RU2541774C2

RU2541774C2 - Method for cell protection against apoptosis

Info

Publication number: RU2541774C2
Application number: RU2013121503/15A
Authority: RU
Inventors: Наталья Викторовна Канская; Наталья Владимировна Рязанцева; Елена Алексеевна Степовая; Ольга Леонидовна Носарева; Ирина Анатольевна Позднякова; Нина Александровна Федорова; Сергей Иванович Твердохлебов; Александр Викторович Канский
Priority date: 2013-05-07
Filing date: 2013-05-07
Publication date: 2015-02-20
Also published as: RU2013121503A

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention refers to medicine and can be used for the lymphocyte protection against apoptosis. That is ensured by adding 1,4-dithioerythritol and ascorbic acid in the final concentration of 3.0 mmole and 0.1 mmole respectively to an incubation medium containing lymphocytes.

EFFECT: invention enables protecting lymphocytes against apoptosis by the combined use of ascorbate and SH group protector, 1,4-dithioerythritol.

1 tbl

Description

Известны способы защиты клеток от апоптоза при активации антиоксидантной активности путем определения роста общего содержания SH-групп белков [Microtubule dynamics and glutathione metabolism in phagocytizing human polymorphonuclear leukocytes / B.R. Burchill, J.M. Oliver, C.B. Pearson et al. // J. of Cell Biology. - 1978. - Vol.76, №2. - P.439-447], но данная методика не позволяет оценить уровень восстановленного глутатиона, а следовательно, оценить эффективность защиты клеток от апоптоза. Известен также способ косвенного определения содержания восстановленного глутатиона по активности глутатионпероксидазы [Медицинские лабораторные технологии: В 2-х томах. / Под ред. А.И. Карпищенко - Т. 2 / А.И. Карпищенко. - СПб.: Интермедика. - 1999. - 656 с.], однако активность этого фермента зависит от конформации активного центра фермента. При изменении конформации активного центра фермента его активность меняется, что не позволяет с высокой точностью оценить уровень восстановленного глутатиона, а следовательно, оценить эффективность защиты клеток от апоптоза. Известен также способ косвенного определения концентрации восстановленного глутатиона по активности глутатионредуктазы [Медицинские лабораторные технологии: в 2-х томах / Под ред. А. И. Карпищенко - Т.2 / А.И. Карпищенко. - СПб.: Интермедика. - 1999. - 656 с.], однако активность этого фермента зависит от конформации активного центра фермента. При изменении конформации активного центра фермента его активность меняется, что не позволяет достоверно в любой ситуации оценить с высокой точностью уровень восстановленного глутатиона, а следовательно, оценить эффективность защиты клеток от апоптозаKnown methods for protecting cells from apoptosis during activation of antioxidant activity by determining the growth of the total content of SH-groups of proteins [Microtubule dynamics and glutathione metabolism in phagocytizing human polymorphonuclear leukocytes / B.R. Burchill, J.M. Oliver, C. B. Pearson et al. // J. of Cell Biology. - 1978. - Vol. 76, No. 2. - P.439-447], but this technique does not allow to evaluate the level of reduced glutathione, and therefore, to evaluate the effectiveness of the protection of cells from apoptosis. There is also a method of indirectly determining the content of reduced glutathione by the activity of glutathione peroxidase [Medical laboratory technology: In 2 volumes. / Ed. A.I. Karpishchenko - T. 2 / A.I. Karpishchenko. - SPb .: Intermedica. - 1999. - 656 S.], however, the activity of this enzyme depends on the conformation of the active center of the enzyme. When the conformation of the active center of the enzyme changes, its activity changes, which does not allow a high accuracy to evaluate the level of reduced glutathione, and therefore, to evaluate the effectiveness of the protection of cells from apoptosis. There is also a method of indirectly determining the concentration of reduced glutathione by the activity of glutathione reductase [Medical laboratory technology: in 2 volumes / Ed. A.I. Karpishchenko - T. 2 / A.I. Karpishchenko. - SPb .: Intermedica. - 1999. - 656 S.], however, the activity of this enzyme depends on the conformation of the active center of the enzyme. When the conformation of the active center of the enzyme changes, its activity changes, which does not allow us to reliably evaluate the level of reduced glutathione in any situation with high accuracy, and therefore, to evaluate the effectiveness of protecting cells from apoptosis

Известен также способ определения антиоксидантной активности как защиты клеток от апоптоза по содержанию восстановленного глутатиона, предложенный М.Е. Anderson (1985) в модификации S. Kojima et al. (2004) [Low dose gamma-rays activate immune functions via induction of glutathione and delay tumor growth / S. Kojima, K. Nakayama, H. Ishida // J. Radiat. Res. - 2004. - Vol.45, №1. - P.33-39], основанный на взаимодействии восстановленного глутатиона (GSH) с 5,5′-дитио-бис(2-нитробензойной) кислотой (ДТНБ). При этом образуется окисленный глутатион (GSSG), который затем восстанавливается и вновь взаимодействует с ДТНБ. Данный способ является наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату и выбран в качестве прототипа.There is also a method of determining antioxidant activity as protecting cells from apoptosis by the content of reduced glutathione, proposed by M.E. Anderson (1985) as modified by S. Kojima et al. (2004) [Low dose gamma-rays activate immune functions via induction of glutathione and delay tumor growth / S. Kojima, K. Nakayama, H. Ishida // J. Radiat. Res. - 2004. - Vol. 45, No. 1. - P.33-39], based on the interaction of reduced glutathione (GSH) with 5.5′-dithiobis (2-nitrobenzoic) acid (DTNB). In this case, oxidized glutathione (GSSG) is formed, which is then reduced and reacts again with DTNB. This method is the closest to the proposed technical essence and the achieved result and is selected as a prototype.

Целью предлагаемого изобретения является повышение эффективности способа защиты лимфоциты от апоптоза.The aim of the invention is to increase the efficiency of the method of protecting lymphocytes from apoptosis.

Указанная цель достигается тем, что дополнительно в инкубационную среду, содержащую лимфоциты, вводится 1,4-дитиоэритритол и аскорбиновая кислота в конечной концентрации 3,0 ммоль и 0,1 ммоль соответственно. без которых невозможна последующая защита клеток от апоптозаThis goal is achieved by the fact that in addition to the incubation medium containing lymphocytes, 1,4-dithioerythritol and ascorbic acid are introduced in a final concentration of 3.0 mmol and 0.1 mmol, respectively. without which the subsequent protection of cells from apoptosis is impossible

Следовательно, только комплексная модернизация способа-прототипа позволяет получить желаемый результат. Только комплексное внесение в инкубационную смесь 1,4-дитиоэритритола и аскорбиновой кислоты в минимальной концентрации 3,0 мМ и 0,1 мМ соответственно позволяет повысить защиту клеток от апоптоза, а именно оценить защиту клеток от апоптоза как эффективную при росте белково-связанного глутатиона на 18% и более и восстановленного глутатиона на 25% и более.Therefore, only a comprehensive modernization of the prototype method allows to obtain the desired result. Only the complex introduction of 1,4-dithioerythritol and ascorbic acid into the incubation mixture at a minimum concentration of 3.0 mM and 0.1 mM, respectively, can increase the protection of cells from apoptosis, namely, to assess the protection of cells from apoptosis as effective in the growth of protein-bound glutathione by 18% or more; and reduced glutathione by 25% or more.

Антиоксидантная система направлена на эффективную нейтрализацию гидроксирадикалов и снижение токсичной для организма гидроперекиси. Гидроксильный радикал (^·OH) участвует в микробицидном и цитотоксическом действии нейтрофилов, моноцитов и Т-лимфоцитов [Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / Е.Б. Меньшикова, В.З. Ланкин, Н.К. Зенков и соавт. - М.: Слово. - 2006. - 556 с. ]. Есть два основных механизма синтеза ^·OH нейтрофилами: первый - образование из пероксида водорода в присутствии металлов переменной валентности в так называемой «реакции Фентона»: Fe²⁺+H₂O₂→Fe³⁺+^·OH+OH^- [Лущак В.И. Окислительный стресс и механизмы защиты от него у бактерий / В.И. Лущак // Биохимия. - 2001. - Т.66, вып.5. - С.592-609], второй - в ходе ряда реакций с участием гипогалоидов: $H O C l + O_{2}^{•}^{-} \to {}^{•}O H + C l^{-} + O_{2};$

или взаимодействие гипохлорита с ионами Fe²⁺ [Spin trapping evidence for myeloperoxidase-dependent hydroxyl radical formation by human neutrophils and monocytes // C.L. Ramos, S. Pou, B.Е. Britigan et al. // J. Biol. Chem. - 1992. - Vol.267. - P.8307-8312; Candeias, L. P. Formation of hydroxyl radicals on reaction of hypochlorous add with ferrocyanide, a model iron (D) complex / L.P. Candeias, М.R.L. Stratford, P. Wardman // Free Radical Res. - 1994. - Vol.20. - P.241-249]. Следовательно, если в клетке нет металлов переменной валентности в свободном состоянии, для нее реакция Фентона и подобные реакции не будут опасными [Hampton М.В. Inside the Neutrophil Phagosome: Oxidants, Myeloperoxidase, and Bacterial Killing / М.B. Hampton, A.J. Kettle, C.C. Winterboum // Blood. - 1998. - Vol.92, №9. - P.3007-3017].The antioxidant system is aimed at effectively neutralizing hydroxy radicals and reducing hydroperoxide toxic to the body. The hydroxyl radical ( ^· OH) is involved in the microbicidal and cytotoxic effects of neutrophils, monocytes and T-lymphocytes [Oxidative stress. Prooxidants and antioxidants / E.B. Menshikov, V.Z. Lankin, N.K. Zenkov et al. - M .: Word. - 2006 .-- 556 p. ]. There are two main mechanisms for the synthesis of ^· OH by neutrophils: the first is the formation of hydrogen peroxide in the presence of metals of variable valency in the so-called “Fenton reaction”: Fe ²⁺ + H ₂ O ₂ → Fe ³⁺ + ^· OH + OH ^- [Lushchak V. AND. Oxidative stress and mechanisms of protection against it in bacteria / V.I. Lushchak // Biochemistry. - 2001. - T.66, issue 5. - S.592-609], the second - during a series of reactions involving hypogaloids:

H O C l + O_{2}^{•}^{-} \to {}^{•}O H + C l^{-} + O_{2};

or the interaction of hypochlorite with Fe ^{2+ ions} [Spin trapping evidence for myeloperoxidase-dependent hydroxyl radical formation by human neutrophils and monocytes // CL Ramos, S. Pou, B.E. Britigan et al. // J. Biol. Chem. - 1992. - Vol. 267. - P.8307-8312; Candeias, LP Formation of hydroxyl radicals on reaction of hypochlorous add with ferrocyanide, a model iron (D) complex / LP Candeias, M.RL Stratford, P. Wardman // Free Radical Res. - 1994 .-- Vol.20. - P.241-249]. Therefore, if a cell does not have metals of variable valency in a free state, for it the Fenton reaction and similar reactions will not be dangerous [Hampton M.V. Inside the Neutrophil Phagosome: Oxidants, Myeloperoxidase, and Bacterial Killing / M.B. Hampton, AJ Kettle, CC Winterboum // Blood. - 1998. - Vol. 92, No. 9. - P.3007-3017].

В клетках предусмотрен ряд защитных реакций по блокированию свободных ионов Fe²⁺ и Cu⁺. Например, активированные клетки синтезируют лактоферрин, связывающий свободное железо и переводящий его в каталитически неактивную форму, а также продуцируют высокие концентрации таурина, конъюгирующего с гипохлоритом и защищающего клетку от его токсичных эффектов [Taurine chloramines, a product of activated netrophils, inhibits in vitro the genetation of nitric oxide and other macrofage inflammatory mediators / J. Marcinkiewiez, A. Grabowska, J. Bereta et al. // J. Leukocyte Biol. - 1995. - Vol.58. - P.667-674].A number of protective reactions are provided in the cells to block free ions of Fe ²⁺ and Cu ⁺ . For example, activated cells synthesize lactoferrin, binding free iron and converting it into a catalytically inactive form, and also produce high concentrations of taurine, conjugating with hypochlorite and protecting the cell from its toxic effects [Taurine chloramines, a product of activated netrophils, inhibits in vitro the genetation of nitric oxide and other macrofage inflammatory mediators / J. Marcinkiewiez, A. Grabowska, J. Bereta et al. // J. Leukocyte Biol. - 1995 .-- Vol. 58. - P.667-674].

Образование ^•OH показано в ходе микросомального окисления, окисления арахидоновой кислоты, в реакциях с флавиновыми ферментами, убихиноном, пероксинитритом. В ряде исследований клеток in vitro получены свидетельства продукции ^•ОН данными клетками [Hydroxylation of salicylate by activated neutrophils / W.B. Davis, B.S. Mohammed, D.C. Mays et al. // Biochem Pharmacol. - 1989. - Vol.38. - P.4013-4019]. Однако изучение этих реакций зачастую основывалось на использовании ингибиторов и измерении уровня вторичных продуктов. Следовательно, реакции, приписанные ^•OH, могли быть вызваны другими оксидантами, в частности $O_{2}^{•^{-}}$

или гипохлорной кислотой [Do human neutrophils form hydroxyl radical. Evaluation of an unresolved controversy / M.S. Cohen, B.E. Britigan, D.J. Hassett et al. // Free Radic Biol Med. - 1988. - Vol.5. - P.81-90]. Ряд авторов считает, что in vitro за счет реакции Фентона клетки производят незначительные количества ^•OH [Rosen, G.M. Free radicals and phagocytic cells / G.M. Rosen, S. Pou, C.L. Ramos // FASEB J. - 1995. - Vol.9. - P.200-211].Formation ^• OH is indicated during microsomal oxidation, oxidation of arachidonic acid, in reactions with flavin enzymes, ubiquinone, peroxynitrite. In a number of in vitro cell studies, evidence of production of ^• OH by these cells has been obtained [Hydroxylation of salicylate by activated neutrophils / WB Davis, BS Mohammed, DC Mays et al. // Biochem Pharmacol. - 1989. - Vol. 38. - P.4013-4019]. However, the study of these reactions was often based on the use of inhibitors and measurement of the level of secondary products. Consequently, the reactions attributed to ^• OH could have been caused by other oxidants, in particular

O_{2}^{•^{-}}

or hypochlorous acid [Do human neutrophils form hydroxyl radical. Evaluation of an unresolved controversy / MS Cohen, BE Britigan, DJ Hassett et al. // Free Radic Biol Med. - 1988 .-- Vol. 5. - P.81-90]. A number of authors believe that in vitro, due to the Fenton reaction, cells produce insignificant amounts of ^• OH [Rosen, GM Free radicals and phagocytic cells / GM Rosen, S. Pou, CL Ramos // FASEB J. - 1995. - Vol.9. - P.200-211].

Генерация ^•OH стимулированными клетками в очаге воспаления может существенно лимитироваться отсутствием в среде ионов железа. Исследование реакции Фентона в клетках выявило, что блокирование ионов железа лактоферрином ингибирует непосредственно саму реакцию [Rosen, G. M. Free radicals and phagocytic cells / G.M. Rosen, S. Pou, C.L. Ramos // FASEB J. - 1995. - Vol.9. - P.200-211], а утилизация H₂O₂ миелопероксидазой ограничивает реакцию, даже если железо доступно [Winterboum, С.С. Myeloperoxidase as an effective inhibitor of hydroxyl radical production: Implications for the oxidative reactions of neutrophils / C.C. Winterboum // J. Clin. Invest. - 1986. - Vol.78. - P.545-557]. Хотя большинство биологических форм железа каталитически неактивно, показана способность клеток к продукции ^•OH в присутствии трансферрина, подверженного протеолитической деградации [Phagocyte-derived free radicals stimulated by ingestion of ironrich Staphylococcus aureus: Aspin-trapping study / M.S. Cohen, B.E. Britigan, Y.S. Chai et al. // J. Infect Dis. - 1991. - Vol.163. - 819-826], или железа в составе Pseudomonas aeruginosa, содержащего сидерофор пиохелин [Possible role of bacterial siderophores in inflammation-Iron bound to the pseudomonas siderophore pyochelin can function as a hydroxyl radical catalyst / T.J. Coffman, C.D. Cox, B.L. Edeker et al. / J. Clin. Invest. - 1990. - Vol.86. - P.1030-1038]. Однако M.S. Cohen и соавторы обнаружили, что внутриклеточное железо не всегда доступно: в их экспериментах повышенного образования радикала ^•OH не отмечалось, даже если клетки поглощали Staphylococcus aureus, который был преинкубирован с Fe²⁺ [Phagocyte-derived free radicals stimulated by ingestion of ironrich Staphylococcus aureus: Aspin-trapping study / M.S. Cohen, B.E. Britigan, Y.S. Chai et al. // J. Infect Dis. - 1991. - Vol.163. - 819-826].The generation of ^• OH by stimulated cells at the site of inflammation can be significantly limited by the absence of iron ions in the medium. A study of the Fenton reaction in cells revealed that the blocking of iron ions by lactoferrin directly inhibits the reaction itself [Rosen, GM Free radicals and phagocytic cells / GM Rosen, S. Pou, CL Ramos // FASEB J. - 1995. - Vol. 9. - P.200-211], and utilization of H ₂ O _{2 with} myeloperoxidase limits the reaction, even if iron is available [Winterboum, C. S. Myeloperoxidase as an effective inhibitor of hydroxyl radical production: Implications for the oxidative reactions of neutrophils / CC Winterboum // J. Clin. Invest. - 1986. - Vol. 78. - P.545-557]. Although most biological forms of iron are catalytically inactive, the ability of cells to produce ^• OH is shown in the presence of transferrin susceptible to proteolytic degradation [Phagocyte-derived free radicals stimulated by ingestion of ironrich Staphylococcus aureus: Aspin-trapping study / MS Cohen, BE Britigan, YS Chai et al. // J. Infect Dis. - 1991. - Vol. 163. - 819-826], or iron in the composition of Pseudomonas aeruginosa containing siderophore piohelin [Possible role of bacterial siderophores in inflammation-Iron bound to the pseudomonas siderophore pyochelin can function as a hydroxyl radical catalyst / TJ Coffman, CD Cox, BL Edeker et al . / J. Clin. Invest. - 1990. - Vol. 86. - P.1030-1038]. However, MS Cohen et al found that intracellular iron is not always available: in their experiments, increased formation of the ^• OH radical was not observed, even if the cells absorbed Staphylococcus aureus, which was preincubated with Fe ²⁺ [Phagocyte-derived free radicals stimulated by ingestion of ironrich Staphylococcus aureus: Aspin-trapping study / MS Cohen, BE Britigan, YS Chai et al. // J. Infect Dis. - 1991. - Vol. 163. - 819-826].

С помощью чувствительных спиновых меток обнаружена наработка гидроксил-радикала клетки in vitro в результате реакции HOCl и $O_{2}^{•^{-}}$

, причем преобразованию в ^•OH подверглась очень небольшая часть использованного клетками кислорода [Free hydroxyl radicals are formed on reaction between the neutrophilderived species superoxide and hypochlorous acid / L.P. Candeias, K.B. Patel, M.R.L. Stratford et al. // FEBS Lett. - 1993. - Vol.333. - P.151-159]. Вопрос о том, достаточно ли такого количества ^•OH, чтобы играть существенную роль в цитотоксичности, до сих пор остается открытым. Здесь необходимо учитывать, что гораздо большей бактерицидной способностью ^•OH обладает в присутствии Cl^- [Radiation induced generation of chlorine derivatives in N₂O-saturated phosphate buffered saline: Toxic effects on Escherichia coli cells / G. Czapski, S. Goldstein, N. Andom et al. // Free Radic. Biol. Med. - 1992. - Vol.12. - P.353-361], вероятно, вследствие реакции между ними с образованием гипохлорита [Bactericidal potency of hydroxyl radical in physiological environments / R.G. Wolcott, B.S. Franks, D.M. Hannum et al. // J. Biol. Chem. - 1994. - Vol.269. - P.9721-9734].Using sensitive spin labels, the in vitro production of the hydroxyl radical of the cell was detected as a result of the HOCl reaction and

O_{2}^{•^{-}}

with a very small fraction of the oxygen used by the cells being converted to ^• OH [Free hydroxyl radicals are formed on reaction between the neutrophilderived species superoxide and hypochlorous acid / LP Candeias, KB Patel, MRL Stratford et al. // FEBS Lett. - 1993 .-- Vol. 333. - P.151-159]. The question of whether enough ^• OH is enough to play a significant role in cytotoxicity is still an open question. It should be borne in mind that ^• OH possesses a much greater bactericidal ability in the presence of Cl ^- [Radiation induced generation of chlorine derivatives in N ₂ O-saturated phosphate buffered saline: Toxic effects on Escherichia coli cells / G. Czapski, S. Goldstein, N. Andom et al. // Free Radic. Biol. Med. - 1992. - Vol. 12. - P.353-361], probably due to the reaction between them with the formation of hypochlorite [Bactericidal potency of hydroxyl radical in physiological environments / RG Wolcott, BS Franks, DM Hannum et al. // J. Biol. Chem. - 1994 .-- Vol.269. - P.9721-9734].

Гидроксильный радикал представляет собой один из наиболее реакционно-способных окислителей и может взаимодействовать почти с любой молекулой клетки. Он модифицирует дезоксирибозу и азотистые основания ДНК, окисляет молекулы белков, углеводов и липидов. Особенно активно ^•OH в ходе реакций перекисного окисления липидов атакует фосфолипиды, содержащие в жирнокислотных радикалах ненасыщенные связи, что ведет к образованию гидроперекисей [Дубинина E.E. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток (жизнь и смерть, созидание и разрушение). Физиологические и клинико-биохимические аспекты / E.E. Дубинина. -СПб.: Медицинская пресса, 2006. - 400 с.; Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / E.Б. Меньшикова, В.3. Ланкин, Н.К. Зенков и соавт. - M.: Слово. - 2006. - 556 с. ]. Основным компонентом антиокидантной системы является восстановленная форма глутатиона.The hydroxyl radical is one of the most reactive oxidizing agents and can interact with almost any cell molecule. It modifies deoxyribose and nitrogenous bases of DNA, oxidizes molecules of proteins, carbohydrates and lipids. Especially active ^• OH during lipid peroxidation reactions attacks phospholipids containing unsaturated bonds in fatty acid radicals, which leads to the formation of hydroperoxides [Dubinina EE Oxygen metabolism products in the functional activity of cells (life and death, creation and destruction). Physiological and clinical-biochemical aspects / EE Dubinina. -SPb .: Medical Press, 2006. - 400 p .; Oxidative stress. Prooxidants and antioxidants / E.B. Menshikov, B.3. Lankin, N.K. Zenkov et al. - M .: The word. - 2006 .-- 556 p. ]. The main component of the antioxidant system is the reduced form of glutathione.

Глутатион - трипептид(L-γ-глутамил-L-цистеилглицин) с молекулярной массой 307 Da занимает особое место среди SH-содержащих соединений. Наличие γ-глутамильной связи защищает трипептид от ферментативной деградации. В организме глутатион присутствует в двух формах: окисленной - GSSG и восстановленной - GSH, причем содержание GSH в клетках на несколько порядков выше, чем GSSG [Колесниченко Л.С., 1989; Wu G. et al., 2004; Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н., 2005; Марри Р. и соавт., 2009]. По данным Р. Pietarinen-Runtti et al. (2000), концентрация GSH в клетках составляет около 5 нмоль/мг белка. Содержание глутатиона в сыворотке крови здоровых людей незначительно, поэтому клетки основную потребность в GSH обеспечивают путем нематричного синтеза [Wu G. et al., 2004] в ходе двух последовательных реакций, катализируемых γ-глутамилцистеин-синтетазой (КФ 6.3.2.2) и глутатион-синтетазой (КФ 6.3.2.3) [Кулинский В.И., 1990; Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н., 2005; Марри Р. и соавт., 2009]. Лимитирующим звеном синтеза является образование γ-глутамилцистеина, зависящее от наличия L-цистеина и его способности окисляться в L-цистин [Зенков Н.К. и соавт., 2001]. В то же время недостаточность глутатион-синтетазы способствует развитию окислительных повреждений в нейтрофилах [Spielberg S.P. et al., 1979].Glutathione, a tripeptide (L-γ-glutamyl-L-cysteylglycine) with a molecular weight of 307 Da, occupies a special place among SH-containing compounds. The presence of a γ-glutamyl bond protects the tripeptide from enzymatic degradation. Glutathione is present in the body in two forms: oxidized - GSSG and reduced - GSH, and the content of GSH in the cells is several orders of magnitude higher than GSSG [Kolesnichenko LS, 1989; Wu G. et al., 2004; Smirnova G.V., Oktyabrsky O.N., 2005; Murray R. et al., 2009]. According to P. Pietarinen-Runtti et al. (2000), the concentration of GSH in cells is about 5 nmol / mg protein. The content of glutathione in the blood serum of healthy people is insignificant; therefore, the main need for GSH is provided by nematrix synthesis [Wu G. et al., 2004] during two sequential reactions catalyzed by γ-glutamylcysteine synthetase (EC 6.3.2.2) and glutathione synthetase (CF 6.3.2.3) [Kulinsky V.I., 1990; Smirnova G.V., Oktyabrsky O.N., 2005; Murray R. et al., 2009]. The limiting link in the synthesis is the formation of γ-glutamylcysteine, which depends on the presence of L-cysteine and its ability to oxidize to L-cystine [Zenkov N.K. et al., 2001]. At the same time, glutathione synthetase deficiency contributes to the development of oxidative damage in neutrophils [Spielberg S.P. et al., 1979].

Глутатион при физиологических значениях pH имеет две анионные карбоксигруппы, положительно заряженную аминогруппу и SH-группу цистеинового остатка, которая придает GSH свойства восстановителя и способность быстро обезвреживать свободные радикалы и АФК [Day R.M., 2005; Zhu Y., 2007; Circu C.L. et al., 2009]. Глутатин является типичным тиолом и, участвуя в одноэлектронных восстановительных реакциях, становится GS^•, который димеризуется до GSSG, легко реагирующего со свободными SH-группами. Второй тип окислительно-восстановительных превращений с участием GSH - это реакции тиолдисульфидного обмена, которые известны как основной путь образования смешанных дисульфидов глутатиона с белками (белок-SSG) и играют роль в регуляции биологических процессов [Chai Y.C. et al., 1994]. В реакциях третьего типа происходит двухэлектронное окисление глутатиона с образованием интермедиата, который реагирует со второй молекулой GSH (получение GSSG) или иной молекулой (синтез смешанного дисульфида) [Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н., 2005].Glutathione at physiological pH values has two anionic carboxy groups, a positively charged amino group and a SH group of the cysteine residue, which imparts the GSH properties of a reducing agent and the ability to quickly neutralize free radicals and ROS [Day RM, 2005; Zhu Y., 2007; Circu CL et al., 2009]. Glutatin is a typical thiol and, participating in one-electron reduction reactions, becomes GS ^• , which dimerizes to GSSG, which readily reacts with free SH-groups. The second type of redox transformations involving GSH is thiol disulfide exchange reactions, which are known as the main pathway for the formation of mixed glutathione disulfides with proteins (protein-SSG) and play a role in the regulation of biological processes [Chai YC et al., 1994]. In reactions of the third type, two-electron oxidation of glutathione takes place with the formation of an intermediate that reacts with the second GSH molecule (producing GSSG) or another molecule (synthesis of mixed disulfide) [Smirnova GV, Oktyabrsky ON, 2005].

GSH является стабилизатором мембран [Биленко М.В, 1989; Udupi V., 1992; Trudel S. et al., 2009]. Он защищает клеточные структуры от высокотоксичного OCI - [Carr A.C., Wmterboum С.С., 1997], при этом GSH превращается в глутатион-сульфонамид и дегидроглутатион [Harwood D.T. et al., 2006]. Связывая NO, глутатион образует токсичные для клетки нитрозильные комплексы. Мононитрозоглутатион может активировать апоптоз [Turpaev K.T. et al., 1997].GSH is a membrane stabilizer [Bilenko M.V., 1989; Udupi V., 1992; Trudel S. et al., 2009]. It protects cell structures from the highly toxic OCI - [Carr A.C., Wmterboum C. S., 1997], while GSH is converted to glutathione sulfonamide and dehydroglutathione [Harwood D.T. et al., 2006]. By binding NO, glutathione forms nitrosyl complexes toxic to the cell. Mononitrosoglutathione may activate apoptosis [Turpaev K.T. et al., 1997].

Не всегда восстановительного потенциала GSH достаточно для полной нейтрализации прооксидантов. Существует мнение, что взаимодействие GSH с органическими радикалами эффективно только в условиях удаления $O_{2}^{•^{-}}$

, поэтому глутатион образует с супероксиддисмутазой своеобразную антиоксидантную систему, ибо в противном случае развиваются реакции образования H₂O₂ и GS^• [Ланкин В.З. и соавт., 1997; Меньшикова Е.Б. и соавт., 2006]. В сочетании с витамином B₁₂ глутатион, а также N-ацетилцистеин, могут потенцировать прооксидантное и цитотоксическое действие на клетку [Соловьева М.Е. и соавт., 2007].GSH's reduction potential is not always sufficient to completely neutralize prooxidants. It is believed that the interaction of GSH with organic radicals is effective only under conditions of removal

O_{2}^{•^{-}}

therefore, glutathione forms a kind of antioxidant system with superoxide dismutase, because otherwise the formation of H ₂ O ₂ and GS ^• will develop [V. Lankin et al., 1997; Menshikova E.B. et al., 2006]. In combination with vitamin B _12, glutathione, as well as N-acetylcysteine, can potentiate the prooxidant and cytotoxic effects on the cell [Solovieva M.E. et al., 2007].

Основной антиоксидантный эффект GSH реализует посредством участия в работе ферментов. Глутатион выступает донором водорода при восстановлении Н₂О₂ и перекисей липидов глутатион-пероксидазами и глутатион-S-трансферазами (ГТ) [Hirayama К., 1989; Sies H. et al., 1997; Кулинский В.И., 1990; Hayes J.D. et al., 2005; Зенков Н.К. и соавт., 2009; Liu G. et al., 2010]. Высокая активность глутатион-редуктазы и накопление GSH оказывает протекторный эффект в отношении альвеолярных макрофагов, инкубируемых с прооксидантами in vitro [Pietarinen P.К., 1995] и других клеток.The main antioxidant effect of GSH is realized through participation in the work of enzymes. Glutathione acts as a hydrogen donor in the reduction of H ₂ O ₂ and lipid peroxides by glutathione peroxidases and glutathione S-transferases (HT) [Hirayama K., 1989; Sies H. et al., 1997; Kulinsky V.I., 1990; Hayes JD et al., 2005; Zenkov N.K. et al., 2009; Liu G. et al., 2010]. The high activity of glutathione reductase and the accumulation of GSH have a protective effect against alveolar macrophages incubated with prooxidants in vitro [Pietarinen PK, 1995] and other cells.

С изменением окислительно-восстановительного баланса сопряжено большое количество реакций, поэтому поддержание оптимального редокс-состояния цитозоля выступает важным условием нормальной жизнедеятельности клеток. Высокая концентрация глутатиона в цитоплазме, его редокс-активность и возможность поддержания в восстановленном состоянии делают систему GSH/GSSG важнейшим внутриклеточным редокс-буфером [Reed M.C. et al., 2008]. Концентрация GSH в клетке в 500-1000 раз превышает уровень НАДФН и других внутриклеточных редокс-систем, поэтому изменения соотношения GSH/GSSG прямо отражают изменения редокс-статуса клетки [Кулинский В.И., 2007; Asian M., Canatan D., 2008; Reed M.C., 2008]. Считают, что буферная емкость системы глутатиона защищает репликативную систему клетки, а дефицит GSH приводит к снижению синтеза ДНК и белков [Poot M., 1991; Ланкин В.З., 1997; Day R.M., Suzuki Y.J., 2005; Liu G. et al., 2010], а затем и к апоптозу.A large number of reactions are associated with a change in the redox balance; therefore, maintaining the optimal redox state of the cytosol is an important condition for the normal functioning of cells. The high concentration of glutathione in the cytoplasm, its redox activity and the ability to maintain in a reduced state make the GSH / GSSG system the most important intracellular redox buffer [Reed M.C. et al., 2008]. The concentration of GSH in the cell is 500-1000 times higher than the level of NADPH and other intracellular redox systems, therefore, changes in the ratio of GSH / GSSG directly reflect changes in the redox status of the cell [Kulinsky VI, 2007; Asian M., Canatan D., 2008; Reed M.C., 2008]. It is believed that the buffer capacity of the glutathione system protects the replicative system of the cell, and GSH deficiency leads to a decrease in DNA and protein synthesis [Poot M., 1991; Lankin V.Z., 1997; Day R.M., Suzuki Y.J., 2005; Liu G. et al., 2010], and then to apoptosis.

К природным антиоксидантам относят также аскорбиновую кислоту, которая играет важную роль в развитии окислительного стресса в организме.Natural antioxidants also include ascorbic acid, which plays an important role in the development of oxidative stress in the body.

Аскорбиновая кислота реализует свое антиоксидантное действие в плазме, межклеточной жидкости и на внеклеточном уровне. В организме человека аскорбиновая кислота преимущественно представлена в L-форме. Стрессовые ситуации увеличивают количество метаболитов витамина С в виде дегидроаскорбиновой кислоты.Ascorbic acid realizes its antioxidant effect in plasma, intercellular fluid and at the extracellular level. In humans, ascorbic acid is predominantly present in L-form. Stressful situations increase the amount of vitamin C metabolites in the form of dehydroascorbic acid.

Аскорбиновая кислота и дегидроаскорбиновая кислота играют активную роль в нескольких процессах, включая защиту от инфекции, повышении иммунности, в процессах заживления ран, а также принимая участие в образовании антистрессовых гормонов. Аскорбат является кофактором дофамин-β-гидроксилазы, которая катализирует синтез норадреналина и других катехоламинов. Аскорбиновая кислота является восстановителем для L-пролингидроксилазы, которая необходима для синтеза коллагена и соединительной ткани в целом. В организме с участием аскорбиновой кислоты происходит регенерация α-токоферола из токофероксильного радикала. Окислительный стресс коррелирует с ухудшением секреции инсулина, а терапия аскорбиновой кислотой прерывает повреждающее действие свободных радикалов, уменьшает степень проявления инсулиновой резистентности [М.И. Балаболкин и соавт., 2003]. Ионы аскорбата являются одним из активных элементов системы антиоксидантной защиты, предохраняя липиды от окисления их пероксидными радикалами. Антиоксидантный эффект аскорбата проявляется при достаточном количестве других антиоксидантов, таких как α-токоферол и глутатион. Глутатион восстанавливает дегидроаскорбиновую кислоту прямым и неферментативным путем до аскорбиновой кислоты. Эта реакция является одним из основных механизмов антиоксидантной системы, часто описываемых как восстановительные циклы - глутатион/глутатиондисульфид и аскорбиновая/дегидроаскорбиновая кислота. При этом клетки периферических тканей поглощают экзогенную дегидроаскорбиновую кислоту и в присутствии глутатиона конвертируют ее в цитоплазме в аскорбиновую кислоту. Восстановление глутатиондисульфида в глутатион катализируется глутатион редуктазой и требует участия NADPH в качестве кофактора. Недостаточность глутатиона снижает содержание аскорбиновой кислоты в тканях и одновременно повышает концентрацию дегидроаскорбиновой кислоты.Ascorbic acid and dehydroascorbic acid play an active role in several processes, including protection against infection, increasing immunity, in the healing process of wounds, and also taking part in the formation of anti-stress hormones. Ascorbate is a cofactor of dopamine-β-hydroxylase, which catalyzes the synthesis of norepinephrine and other catecholamines. Ascorbic acid is a reducing agent for L-proline hydroxylase, which is necessary for the synthesis of collagen and connective tissue in general. In the body, with the participation of ascorbic acid, α-tocopherol is regenerated from the tocopheroxyl radical. Oxidative stress correlates with a decrease in insulin secretion, and ascorbic acid therapy interrupts the damaging effect of free radicals, reduces the degree of manifestation of insulin resistance [M.I. Balabolkin et al., 2003]. Ascorbate ions are one of the active elements of the antioxidant defense system, protecting lipids from oxidation by their peroxide radicals. The antioxidant effect of ascorbate is manifested with a sufficient amount of other antioxidants, such as α-tocopherol and glutathione. Glutathione reduces dehydroascorbic acid directly and non-enzymatically to ascorbic acid. This reaction is one of the main mechanisms of the antioxidant system, often described as reduction cycles - glutathione / glutathione disulfide and ascorbic / dehydroascorbic acid. At the same time, peripheral tissue cells absorb exogenous dehydroascorbic acid and, in the presence of glutathione, convert it in the cytoplasm into ascorbic acid. The reduction of glutathione disulfide to glutathione is catalyzed by glutathione reductase and requires the participation of NADPH as a cofactor. Glutathione deficiency reduces the content of ascorbic acid in tissues and at the same time increases the concentration of dehydroascorbic acid.

При недостатке α-токоферола и глутатиона может превалировать прооксидантный эффект аскорбата и его метаболитов. Прооксидантный эффект аскорбиновой кислоты может наблюдаться не только при недостатке α-токоферола и глутатиона, но и при применении высоких доз аскорбиновой кислоты. Избежать прооксидантного эффекта аскорбиновой кислоты можно в случае создания адекватного внутриклеточного уровня восстановленного глутатиона.With a lack of α-tocopherol and glutathione, the prooxidant effect of ascorbate and its metabolites may prevail. The prooxidant effect of ascorbic acid can be observed not only with a lack of α-tocopherol and glutathione, but also with the use of high doses of ascorbic acid. The prooxidant effect of ascorbic acid can be avoided if an adequate intracellular level of reduced glutathione is created.

Исходя из вышесказанного, целесообразно использовать в эксперименте комплексное применение аскорбата с протектором SH-групп, а именно 1,4-дитиоэритритолом. Для проникновения внутрь клетки пассивным транспортом происходит превращение аскорбиновой кислоты в дегидроаскорбиновую кислоту, затем последняя подвергается обратимому превращению в аскорбиновую кислоту при участии восстановленного глутатиона. Следовательно, комплексная модернизация способа-прототипа позволяет повысить точность защиты клеток от апоптоза.Based on the foregoing, it is advisable to use in the experiment the complex use of ascorbate with a protector of SH-groups, namely 1,4-dithioerythritol. For penetration into the cell by passive transport, the conversion of ascorbic acid to dehydroascorbic acid occurs, then the latter undergoes a reversible conversion to ascorbic acid with the participation of reduced glutathione. Therefore, a comprehensive modernization of the prototype method allows to increase the accuracy of the protection of cells from apoptosis.

Каждый вновь введенный в формулу изобретения признак выполняет функцию повышения точности и эффективности способа: дополнительное добавление в инкубационную среду 1,4-дитиоэритритола и аскорбиновой кислоты в низкой концентрации для последующего определения белково-связанного и восстановленного глутатиона.Each newly introduced into the claims formula performs the function of increasing the accuracy and efficiency of the method: additional addition of low-concentration 1,4-dithioerythritol and ascorbic acid to the incubation medium for the subsequent determination of protein-bound and reduced glutathione.

Роль антиоксидантной системы клетки заключается в снижении токсического эффекта свободных радикалов, в том числе и гидроперекисей липидов.The role of the antioxidant system of the cell is to reduce the toxic effect of free radicals, including lipid hydroperoxides.

Антиоксидантную защиту обеспечивает широкий круг веществ, различных по происхождению, физико-химической природе и механизмам действия. Общим их свойством, по определению J.M. Gutteridge (1992), является способность, присутствуя в низких по сравнению с окисляемым субстратом концентрациях, существенно задерживать или ингибировать его окисление. Постоянное образование прооксидантов должно быть уравновешено их инактивацией, поэтому для поддержания гомеостаза необходима адекватная ситуации непрерывная регенерация антиоксидантной способности клеток [Зенков Н.К. и соавт., 2001; Blokhina О. et al., 2003].Antioxidant protection provides a wide range of substances that are different in origin, physico-chemical nature and mechanisms of action. Their common property, as defined by J.M. Gutteridge (1992), is the ability, present at low concentrations compared with the oxidizable substrate, to significantly delay or inhibit its oxidation. The constant formation of prooxidants should be balanced by their inactivation, therefore, to maintain homeostasis, continuous regeneration of the antioxidant ability of cells is necessary [Zenkov N.K. et al., 2001; Blokhina, O. et al., 2003].

Общепринятой номенклатуры антиоксидантов в настоящее время не существует, хотя ряд авторов [Dimascio Р., 1990; Kaira V. et al., 2001; Зайцев В.Г. и соавт., 2003] выделяет два класса: превентивные, снижающие скорость инициации цепной реакции окисления, и гасящие (прерывающие цепь), препятствующие развитию цепной реакции. К превентивным относят каталазу и пероксидазы, разрушающие ROOH, а также агенты, образующие хелатные комплексы с металлами переменной валентности, к прерывающим цепь - фенолы, ароматические амины. В условиях in vivo главными гасящими антиоксидантами являются: витамин Е, нейтрализующий ROO^• в липидной фазе мембран [Jore D. et al., 1990; Hong J.H. et al., 2004], фермент СОД, улавливающий $O_{2}^{•^{-}}$

в водной фазе клетки [Fridovich L, 1989; Dimascio Р., 1990; Ciurca D., 1992], и церулоплазмин - белок острой фазы, выполняющий антирадикальную функцию в крови [Maridund S.L., 1987; Atanasiu R.L. et al.,1998].The generally accepted nomenclature of antioxidants does not currently exist, although a number of authors [Dimascio R., 1990; Kaira V. et al., 2001; Zaitsev V.G. et al., 2003] distinguishes two classes: preventive, reducing the rate of initiation of a chain oxidation reaction, and quenching (breaking the chain), preventing the development of a chain reaction. Catalase and peroxidases that destroy ROOH, as well as agents that form chelate complexes with metals of variable valency, and phenols and aromatic amines interrupt the chain. Under in vivo conditions, the main quenching antioxidants are: vitamin E, which neutralizes ROO ^• in the lipid phase of membranes [Jore D. et al., 1990; Hong JH et al., 2004], an SOD trapping enzyme

O_{2}^{•^{-}}

in the aqueous phase of the cell [Fridovich L, 1989; Dimascio R., 1990; Ciurca D., 1992], and ceruloplasmin is an acute phase protein that performs an antiradical function in the blood [Maridund SL, 1987; Atanasiu RL et al., 1998].

Более известно деление антиоксидантов на ферменты и соединения неферментативной природы. Последние в определенных концентрациях всегда присутствуют в липидной фазе мембран и водных средах организма и расходуются первыми при устранении проявлений окислительного стресса [Droge W., 2002; Blokhina O., 2003]. Ферменты наиболее активно присоединяется к антиоксидантной защите (АОЗ) после включения механизмов индукции [Лущак В.И., 2001]. При возникновении окислительного стресса (ОС) расход антиоксидантов возрастает и меняется экспрессия генов, кодирующих белковые компоненты АОЗ [Дубинина Е.Е., 2006]. Между ферментами и неферментативными элементами АОЗ существует равновесие, причем последние при ряде патологических состояний организма могут выступать в качестве прооксидантов [Зенков Н.К. и др., 2001].It is more known to divide antioxidants into enzymes and non-enzymatic compounds. The latter, in certain concentrations, are always present in the lipid phase of membranes and body fluids and are consumed first when eliminating the manifestations of oxidative stress [Droge W., 2002; Blokhina O., 2003]. Enzymes most actively join the antioxidant defense (AOD) after the inclusion of induction mechanisms [V. Lushchak, 2001]. When oxidative stress (OS) occurs, the consumption of antioxidants increases and the expression of genes encoding the protein components of AOD changes [Dubinina E.E., 2006]. There is a balance between enzymes and non-enzymatic elements of AOD, and the latter can act as prooxidants in a number of pathological conditions of the body [Zenkov N.K. et al., 2001].

Главную роль среди неферментавных антиоксидантных систем защиты отводят глутатиону.The main role among non-enzymatic antioxidant defense systems is assigned to glutathione.

Функционирование клеток связано с уровнем белково-связанного глутатиона. Определение белково-связанного глутатиона основано на способности боргидрата натрия (NaBH4) высвобождать из связи с белками глутатион, который при взаимодействии с ДТНБ образует окрашенное соединение, а именно тио-2-нитробензойную кислоту, водный раствор которой имеет максимум поглощения при длине волны 412 нм [Burchill B.R. Microtubule dynamics and glutathione metabolism in phagocytizing human polymorphonuclear leukocytes [Text] / B.R. Burchill, J.M. Oliver, C.B. Pearson et al. // J. of Cell Biology. - 1978. - Vol.76, №2. - P.439-447].The functioning of cells is associated with the level of protein-bound glutathione. The definition of protein-bound glutathione is based on the ability of sodium borohydrate (NaBH4) to release glutathione from the protein bond, which when reacted with DTNB forms a colored compound, namely thio-2-nitrobenzoic acid, the aqueous solution of which has an absorption maximum at a wavelength of 412 nm [ Burchill br Microtubule dynamics and glutathione metabolism in phagocytizing human polymorphonuclear leukocytes [Text] / B.R. Burchill, J.M. Oliver, C. B. Pearson et al. // J. of Cell Biology. - 1978. - Vol. 76, No. 2. - P.439-447].

В настоящее время крайне важно определить уровень белково-связанного глутатиона для защиты клеток от апоптоза.It is now extremely important to determine the level of protein-bound glutathione to protect cells from apoptosis.

В настоящее время в лабораторной практике наиболее распространен способ защиты клеток от апоптоза и переокисления с помощью определения концентрации белково-связанного и восстановленного глутатиона.Currently, in laboratory practice, the most common way to protect cells from apoptosis and peroxidation by determining the concentration of protein-bound and reduced glutathione.

Концентрацию гидроксирадикалов определяют методом, предложенным Thom S.R., Elbuken M.E., 1991]. Метод основан на разрушении модельного субстрата 2-дезокси-D-рибозы гидроксильным радикалом, образуемым опсонизированными лимфоцитами.The concentration of hydroxy radicals is determined by the method proposed by Thom S.R., Elbuken M.E., 1991]. The method is based on the destruction of a model substrate of 2-deoxy-D-ribose by a hydroxyl radical formed by opsonized lymphocytes.

Содержание восстановленного глутатиона определяют методом, предложенным М.Е. Anderson (1985) в модификации S. Kojima et al. (2004) [Kojima S. Low dose gamma-rays activate immune functions via induction of glutathione and delay tumor growth / S. Kojima, K. Nakayama, H. Ishida // J. Radiat. Res. - 2004. - Vol.45, №1. - P.33-39]. Принцип метода основан на взаимодействии GSH с 5,5′-дитио-бис(2-нитробензойной) кислотой (ДТНБ) с образованием тио-2-нитробензойной кислоты, водный раствор которой имеет максимум поглощения при длине волны 412 нм. При этом образуется GSSG, который восстанавливается глутатионредуктазой до GSH и вновь взаимодействует с ДТНБ. Скорость образования окрашенного продукта пропорциональна содержанию общего глутатиона. Для определения содержания GSSG пробы прединкубируются с блокатором SH-групп 2-винилпиридином («Wako», Япония), который необратимо связывает GSH, и, следовательно, скорость образования окрашенного продукта пропорциональна содержанию GSSG.The content of reduced glutathione is determined by the method proposed by M.E. Anderson (1985) as modified by S. Kojima et al. (2004) [Kojima S. Low dose gamma-rays activate immune functions via induction of glutathione and delay tumor growth / S. Kojima, K. Nakayama, H. Ishida // J. Radiat. Res. - 2004. - Vol. 45, No. 1. - P.33-39]. The principle of the method is based on the interaction of GSH with 5.5′-dithio-bis (2-nitrobenzoic) acid (DTNB) with the formation of thio-2-nitrobenzoic acid, the aqueous solution of which has an absorption maximum at a wavelength of 412 nm. In this case, GSSG is formed, which is reduced by glutathione reductase to GSH and again interacts with DTNB. The rate of formation of a colored product is proportional to the content of total glutathione. To determine the content of GSSG, samples are preincubated with SH-group blocker 2-vinylpyridine (Wako, Japan), which irreversibly binds GSH, and, therefore, the rate of formation of a colored product is proportional to the content of GSSG.

Лизат клеток готовят на 5% сульфосалициловой кислоте, которая осаждает белки, но не ингибирует активность глутатионредуктазы.A cell lysate is prepared on 5% sulfosalicylic acid, which precipitates proteins but does not inhibit glutathione reductase activity.

Концентрацию белка в клетках определяют методом [A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M.M. Bradford // Analyt. Biochem. - 1976. - Vol.7, №1, 2. - P.248-254], основанным на взаимодействии Кумасси голубого G-250 с остатками аргинина и лизина в белках. Свободный краситель красного цвета (максимум поглощения - 495 нм) при образовании комплекса с белком переходит в синюю форму (максимум поглощения - 595 нм).Protein concentration in cells is determined by the method [A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M.M. Bradford // Analyt. Biochem. - 1976. - Vol.7, No. 1, 2. - P.248-254], based on the interaction of Coomassie blue G-250 with residues of arginine and lysine in proteins. The free red dye (absorption maximum - 495 nm), when complexed with the protein, turns into a blue form (absorption maximum - 595 nm).

К 0,1 мл лизата клеток добавляют 1,0 мл раствора Кумасси голубого (100 мг красителя, 50 мл 96° этанола, 100 мл 85% H₃PO₄, H₂O до 1,0 л), перемешивают, инкубируют 3 мин при комнатной температуре и измеряют оптическую плотность проб (длина волны 595 нм) против контроля, содержащего 0,1 мл воды и 1,0 мл раствора Кумасси голубого. Содержание белка рассчитывают по калибровочной кривой, построенной по разведениям стандартного раствора альбумина (1,0 мг/мл) и выражают в мг/мл.To 0.1 ml of cell lysate, add 1.0 ml of Coomassie blue solution (100 mg of dye, 50 ml of 96 ° ethanol, 100 ml of 85% H ₃ PO ₄ , H ₂ O to 1.0 L), mix, incubate for 3 min at room temperature and measure the optical density of the samples (wavelength 595 nm) against a control containing 0.1 ml of water and 1.0 ml of Kumasi blue solution. Protein content is calculated from a calibration curve constructed from dilutions of a standard albumin solution (1.0 mg / ml) and expressed in mg / ml.

В настоящее время крайне важно для защиты клеток от апоптоза и переокисления оценить концентрацию различных форм глутатиона после стимуляции антиоксидантной активности низкими концентрациями 1,4-дитиоэритритола и аскорбиновой кислоты. Для решения этой задачи предложен новый способ защиты клеток от апоптоза после дополнительного добавления в инкубационную среду 1,4-дитиоэритритола и аскорбиновой кислоты в конечной концентрации 3,0 мМ и 0,1 мМ соответственно.At present, it is extremely important to protect cells from apoptosis and peroxidation to evaluate the concentration of various forms of glutathione after stimulation of antioxidant activity with low concentrations of 1,4-dithioerythritol and ascorbic acid. To solve this problem, a new method of protecting cells from apoptosis after additional addition of 1,4-dithioerythritol and ascorbic acid to a final concentration of 3.0 mM and 0.1 mM, respectively, was proposed.

Все сказанное свидетельствует о крайней важности разработки способа защиты клеток от апоптоза, а также для защиты клеток от токсического действия активных форм кислорода.All of the above indicates the extreme importance of developing a method for protecting cells from apoptosis, as well as for protecting cells from the toxic effects of reactive oxygen species.

Популярность указанного выше способа обоснована его высокой чувствительностью, простотой осуществления и достаточной адекватностью получаемых результатов, лежащих в основе определения концентрации гидроксильных радикалов в среде инкубации лимфоцитов.The popularity of the above method is justified by its high sensitivity, ease of implementation and sufficient adequacy of the results obtained, which are the basis for determining the concentration of hydroxyl radicals in the incubation medium of lymphocytes.

Существенные признаки, характеризующие изобретение, проявили в заявленной совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области, и не являются очевидными для специалиста.The essential features characterizing the invention, showed in the claimed combination of new properties that are not explicitly derived from the prior art in this field, and are not obvious to a specialist.

Идентичной совокупности признаков не обнаружено при изучении патентной и научной медицинской литературы. Данное изобретение может быть использовано в медицинской практике для повышения точности защиты клеток от апоптоза при различных заболевания. Таким образом, следует считать предлагаемое изобретение соответствующим условиям патентеоспособности: «новизна», «изобретательский уровень», «промышленная применимость».An identical set of features was not found in the study of patent and scientific medical literature. This invention can be used in medical practice to improve the accuracy of the protection of cells from apoptosis in various diseases. Thus, the proposed invention should be considered appropriate to the conditions of patentability: "novelty", "inventive step", "industrial applicability".

Метод основан на определении концентрации белок-связанного и восстановленного глутатиона.The method is based on determining the concentration of protein-bound and reduced glutathione.

Способ осуществляется следующим образом поэтапно.The method is as follows in stages.

1. Выделение культуры клеток линии Jurkat.1. Isolation of cell culture line Jurkat.

Культивирование и исследование клеток на апоптоз проводилось в луночных планшетах (2,0×10⁴ клеток на лунку) в питательной среде RPMI-1640 при инкубации 48 часов, температуре 37°С и 5% содержанием СО₂ с добавлением минимальной концентрации индуктора апоптоза - синтетического глюкокортикоида дексаметазона ("KRCA", Словения), составлявшем 10^-4 моль/мл. Затем проводилась оценка количества апоптотических клеток с использованием FITC - меченного аннексина V и пропидиума йодида (PI) методом проточной лазерной цитометрии, а также порводилось определение жизнеспособности клеток по включению трипанового синего. В контроле количество клеток в апоптозе составило 7,06 (6,00-8,71)%, а после инкубации 28,2 (25,1-31,4)% (четырехкратное увеличение)Cultivation and study of cells for apoptosis was carried out in well plates (2.0 × 10 ⁴ cells per well) in RPMI-1640 nutrient medium for 48 hours incubation at 37 ° C and 5% CO ₂ with the addition of a minimum concentration of apoptosis inducer - synthetic glucocorticoid dexamethasone ("KRCA", Slovenia), comprising 10 ^-4 mol / ml. Then, the number of apoptotic cells was estimated using FITC - labeled annexin V and propidium iodide (PI) by flow laser cytometry, and cell viability was determined by the inclusion of trypan blue. In the control, the number of cells in apoptosis was 7.06 (6.00-8.71)%, and after incubation 28.2 (25.1-31.4)% (fourfold increase)

2. Количественное определение численности жизнеспособных клеток с помощью окраски трипановым синим («Serva»,США) микроскопическим методом. Клетки ресуспендируют в 1 мл клеточной взвеси. Отбирают 100 мкл ресуспендированной клеточной суспензии и добавляют 100 мкл 0,1% раствора трипанового синего на физ. растворе, хорошо перемешивают и заполняют камеру Горяева. Предварительно к камере притирают покровное стекло так, чтобы появлялись радужные, ньютоновые кольца (только при этих условиях соблюдался правильный объем камеры). Каплю клеточной взвеси с красителем вносят под притертое покровное стекло. Подсчет клеток производят в 5-ти больших квадратах по диагонали камеры Горяеева. Расчет жизнеспособных клеток по содержанию «мертвых» клеток, окрашенных в синий цвет, производят по формуле:2. Quantitative determination of the number of viable cells using trypan blue staining (Serva, USA) using the microscopic method. Cells are resuspended in 1 ml of cell suspension. Selected 100 μl of the resuspended cell suspension and add 100 μl of a 0.1% trypan blue solution to phys. solution, mix well and fill the chamber Goryaeva. Previously, the coverslip is rubbed to the camera so that rainbow, Newtonian rings appear (only under these conditions the correct chamber volume was observed). A drop of cell suspension with dye is added under the ground glass cover slip. Cell counting is carried out in 5 large squares along the diagonal of the Goryaev camera. The calculation of viable cells according to the content of "dead" cells, stained in blue, is carried out according to the formula:

А×10⁶=(число клеток)/4A × 10 ⁶ = (number of cells) / 4

где А - клеточность лимфоцитов крови.where A is the cellularity of blood lymphocytes.

3. Внесение в инкубационную смесь заявленных добавок.3. The introduction into the incubation mixture of the declared additives.

В культуральную смесь добавляют соединения: 1,4-дитиоэритритол в концентрации 3,0 мМ и аскорбиновую кислоту в конечной концентрации 0,1 мМ.The following compounds are added to the culture mixture: 1,4-dithioerythritol at a concentration of 3.0 mM and ascorbic acid at a final concentration of 0.1 mM.

4. Биохимическое исследование белково-связанного, восстановленного и окисленного глутатиона.4. Biochemical study of protein-bound, reduced and oxidized glutathione.

Лизат лимфоцитов готовят на 5% сульфосалициловой кислоте, которая осаждает белки, но не ингибирует активность глутатионредуктазы. Количество общего глутатиона (GSH и GSSG) определяют в пробе, содержащей 0,1 М Na-фосфатный буфер (pH=7,5) с 1 мМ ЭДТА, 0,4 мМ НАДФН2, 0,3 мМ ДТНБ и 1 U/мл глутатионредуктазы («Wako», Япония). Окисленный глутатион определяют аналогичным способом в клеточном лизате после предварительной инкубации пробы в течение 30 мин с 10 мМ 2-винилпиридином. Расчет содержания общего и окисленного глутатиона производят с помощью калибровочных графиков, для построения которых используют растворы GSH и GSSG («MP», США) в концентрации от 3 до 100 мкМ, обработанные аналогично опытным пробам. Концентрацию GSH рассчитывают как разницу между концентрацией общего глутатиона и GSSG, выражая результат в нмоль/мг белка.Lymphocyte lysate is prepared on 5% sulfosalicylic acid, which precipitates proteins but does not inhibit glutathione reductase activity. The amount of total glutathione (GSH and GSSG) is determined in a sample containing 0.1 M Na-phosphate buffer (pH = 7.5) with 1 mm EDTA, 0.4 mm NADPH2, 0.3 mm DTNB and 1 U / ml glutathione reductase (Wako, Japan). Oxidized glutathione is determined in a similar manner in a cell lysate after preliminary incubation of the sample for 30 min with 10 mM 2-vinylpyridine. The content of total and oxidized glutathione is calculated using calibration graphs, for the construction of which GSH and GSSG solutions (“MP”, USA) are used in a concentration of 3 to 100 μM, processed similarly to experimental samples. The concentration of GSH is calculated as the difference between the concentration of total glutathione and GSSG, expressing the result in nmol / mg protein.

Определение белково-связанного глутатиона.Determination of protein-bound glutathione.

После инкубации в экспериментальных условиях (5% и 20% кислорода) в присутствии или отсутствии NEM, DTE, NAC клетки центрифугируют 5 минут при 4°С и 1500 об/мин для их осаждения. Удаляют супернатант. Добавляют 1 мл охлажденного PBS (pH 7,4). Ресуспендируют на вортексе. Центрифугируют 5 минут при 4°С и 1500 об/мин. Удаляют супернатант. Осадок клеток ресуспендируют в 1 мл 5% сульфосалициловой кислоты для получения клеточного лизата. Центрифугируют при 3000 об/мин 10 мин. 1,0 мл осадка белка инкубируют 1 ч при 50°C с 1,0 мл 1% NaBH₄. Далее оставшийся белок осаждают добавлением 0,4 мл 30% ТХУ. Пробу инкубируют 15 мин при 50°С. Затем пробу охлаждают 5 мин (0°С). Центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. Супернатант смешивают с 2,5 мл PBS (pH 7,4) и добавляют 2,0 мл ацетона для полного окисления NaBH₄. Перемешивают. Центрифугировают 10 мин при 3000 об/мин. Удаляют верхнюю фазу. К нижней фазе добавляют равный объем диэтилового эфира (для удаления ТХУ). Перемешивают. Центрифугировают 10 мин при 3000 об/мин. Затем снова удаляют верхнюю фазу. Далее процедуру отмывки пробы от ТХУ с помощью диэтилового эфира производят 4-кратно. Затем отбирают 0,1 мл жидкости (из нижней фазы) и смешивают с 0,4 мл 0,01 М фосфатного буфера (pH=7,0). В пробу добавляют 0,1 мл 0,4 мг/мл ДТНБ. Пробу спектрофотометрируют при 412 нм против контроля, содержащего воду вместо раствора осажденного белка.After incubation under experimental conditions (5% and 20% oxygen) in the presence or absence of NEM, DTE, NAC, the cells are centrifuged for 5 minutes at 4 ° C and 1500 rpm to precipitate them. Remove supernatant. Add 1 ml of chilled PBS (pH 7.4). Resuspend on the vortex. Centrifuge for 5 minutes at 4 ° C and 1500 rpm. Remove supernatant. The cell pellet was resuspended in 1 ml of 5% sulfosalicylic acid to obtain a cell lysate. Centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes. 1.0 ml of protein precipitate is incubated for 1 h at 50 ° C with 1.0 ml of 1% NaBH ₄ . Next, the remaining protein is precipitated by the addition of 0.4 ml of 30% TCA. The sample is incubated for 15 min at 50 ° C. Then the sample is cooled for 5 min (0 ° C). Centrifuged for 10 min at 3000 rpm. The supernatant was mixed with 2.5 ml of PBS (pH 7.4) and 2.0 ml of acetone was added to completely oxidize NaBH ₄ . Mixed. Centrifuged for 10 min at 3000 rpm. Remove the upper phase. An equal volume of diethyl ether was added to the lower phase (to remove TCA). Mixed. Centrifuged for 10 min at 3000 rpm. Then, the upper phase is again removed. Next, the procedure for washing the sample from TCA using diethyl ether is performed 4 times. Then, 0.1 ml of liquid was taken (from the lower phase) and mixed with 0.4 ml of 0.01 M phosphate buffer (pH = 7.0). 0.1 ml 0.4 mg / ml DTNB is added to the sample. The sample is spectrophotometrically at 412 nm against a control containing water instead of a precipitated protein solution.

Расчет производят с учетом коэффициента молярной экстинкции 13·10³ М^-1 см^-1. Результаты определения концентрации белково-связанного глутатиона выражают в нмоль/мг белка.The calculation is made taking into account the molar extinction coefficient of 13 · 10 ³ M ^-1 cm ^-1 . The results of determining the concentration of protein-bound glutathione are expressed in nmol / mg protein.

Оценка способа защиты клеток от апоптоза по способу-прототипу и предлагаемому способу выполнялось 40 раз. Результаты исследования обработаны статистически с использованием пакета программ Stat Soft Statistica 6.0.Evaluation of the method of protecting cells from apoptosis by the prototype method and the proposed method was performed 40 times. The research results were statistically processed using the Stat Soft Statistica 6.0 software package.

При проведении исследования по способу-прототипу уровень восстановленного глутатиона в среде инкубации клеток в норме составил 2.15±0.18 нмоль/мг белка и белково-связанного глутатиона 2.9±0.25 нмоль/мг белка, а при оценке по предлагаемому способу в случае эффективной защиты клеток от апоптоза уровень восстановленного глутатиона составил 2.7±0.2 нмоль/мг белка и белково-связанного глутатиона 3.5±0.3 нмоль/мг белка. В случае неэффективной защиты клеток от апоптоза уровень восстановленного глутатиона составил 2.27±0.2 нмоль/мг белка и белково-связанного глутатиона 3.0±0.26 нмоль/мг белка (Табл.1). То есть при эффективной защите клеток от апоптоза уровень восстановленного глутатиона возрастает на 25% и более, а белково-связанного глутатиона на 18% и более. При неэффективной защите клеток от апоптоза уровень восстановленного глутатиона увеличивается на 6% и менее, а белково-связанного глутатиона на 4% и менее.When conducting research on the prototype method, the level of reduced glutathione in the cell incubation medium was normally 2.15 ± 0.18 nmol / mg protein and protein-bound glutathione 2.9 ± 0.25 nmol / mg protein, and when evaluated by the proposed method in the case of effective protection of cells from apoptosis the level of reduced glutathione was 2.7 ± 0.2 nmol / mg protein and protein-bound glutathione 3.5 ± 0.3 nmol / mg protein. In the case of ineffective protection of cells from apoptosis, the level of reduced glutathione was 2.27 ± 0.2 nmol / mg protein and protein-bound glutathione 3.0 ± 0.26 nmol / mg protein (Table 1). That is, with effective protection of cells from apoptosis, the level of reduced glutathione increases by 25% or more, and protein-bound glutathione by 18% or more. With ineffective protection of cells from apoptosis, the level of reduced glutathione increases by 6% or less, and protein-bound glutathione by 4% or less.

Полученные результаты уровня глутатиона в среде инкубации клеток соответствуют данным литературы [Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н., 2005].The results of glutathione level in the cell incubation medium are consistent with the literature [Smirnova G.V., Oktyabrsky ON, 2005].

Итак, при применении способа-прототипа был получен недостаточно точный результат, не позволивший установить эффективность защиты клеток от апоптоза, что связано с отсутствием биохимической стимуляции процесса, а наиболее эффективным и точным был предлагаемый способ.So, when applying the prototype method, an insufficiently accurate result was obtained that did not allow to establish the effectiveness of protecting cells from apoptosis, which is associated with the lack of biochemical stimulation of the process, and the proposed method was the most effective and accurate.

При этом предлагаемый способ прост в исполнении и интерпретации полученных результатов.Moreover, the proposed method is simple in the execution and interpretation of the results.

Claims

A method of protecting lymphocytes from apoptosis, including the introduction of 1,4-dithioerythritol and ascorbic acid in a final concentration of 3.0 mmol and 0.1 mmol, respectively, in an incubation medium containing lymphocytes.