RU2548773C1 - Method for detecting benign and malignant new growths of human thyroid - Google Patents
Method for detecting benign and malignant new growths of human thyroid Download PDFInfo
- Publication number
- RU2548773C1 RU2548773C1 RU2014105810/15A RU2014105810A RU2548773C1 RU 2548773 C1 RU2548773 C1 RU 2548773C1 RU 2014105810/15 A RU2014105810/15 A RU 2014105810/15A RU 2014105810 A RU2014105810 A RU 2014105810A RU 2548773 C1 RU2548773 C1 RU 2548773C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- thyroid
- expression
- mirnas
- malignant
- benign
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицины, в частности к онкологии, и предназначено для быстрого определения типа новообразования (злокачественное или доброкачественное) щитовидной железы (ЩЖ) человека.The invention relates to the field of molecular biology and medicine, in particular to oncology, and is intended to quickly determine the type of neoplasm (malignant or benign) of the human thyroid gland (thyroid gland).
Новообразования ЩЖ проявляются как структурные (узловые) патологии ЩЖ. Узловой зоб (собирательное клиническое понятие, объединяющее все обособленные образования в ЩЖ, отличающиеся морфологическими характеристиками от остальной ткани) встречается почти у 40-50% населения. Злокачественные образования составляют до 10% всех случаев узлового зоба. К неопухолевым заболеваниям, или опухолеподобным поражениям (ОПП) ЩЖ, проявляющимся в форме диффузной и узловатой гиперплазии и напоминающим новообразования, относятся узловой зоб, аутоиммунный тиреоидит.Thyroid neoplasms appear as structural (nodal) thyroid pathologies. Nodular goiter (a collective clinical concept that unites all isolated formations in the thyroid gland that differ in morphological characteristics from the rest of the tissue) occurs in almost 40-50% of the population. Malignant tumors account for up to 10% of all cases of nodular goiter. Non-tumor diseases, or tumor-like lesions (AKP) of the thyroid gland, manifested in the form of diffuse and nodular hyperplasia and resembling neoplasms, include nodular goiter, autoimmune thyroiditis.
Рак щитовидной железы (РЩЖ) - наиболее часто встречающаяся злокачественная опухоль эндокринных органов, занимающая высокие позиции по числу смертельных исходов среди злокачественных эндокринных опухолей [1]. Эпидемиологические исследования последних десятилетий показывают отчетливую тенденцию к росту количества больных РЩЖ во многих регионах мира. В РФ в последние годы прирост заболеваемости РЩЖ составляет в среднем 3.5% в год [2].Thyroid cancer (thyroid cancer) is the most common malignant tumor of the endocrine organs, occupying a high position in the number of deaths among malignant endocrine tumors [1]. Epidemiological studies of recent decades show a clear upward trend in the number of thyroid cancer patients in many regions of the world. In recent years, in the Russian Federation, an increase in the incidence of thyroid cancer is an average of 3.5% per year [2].
Подавляющее большинство случаев РЩЖ (80-85% всех случаев) составляет папиллярный рак (или папиллярная аденокарцинома), который может встречаться в любом возрасте. На долю фолликулярного рака (фолликулярной аденокарциномы) приходится 5-15% случаев. Эти два типа рака относят к дифференцированному РЩЖ, отличающемуся медленным течением и благоприятным прогнозом. К умеренно дифференцированному раку относят медуллярную карциному (5% случаев) и плоскоклеточный рак (0.2-0.7%). Недифференцированный или анапластический рак составляет 0.1-1% всех карцином. Папиллярный рак является самым вариабельным по степени поражения долей железы и окружающих тканей, причем для этого типа рака характерно метастазирование в региональные лимфатические узлы шеи (60-70%). Особенность развития РЩЖ заключается в том, что узел на шее безболезнен, развивается медленно и может не беспокоить до 10 лет, а затем быстро начать прогрессировать.The vast majority of cases of thyroid cancer (80-85% of all cases) are papillary cancer (or papillary adenocarcinoma), which can occur at any age. Follicular cancer (follicular adenocarcinoma) accounts for 5-15% of cases. These two types of cancer are classified as differentiated thyroid cancer, characterized by a slow course and a favorable prognosis. Medially differentiated cancer includes medullary carcinoma (5% of cases) and squamous cell carcinoma (0.2-0.7%). Undifferentiated or anaplastic cancer accounts for 0.1-1% of all carcinomas. Papillary cancer is the most variable in the degree of damage to the lobes of the gland and surrounding tissues, and for this type of cancer, metastasis to the regional lymph nodes of the neck is characteristic (60-70%). A feature of the development of thyroid cancer is that the node on the neck is painless, develops slowly and may not bother up to 10 years, and then quickly begin to progress.
В настоящее время диагноз пациенту ставится на основании цитологического исследования биоптата опухоли, однако практика цитологической дифференциальной диагностики опухолей ЩЖ демонстрирует ее недостаточную надежность из-за сложности и разнообразия морфологических форм РЩЖ, когда даже внутри одного и того же гистологического типа новообразования наблюдается вариабельность клинического течения. В целом дооперационная и послеоперационная диагностика с помощью цитологического исследования новообразований ЩЖ не позволяет избежать высокого, до 20%, уровня ошибок.Currently, the diagnosis is made to the patient on the basis of a cytological study of a tumor biopsy, however, the practice of differential cytological diagnosis of thyroid tumors demonstrates its lack of reliability due to the complexity and variety of morphological forms of thyroid cancer, when even within the same histological type of neoplasm the clinical course is observed. In general, preoperative and postoperative diagnosis using a cytological study of thyroid neoplasms does not allow to avoid a high, up to 20%, error rate.
В этой связи чрезвычайно актуальна проблема создания современных высокоэффективных методов определения опухолевых образований ЩЖ, содержащих объективные и надежные количественные методы оценки состояния клетки в норме и при патологическом состоянии.In this regard, the problem of creating modern highly effective methods for determining thyroid tumor formations containing objective and reliable quantitative methods for assessing the state of the cell in a normal and pathological condition is extremely urgent.
Известен стандартный способ дифференциальной диагностики опухолей ЩЖ, включающий забор материала опухоли пациента путем аспирационной биопсии или вырезания фрагментов ткани опухоли, удаленной во время операции, приготовление препаратов для морфологического анализа - стандартных гистологических срезов толщиной 5-6 мкм, их стандартную окраску для гистологического исследования и цитологическое исследование аномальных клеток опухоли ЩЖ [3].A standard method for differential diagnosis of thyroid tumors is known, including sampling the patient’s tumor material by aspiration biopsy or cutting out tumor tissue fragments removed during surgery, preparing preparations for morphological analysis — standard histological sections 5-6 μm thick, their standard color for histological examination and cytological investigation of abnormal thyroid tumor cells [3].
Способ неточный, неколичественный, достаточно субъективный и зависит от практического опыта врачей при визуальной оценке структур опухоли и раковых клеток.The method is inaccurate, non-quantitative, quite subjective and depends on the practical experience of doctors in the visual assessment of tumor structures and cancer cells.
На настоящий момент на стыке медицины и молекулярной биологии разрабатываются способы диагностики различных заболеваний и различных типов рака, в том числе рака ЩЖ, с использованием в качестве биомаркеров микроРНК [4].Currently, at the intersection of medicine and molecular biology, methods are being developed for diagnosing various diseases and various types of cancer, including thyroid cancer, using microRNAs as biomarkers [4].
МикроРНК - это недавно открытые малые, не кодирующие белок, регуляторные РНК, которые контролируют экспрессию генов на посттранскрипционном уровне. МикроРНК участвуют практически во всех базовых процессах от момента возникновения организма: эмбриональном развитии, пролиферации, дифференцировке, старении, иммунном и стрессорном ответах, геномном импринтинге, в ключевых процессах метаболизма, а также при разных патологиях, включая рак. Кроме того, микроРНК сами могут выступать в роли онкогенов и супрессоров опухолевого роста. Дерегуляция микроРНК ведет к изменению их экспрессии в опухолевых клетках в сравнении с нормальными тканями.MicroRNAs are recently discovered small, non-protein encoding, regulatory RNAs that control gene expression at the post-transcriptional level. MicroRNAs are involved in almost all basic processes from the moment an organism emerges: embryonic development, proliferation, differentiation, aging, immune and stress responses, genomic imprinting, in key metabolic processes, as well as in various pathologies, including cancer. In addition, miRNAs themselves can act as oncogenes and tumor suppressors. The deregulation of miRNAs leads to a change in their expression in tumor cells in comparison with normal tissues.
Известен способ определения новообразований ЩЖ на основе комбинации методов ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) и микрочипа по классификации фолликулярной неоплазии ЩЖ [5]. Способ заключается в измерении экспрессии 4-х групп микроРНК для улучшения дооперационной диагностики узелковых образований ЩЖ. Первая комбинация, состоящая из 14 и 2 микроРНК, позволяет, согласно двухстороннему классификатору с вероятностью от 0 до 1, получить ответ на один из поставленных вопросов: а) фолликулярная неоплазия (аденома или карцинома) или норма; б) фолликулярная аденома или норма и в) фолликулярная карцинома или норма. Вторая комбинация, состоящая из 2 и нескольких дополнительных из 4-й группы в 59 микроРНК, позволяет различить сильно агрессивную фолликулярную карциному, склонную к образованию метастазов, и минимально агрессивную фолликулярную карциному ЩЖ.There is a method for determining thyroid neoplasms based on a combination of real-time PCR (qRT-PCR) and a microchip according to the classification of follicular thyroid neoplasia [5]. The method consists in measuring the expression of 4 miRNA groups to improve the preoperative diagnosis of thyroid nodules. The first combination, consisting of 14 and 2 miRNAs, allows, according to a two-sided classifier with a probability from 0 to 1, to get an answer to one of the questions posed: a) follicular neoplasia (adenoma or carcinoma) or norm; b) follicular adenoma or norm; and c) follicular carcinoma or norm. The second combination, consisting of 2 and several additional ones from the 4th group of 59 miRNAs, allows us to distinguish between highly aggressive follicular carcinoma, prone to metastases, and minimally aggressive follicular carcinoma of the thyroid gland.
Недостатками известного способа являются сложность, громоздкость, дороговизна, ограниченные функциональные возможности, поскольку классификатор служит для распознавания в основном злокачественного и доброкачественного подтипов фолликулярного РЩЖ. Кроме того, использование микрочипов (технология microarray) дает практически на порядок менее точные результаты, чем метод ПНР в реальном времени.The disadvantages of this method are the complexity, bulkiness, high cost, limited functionality, because the classifier is used to recognize mainly malignant and benign subtypes of follicular thyroid cancer. In addition, the use of microchips (microarray technology) gives almost an order of magnitude less accurate results than the real-time PNR method.
Наиболее близким к заявляемому способу - прототипом является способ определения новообразований ЩЖ путем оценки экспрессии микроРНК [6], заключающийся в следующем. Образцы опухолевой ткани ЩЖ получали из фиксированных формалином и залитых парафином блоков (слайдов), хранимых более 10 лет. Из образцов опухолевой ткани ЩЖ выделяли микроРНК. Для получения кДНК проводили обратную транскрипцию не менее чем 500 нг РНК с использованием TaqMan микроРНК Kit (Applied Biosystems). После чего проводили измерение экспрессии микроРНК методом количественной ПНР в реальном времени с использованием специфических праймеров и зондов TaqMan для человеческих микроРНК.Closest to the claimed method, the prototype is a method for determining thyroid neoplasms by evaluating miRNA expression [6], which consists in the following. Thyroid tumor tissue samples were obtained from formalin-fixed and paraffin-embedded blocks (slides) stored for more than 10 years. MicroRNA was isolated from thyroid tumor tissue samples. To obtain cDNA, at least 500 ng of RNA was reverse transcribed using the TaqMan microRNA Kit (Applied Biosystems). After that, the expression of miRNA was measured by quantitative PNR in real time using specific primers and TaqMan probes for human miRNAs.
При этом измеряли уровень экспрессии хотя бы по одной микроРНК из каждой группы (46 специфических микроРНК - 1-я группа и 13 микроРНК - 2-я группа) у отдельного пациента и далее проводили сравнение с известным уровнем экспрессии микроРНК, установленным для случаев отсутствия неоплазии ЩЖ (контроль). Аналогично проводили сравнение уровней экспрессии по 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40 микроРНК из первой группы и 13 микроРНК из второй группы и также проводили сравнение уровней экспрессии микроРНК в обеих группах. На основании анализа индивидуальных уровней экспрессии измеряемых микроРНК устанавливали диагноз или делали прогноз вероятности возникновения злокачественного новообразования и предлагали соответствующее лечение. В анализ входил поиск тех специфических микроРНК, которые экспрессировались только в опухолях определенного типа, а именно для фолликулярного рака - это 5, для фолликулярной аденомы - 3, для папиллярного рака - 8 и для незлокачественных неоплазии - это 5 индивидуальных и различных микроРНК. Строили диаграмму Венна, представляющую собой частично перекрывающиеся овалы, символизирующие для конкретного типа опухоли экспрессируемые микроРНК с уровнем значимости p<0.01. Неперекрывающиеся между различными типами опухолей участки и соответствовали количеству специфических для данного типа диагностических микроРНК.At the same time, the expression level was measured for at least one miRNA from each group (46 specific miRNAs — 1st group and 13 miRNAs — 2nd group) in an individual patient, and then they were compared with the known level of miRNA expression established for cases of absence of thyroid neoplasia (the control). Similarly, expression levels of 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, or 40 miRNAs from the first group and 13 miRNAs from the second group were compared, and miRNA expression levels in both groups were also compared. Based on the analysis of individual expression levels of the measured miRNAs, a diagnosis was made or a prognosis was made for the likelihood of a malignant neoplasm and appropriate treatment was offered. The analysis included the search for those specific miRNAs that were expressed only in tumors of a certain type, namely for follicular cancer — 5, for follicular adenoma — 3, for papillary cancer — 8, and for non-malignant neoplasia — 5 individual and different miRNAs. A Venn diagram was constructed, which was partially overlapping ovals, symbolizing expressed microRNAs for a particular type of tumor with a significance level of p <0.01. Sections that did not overlap between different types of tumors corresponded to the number of diagnostic miRNAs specific for this type.
Недостатками известного способа являются большая сложность и длительность, громоздкость и дороговизна для массового применения в клинической онкологии. Известный способ неприемлем для быстрого анализа биопсийного или операционного материала и быстрой постановки диагноза больному до или во время операции.The disadvantages of this method are the great complexity and duration, cumbersome and high cost for mass use in clinical oncology. The known method is unacceptable for quick analysis of biopsy or surgical material and quick diagnosis of the patient before or during surgery.
Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является упрощение и сокращение длительности способа определения новообразований ЩЖ.The problem to which the present invention is directed, is to simplify and reduce the duration of the method for determining thyroid tumors.
Технический результат: упрощение и сокращение длительности способа.Effect: simplification and reduction of the duration of the method.
Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.The problem is achieved by the proposed method, which consists in the following.
Забор образца опухолевой ткани ЩЖ и образца прилежащей неизмененной ткани железы в качестве контроля осуществляют при операции или с помощью тонкоигольной аспирационной пункционной биопсии (ТАПБ), выделяют микроРНК из образцов любым из известных способов. Для получения копии кДНК проводят реакцию обратной транскрипции с соответствующими праймерами (амплификация), полученную кДНК сразу используют в качестве матрицы для проведения ПЦР.A sample of thyroid tumor tissue and a sample of adjacent unchanged glandular tissue were taken as a control during surgery or using a fine-needle aspiration puncture biopsy (TAPB), miRNAs were isolated from samples using any of the known methods. To obtain a copy of cDNA, a reverse transcription reaction is carried out with the corresponding primers (amplification), the obtained cDNA is immediately used as a template for PCR.
Далее проводят измерение уровня экспрессии пяти микроРНК, а именно микроРНК-21, -221, -222, -155, -205 в опухолевых клетках в сравнении с нормальными тканями методом ПНР в реальном времени (qRT-PCR платформа) стандартным способом [7]. В качестве внутреннего контроля используют малую РНК U6, которая характеризуется стабильной экспрессией.Next, they measure the expression level of five miRNAs, namely miRNA-21, -221, -222, -155, -205 in tumor cells in comparison with normal tissues using the real-time PNR method (qRT-PCR platform) in a standard way [7]. Small internal RNA U6, which is characterized by stable expression, is used as internal control.
Сочетание времени и температуры на каждом этапе протокола реакции подбирают специально для эффективной реакции с используемыми олигонуклеотидами. Использованные праймеры и зонды приведены в таблице 1.The combination of time and temperature at each stage of the reaction protocol is selected specifically for an effective reaction with the oligonucleotides used. Used primers and probes are shown in table 1.
Оценку изменения уровня экспрессии диагностических микроРНК в опытном образце по отношению к контрольному (т.е. опухолевой и нормальной ткани ЩЖ) вычисляют по стандартной формуле [7]:An estimate of the change in the expression level of diagnostic miRNAs in the test sample relative to the control (ie, tumor and normal thyroid tissue) is calculated using the standard formula [7]:
В том случае, если изменение уровня экспрессии диагностических микроРНК-21, -221, -222, -155, -205 не превышает 4-кратного значения как в сторону повышения, так и в сторону понижения экспрессии, т.е. находится в диапазоне [-4; +4], делают заключение о доброкачественном новообразовании, а если уровни экспрессии вышеназванных микроРНК в опухоли при сравнении с нормальной тканью органа отличаются более чем в 4 раза, то делают заключение о злокачественном новообразовании.In that case, if the change in the expression level of diagnostic miRNA-21, -221, -222, -155, -205 does not exceed a 4-fold value both upward and downward expression, i.e. is in the range [-4; +4], make a conclusion about a benign neoplasm, and if the expression levels of the aforementioned miRNAs in a tumor, when compared with normal organ tissue, differ by more than 4 times, then they make a conclusion about a malignant neoplasm.
Предлагаемый способ позволяет просто, быстро и точно идентифицировать и различать доброкачественные (опухолеподобные поражения - коллоидный зоб, аутоиммунный тиреоидит и фолликулярная аденома) и злокачественные (папиллярный рак) новообразования ЩЖ человека.The proposed method allows you to simply, quickly and accurately identify and distinguish between benign (tumor-like lesions - colloid goiter, autoimmune thyroiditis and follicular adenoma) and malignant (papillary cancer) neoplasms of the human thyroid gland.
Определяющим отличием заявляемого способа, по сравнению с прототипом, является то, что измеряют уровни экспрессии специально подобранных пяти микроРНК (микроРНК-21, -221, -222, -155, -205) в опухолевых образцах в сравнении с нормальными тканями ЩЖ, что позволяет упростить способ, вследствие подбора минимально значимого количества диагностируемых микроРНК сократить его длительность (5-6 часов или один рабочий день, вместо как минимум трех рабочих дней по прототипу). Выбранные для анализа онкогенные и онкосупрессорные микроРНК являются оптимальными и достаточными, поскольку первые три микроРНК относятся к онкогенным, повышенная экспрессия которых в раковых клетках нарушает работу генов-супрессоров опухоли, стимулируя развитие раковых клеток; микроРНК-155 тесно связана с иммунной системой, состояние которой важно учитывать при онкологическом заболевании, а микроРНК-205 является онкосупрессорной микроРНК в норме, т.е. сдерживает возникновение и рост опухоли, ее дерегуляция и снижение экспрессии свидетельствуют об активации онкогенов и росте опухоли.The defining difference of the proposed method, compared with the prototype, is that they measure the expression levels of specially selected five miRNAs (miRNA-21, -221, -222, -155, -205) in tumor samples in comparison with normal thyroid tissue, which allows to simplify the method, due to the selection of the minimum significant number of diagnosed miRNAs, reduce its duration (5-6 hours or one working day, instead of at least three working days for the prototype). The oncogenic and oncosuppressive miRNAs selected for analysis are optimal and sufficient, since the first three miRNAs are oncogenic, the increased expression of which in cancer cells disrupts the tumor suppressor genes, stimulating the development of cancer cells; miRNA-155 is closely related to the immune system, the state of which is important to consider in cancer, and miRNA-205 is normal oncosuppressive miRNA, i.e. inhibits the onset and growth of the tumor, its deregulation and decreased expression indicate activation of oncogenes and tumor growth.
Предварительно, для определения и обоснования диагностических значений микроРНК был проведен сравнительный анализ уровней экспрессии пяти человеческих микроРНК: микроРНК-21, микроРНК-221, микроРНК-222, микроРНК-155 и микроРНК-205 в 67 образцах трех групп новообразований ЩЖ: ОПП - 15, фолликулярная аденома - 26 и папиллярный рак - 26 образцов. Материал сопровождался официальным заключением гистологического анализа.Previously, to determine and justify the diagnostic values of miRNAs, a comparative analysis of the expression levels of five human miRNAs was performed: miRNA-21, miRNA-221, miRNA-222, miRNA-155 and miRNA-205 in 67 samples of three thyroid tumor groups: AKP - 15, follicular adenoma - 26 and papillary cancer - 26 samples. The material was accompanied by the official conclusion of the histological analysis.
При проведении сравнительного анализа уровней экспрессии 5 онкогенных и онкосупрессорных микроРНК в разных типах опухолей ЩЖ человека - опухолеподобных поражениях (ОПП), доброкачественных и злокачественных новообразованиях, выявлены характерные для каждого вида новообразования уровни экспрессии микроРНК. Определение вариации уровня экспрессии каждой микроРНК в нормальных клетках ЩЖ выявило, что уровень медианных значений колебался в пределах не более 4 единиц как в сторону повышения, так и понижения экспрессии.When conducting a comparative analysis of the expression levels of 5 oncogenic and oncosuppressive miRNAs in different types of human thyroid tumors - tumor-like lesions (AKI), benign and malignant neoplasms, the miRNA expression levels characteristic of each neoplasm were revealed. Determination of the variation in the expression level of each miRNA in normal thyroid cells revealed that the level of median values fluctuated within no more than 4 units both in the direction of increasing and decreasing expression.
На фиг.1 представлены уровни экспрессии микроРНК-21, -221, -222, -155, -205 в трех исследуемых выборках. Для удобства визуального восприятия материала в виде графиков рассчитанные по формуле данные 0<Соп/Снорм<1 представлены в виде 1:Соп/Снорм со знаком «минус». А данные Соп/Снорм>1 представлены на графиках со знаком «плюс».Figure 1 shows the expression levels of miRNA-21, -221, -222, -155, -205 in the three studied samples. For the convenience of visual perception of the material in the form of graphs, the data calculated according to the
Из фиг.1 видно, что все три группы - ОПП, фолликулярная аденома и папиллярный рак, имеют различающиеся уровни экспрессии. ОПП и фолликулярная аденома по всем микроРНК имеют пониженные медианные значения, незначительные интерквартильные размахи, характеризуются небольшой вариацией уровня экспрессии микроРНК, что совпадает со значениями для нормальных клеток. Злокачественное новообразование ЩЖ - папиллярная карцинома, характеризуется повышением и более значительным интерквартильным размахом по трем онкогенным микроРНК: -21, -221 и -222, тогда как изменения микроРНК-155 и микроРНК-205 менее выражены, но отличаются по своим медианам от ОПП и фолликулярных аденом. Статистический анализ с помощью U-критерия Манна-Уитни подтвердил наличие достоверных отличий (p<0.05) группы образцов с карциномами от случаев с опухолеподобными образованиями и аденомами.Figure 1 shows that all three groups — AKI, follicular adenoma, and papillary cancer, have different levels of expression. AKI and follicular adenoma for all miRNAs have lower median values, insignificant interquartile ranges, are characterized by a slight variation in the level of miRNA expression, which coincides with the values for normal cells. Malignant neoplasm of the thyroid gland - papillary carcinoma, is characterized by an increase and a more significant interquartile range of three oncogenic miRNAs: -21, -221 and -222, while changes in miRNA-155 and miRNA-205 are less pronounced, but differ in their medians from AKP and follicular adenomas. Statistical analysis using the Mann-Whitney U-test confirmed the presence of significant differences (p <0.05) in the group of samples with carcinomas from cases with tumor-like formations and adenomas.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.The invention is illustrated by the following examples of specific performance of the method.
Пример 1.Example 1
У пациента №101 во время операции были взяты образцы ткани опухоли щитовидной железы и прилежащей неизмененной ткани железы для контроля. Выделение микроРНК из образцов ткани проводили с помощью набора «РеалБест экстракция 100» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск) в соответствии с инструкцией производителя. Реакцию обратной транскрипции для получения копии к ДНК проводили в объеме 50 мкл. Использовали готовые реакционные смеси «РеалБест Мастер микс ОТ» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск) с добавлением 0.5 мкМ соответствующего праймера для обратной транскрипции. Реакцию проводили в течение 30 мин при 42°С, после чего реакционную смесь инкубировали 2 мин при 95°С для инактивации обратной транскриптазы. Полученную реакционную смесь, содержащую кДНК, в объеме 3 мкл сразу использовали в качестве матрицы для проведения ПЦР.Patient No. 101 during the operation took tissue samples of the thyroid tumor and adjacent unchanged gland tissue for control. MicroRNA was isolated from tissue samples using the
Измерение уровней экспрессии микроРНК-21, -221, -222, -155, -205 проводили методом ПЦР в реальном времени на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, США). В качестве контроля использовали малую РНК U6. Использовали праймеры и зонды, приведенные в таблице 1. Реакцию проводили в объеме 50 мкл с использованием готовых реакционных смесей «РеалБест Мастер микс» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск) с добавлением по 0.5 мкМ раствора прямого и обратного праймеров и 0.25 мкМ раствора зонда. Протокол реакции ПЦР: предварительный прогрев при 94°C - 2 мин, 50 основных циклов: денатурация при 94°C - 10 сек, отжиг праймеров и элонгация: 60°С - 20 сек.Measurement of expression levels of miRNA-21, -221, -222, -155, -205 was carried out by real-time PCR on a CFX96 amplifier (Bio-Rad Laboratories, USA). Small RNA U6 was used as a control. The primers and probes shown in Table 1 were used. The reaction was carried out in a volume of 50 μl using the prepared reaction mixtures RealBest Master Mix (CJSC Vector-Best, Novosibirsk) with the addition of 0.5 μM solution of forward and reverse primers and 0.25 μM solution a probe. PCR reaction protocol: preliminary heating at 94 ° C - 2 min, 50 main cycles: denaturation at 94 ° C - 10 sec, annealing of primers and elongation: 60 ° C - 20 sec.
Изменение уровней экспрессии микроРНК в опытном образце (fold change), по отношению к контрольному (во сколько раз), вычисляли по стандартной формуле:The change in miRNA expression levels in the experimental sample (fold change), relative to the control (by how many times), was calculated by the standard formula:
где Е - эффективность реакции амплификации микроРНК (EmiR) или внутреннего контроля U6 (EU6); Ct - пороговый цикл реакции. Все значения Ct определяли как для опухоли (оп), так и для нормы (норм).where E is the efficiency of the miRNA amplification reaction (EmiR) or internal control U6 (E U6 ); Ct is the threshold reaction cycle. All Ct values were determined both for the tumor (op) and for the norm (s).
Результаты, полученные по пациенту №101, представлены на фиг.2. Дооперационный диагноз пациента №101 по ТАПБ - ОПП (диффузный токсический зоб правой доли ЩЖ). Диагноз подтвержден гистологически на операционном материале. Измерения пяти микроРНК показали, что изменения уровней экспрессии микроРНК варьируют в пределах [-2; +2], что соответствует незлокачественному образованию.The results obtained for patient No. 101, are presented in figure 2. The preoperative diagnosis of patient No. 101 according to TAPB - AKI (diffuse toxic goiter of the right lobe of the thyroid gland). The diagnosis is histologically confirmed on surgical material. Measurements of five miRNAs showed that changes in miRNA expression levels vary within [-2; +2], which corresponds to a non-malignant formation.
Пример 2.Example 2
У пациента №80 во время операции были взяты образцы ткани опухоли щитовидной железы и прилежащей неизмененной ткани железы для контроля. Способ определения новообразований ЩЖ осуществляли аналогично примеру 1. Результаты, полученные по пациенту №80, представлены на фиг.3.Patient # 80 during the operation took tissue samples of the thyroid tumor and adjacent unchanged gland tissue for control. The method for determining thyroid neoplasms was carried out analogously to example 1. The results obtained for patient No. 80 are presented in figure 3.
Дооперационный диагноз пациента №80 по ТАПБ - Аденома Гюртле, диагноз по гистологии операционного материала - атипическая фолликулярная аденома и токсический зоб, размер 2.0 см. Измерения пяти микроРНК показали, что изменения уровней экспрессии по пяти микроРНК находятся в пределах [-2.5; +4], что соответствует доброкачественному образованию.The preoperative diagnosis of patient No. 80 according to TAPB is Gürtle Adenoma, the histological diagnosis of surgical material is atypical follicular adenoma and toxic goiter, size 2.0 cm. Measurements of five miRNAs showed that changes in expression levels for five miRNAs are within [-2.5; +4], which corresponds to a benign education.
Пример 3.Example 3
У пациента №59 во время операции были взяты образцы ткани опухоли щитовидной железы и прилежащей неизмененной ткани железы для контроля. Все методические процедуры обработки и определения материала проведены аналогично примеру 1. Результаты, полученные по пациенту №59, представлены на фиг.4.Patient No. 59 during the operation took tissue samples of a thyroid tumor and adjacent unchanged gland tissue for control. All methodological procedures for processing and determining the material were carried out analogously to example 1. The results obtained for patient No. 59 are presented in figure 4.
У пациента №59 по ТАПБ выявлен папиллярный рак, диагноз подтвержден гистологически - T1mN0M0. Измерения по пяти микроРНК показали, что изменения уровней экспрессии диагностируемых микроРНК в ткани опухоли в 12-200 раз выше, чем в нормальной ткани, т.о. изменения в диапазоне [+12; +200], что соответствует злокачественному образованию (папиллярный рак).In patient No. 59, TAPB revealed papillary cancer, the diagnosis was histologically confirmed - T1mN0M0. Measurements of five miRNAs showed that changes in the levels of expression of diagnosed miRNAs in tumor tissue are 12-200 times higher than in normal tissue, i.e. changes in the range [+12; +200], which corresponds to a malignant formation (papillary cancer).
Пример 4.Example 4
Провели сравнение изменений уровней экспрессии пяти микроРНК в разных долях ЩЖ одного пациента при злокачественном опухолевом поражении только одной из долей. Пациент дважды прооперирован с интервалом в 6 мес. (образцы №7 и №117, соответственно). В обоих случаях во время операции были взяты образцы ткани опухоли щитовидной железы и прилежащей неизмененной ткани железы для контроля. Все методические процедуры обработки и измерения уровней экспрессии пяти микроРНК проведены аналогично примеру 1. Полученные результаты показаны на фиг.5, где белые столбики - норма, нет злокачественного образования в правой доле ЩЖ, серые - папиллярный рак в левой доле ЩЖ.We compared the changes in the expression levels of five miRNAs in different thyroid lobes of one patient with malignant tumor damage in only one of the lobes. The patient was operated twice with an interval of 6 months. (samples No. 7 and No. 117, respectively). In both cases, tissue samples of the thyroid tumor and adjacent unmodified gland tissue were taken during the operation for control. All methodological procedures for processing and measuring the expression levels of five miRNAs were carried out analogously to example 1. The results are shown in Fig. 5, where white bars are the norm, there is no malignant tumor in the right lobe of the thyroid gland, gray - papillary cancer in the left lobe of the thyroid gland.
В первом случае (№7) по результатам ТАПБ было вынесено заключение - подозрение на рак, показание - хирургическое удаление левой доли ЩЖ. Гистологическое заключение операционного материала - папиллярный рак, T1mN0M0, размер 1 см. По показаниям проведена повторная операция через 6 месяцев - удаление правой доли железы. Гистологическое заключение - отсутствие новообразований.In the first case (No. 7), according to the results of TAPB, a conclusion was made - suspicion of cancer, indication - surgical removal of the left thyroid lobe. The histological conclusion of the surgical material is papillary cancer, T1mN0M0,
При измерении уровней экспрессии пяти микроРНК в левой доле ЩЖ (№7) выявлены изменения в 8-16 раз, что подтверждает злокачественность новообразования. В правой доле (№117) изменение уровней экспрессии микроРНК не превышает двукратного увеличения (диапазон [0; +2]), что указывает на отсутствие злокачественных изменений и соответствует норме. Данный пример показывает, что пациенту проведена неоправданная операция: правая доля железы могла быть сохранена, т.к. гистологическое послеоперационное заключение и анализ экспрессии пяти микроРНК показали, что правая доля железы не была поражена раком. Достаточно было провести дооперационное измерение уровней экспрессии микроРНК, используя ТАПБ правой доли ЩЖ.When measuring the expression levels of five microRNAs in the left thyroid lobe (No. 7), changes of 8–16 times were revealed, which confirms the malignancy of the neoplasm. In the right lobe (No. 117), the change in microRNA expression levels does not exceed a twofold increase (range [0; +2]), which indicates the absence of malignant changes and is consistent with the norm. This example shows that the patient underwent an unjustified operation: the right lobe of the gland could be saved, because histological postoperative findings and analysis of the expression of five miRNAs showed that the right lobe of the gland was not affected by cancer. It was enough to conduct a preoperative measurement of miRNA expression levels using TAPB of the right thyroid lobe.
Заявляемый способ позволит просто, быстро и точно определять новообразования ЩЖ до операции, используя ткань опухоли, полученную с помощью ТАПБ или сразу после операции, чтобы подтвердить или скорректировать результаты, полученные при гистологическом и цитологическом исследовании, выбрать правильную тактику последующего лечения пациента.The inventive method will allow you to simply, quickly and accurately determine thyroid neoplasms before surgery, using tumor tissue obtained using TAPB or immediately after surgery to confirm or adjust the results obtained by histological and cytological examination, choose the right tactics for subsequent treatment of the patient.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИINFORMATION SOURCES
1. Чиссов В.И., Старинский В.В. Петрова Г.В. Злокачественные новообразования в России в 2003 г. (заболеваемость и смертность). - М., 2005. - 228 с.1. Chissov V.I., Starinsky V.V. Petrova G.V. Malignant neoplasms in Russia in 2003 (morbidity and mortality). - M., 2005 .-- 228 p.
2. Румянцев П.О., Ильин А.А., Румянцева У.В., Саенко В.А. Рак щитовидной железы. / М.: ГЕОТАР-Медиа, 2009. - 448 с.2. Rumyantsev P.O., Ilyin A.A., Rumyantsev U.V., Saenko V.A. Thyroid cancer. / M.: GEOTAR-Media, 2009 .-- 448 p.
3. Богин Ю.Н. Комплексная экспресс-диагностика заболеваний щитовидной железы / Ю.Н. Богин и др. // Методические рекомендации. - М., 1992. - 175 с.3. Bogin Yu.N. Integrated rapid diagnosis of thyroid diseases / Yu.N. Bogin et al. // Methodical recommendations. - M., 1992. - 175 p.
4. Iorio M.V., Croce СМ. MicroRNA dysregulation in cancer: diagnostics, monitoring and therapeutics. A comprehensive review// EMBO Mol Med - 2012. - №4 - P.143-159.4. Iorio M.V., Croce CM. MicroRNA dysregulation in cancer: diagnostics, monitoring and therapeutics. A comprehensive review // EMBO Mol Med - 2012. - No. 4 - P.143-159.
5. Nielsen F.C., Rossing M., Bennedbaek F.N. Microma classification of thyroid follicular neoplasia. - Patent WO 2011154008 A1, on. 25.12.2011.5. Nielsen F.C., Rossing M., Bennedbaek F.N. Microma classification of thyroid follicular neoplasia. - Patent WO 2011154008 A1, on. 12/25/2011.
6. Soldin O. P., Gusev Y., Marian C. Microma expression profiling of thyroid cancer. - Patent WO 2013066678 A1, on. 10.05.2013.6. Soldin O. P., Gusev Y., Marian C. Microma expression profiling of thyroid cancer. - Patent WO 2013066678 A1, on. 05/10/2013.
7. Pfaffl M.W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR //Nucleic Acids Res. - 2001. - V.29. - №9. - С45.7. Pfaffl M.W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR // Nucleic Acids Res. - 2001. - V.29. - No. 9. - C45.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014105810/15A RU2548773C1 (en) | 2014-02-17 | 2014-02-17 | Method for detecting benign and malignant new growths of human thyroid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014105810/15A RU2548773C1 (en) | 2014-02-17 | 2014-02-17 | Method for detecting benign and malignant new growths of human thyroid |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2548773C1 true RU2548773C1 (en) | 2015-04-20 |
Family
ID=53289483
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014105810/15A RU2548773C1 (en) | 2014-02-17 | 2014-02-17 | Method for detecting benign and malignant new growths of human thyroid |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2548773C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2705110C1 (en) * | 2019-04-10 | 2019-11-06 | Государственное бюджетное учреждение здравоохранения "Краевая клиническая больница N2" Министерства здравоохранения Краснодарского края | Method for differential diagnosis of thyroid neoplasms |
| RU2757347C1 (en) * | 2021-02-08 | 2021-10-13 | Сергей Евгеньевич Титов | Method for differential diagnosis of nodular formations of the human thyroid gland |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013063544A1 (en) * | 2011-10-27 | 2013-05-02 | Asuragen, Inc. | Mirnas as diagnostic biomarkers to distinguish benign from malignant thyroid tumors |
| WO2013066678A1 (en) * | 2011-10-26 | 2013-05-10 | Georgetown University | Microrna expression profiling of thyroid cancer |
| US8568971B2 (en) * | 2004-05-28 | 2013-10-29 | Asuragen, Inc. | Methods and compositions involving microRNA |
-
2014
- 2014-02-17 RU RU2014105810/15A patent/RU2548773C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8568971B2 (en) * | 2004-05-28 | 2013-10-29 | Asuragen, Inc. | Methods and compositions involving microRNA |
| WO2013066678A1 (en) * | 2011-10-26 | 2013-05-10 | Georgetown University | Microrna expression profiling of thyroid cancer |
| WO2013063544A1 (en) * | 2011-10-27 | 2013-05-02 | Asuragen, Inc. | Mirnas as diagnostic biomarkers to distinguish benign from malignant thyroid tumors |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| КАРПИНСКАЯ Е.В. и др. Применение microRNA в диагностике рака щитовидной железы. Материалы Первого Конгресса Общества специалистов по опухолям головы и шеи. Москва, 18-19 октября 2012 г. С.17-18 [Найдено 20.11.2014] [он-лайн]. Найдено из Интернет: URL: http://www.hnonco.ru/.uploads/press/514/tezis_i_201210.file.pdf * |
| ШЕВЧЕНКО С.П. Современные клинические и молекулярно-генетические подходы к диагностике и лечению рака щитовидной железы. Автореф. дисс. доктора мед. наук. Москва , 10.01.2013, 258 c. [Найдено 20.11.2014] [он-лайн]. Найдено из Интернет: URL: http://medical-diss.com/medicina/sovremennye-klinicheskie-i-molekulyarno-geneticheskie-podhody-k-diagnostike-i-lecheniyu-raka-schitovidnoy-zhelezy. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2705110C1 (en) * | 2019-04-10 | 2019-11-06 | Государственное бюджетное учреждение здравоохранения "Краевая клиническая больница N2" Министерства здравоохранения Краснодарского края | Method for differential diagnosis of thyroid neoplasms |
| RU2757347C1 (en) * | 2021-02-08 | 2021-10-13 | Сергей Евгеньевич Титов | Method for differential diagnosis of nodular formations of the human thyroid gland |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tsai et al. | Circulating microRNA-196a/b are novel biomarkers associated with metastatic gastric cancer | |
| US11434536B2 (en) | Diagnostic test for predicting metastasis and recurrence in cutaneous melanoma | |
| CN106148538B (en) | MicroRNA marker group and its preparing the application in evaluating breast cancer chemosensitivity kit | |
| CN115537466A (en) | miRNA marker combination and kit for detecting gastric cancer | |
| EP3978631A1 (en) | Squamous cell cancer diagnostic or prognosis prediction marker and use thereof | |
| RU2548773C1 (en) | Method for detecting benign and malignant new growths of human thyroid | |
| US20150322533A1 (en) | Prognosis of breast cancer patients by monitoring the expression of two genes | |
| CN109182524A (en) | MiRNA combination marker and its application of a kind of auxiliary diagnosis cervical carcinoma and its precancerous lesion | |
| CN103911436A (en) | Serum/plasma miRNA marker for early diagnosis of noncardiac gastric carcinoma and applications thereof | |
| Zibadi et al. | Surgical and molecular pathology of barrett esophagus | |
| CN102686745B (en) | Method for analyzing cervical lymph node metastasis, and tumor marker for head and neck cancer | |
| JP6860148B2 (en) | Foreseeing the benefits of treatment | |
| CN111172285A (en) | miRNA group for early diagnosis and/or prognosis monitoring of pancreatic cancer and application thereof | |
| JP2022514838A (en) | Health risk assessment method | |
| KR102602132B1 (en) | Composition for diagnosing metastasis of cervical cancer | |
| CN104774916B (en) | Biomarker combination used for detection of chemotherapy curative effect and/or prognosis of metastatic colorectal cancer and application thereof | |
| JP7024957B2 (en) | Methods for predicting the presence or absence of metastatic metastasis of colorectal cancer and kits used for it | |
| Trirahmanto et al. | Plasma MicroRNA-200c as A Prognostic Biomarker for Epithelial Ovarian Cancer | |
| WO2022031670A1 (en) | Methods of diagnosing and treating patients with pigmented skin lesions | |
| RU2560711C1 (en) | Differential diagnostic technique for melanocytic skin growths | |
| Pectasides et al. | Predictive biomarkers for adjuvant therapy in gastric adenocarcinoma | |
| CN103773761A (en) | Gastric cancer detection serum/plasma miRNA (micro ribonucleic acid) marker and application thereof | |
| Gibson et al. | B63 MOLECULAR INSIGHTS INTO LUNG CANCER II: Mutational Analysis Of Lung Adenocarcinomas Compared To The Corresponding Lymph Node Metastases | |
| Meister et al. | D6-02: Patient-to-patient and tumor sub-sample variations of gene expression in NSCLC | |
| AL-Temimi | Circulating microRNA-182 overexpression as a biomarker for breast cancer |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160218 |