RU2542404C1 - Method for determining functional activity of human complement component c4 - Google Patents

Method for determining functional activity of human complement component c4 Download PDF

Info

Publication number
RU2542404C1
RU2542404C1 RU2013149248/15A RU2013149248A RU2542404C1 RU 2542404 C1 RU2542404 C1 RU 2542404C1 RU 2013149248/15 A RU2013149248/15 A RU 2013149248/15A RU 2013149248 A RU2013149248 A RU 2013149248A RU 2542404 C1 RU2542404 C1 RU 2542404C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
component
activity
living
complement component
complement
Prior art date
Application number
RU2013149248/15A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Леонид Васильевич Козлов
Ольга Николаевна Кулешина
Original Assignee
Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека filed Critical Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Priority to RU2013149248/15A priority Critical patent/RU2542404C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2542404C1 publication Critical patent/RU2542404C1/en

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

FIELD: medicine.
SUBSTANCE: cell suspension of Tetrahymena pyriformis, a test sample and R4 agent representing a human blood serum with selectively deactivated component C4 by hydrazine hydrate processing are introduced into measuring cells of automated living infusorians counting device to determine a living cell count a minute. A progressing decrease of the living cell count through time is used to calculate a first-order reaction rate constant with determining a slope of living cell count log and time dependence in the period of the observed decrease of the living cell count. The calculated decrease rate constant through time is linearly dependent on component C4 activity.
EFFECT: invention is effective for diagnosing a number of component C4 activity related diseases.
2 cl, 1 dwg, 1 ex

Description

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности комплемента в сыворотке крови организма при диагностике ряда заболеваний.The invention relates to medical immunology, and in particular to methods for determining the functional activity of complement in the blood serum of an organism in the diagnosis of a number of diseases.

Традиционный способ определения функциональной активности комплемента человека в сыворотке крови основан на его способности лизировать клетки-мишени, каковыми являются эритроциты барана, сенсибилизированные кроличьими антителами к поверхностным антигенам. Для определения функциональной активности отдельных компонентов такой гемолиз проводят с образцами сыворотки в количествах, недостаточных для осуществления самостоятельного лизиса, но в присутствии реагента RX (где X - тестируемый компонент), характеризующийся отсутствием тестируемого компонента, но избыточным содержанием остальных компонентов, необходимых для осуществления лизиса. Размер фиксируемого гемолиза в этом случае определяется количеством функционально активного тестируемого компонента, находящегося в образце сыворотки, взятой в количествах, недостаточных для осуществления самостоятельного лизиса [1]. Для определения функциональной активности компонента С4 в качестве реагента R4 используется пул не менее 10 сывороток здоровых доноров, обработанный гидразингидратом, необратимо инактивирующим компонент С4 [1].The traditional method for determining the functional activity of human complement in serum is based on its ability to lyse target cells, such as sheep erythrocytes sensitized by rabbit antibodies to surface antigens. To determine the functional activity of the individual components, such hemolysis is carried out with serum samples in quantities insufficient for independent lysis, but in the presence of RX reagent (where X is the test component), characterized by the absence of the tested component, but with an excess content of the remaining components necessary for lysis. The size of the fixed hemolysis in this case is determined by the amount of a functionally active test component located in a serum sample taken in amounts insufficient for independent lysis [1]. To determine the functional activity of component C4, a pool of at least 10 healthy donor sera treated with hydrazine hydrate irreversibly inactivating component C4 is used as R4 reagent [1].

Недостатком гемолитического метода является необходимость наличия сенсибилизированных эритроцитов барана, что сопряжено с необходимостью содержания животного или приобретения свежей бараньей крови.The disadvantage of the hemolytic method is the need for sensitized sheep erythrocytes, which is associated with the need to keep the animal or purchase fresh sheep blood.

Преодолеть эти недостатки можно, используя другую мишень для тестирования активности комплемента. Из литературы известно [2], что комплемент морской свинки способен обездвиживать инфузории Tetrahymena pyriformis и при этом не требуется дополнительной сенсибилизации микроорганизма антителами. В работе, однако, не было изучено, какой из наблюдаемых эффектов: набухание микроорганизма, обездвиживание или дальнейший лизис мог бы послужить в дальнейшем критерием для определения активности комплемента. Кроме того, не было известно, можно ли такой подход использовать для определения активности отдельных компонентов комплемента. Получение необходимых для осуществления способа клеток Tetrahymena pyriformis существенно удобнее и дешевле, чем получение или приобретение сенсибилизированных эритроцитов барана.These deficiencies can be overcome by using another target to test complement activity. It is known from the literature [2] that the complement of guinea pigs is capable of immobilizing the ciliates of Tetrahymena pyriformis and does not require additional sensitization of the microorganism with antibodies. However, the study did not study which of the observed effects: swelling of the microorganism, immobilization, or further lysis could serve as a further criterion for determining complement activity. In addition, it was not known whether this approach can be used to determine the activity of individual components of complement. Obtaining the necessary for the implementation of the method of Tetrahymena pyriformis cells is much more convenient and cheaper than obtaining or purchasing sensitized sheep erythrocytes.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа определения функциональной активности компонента С4 комплемента человека с использованием доступной мишени для действия активного комплемента, не требующей дополнительной сенсибилизации антителами.The objective of the claimed invention is to develop a method for determining the functional activity of component C4 of a human complement using an accessible target for the action of active complement, which does not require additional sensitization with antibodies.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения функциональной активности компонента С4 комплемента человека по измерению его воздействия в присутствии реагента R4 на инфузории Tetrahymena pyriformis, с использованием прибора для биологических исследований БиоЛаТ-3 [3]. Было обнаружено, что при действии комплемента на инфузории через определенный промежуток времени, зависящий от количества активного комплемента, начинается процесс обездвиживания инфузорий, протекающий со скоростью, также зависящей от количества активного комплемента. Скорость перехода подвижных инфузорий в неподвижные может быть использована для расчета количества функционально активного комплемента.The task is achieved by developing a method for determining the functional activity of the complement component C4 of a person by measuring its effect in the presence of R4 reagent on Tetrahymena pyriformis ciliates using a BioLaT-3 biological research device [3]. It was found that with the action of complement on the ciliates, after a certain period of time, depending on the amount of active complement, the process of immobilization of ciliates begins, proceeding at a speed that also depends on the amount of active complement. The rate of transition of moving infusoria to motionless can be used to calculate the number of functionally active complement.

Способ определения предусматривает внесение в измерительные ячейки прибора суспензии инфузорий в буферном растворе, добавление в ячейки сыворотки крови в необходимом количестве, как источника С4, и реагента R4, как источника остальных, кроме С4, компонентов комплемента, и автоматический циклический подсчет оставшихся подвижными клеток во времени.The method of determination involves introducing into the measuring cells of the device a suspension of ciliates in a buffer solution, adding to the blood serum cells in the required quantity, as a source of C4, and reagent R4, as a source of the complement components other than C4, and automatic cyclic counting of the remaining mobile cells in time .

Метод расчета основан на определении константы скорости гибели клеток, которую удобно рассчитывать по тангенсу угла наклона зависимости логарифма числа подвижных клеток от времени в период наблюдаемого падения числа живых клеток. Величина константы скорости падения числа живых клеток, зависящая от количества активного компонента С4 комплемента, сравнивается с активностью компонента С4 комплемента в пуле не менее 10 сывороток здоровых людей, что выбирается в качестве стандарта. Тем самым достигается определение функциональной активности компонента С4 комплемента методом, пригодным для стандартизации.The calculation method is based on determining the cell death rate constant, which is conveniently calculated from the slope of the logarithm of the number of mobile cells versus time during the period of the observed drop in the number of living cells. The value of the rate constant for the decrease in the number of living cells, depending on the amount of the active component of C4 complement, is compared with the activity of the component C4 of complement in a pool of at least 10 healthy human sera, which is chosen as the standard. Thereby, the determination of the functional activity of the complement component C4 is achieved by a method suitable for standardization.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа определения функциональной активности компонента С4 комплемента человека с использованием доступной мишени для действия комплемента, каковой являются инфузории Tetrahymena pyriformis.The technical result of the claimed invention is the development of a method for determining the functional activity of the complement component C4 of a person using an accessible target for complement action, which are Tetrahymena pyriformis ciliates.

Пример 1. Определение функциональной активности компонента С4 комплемента человека. В измерительные ячейки прибора БиоЛаТ-3 вносят 200 мкл суспензии приблизительно 800 клеток инфузории Tetrahymena pyriformis в вероналовом буферном растворе, pH 7,4, содержащим 0,075 М NaCl, 0,075 мМ Са2+ и 0,25 мМ Mg2+, и 100 мкл того же буфера, содержащего от 1 до 6 мкл испытуемой пробы и от 5 до 15 мкл реагента R4, представляющего собой пул не менее 10 сывороток здоровых людей, обработанный гидразингидратом, необратимо инактивирующим компонент С4. С помощью прибора БиоЛаТ-3 и совмещенного с ним компьютера определяют число живых клеток в ячейках каждую минуту. На основании динамики падения числа живых клеток во времени рассчитывают константу скорости реакции первого порядка, определяя тангенс угла наклона зависимости логарифма числа подвижных клеток от времени в период наблюдаемого падения числа живых клеток. Калибровочную кривую получают, измеряя падение числа живых клеток во времени для пула сывороток, выбранного в качестве стандарта (рис.1). На рис.1, представлен калибровочный график зависимости константы скорости обездвиживания инфузорий от количества активного компонента С4 (R2=0.99).Example 1. Determination of the functional activity of the complement component C4 of a person. 200 μl of a suspension of approximately 800 Tetrahymena pyriformis infusoria cells in a Veronal buffer solution, pH 7.4, containing 0.075 M NaCl, 0.075 mM Ca 2+ and 0.25 mM Mg 2+ , and 100 μl of that the same buffer containing from 1 to 6 μl of the test sample and from 5 to 15 μl of R4 reagent, which is a pool of at least 10 healthy human sera treated with hydrazine hydrate that irreversibly inactivates the C4 component. Using the BioLaT-3 device and a computer combined with it, the number of living cells in the cells is determined every minute. Based on the dynamics of the decrease in the number of living cells in time, the first-order reaction rate constant is calculated by determining the slope of the logarithm of the number of mobile cells versus time during the period of the observed decrease in the number of living cells. A calibration curve is obtained by measuring the drop in the number of living cells over time for a serum pool selected as a standard (Fig. 1). In Fig. 1, a calibration graph of the dependence of the constant of the immobilized immobility rate constant on the amount of active component C4 (R 2 = 0.99) is presented.

Содержание активного С4 в стандартной сыворотке принято за 400 мкг/мл в соответствии с литературными данными [4].The content of active C4 in standard serum was taken as 400 μg / ml in accordance with published data [4].

ЛитератураLiterature

1. Козлов Л.В., Крылова Ю.И., Чих В.П., Молчанова Н.Н. Модифицированные методы определения функциональной активности факторов комплемента С2, С3, С4 и С5. Биоорган, химия. 1982. Т.8. С.652-659.1. Kozlov L.V., Krylova Yu.I., Chikh V.P., Molchanova N.N. Modified methods for determining the functional activity of complement factors C2, C3, C4 and C5. Bioorgan, chemistry. 1982.V.8. S.652-659.

2. Sinclair I.J.B. The role of complement in the immune reactions of Paramecium aurelia and Tetrahymena pyriformis. Immunology. 1958. V.1. P.291-299.2. Sinclair I.J.B. The role of complement in the immune reactions of Paramecium aurelia and Tetrahymena pyriformis. Immunology 1958. V.1. P.291-299.

3. Черемных Е.Г., Покатаев A.C., Гридунова B.H. Прибор для биологических исследований. Патент РФ 2361913 опубл. 20.07.09. Бюл. №20.3. Cheremnykh EG, Pokataev A.C., Gridunova B.H. The device for biological research. RF patent 2361913 publ. 07/20/09. Bull. No. 20.

4. Hallett A.F., Cooper R. Complement activation in Staphylococcus aureus bacteraemia. Clin. exp. Immunol. 1980. V.40. P.306-311.4. Hallett A.F., Cooper R. Complement activation in Staphylococcus aureus bacteraemia. Clin. exp. Immunol. 1980. V. 40. P.306-311.

Claims (2)

1. Способ определения функциональной активности компонента C4 комплемента человека по его действию на клетки-мишени в присутствии реагента R4, являющегося сывороткой крови человека, избирательно лишенной активности компонента C4, отличающийся тем, что в качестве клеток-мишени выбраны инфузории Tetrahymena pyriformis, суспензию которых вместе с испытуемым образцом, содержащим определяемый компонент C4, и реагентом R4 вносят в измерительные ячейки прибора для автоматизированного подсчета числа живых инфузорий с последующим определением числа живых клеток в каждую минуту, при этом совпадение динамики изменения числа живых клеток во времени для испытуемого образца и контрольного, представляющего пул 10 сывороток здоровых доноров, предполагает равенство активностей компонента C4 комплемента в этих образцах.1. A method for determining the functional activity of the complement component C4 of a person by its effect on target cells in the presence of R4 reagent, which is human blood serum, selectively deprived of the activity of component C4, characterized in that Tetrahymena pyriformis ciliates are selected as target cells, the suspension of which together with the test sample containing the determined component C4 and reagent R4 are introduced into the measuring cells of the device for the automated calculation of the number of living ciliates with the subsequent determination of the number of living cells it every minute, and the coincidence of the dynamics of changes in the number of living cells over time for the test sample and the control, representing a pool of 10 healthy donor sera, suggests the equality of the activities of the complement component C4 in these samples. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что рассчитывают тангенс угла наклона зависимости логарифма числа живых клеток от времени в период наблюдаемого падения числа живых клеток, который равен константе скорости процесса и прямо пропорционален активности компонента C4 комплемента, и сравнивают с константой скорости процесса для стандартного образца, представляющего собой пул сывороток от 10 доноров крови и активность компонента C4 комплемента в котором принимают за 100%. 2. The method according to claim 1, characterized in that the slope of the logarithm of the number of living cells versus time is calculated during the period of the observed drop in the number of living cells, which is equal to the rate constant of the process and directly proportional to the activity of the complement component C4, and compared with the rate constant of the process for a standard sample, which is a pool of sera from 10 blood donors and the activity of the complement component C4 in which is taken as 100%.
RU2013149248/15A 2013-11-06 2013-11-06 Method for determining functional activity of human complement component c4 RU2542404C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2013149248/15A RU2542404C1 (en) 2013-11-06 2013-11-06 Method for determining functional activity of human complement component c4

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2013149248/15A RU2542404C1 (en) 2013-11-06 2013-11-06 Method for determining functional activity of human complement component c4

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2542404C1 true RU2542404C1 (en) 2015-02-20

Family

ID=53289000

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2013149248/15A RU2542404C1 (en) 2013-11-06 2013-11-06 Method for determining functional activity of human complement component c4

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2542404C1 (en)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996007738A3 (en) * 1994-09-08 1996-03-28 Imutran Ltd Modified human c3 proteins
RU2253118C1 (en) * 2003-12-09 2005-05-27 Государственное учреждение "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Министерства здравоохранения Российской Федерации" Determination of functional activity of human complement c4 component
RU2376606C1 (en) * 2008-10-22 2009-12-20 Федеральное Государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Method and set for immune-enzyme detection of functional activity of component c4 of human complement
WO2011047346A1 (en) * 2009-10-16 2011-04-21 Omeros Corporation Methods for treating disseminated intravascular coagulation by inhibiting masp-2 dependent complement activation
RU2417375C2 (en) * 2009-07-28 2011-04-27 Федеральное Государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Method and set for immune-enzyme assay of functional activity of human complement component c3

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996007738A3 (en) * 1994-09-08 1996-03-28 Imutran Ltd Modified human c3 proteins
RU2253118C1 (en) * 2003-12-09 2005-05-27 Государственное учреждение "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Министерства здравоохранения Российской Федерации" Determination of functional activity of human complement c4 component
RU2376606C1 (en) * 2008-10-22 2009-12-20 Федеральное Государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Method and set for immune-enzyme detection of functional activity of component c4 of human complement
RU2417375C2 (en) * 2009-07-28 2011-04-27 Федеральное Государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Method and set for immune-enzyme assay of functional activity of human complement component c3
WO2011047346A1 (en) * 2009-10-16 2011-04-21 Omeros Corporation Methods for treating disseminated intravascular coagulation by inhibiting masp-2 dependent complement activation

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Basinska et al. The production and distribution of IL-6 and TNF-α in subcutaneous adipose tissue and their correlation with serum concentrations in Welsh ponies with equine metabolic syndrome
Andreani et al. Reference values for hematology and plasma biochemistry variables, and protein electrophoresis of healthy Hermann's tortoises (Testudo hermanni ssp.)
Bozzo et al. Analysis of stress indicators for evaluation of animal welfare and meat quality in traditional and Jewish slaughtering
Gauchotte et al. FVIIIra, CD15, and tryptase performance in the diagnosis of skin stab wound vitality in forensic pathology
RU2010101909A (en) METHOD FOR IDENTIFICATION OR TREATMENT OF REACTION "TRANSPLANT AGAINST THE OWNER"
Svete et al. Serum cortisol and haematological, biochemical and antioxidant enzyme variables in horse blood sampled in a slaughterhouse lairage, immediately before stunning and during exsanguination
CN114019171A (en) Blood preparation and profiling
Duffield et al. Interpretation of serum metabolic parameters around the transition period
US9377458B2 (en) Anti-VLA-4 related assays
Arneth Activated CD4+ and CD8+ T cell proportions in multiple sclerosis patients
Zhang et al. Analysis of immunoglobulin, complements and CRP levels in serum of captive northern pig-tailed macaques (Macaca leonina)
Hooijberg et al. Method comparison and generation of plasma biochemistry RIs for the White rhinoceros on a point‐of‐care and wet chemistry analyzer
Hartmann et al. Development of a sensitive phospho-p70 S6 kinase ELISA to quantify mTOR proliferation signal inhibition
CN104007103A (en) Sperm detection method and kit thereof
Padula et al. Eastern brown snake (Pseudonaja textilis) envenomation in dogs and cats: Clinical signs, coagulation changes, brown snake venom antigen levels and treatment with a novel caprylic acid fractionated bivalent whole IgG equine antivenom
RU2542404C1 (en) Method for determining functional activity of human complement component c4
RU2417375C2 (en) Method and set for immune-enzyme assay of functional activity of human complement component c3
RU2545775C1 (en) Method for assaying functional activity of human complement component c3
Suzuki et al. Validation of the bovine blood calcium checker as a rapid and simple measuring tool for the ionized calcium concentration in cattle
RU2542401C1 (en) Method for determining functional activity of human complement component c2
RU2542397C1 (en) Method for determining integral functional activity of complement membrane attack complex components
RU2550946C1 (en) Method of determining functional activity of human complement factor b
RU2542399C1 (en) Method for determining integral functional activity of human complement component c1
RU2542407C1 (en) Method for determining functional activity of human complement factor d
Ferreira et al. Potential role of CXCL10 in monitoring response to treatment in leprosy patients

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20171107