RU2533786C2 - Method for making glass knives for preparing stable series of ultra-fine sections - Google Patents
Method for making glass knives for preparing stable series of ultra-fine sections Download PDFInfo
- Publication number
- RU2533786C2 RU2533786C2 RU2012157496/03A RU2012157496A RU2533786C2 RU 2533786 C2 RU2533786 C2 RU 2533786C2 RU 2012157496/03 A RU2012157496/03 A RU 2012157496/03A RU 2012157496 A RU2012157496 A RU 2012157496A RU 2533786 C2 RU2533786 C2 RU 2533786C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- knife
- square
- knives
- glass
- cutting edge
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицинскому и биологическому приборостроению и предназначено для получения гистологических срезов для проведения анализа ультраструктуры ткани.The invention relates to medical and biological instrumentation and is intended to obtain histological sections for analysis of tissue ultrastructure.
Анализ структуры ткани с использованием набора последовательных (серийных) срезов считается одним из наиболее адекватных методов анализа пространственной организации биологических структур, а последующий количественный анализ ультраструктуры большого объема ткани с применением методов объемной (3D) реконструкции именуют «золотым стандартом» в морфометрии.Analysis of tissue structure using a set of sequential (serial) sections is considered one of the most appropriate methods for analyzing the spatial organization of biological structures, and the subsequent quantitative analysis of the ultrastructure of a large volume of tissue using volumetric (3D) reconstruction methods is called the "gold standard" in morphometry.
Подготовка к анализу структуры биообъектов с использованием 3D реконструкции на основе серийных ультратонких срезов в наиболее общей форме требует соблюдения нескольких ключевых правил.Preparation for the analysis of the structure of biological objects using 3D reconstruction based on serial ultrathin sections in the most general form requires the observance of several key rules.
Правила состоят в необходимости: 1) качественной химической фиксации ткани, 2) адекватного подбора заливочной среды из смеси эпоксидных смол, 3) наличия качественных ножей для ультратомии, 4) специальной подготовки пирамидки, расположенной на поверхности блока с тканью; 5) получения с поверхности этой пирамидки достаточно длинной ленточки из 100-200 серийных срезов, 6) аккуратного монтировании этой ленточки срезов на бленду, покрытую пленкой-подложкой, выполненной, например, из формвара, коллодия или пиолоформа, 7) контрастирования срезов, исключающих их загрязнение. The rules consist of the need for: 1) high-quality chemical fixation of the tissue, 2) adequate selection of the filling medium from a mixture of epoxy resins, 3) the availability of high-quality knives for ultratomy, 4) special preparation of the pyramid located on the surface of the block with the fabric; 5) receiving from the surface of this pyramid a sufficiently long ribbon of 100-200 serial slices, 6) carefully mounting this ribbon of slices on a hood coated with a backing film made, for example, of formar, collodion or pyoform, 7) contrasting the slices excluding them pollution.
Процесс получения ультратонких срезов на специальных приборах - ультратомах, оборудованных антивибрационными устройствами, состоит в том, что образец ткани, заключенный в твердый полимер из эпоксидных смол (гистологический блок) и заточенный в форме усеченной пирамидки, совершает последовательные возвратно-поступательные движения вверх-вниз относительно ножа ультратома, оборудованного приемной ванночкой с жидкостью. Режущая кромка ножа отсекает от поверхности пирамидки гистологического блока срезы в виде отдельных или сцепленных пластинок толщиной 50-100 нм, которые формируют ленту (серию) на поверхности жидкости в ванночке ножа.The process of obtaining ultrathin sections on special instruments - ultratomes equipped with anti-vibration devices, consists in the fact that a tissue sample enclosed in a solid polymer of epoxy resins (histological block) and sharpened in the form of a truncated pyramid performs successive reciprocating movements up and down relative to ultratome knife equipped with a receiving tray with liquid. The cutting edge of the knife cuts off from the surface of the pyramid of the histological block sections in the form of separate or linked plates with a thickness of 50-100 nm, which form a tape (series) on the surface of the liquid in the knife tray.
Вне зависимости от типа исследуемой ткани/объекта, способа ее фиксации, свойств заливочной среды и материала, из которого изготовлен нож для ультратомии, необходимым условием для количественного ультраструктурного анализа на основе 3D реконструкции является получение на поверхности жидкости в ванночке ножа достаточно длинной, ровной и стабильной ленты из 100-200 срезов одинаковой толщины. Стабильность ленты срезов, т.е. ее устойчивость к разрывам при манипуляциях с ней обеспечивает удобство переноса серии с поверхности жидкости и монтирования ее на пленку-подложку без нарушения целостности серии и последовательности срезов в ней.Regardless of the type of tissue / object being studied, the way it is fixed, the properties of the pouring medium and the material from which the knife for ultratomy is made, a prerequisite for quantitative ultrastructural analysis based on 3D reconstruction is to obtain a sufficiently long, even and stable surface of the liquid in the knife bath tapes from 100-200 sections of the same thickness. The stability of the tape slices, i.e. its resistance to tearing during manipulations with it provides the convenience of transferring the series from the surface of the liquid and mounting it on the substrate film without violating the integrity of the series and the sequence of slices in it.
Ключевыми факторами для формирования ровной стабильной ленты из последовательных срезов одинаковой толщины является соблюдение двух условий: 1) параллельность нижней (падающей на режущую кромку ножа) и верхней (от которой отрывается срез) граней пирамидки, сформированной на поверхности блока, и 2) сохранение линейных размеров срезов по мере увеличения их числа в ленточке в процессе ультратомии. Отклонение граней пирамидки от параллели является одной из причин неоднородной толщины среза, изгиба и разрыва ленточки срезов еще до ее монтирования на пленку-подложку. Кроме того, манипулировать изогнутой ленточкой срезов в ванночке ножа и монтировать ее по центру пленки-подложки крайне затруднительно. Изогнутая ленточка создаст дополнительные проблемы при поиске и фотографировании одного и того же участка на последовательных срезах в электронном микроскопе и последующее взаимное выравнивание серийных изображений для 3D реконструкции. Несоблюдение второго условия является причиной увеличения срезаемой площади с поверхности пирамидки и, как следствие, причиной изменения нагрузки на режущую кромку ножа по мере увеличения длины серии. Такое изменение условий резки в процессе получения серии может потребовать от оператора ультратома неотложной подстройки скорости движения образца и величины подачи образца к ножу, что неизбежно приведет к увеличению вибрации ультратома, которая проявится в неравномерной толщине срезов в серии. Соблюсти второе условие можно в том случае, если поверхность блока с тканью заточена не в форме чаще используемой усеченной пирамидки, а в форме (чаще удлиненного) параллелепипеда, выступающего над поверхностью блока на 15-30 мкм. Формирование параллелепипеда на поверхности блока с тканью именуется «заточкой пирамидки способом мезы» [1; 2].The key factors for forming an even, stable ribbon from successive slices of the same thickness are two conditions: 1) parallelism between the lower (falling on the cutting edge of the knife) and the upper (from which the cut comes off) faces of the pyramid formed on the block surface, and 2) maintaining linear dimensions sections as their number in the ribbon increases during ultratomy. The deviation of the faces of the pyramid from the parallel is one of the reasons for the inhomogeneous thickness of the slice, bending and tearing of the ribbon of slices even before it is mounted on the substrate film. In addition, it is extremely difficult to manipulate the curved ribbon of slices in the knife bath and mount it in the center of the substrate film. A curved ribbon will create additional problems when searching and photographing the same area on successive sections in an electron microscope and the subsequent mutual alignment of serial images for 3D reconstruction. Failure to comply with the second condition is the reason for the increase in the cut-off area from the surface of the pyramid and, as a result, the change in the load on the cutting edge of the knife as the length of the series increases. Such a change in the cutting conditions during the production of the series may require the operator of the ultratome to urgently adjust the speed of the sample and the feed rate of the sample to the knife, which will inevitably lead to an increase in the vibration of the ultratome, which will manifest itself in the uneven thickness of the slices in the series. The second condition can be observed if the surface of the block with the fabric is sharpened not in the form of a commonly used truncated pyramid, but in the form of (often elongated) parallelepiped protruding 15-30 microns above the surface of the block. The formation of the parallelepiped on the surface of the block with the fabric is called "sharpening the pyramid using the mesa method" [1; 2].
Боковые поверхности такого параллелепипеда можно получить непосредственно на ультратоме, обтачивая блок с тканью острым уголком стеклянного ножа для ультратомии в качестве резца на глубину 15-30 мкм [1; 2], и повторяя процедуру, последовательно разворачивая образец на угол 90° или 180°. Для воспроизводимости качества результата желательно использовать стеклянные ножи с заданным профилем режущей кромки. Известны способы приготовления стеклянных ножей вручную [3] и устройства - найфмейкеры, позволяющие получать высококачественные ножи с заданной формой профиля режущей кромки, например найфмейкеры, производившиеся шведской компанией LKB-Produkter АВ (патент США №3207398 [4]), или найфмейкеры последнего поколения Leica ЕМ KMR3, производимые компанией Leica Microsystems Inc. (USA) и RMC GKM-2, производимые компанией Boeckeler Instruments Inc. (отделение RMC Products, USA).The lateral surfaces of such a parallelepiped can be obtained directly on the ultratome, turning the block with the tissue with the sharp corner of a glass knife for ultratomy as a cutter to a depth of 15-30 microns [1; 2], and repeating the procedure, sequentially turning the sample at an angle of 90 ° or 180 °. For reproducible quality of the result, it is desirable to use glass knives with a given profile of the cutting edge. Known methods for making glass knives manually [3] and device-life makers that allow to obtain high-quality knives with a given profile shape of the cutting edge, for example life makers made by the Swedish company LKB-Produkter AB (US patent No. 3207398 [4]), or life-makers of the latest generation Leica EM KMR3 manufactured by Leica Microsystems Inc. (USA) and RMC GKM-2 manufactured by Boeckeler Instruments Inc. (branch of RMC Products, USA).
Современные ультрамикротомы оборудованы объектодержателями со шкалой, позволяющей поворачивать образец на определенный угол. Но на практике развернуть образец точно на заданный угол 90° или 180° не удается. Даже если подготовленные таким образом грани пирамидки и окажутся близки к параллели, то разница между ними даже в 0,5° даст изгиб полученной ленточки из 100 срезов на угол около 40-50°, что значительно уменьшит однородность толщины срезов и стабильность ленты срезов при манипуляциях с ней.Modern ultra-microtomes are equipped with object holders with a scale that allows you to rotate the sample at a certain angle. But in practice, it is not possible to expand the sample exactly at a given angle of 90 ° or 180 °. Even if the faces of the pyramid prepared in this way turn out to be close to the parallel, then a difference of even 0.5 ° between them will give a bend of the obtained ribbon of 100 slices to an angle of about 40-50 °, which will significantly reduce the uniformity of the thickness of the slices and the stability of the ribbon of slices during handling with her.
Известен способ получения параллельных боковых граней удлиненного параллелепипеда на поверхности блока с тканью, при котором положение объекте держателя и образца остается неизменным, меняется лишь положение ножа [6]. Такой способ реализуют с использованием алмазного ножа для криоультратомии CryoTrim 45° (Diatome U.S., Inc. USA). Этот нож имеет режущие кромки с фронтальной, с левой и с правой стороны. Сначала правой стороной режущей кромки ножа стачивают поверхность блока слева, а затем левой стороной режущей кромки ножа стачивают поверхность блока справа, получая две параллельные грани формируемого параллелепипеда. Затем образец разворачивают на угол, близкий к 90°, по длинной оси штанги объектодержателя и процедуру повторяют. В процессе получения срезов одна из удлиненных граней будет служить нижней (падающей на режущую кромку ножа), а параллельная ей вторая - верхней (от которой отрывается срез). Стоит новый CryoTrim 45° довольно дорого; стоимость алмазных ножей на три порядка превышает стоимость ножей стеклянных.A known method of obtaining parallel side faces of an elongated parallelepiped on the surface of the block with a fabric, in which the position of the holder and the sample remains unchanged, only the position of the knife changes [6]. This method is implemented using a CryoTrim 45 ° diamond knife for cryo-ultratomy (Diatome U.S., Inc. USA). This knife has cutting edges on the front, left and right sides. First, the surface of the block on the left is grind off by the right side of the knife’s edge, and then the surface of the block is grind off by the left side of the knife, receiving two parallel faces of the formed parallelepiped. Then the sample is deployed at an angle close to 90 °, along the long axis of the object holder rod and the procedure is repeated. In the process of obtaining slices, one of the elongated faces will serve as the bottom (falling on the cutting edge of the knife), and the second parallel to it will serve as the upper (from which the cut comes off). The new CryoTrim 45 ° is quite expensive; the cost of diamond knives is three orders of magnitude higher than the cost of glass knives.
Известен способ получения параллельных боковых граней удлиненного параллелепипеда на поверхности блока с тканью, предложенный Ханссеном с соавт., при котором положение образца также не меняется, но в качестве резца используется не алмазный, а стеклянный нож, выполненный с формированием двух острых уголков, расположенных на одном ноже симметрично относительно короткой оси плоскости разлома квадрата [7]. Иными словами, такой нож имеет форму треугольной призмы, где один угол треугольника является углом квадрата и составляет 90°, а два других угла треугольника являются режущими уголками ножа. Одним уголком можно заточить одну грань параллелепипеда, а симметрично расположенным уголком - грань, параллельную первой. Основной недостаток данного способа формирования режущих кромок ножей состоит в том, что для получения ножей такой формы линию разлома стеклянного квадрата (из которого формируют один нож), параллельную диагонали квадрата от диагонали, смещают в сторону, что требует изменения настроек найфмейкера. В последующем, для воспроизводимости высокого качества стеклянных ножей для ультратомии потребуется вернуть настройки найфмейкера к исходным, что требует длительной его настройки и значительных затрат специального стекла для изготовления ножей. Второй недостаток данного способа состоит в том, что режущие две кромки и два острых уголка такого ножа сформированы на разных поверхностях разлома стекла: одни - на более однородной по профилю поверхности производственного разлома стекла на полосы, а другие - на поверхности разлома стеклянных полос на квадраты на найфмейкере, что негативно влияет на разницу в качестве получаемых боковых поверхностей параллелепипеда.A known method of producing parallel lateral faces of an elongated parallelepiped on the surface of a block with a fabric, proposed by Hanssen et al., In which the position of the sample also does not change, but not a diamond knife, but a glass knife, made with the formation of two sharp corners located on one it is also symmetrical with respect to the short axis of the plane of the fault of the square [7]. In other words, such a knife has the shape of a triangular prism, where one corner of the triangle is the angle of the square and is 90 °, and the other two angles of the triangle are the cutting corners of the knife. One corner can sharpen one face of the parallelepiped, and symmetrically located corner - the side parallel to the first. The main disadvantage of this method of forming the cutting edges of the knives is that to obtain knives of this shape, the fault line of the glass square (from which one knife is formed) parallel to the diagonal of the square from the diagonal is shifted to the side, which requires changing the settings of the knifemaker. Subsequently, for reproducibility of high quality glass knives for ultratomy, it will be necessary to return the settings of the life maker to the original ones, which requires a long setup and significant costs of special glass for making knives. The second disadvantage of this method is that the cutting two edges and two sharp corners of such a knife are formed on different surfaces of the glass fault: one on the more uniform surface profile of the production glass fault into stripes, and the other on the surface of the glass strip fault into squares per nifmaker, which negatively affects the difference in the quality of the resulting side surfaces of the box.
Технический результат изобретения в части способа состоит в расширении арсенала технических средств получения двух параллельных граней «пирамидки» (параллелепипеда) на поверхности гистологического блока с тканью для получения с него стабильной серии ультратонких срезов на основе дешевого и быстрого метода создания двух стеклянных ножей с левой и правой режущими кромками (уголками), зеркально расположенными друг относительно друга.The technical result of the invention in terms of the method consists in expanding the arsenal of technical means for obtaining two parallel faces of the “pyramid” (parallelepiped) on the surface of the histological block with tissue to obtain a stable series of ultra-thin sections from it based on a cheap and quick method of creating two glass knives with left and right cutting edges (corners), mirrored relative to each other.
Сущность изобретения состоит в том, что получают два стеклянных ножа способом, в соответствии с которым отрезают первый квадрат от стеклянной полосы, поворачивают его против часовой стрелки на 45° в горизонтальной плоскости, фиксируют в регулируемых крепежных элементах найфмейкера, надрезают и разламывают квадрат на два ножа, выбирают первый нож, имеющий острый уголок режущей кромки слева, и изготавливают второй нож из второго квадрата, который поворачивают по часовой стрелке на 45° в горизонтальной плоскости, дополнительно второй квадрат переворачивают на 180° вдоль оси, совпадающей с длинной осью найфмейкера, закрепляют второй квадрат в крепежных элементах найфмейкера, надрезают и разламывают второй квадрат на два ножа, из которых, выбирают второй нож, имеющий острый уголок режущей кромки справа, и формируют пару из первого и второго ножей, позволяющих формировать две строго параллельные боковые грани пирамидки на поверхности образца ткани без изменения его положения в держателе образца ультратома.The essence of the invention lies in the fact that two glass knives are obtained by the method according to which the first square is cut from the glass strip, turned it counterclockwise by 45 ° in the horizontal plane, fixed in adjustable fasteners of the knifemaker, cut and break the square into two knives , choose the first knife having a sharp corner of the cutting edge on the left, and make the second knife from the second square, which is rotated clockwise 45 ° in the horizontal plane, optionally the second square t is rotated 180 ° along the axis coinciding with the long axis of the knifemaker, fasten the second square in the fasteners of the knifemaker, cut and break the second square into two knives, from which, select the second knife having a sharp corner of the cutting edge to the right, and form a pair of the first and a second knife, allowing the formation of two strictly parallel lateral sides of the pyramid on the surface of the tissue sample without changing its position in the sample holder of the ultratome.
Предлагаемый метод не требует изменения настроек найфмейкера. Он основан только на изменении положения стеклянных квадратов, из которых приготовляют два ножа.The proposed method does not require changing the settings of the life maker. It is based only on changing the position of the glass squares from which two knives are made.
Изобретение поясняется чертежамиThe invention is illustrated by drawings.
Фиг.1. Схема этапов формирования первого и второго ножа с «зеркальным» расположением острого уголка.Figure 1. Diagram of the stages of the formation of the first and second knife with a "mirror" location of an acute angle.
Фиг.2. Схема смещения линии разреза стеклянного квадрата от его диагонали.Figure 2. Scheme of displacement of the cut line of a glass square from its diagonal.
Фиг.3. Схема использования двух форм стеклянных ножей для получения строго параллельных боковых граней формируемого параллелепипеда.Figure 3. The scheme of using two forms of glass knives to obtain strictly parallel side faces of the formed parallelepiped.
Описание изобретенияDescription of the invention
В процессе подготовки образцов биологической ткани для 3D реконструкции ее ультраструктуры на основе последовательных (серийных) ультратонких срезов было обнаружено, что существует техническое решение, которое позволяет усовершенствовать способ получения стабильной ленты серийных срезов однородной толщины на поверхности жидкости в ванночке ножа ультратома за счет усовершенствования способа заточки пирамидки при помощи стеклянных ножей, который повышает точность формирования параллельности сторон пирамидки на гистологическом блоке с тканью, повышает качество ее сформированных поверхностей, повышает однородность условий получения последовательных срезов в начале и в конце серии. Техническое решение реализовано в новом способе изготовления пары стеклянных ножей, режущие кромки (уголки) которых сформированы зеркально друг относительно друга, что позволяет использовать их для формирования точно параллельных левой и правой сторон пирамидки без изменения положения блока с тканью.In the process of preparing biological tissue samples for 3D reconstruction of its ultrastructure based on sequential (serial) ultrathin sections, it was found that there is a technical solution that allows to improve the method of obtaining a stable tape of serial sections of uniform thickness on the surface of the liquid in the ultratome knife tray by improving the sharpening method pyramids with glass knives, which increases the accuracy of the formation of parallelism of the sides of the pyramid on the histological block e with a cloth, it enhances the quality of the formed surfaces, increases the uniformity of the conditions for obtaining successive sections at the beginning and end of the series. The technical solution is implemented in a new method for manufacturing a pair of glass knives, the cutting edges (corners) of which are mirror-shaped relative to each other, which allows them to be used to form exactly parallel left and right sides of the pyramid without changing the position of the block with the fabric.
Предлагаемый способ изготовления пары ножей для формирования пирамидок не требует изменения и длительной настройки предустановленных положений крепежных элементов найфмейкера, фиксирующих стеклянные квадраты, при разломе их на два ножа, которая необходима для изготовления ножей высокого качества для получения ультратонких срезов.The proposed method for manufacturing a pair of knives for the formation of pyramids does not require changing and long-term tuning of the preset positions of the fasteners of the knifemaker that fix the glass squares when they are broken into two knives, which is necessary for the manufacture of high-quality knives to obtain ultra-thin slices.
Предлагаемый способ состоит из двух стадий. На первой стадии используют стандартную процедуру приготовления ножей из квадратов согласно, например, техническому описанию найфмейкера серии 7800 [5], такие ножи имеют острый уголок слева. На верхней части фиг.1 приведена схема изготовления стеклянных ножей по этой стандартной процедуре. Стандартная последовательность операций при приготовлении ножей с углом в 45° на найфмейкере LKB серии 7800 состоит из следующих шагов: а) закрепляют стеклянную полосу 1 для изготовления ножей между прижимными 2 и ломающими 3 штырями найфмейкера так, чтобы след стеклореза от производственного разлома стекла на полосы был расположен снизу (на фиг.1 - плоскость производственного разлома стекла на полосы выделена точечной штриховкой); б) стеклянную полосу 1 надрезают стеклорезом каретки найфмейкера, формируя первый стеклянный квадрат 4; в) отламывают стеклянный квадрат 4 от полосы 1; г) разворачивают стеклянный квадрат 4 против часовой стрелки на 45° в горизонтальной плоскости, по вертикальной оси 5; д) закрепляют стеклянный квадрат 4 прижимными вилочками 6 найфмейкера, между прижимными 2 и ломающими 3 штырями; е) надрезают квадрат 4 стеклорезом каретки найфмейкера; ж) подъемом ломающих штырей 3 разламывают квадрат 4 на два ножа 7 и 8.The proposed method consists of two stages. At the first stage, the standard procedure for preparing knives from squares is used according to, for example, the technical description of the knifemaker of the 7800 series [5], such knives have a sharp corner on the left. On the upper part of figure 1 is a diagram of the manufacture of glass knives according to this standard procedure. The standard procedure for preparing knives with an angle of 45 ° on the LKB 7800 nifmaker consists of the following steps: a) fasten the glass strip 1 for making knives between the
Фиг.2А иллюстрирует отклонение линии разреза квадрата от его диагонали. Квадрат 4 всегда надрезают не строго по диагонали, но так чтобы смещение 9 линии надреза 10 относительно диагонали 11 квадрата по возможности было меньше 0,1 мм [8]. Настройка величины смещения 9 требует кропотливой длительной тонкой настройки взаиморасположения прижимных вилочек 6 за счет их бокового смещения 12, а также значительных затрат стеклянных полос. Для сравнения на Фиг.2Б приведена схема изменения положения линии разлома квадрата по методу, предложенному Ханссеном с соавт.[7].2A illustrates the deviation of the cut line of a square from its diagonal. Square 4 is always not cut strictly diagonally, but so that the
На второй стадии изготовляют нож для получения левой боковой грани формируемого параллелепипеда. На нижней части фиг.1 приведена схема изготовления ножа с зеркальным расположением режущей кромки по предлагаемому способу, состоящему из следующих шагов: з) закрепляют оставшуюся часть стеклянной полосы 1 между опорными и ломающими штырями каретки найфмейкера; и) надрезают стеклорезом стеклянную полосу 1, формируя второй квадрат 17; к) отламывают второй квадрат 17 от полосы 1 для изготовления ножей, л) разворачивают квадрат 17 по часовой стрелке на 45° в горизонтальной плоскости, по вертикальной оси 5; м) переворачивают квадрат на 180° относительно его диагонали 18, совпадающей с длинной осью найфмейкера таким образом, чтобы исходная верхняя поверхность квадрата оказалась внизу, н) закрепляют квадрат 17 прижимными вилочками 6 найфмейкера и штырями 2 и 3; о) надрезают второй квадрат 17 стеклорезом каретки найфмейкера; п) рукояткой, поднимающей ломающие штыри, разламывают второй квадрат 17 на два ножа 19 и 20.At the second stage, a knife is made to obtain the left side face of the formed parallelepiped. On the lower part of figure 1 is a diagram of the manufacture of a knife with a mirror arrangement of the cutting edge according to the proposed method, consisting of the following steps: h) fix the remaining part of the glass strip 1 between the support and breaking pins of the carriage of the knifemaker; i) cut a glass strip 1 with a glass cutter, forming a
Фиг.3А иллюстрирует то, как левый уголок первого типа изготовленных ножей (7 или 8) с режущей кромкой (уголком) слева 13 используют для создания правой грани 14 формируемого параллелепипеда, срезая поверхность блока с тканью 15. Режущая кромка первого типа ножей (7 и 8) справа заканчивается неровной поверхностью плоскости стеклянного квадрата 4, имеющей след от стеклореза 16, и непригодна для заточки грани формируемого параллелепипеда слева 22.3A illustrates how the left corner of the first type of manufactured knives (7 or 8) with a cutting edge (corner) on the left 13 is used to create the
Фиг.3Б иллюстрирует то, как правый уголок 21 ножа 20 используют для формирования боковой поверхности формируемого параллелепипеда слева 22 строго параллельной поверхности 14. Режущие кромки (уголки) второго типа ножей 19 и 20 слева заканчиваются неровной поверхностью плоскости стеклянного квадрата 17, имеющей след от стеклореза 16, и непригодны для формирования грани параллелепипеда слева 14. Нож 19,как правило, имеет сколотый правый уголок 21 и непригоден для формирования боковой грани параллелепипеда.Fig.3B illustrates how the
Полученные ножи используют в качестве резца при подготовке на гистологическом блоке с тканью выступа в форме параллелепипеда для получения с поверхности этого параллелепипеда серийных ультратонких срезов для последующего исследования ультраструктуры ткани методами 3D реконструкции. Формирование параллелепипеда на гистологическом блоке производят с использованием ультратома, например Leica ЕМ UC6 (Leica Microsistems Inc., USA), в автоматическом режиме: блок, зажатый в объектодержателе, совершает возвратно-поступательные движения вверх-вниз относительно острого левого уголка первого типа стеклянного ножа, закрепленного в держателе,со скоростью 50-100 мм/с с пошаговой подачей блока к ножу на 10-50 нм в ходе каждого цикла возвратно-поступательного движения, вплоть до достижения необходимой глубины от лицевой поверхности блока. Затем первый тип ножа заменяют на второй тип с зеркальным (правым) расположением острого уголка, изменяют положение держателя ножа так, чтобы расстояние между параллельными гранями формируемого параллелепипеда составляло 15-50 мкм, и повторяют операцию, создавая две строго параллельные боковые грани формируемого параллелепипеда. Объектодержатель с образцом разворачивают на угол, близкий к 90°, и обе операции повторяют.The resulting knives are used as a cutter when preparing a protrusion in the shape of a parallelepiped on a histological block with tissue to obtain serial ultrathin sections from the surface of this parallelepiped for subsequent study of tissue ultrastructure by 3D reconstruction methods. The parallelepiped is formed on the histological block using an ultratome, for example, Leica EM UC6 (Leica Microsistems Inc., USA), in automatic mode: the block, clamped in the object holder, performs reciprocating movements up and down relative to the sharp left corner of the first type of glass knife, fixed in the holder, at a speed of 50-100 mm / s with a stepwise feed of the block to the knife at 10-50 nm during each cycle of the reciprocating movement, until the required depth is reached from the front surface of the block. Then, the first type of knife is replaced with the second type with a mirror (right) location of the sharp corner, the position of the knife holder is changed so that the distance between the parallel faces of the formed parallelepiped is 15-50 μm, and the operation is repeated, creating two strictly parallel side faces of the formed parallelepiped. The object holder with the sample is deployed at an angle close to 90 °, and both operations are repeated.
Описан способ изготовления пары стеклянных ножей с зеркальным профилем расположения режущей части друг относительно друга для формирования параллельных граней пирамидки (параллелепипеда) на поверхности блока с исследуемым образцом, облегчающих получение стабильной серии ультратонких срезов. Способ изготовления пары стеклянных ножей с зеркальным профилем режущей части друг относительно друга проверен на найфмейкерах LKB 7800, LKB 7801, Reichert-Jung серии 705202, Leica ЕМ KMR2 и может быть реализован на найфмейкерах нового поколения, Leica ЕМ KMR3 и RMC GKM-2,без изменения настроек их крепежных элементов, положение которых предустановлено для приготовления стеклянных ножей оптимального качества для ультратомии. Пара стеклянных ножей, с левой и правой режущими поверхностями, приготовленных описанным способом, позволяет подготовить до 10 и более пирамидок мягких тканей, залитых в смеси эпоксидных смол, для получения с них серий ультратонких срезов. Представленный способ прост, основан лишь на изменении ориентации стеклянного квадрата при разломе на два ножа и реализуем с использованием практически любого доступного на сегодняшний день найфмейкера.A method is described for manufacturing a pair of glass knives with a mirror profile of the cutting part relative to each other to form parallel faces of the pyramid (parallelepiped) on the surface of the block with the test sample, making it easier to obtain a stable series of ultrathin sections. A method of manufacturing a pair of glass knives with a mirror profile of the cutting part relative to each other has been tested on LIFB 7800, LKB 7801, Reichert-Jung series 705202, Leica EM KMR2 and it can be implemented on a new generation of makers, Leica EM KMR3 and RMC GKM-2, without changing the settings of their fasteners, the position of which is predefined for the preparation of glass knives of optimal quality for ultratomy. A pair of glass knives, with left and right cutting surfaces, prepared as described, allows you to prepare up to 10 or more pyramids of soft tissues, embedded in a mixture of epoxy resins, to obtain a series of ultrathin sections from them. The presented method is simple, it is based only on a change in the orientation of the glass square during a break into two knives and is implemented using almost any knifemaker available today.
Литература:Literature:
1. Миронов и др., Методы электронной микроскопии в биологии и медицине. Методическое руководство. СПб., Наука, стр.72-74 (1994).1. Mironov et al., Methods of electron microscopy in biology and medicine. Methodical guide. St. Petersburg, Science, pp. 72-74 (1994).
2. de Bruijn, W.С, McGee-Russell, S.M. (1966). Bridging a gap in pathology and histology. Journal of the Royal Microscopical Society. 85(1): 77-90.2. de Bruijn, W.C., McGee-Russell, S.M. (1966). Bridging a gap in pathology and histology. Journal of the Royal Microscopical Society. 85 (1): 77-90.
3. Уикли Б. Электронная микроскопия для начинающих. М., Мир, 1975, стр.71-77.3. Wickley B. Electron microscopy for beginners. M., Mir, 1975, pp. 71-77.
4. Патент США №3207398. Во Gosta Forsstrom, Karl Goran Algy Persson. Device for cutting a glass plate so as to produce a sharp edge (21.09.1965).4. US patent No. 3207398. In Gosta Forsstrom, Karl Goran Algy Persson. Device for cutting a glass plate so as to produce a sharp edge (09/21/1965).
5. LKB 7800B KnifeMaker Operation Instruction. LKB-Produkter AB. (1977).5. LKB 7800B KnifeMaker Operation Instruction. LKB-Produkter AB. (1977).
6. Harris et al, Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy. Journal of Neuroscience. 26(47): 12101-12103 (2006).6. Harris et al, Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy. Journal of Neuroscience. 26 (47): 12101-12103 (2006).
7. Hanssen E. et al., Ultrastructure of the asexual blood stages of Plasmodium falciparum. Methods in cell biology, vol.96, p.93-116. Elsevier (2010).7. Hanssen E. et al., Ultrastructure of the asexual blood stages of Plasmodium falciparum. Methods in cell biology, vol. 96, p. 93-116. Elsevier (2010).
8. Hagler H.K. Ultramicrotomy for biological electron microscopy. In: Methods in molecular biology, vol.39, p.67-96. Humana press (2007).8. Hagler H.K. Ultramicrotomy for biological electron microscopy. In: Methods in molecular biology, vol. 39, p. 67-96. Humana press (2007).
Claims (5)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012157496/03A RU2533786C2 (en) | 2012-11-29 | 2012-11-29 | Method for making glass knives for preparing stable series of ultra-fine sections |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012157496/03A RU2533786C2 (en) | 2012-11-29 | 2012-11-29 | Method for making glass knives for preparing stable series of ultra-fine sections |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2012157496A RU2012157496A (en) | 2014-06-10 |
| RU2533786C2 true RU2533786C2 (en) | 2014-11-20 |
Family
ID=51214228
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012157496/03A RU2533786C2 (en) | 2012-11-29 | 2012-11-29 | Method for making glass knives for preparing stable series of ultra-fine sections |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2533786C2 (en) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3494521A (en) * | 1966-05-24 | 1970-02-10 | Lkb Produkter Ab | Method and an apparatus for manufacturing a glass knife for a microtome |
| GB2024199A (en) * | 1978-07-04 | 1980-01-09 | Lkb Produkter Ab | Breaking glass plate |
| SU1024429A1 (en) * | 1982-01-22 | 1983-06-23 | Gevondyan Tigran A | Method and apparatus for making glass knife |
| RU2206525C2 (en) * | 2001-07-25 | 2003-06-20 | Кондратенко Владимир Степанович | Method of cutting friable non-metallic materials |
-
2012
- 2012-11-29 RU RU2012157496/03A patent/RU2533786C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3494521A (en) * | 1966-05-24 | 1970-02-10 | Lkb Produkter Ab | Method and an apparatus for manufacturing a glass knife for a microtome |
| GB2024199A (en) * | 1978-07-04 | 1980-01-09 | Lkb Produkter Ab | Breaking glass plate |
| SU1024429A1 (en) * | 1982-01-22 | 1983-06-23 | Gevondyan Tigran A | Method and apparatus for making glass knife |
| RU2206525C2 (en) * | 2001-07-25 | 2003-06-20 | Кондратенко Владимир Степанович | Method of cutting friable non-metallic materials |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2012157496A (en) | 2014-06-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Severs | Freeze-fracture electron microscopy | |
| CN109000956B (en) | Method for manufacturing small-interval continuous pathological section of full breast tumor | |
| JP2010502983A (en) | Method and apparatus for cutting out fresh tissue slices | |
| JP2019197070A (en) | Motion scheme for scanning type microscope imaging | |
| JP2022177037A5 (en) | ||
| US4485706A (en) | Methods and apparatus for cutting a substrate | |
| RU2533786C2 (en) | Method for making glass knives for preparing stable series of ultra-fine sections | |
| US11320349B2 (en) | Spheroid tissue microarray and methods of manufacture | |
| JP6233889B2 (en) | Sample dispensing apparatus and protein crystallization method | |
| US4024779A (en) | Anti-roll device for ultramicrotomes | |
| US20170276574A1 (en) | Microtomy method and device | |
| CN203148713U (en) | Testing and sampling device for carbon fiber tow linear density | |
| EP2009419B1 (en) | Measuring the thickness of organic samples | |
| GB2545843A (en) | Fixed position controller and method | |
| JP4683425B2 (en) | Automatic thin section preparation apparatus, automatic thin section preparation apparatus, and automatic thin section preparation method | |
| DE2416391A1 (en) | METHOD AND APPARATUS FOR FRACTIONATION AND IDENTIFICATION OF PROTEIN BY STARCH CONE ELECTROPHORESIS | |
| RU2525436C1 (en) | Method for fixing and producing histological preparations | |
| JP2001289747A (en) | Apparatus and method for lamina sample preparation | |
| CN214446690U (en) | Miniature section device of gel class high-molecular polymer | |
| SU1355894A1 (en) | Device for cutting histological specimens | |
| CN212255865U (en) | Microscope slicing table | |
| Rogachevskii | A method of mesa trimming with glass knives for obtaining large series of ultrathin sections | |
| Osborne | Micro-Analysis of Textile Fibres: Part I.—Techniques: Sectioning, Dissecting, Swelling, Compressing and Casting | |
| Seliger et al. | The production of large, epoxy-embedded, 50 μ sections by precision sawing; a preliminary to survey for ultrathin sectioning | |
| CN110421541A (en) | A kind of pole sample lineation device |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20201130 |