium chloride, 5 mM EDTA containing a conjugate of biotinylated DNA with neutravidin in an amount of 0.1 μg DNA per well / tube are added to the wells of the plate and incubated with shaking for 30 minutes at room temperature, after which the paramagnetic particles are washed ten times with a solution containing 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM sodium chloride using an ELx405 Magna instrument or using a Lenpipet mechanical step metering device and Gilson Safe Aspiration Station.

После полного удаления промывочного раствора в лунки планшета или микропробирки разносят по 50 мкл однократного буферного раствора для эндонуклеазы рестрикции Sac I, содержащий фермент Sac I в концентрации 50 ед/мл. Инкубируют при 37°C в течение 1 часа, помещают планшет на магнитную плату, пробирки на магнитный сепаратор и переносят супернатант в пробирки для ПЦР. К 1/10 отобранного супернатанта добавляют смесь для ПЦР-амплификации в режиме реального времени.After complete removal of the wash solution, 50 μl of a single Sac I restriction endonuclease buffer solution containing the Sac I enzyme at a concentration of 50 u / ml is dispensed into the wells of the plate or microtubes. Incubate at 37 ° C for 1 hour, place the plate on a magnetic board, tubes on a magnetic separator and transfer the supernatant to PCR tubes. A real-time PCR amplification mixture is added to 1/10 of the selected supernatant.

Пример 5. Проведение ПЦР-амплификации с флуоресцентной детекцией сигнала в режиме реального времени для определения ботулинического нейротоксина типа А способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией.Example 5. Real-time PCR amplification with fluorescence detection of the signal to determine type A botulinum neurotoxin by immunodetection using PCR amplification.

Для проведения ПЦР-амплификации в режиме реального времени в пробирки для ПЦР, содержащие по 5 мкл продуктов рестрикции ДНК-матрицы, отобранных с парамагнитных частиц, обработанных рестриктазой Sac I, разносят по 50 мкл 1х реакционную смесь для амплификации (Реакционная смесь 2,5х для проведения ПЦР-РВ, ″Синтол″, Россия), содержащую по 300 нМ каждого из праймеров для амплификации, 1 единицу рекомбинантной Taq-полимеразы и 200 нМ зонда TaqMan (фиг. 3). Реакцию амплификации проводят на приборе для ПЦР амплификации в режиме реального времени MiniOpticon Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, США) с использованием следующего протокола:To carry out real-time PCR amplification, in PCR tubes containing 5 μl of restriction products of the DNA template, selected from paramagnetic particles treated with Sac I restriction enzyme, 50 μl of 1x reaction mixture for amplification are distributed (Reaction mixture 2.5x for PCR-RV, Syntol, Russia) containing 300 nM of each of the amplification primers, 1 unit of recombinant Taq polymerase and 200 nM TaqMan probe (Fig. 3). The amplification reaction is carried out on a MiniOpticon Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, USA) instrument for real-time PCR amplification using the following protocol:

Figure 00000001
Figure 00000001

Регистрацию нарастания флуоресценции ведут при длине волны 520 нм. Положительный контроль амплификации показывает нарастание сигнала флуоресценции до 15 цикла реакции амплификации. Пробы, содержащие BoNT/A выше предела детекции, показывают нарастание флуоресценции с 15 по 25 циклы реакции амплификации. Нарастания флуоресценции в отрицательных контрольных пробах и в пробах, содержащих BoNT/A ниже предела определения, в диапазоне циклов реакции с 5 по 30 не обнаруживают (фиг. 5). Применив калибровочную кривую, построенную на основании зависимости номера цикла, на котором начинает регистрироваться изменение флуоресценции, от значений концентрации белка ботулотоксина А в контрольных образцах, определяют концентрацию белка BoNT/A в исследуемых пробах. Чувствительность метода составляет 1 пг/мл ботулотоксина типа А. Анализ специфической активности показывает отсутствие перекрестного взаимодействия с белковыми токсинами иной природы.The increase in fluorescence is recorded at a wavelength of 520 nm. A positive amplification control shows an increase in the fluorescence signal up to the 15th cycle of the amplification reaction. Samples containing BoNT / A above the detection limit show an increase in fluorescence from 15 to 25 cycles of the amplification reaction. No increase in fluorescence in negative control samples and in samples containing BoNT / A below the limit of detection was not detected in the range of reaction cycles from 5 to 30 (Fig. 5). Using a calibration curve constructed on the basis of the dependence of the cycle number, on which the change in fluorescence begins to be recorded, on the concentration of botulinum toxin A protein in control samples, the concentration of BoNT / A protein in the studied samples is determined. The sensitivity of the method is 1 pg / ml of botulinum toxin type A. Analysis of specific activity shows the absence of cross-interaction with protein toxins of a different nature.

Claims (1)

Способ определения наличия ботулинического нейротоксина типа А на основе иммунодетекции, сопряженной с полимеразной цепной реакцией, включающий адсорбцию белка ботулотоксина типа А на парамагнитных частицах, несущих иммобилизованный белок G бактерий семейства Streptococcus, с блокированными раствором Денхардт-ДНК свободными валентностями частиц, при помощи специфических высокоаффинных поликлональных антител, узнающих рецептор-связывающий домен тяжелой субъединицы ботулотоксина типа А, связывание иммобилизованного белка ботулотоксина типа А при помощи биотинилированных поликлональных антител, детекцию комплекса белка ботулинического нейротоксина типа А с биотинилированным антителом посредством нековалентного коньюгата фрагментов неспецифической оптимизированной ДНК с нейтравидином, освобождение ДНК-матрицы из образованного твердофазного комплекса при помощи эндонуклеазы рестрикции с последующим проведением ее ПЦР-амплификации с флуоресцентной детекцией сигнала в режиме реального времени с использованием специфических праймеров и метки TaqMan и регистрацией присутствия ботулотоксина типа А в исследуемых образцах по изменению уровня флуоресценции в соответствующих пробирках, лунках планшета или пробирках стрипа против контрольных. A method for determining the presence of type A botulinum neurotoxin based on immunodetection coupled with a polymerase chain reaction, including the adsorption of type A botulinum toxin protein on paramagnetic particles carrying an immobilized protein of Streptococcus bacteria family G with blocked Denhardt-DNA free valency particles using specific high-affinity particles antibodies recognizing the receptor-binding domain of the heavy subunit of botulinum toxin type A, binding of the immobilized botulinum toxin protein IPA using biotinylated polyclonal antibodies, detection of a complex of botulinum neurotoxin type A protein with a biotinylated antibody by means of a non-covalent conjugate of fragments of non-specific optimized DNA with neutravidin, release of the DNA matrix from the formed solid-phase complex using restriction endonuclease, followed by PCR amplification signal in real time using specific primers and labels TaqMan and registration p isutstviya botulinum toxin type A in the samples to change the fluorescence level in the respective test tubes, wells of the plate or strip against the control tubes.
RU2013153456/15A 2013-12-03 2013-12-03 Method of determining botulinum neurotoxin of type a based immunodetection, combined with polymerase chain reaction RU2549463C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2013153456/15A RU2549463C1 (en) 2013-12-03 2013-12-03 Method of determining botulinum neurotoxin of type a based immunodetection, combined with polymerase chain reaction

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2013153456/15A RU2549463C1 (en) 2013-12-03 2013-12-03 Method of determining botulinum neurotoxin of type a based immunodetection, combined with polymerase chain reaction

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2549463C1 true RU2549463C1 (en) 2015-04-27

Family

ID=53289749

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2013153456/15A RU2549463C1 (en) 2013-12-03 2013-12-03 Method of determining botulinum neurotoxin of type a based immunodetection, combined with polymerase chain reaction

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2549463C1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2623157C1 (en) * 2016-03-15 2017-06-22 Открытое акционерное общество "Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения" (ОАО "ВНЦМДЛ") Antigen binding section (fab), including humanized fab, against botulinical neurotoxin c (versions), method to obtain fab using yeast, method and set for botulinical neurotoxin c detection

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002025284A2 (en) * 2000-09-25 2002-03-28 U.S. Medical Research Institute Of Infectious Diseases High-throughput assays for the proteolytic activities of clostridial neurotoxins
RU2339953C1 (en) * 2007-06-13 2008-11-27 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт биологического приборостроения" (ФГУП "ГосНИИ БП") Method of multyanalite immunoassay with use of microparticles
WO2011048044A1 (en) * 2009-10-21 2011-04-28 Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa System for determining unprocessed and partially processed neurotoxin type a
RU2470307C1 (en) * 2011-11-09 2012-12-20 Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) Method of determining presence of anthrax protective antigen based on immunodetection, associated with polymerase chain reaction

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002025284A2 (en) * 2000-09-25 2002-03-28 U.S. Medical Research Institute Of Infectious Diseases High-throughput assays for the proteolytic activities of clostridial neurotoxins
RU2339953C1 (en) * 2007-06-13 2008-11-27 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт биологического приборостроения" (ФГУП "ГосНИИ БП") Method of multyanalite immunoassay with use of microparticles
WO2011048044A1 (en) * 2009-10-21 2011-04-28 Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa System for determining unprocessed and partially processed neurotoxin type a
RU2470307C1 (en) * 2011-11-09 2012-12-20 Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) Method of determining presence of anthrax protective antigen based on immunodetection, associated with polymerase chain reaction

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RAJKOVIC A. et al. Detection of Clostridium botulinum neurotoxins A and B in milk by ELISA and immuno-PCR at higher sensitivity than mouse bio-assay. Food Analytical Methods. 2012; 5(3): 319-326. КОЗЫРЬ А.В. и др. Разработка технодиагностикумов бактериальных инфекций на основе метода иммуно-ПЦР. Теоретические и практические аспекты современной медицины: материалы международной заочной научно-практической конференции. 29 февраля 2012 г. [Найдено 16.10.2014] [он-лайн]. Найдено из Интернет: URL: http://sibac.info/index.php/2009-07-01-10-21-16/1556-2012-03-14-19-39-28. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2623157C1 (en) * 2016-03-15 2017-06-22 Открытое акционерное общество "Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения" (ОАО "ВНЦМДЛ") Antigen binding section (fab), including humanized fab, against botulinical neurotoxin c (versions), method to obtain fab using yeast, method and set for botulinical neurotoxin c detection

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yang et al. Dual-recognition detection of Staphylococcus aureus using vancomycin-functionalized magnetic beads as concentration carriers
Sharma et al. Detection of type A, B, E, and F Clostridium botulinum neurotoxins in foods by using an amplified enzyme-linked immunosorbent assay with digoxigenin-labeled antibodies
Cai et al. Botulism diagnostics: from clinical symptoms to in vitro assays
Toledo et al. The enolase of Borrelia burgdorferi is a plasminogen receptor released in outer membrane vesicles
Foddai et al. Maximizing capture efficiency and specificity of magnetic separation for Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis cells
Liang et al. A highly sensitive immuno-PCR assay for detecting Group A Streptococcus
Fischer et al. A quantitative real-time immuno-PCR approach for detection of staphylococcal enterotoxins
Dorner et al. Complexity of botulinum neurotoxins: challenges for detection technology
Kalb et al. Detection of botulinum neurotoxin A in a spiked milk sample with subtype identification through toxin proteomics
Balachandran et al. Expression and function of protein A in Staphylococcus pseudintermedius
Grate et al. Advances in assays and analytical approaches for botulinum-toxin detection
Singh et al. Evaluation of highly sensitive indigenous milk ELISA kit with fecal culture, milk culture and fecal-PCR for the diagnosis of bovine Johne's disease (BJD) in India
Brunt et al. Rapid affinity immunochromatography column-based tests for sensitive detection of Clostridium botulinum neurotoxins and Escherichia coli O157
Janardhanan et al. RNA aptasensor for rapid detection of natively folded type A botulinum neurotoxin
EP2540738A1 (en) Method for extracting staphylococcus aureus antigen, reagent for extracting staphylococcus aureus antigen, and method for testing staphylococcus aureus
Nepal et al. Alternative methods for testing botulinum toxin: Current status and future perspectives
Widiyanti et al. Development of immunochromatography-based methods for detection of leptospiral lipopolysaccharide antigen in urine
ElTahir et al. Binding of Brucella protein, Bp26, to select extracellular matrix molecules
Parks et al. Quantification of botulinum neurotoxin serotypes A and B from serum using mass spectrometry
Shin et al. Hybrid microarray based on double biomolecular markers of DNA and carbohydrate for simultaneous genotypic and phenotypic detection of cholera toxin-producing Vibrio cholerae
Wang et al. Subtyping botulinum neurotoxins by sequential multiple endoproteases in-gel digestion coupled with mass spectrometry
Ataee et al. Staphylococcal enterotoxin C in synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis
Cheng et al. Current methods for detecting the presence of botulinum neurotoxins in food and other biological samples
RU2549463C1 (en) Method of determining botulinum neurotoxin of type a based immunodetection, combined with polymerase chain reaction
Volland et al. A sensitive sandwich enzyme immunoassay for free or complexed Clostridium botulinum neurotoxin type A

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20201204