RU2533233C2

RU2533233C2 - Method for preventing progression and relieving intensity of alcoholic impulse

Info

Publication number: RU2533233C2
Application number: RU2011149553/15A
Authority: RU
Inventors: Александр Владимирович Котов; Елена Игоревна Певцова; Светлана Михайловна Толпыго
Priority date: 2011-12-06
Filing date: 2011-12-06
Publication date: 2014-11-20
Also published as: RU2011149553A

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention refers to medicine, particularly to addictology, and can be used to prevent a progression and/or to suppress an alcoholic impulse by immunising an animal. That is ensured by administering angiotensin I and bovine serum albumin (BSA) conjugate in a dose of 300 mcg/kg.

EFFECT: invention enables reducing the toxic damaging action of ethanol and the intensity of immunological disorders accompanying continuous alcoholisation.

1 dwg, 7 tbl, 1 ex

Description

Изобретение относится к медицине, в частности к наркологии, и может быть использовано для угнетения алкогольной мотивации в комплексном лечении хронического алкоголизма, а также в экспериментальной фармакологии для разработки средств направленной коррекции алкогольной зависимости и соматических осложнений алкоголизма у человека.The invention relates to medicine, in particular to narcology, and can be used to inhibit alcohol motivation in the complex treatment of chronic alcoholism, as well as in experimental pharmacology for the development of means for the directed correction of alcohol dependence and somatic complications of alcoholism in humans.

Алкоголизм является не только социальной, но и сложной медико-биологической проблемой. Развитие алкоголизма и его органных осложнений имеет гетерохимическую природу и связано с нарушением функций опиоидной, дофаминергической и др. систем, а также алко-гольметаболизирующих процессов. В то же время нейрохимические механизмы формирования начальной стадии алкоголизма - алкогольной зависимости, и в первую очередь, становления мотивации к многократному повторному приему этанола - остаются недостаточно выясненными. При этом следует подчеркнуть, что в большинстве исследований основное внимание уделяется выяснению и разработке способов направленной коррекции (см., например, Spanagel R. Alcoholism: A Systems Approach from Molecular Physiology to Addictive Behavior // Physiol. Rev. 2009. V.89. P.649-705) нарушений, обусловленных прямым и косвенным длительным воздействием алкоголя за счет его физико-химических и фармакодинамических влияний на различные нейромедиаторные и нейропептидные системы, обеспечивающих нарушения взаимоотношений мозговых систем подкрепления, отвергания и реагирования организма на стресс.Можно констатировать, что многие применяемые в настоящее время схемы лечения хронического алкоголизма (см., например, там же), являются часто эмпирическими и малоэффективными.Alcoholism is not only a social, but also a complex biomedical problem. The development of alcoholism and its organ complications has a heterochemical nature and is associated with impaired functions of the opioid, dopaminergic and other systems, as well as alcohol-metabolizing processes. At the same time, the neurochemical mechanisms of the formation of the initial stage of alcoholism - alcohol dependence, and, first of all, the formation of motivation for repeated repeated intake of ethanol - remain insufficiently understood. It should be emphasized that most studies focus on identifying and developing methods of directional correction (see, for example, Spanagel R. Alcoholism: A Systems Approach from Molecular Physiology to Addictive Behavior // Physiol. Rev. 2009. V.89. P.649-705) disorders caused by direct and indirect long-term exposure to alcohol due to its physicochemical and pharmacodynamic effects on various neurotransmitter and neuropeptide systems, which interfere with the relationship of the brain systems of reinforcement, rejection and response of the body to ress.Mozhno state that many currently used regimens alcoholism (see., e.g., ibid) are empirical and often ineffective.

Известно, что ренин-ангиотензиновая система (РАС) играет ведущую роль в регуляции адаптационно-трофических процессов, участвуя в поддержания жизненно-важных физиологических констант организма (артериальное давление, электролитный состав крови, осмотическое давление и др.). Ее отдельные компоненты также вовлечены в опосредование мотивационных и эмоционально-окрашенных состояний, предопределяющие инициацию и субъективную оценку реализации целостных поведенческих актов (см., в частности, Albrecht D. Physiological and pathophysiological functions of different angiotensins in the brain // Br. J. Pharmacol. 2010. V.159. P.1392-1401).It is known that the renin-angiotensin system (RAS) plays a leading role in the regulation of adaptive trophic processes, participating in the maintenance of vital physiological constants of the body (blood pressure, electrolyte composition of the blood, osmotic pressure, etc.). Its individual components are also involved in mediating motivational and emotionally colored states that determine the initiation and subjective assessment of the implementation of holistic behavioral acts (see, in particular, Albrecht D. Physiological and pathophysiological functions of different angiotensins in the brain // Br. J. Pharmacol . 2010. V.159. P.1392-1401).

Поскольку алкоголь потребляется, как правило, в виде жидкости, в составе водных растворов, злоупотребление в его приеме сочетается со стойкими нарушениями в механизмах поддержания водно-солевого баланса, а также перестройкой гомеостатических механизмов контроля кардиоваскулярных функций, сопровождающейся дисрегуляцией артериального давления и гемодинамики (Судаков К.В., Котов А.В., Келешева Л.Ф., Мещеряков А.Ф., Азаров А.В. Нейрофизиологические основы формирования алкогольной мотивации в эксперименте // Вопросы наркологии. 1990. №3. С.7-14).Since alcohol is consumed, as a rule, in the form of a liquid, as part of aqueous solutions, abuse of it is combined with persistent disturbances in the mechanisms of maintaining water-salt balance, as well as the restructuring of homeostatic mechanisms for controlling cardiovascular functions, accompanied by dysregulation of blood pressure and hemodynamics (Sudakov K .V., Kotov A.V., Kelesheva L.F., Meshcheryakov A.F., Azarov A.V. Neurophysiological basis for the formation of alcoholic motivation in the experiment // Issues of Addiction Medicine. 1990. No. 3. P.7-14) .

Имеются убедительные сведения, что потребление алкоголя может модулироваться активностью РАС (там же). Однако анализ имеющихся литературных данных показал, что экспериментальные факты о взаимосвязи активности РАС и потребления алкоголя являются несистематизированными, разнородными и противоречивыми. Они касаются, как правило, либо различных особенностей изменения активности РАС в условиях однократного или токсического действия этанола (Cain M.L., Hester R.L., Izevbigie Е.В. Ethanol abrogates Angiotensin II-stimulated vascular smooth muscle cell growth // Med. Sci. Monit. 2006. V.12. N5. P.BR162-168), либо влияния модуляции активности РАС на метаболические изменения, развивающиеся при длительном, принудительном потреблении алкоголя (Kazim Н., Vazquez М., Ansari R.A., Malafa М.Р., Lalla J. Chronic alcohol-induced oxidative endothelial injury relates to angiotensin II levels in the rat // Mol. Cell. Biochem. 2007. DOI 10.1007/s11010-007-9583-6). Данные о систематических и целенаправленных исследованиях механизмов специфического участия РАС в процессах становления алкогольной мотивации в научной литературе не обнаружены.There is convincing evidence that alcohol consumption can be modulated by ASD activity (ibid.). However, an analysis of the available literature data showed that the experimental facts about the relationship between ASD activity and alcohol consumption are unsystematized, heterogeneous, and contradictory. They concern, as a rule, either various features of changes in the activity of ASD under the conditions of a single or toxic effect of ethanol (Cain ML, Hester RL, Izevbigie E.V. Ethanol abrogates Angiotensin II-stimulated vascular smooth muscle cell growth // Med. Sci. Monit. 2006. V.12. N5. P.BR162-168), or the influence of modulation of PAC activity on metabolic changes that develop with prolonged, forced alcohol consumption (Kazim N., Vazquez M., Ansari RA, Malafa M.R., Lalla J. Chronic alcohol-induced oxidative endothelial injury relates to angiotensin II levels in the rat // Mol. Cell. Biochem. 2007. DOI 10.1007 / s11010-007-9583-6). Data on systematic and targeted studies of the mechanisms of specific involvement of ASD in the formation of alcohol motivation in the scientific literature are not found.

Известно также, что хроническая алкоголизация сопровождается не только нарушениями регуляции базисных физиологических реакций, но и деструктивными процессами в тканях организма. Изменение содержания продуктов свободнорадикального перекисного окисления липидов, изменение активности протеаз, факторов свертывания крови и др. являются маркерами повреждения тканей при патологических состояниях, в том числе и при алкоголизме. К таким же маркерам относят и содержание в крови факторов антиоксидантной защиты (SH-группы белков, нитраты/нитриты, активность каталазы и др.) (Deng Xin-Sheng, Deitrich R.A. Ethanol Metabolism and Effects: Nitric Oxide and its Interaction // Current Clinical Pharmacology, 2007, 2, 145-153). Считают, что с этим связано токсическое действие алкоголя и его метаболитов на органы и ткани организма, а также развитие неспецифического иммунодефицита и аутоиммунных процессов, по отношению к антигенам мозга, печени, сердца и др. органов (Crews F.T., Nixon K. Mechanisms of Neurodegeneration and Regeneration in Alcoholism // Alcohol & Alcoholism V.44, No.2, pp.115-127, 2009), развивающихся в результате неспецифической модификации белков этими реактогенными соединениями. При этом аутоантитела такого рода рассматривают лишь в качестве маркеров хронического действия этанола. Обнаружено также, что при алкоголизации у животных и человека развивается неспецифическое иммунодефицитное состояние по иммуноцитологическим показателям (там же).It is also known that chronic alcoholization is accompanied not only by dysregulation of basic physiological reactions, but also by destructive processes in the tissues of the body. A change in the content of products of free radical lipid peroxidation, a change in the activity of proteases, blood coagulation factors, etc. are markers of tissue damage in pathological conditions, including alcoholism. The same markers include the content of antioxidant defense factors in the blood (protein SH-groups, nitrates / nitrites, catalase activity, etc.) (Deng Xin-Sheng, Deitrich RA Ethanol Metabolism and Effects: Nitric Oxide and its Interaction // Current Clinical Pharmacology, 2007, 2, 145-153). It is believed that the toxic effect of alcohol and its metabolites on the organs and tissues of the body, as well as the development of non-specific immunodeficiency and autoimmune processes, in relation to antigens of the brain, liver, heart and other organs (Crews FT, Nixon K. Mechanisms of Neurodegeneration, is associated with this ( and Regeneration in Alcoholism // Alcohol & Alcoholism V.44, No.2, pp.115-127, 2009), developing as a result of nonspecific modification of proteins by these reactogenic compounds. Moreover, autoantibodies of this kind are considered only as markers of the chronic action of ethanol. It was also found that with alcoholization in animals and humans a non-specific immunodeficiency state develops according to immunocytological parameters (ibid.).

Следует отметить, что повышение уровня свободнорадикальных соединений является также признаком активации РАС, причем эти соединения являются одним из ключевых звеньев в механизмах сигнальной трансдукции, запускающихся при взаимодействии основного пептида PAC - ангиотензина-II (A-II) со специфическими рецепторами (Prasad K. Oxyradicals as a mechanism of angiotensin-induced hypertension // Intern. J. Angiology. 2004. V.13. P.13-59). Напротив, система оксида азота (NO) подавляет образование свободнорадикальных соединений и модулирует деятельность иммунной системы, играя роль физиологического антагониста этих процессов (там же).It should be noted that an increase in the level of free radical compounds is also a sign of PAC activation, and these compounds are one of the key links in signal transduction mechanisms triggered by the interaction of the main PAC peptide, angiotensin-II (A-II), with specific receptors (Prasad K. Oxyradicals as a mechanism of angiotensin-induced hypertension // Intern. J. Angiology. 2004. V.13. P.13-59). On the contrary, the nitric oxide (NO) system inhibits the formation of free radical compounds and modulates the activity of the immune system, playing the role of a physiological antagonist of these processes (ibid.).

Однако, в области изучения алкоголизма и при оценке эффектов этанола в экспериментальных исследованиях, учет динамики таких факторов проводится лишь в единичных случаях. В этой связи задачей, решаемой при создании заявленного способа, является проведение комплексных исследований динамики показателей, отражающих образование свободнорадикальных соединений и состояние систем антиоксидантной защиты, в корреляции с поведенческими и иммунологическими данными на разных стадиях становления и реализации алкогольной зависимости особи - человека и на животных в модельных экспериментах. Результат, который может быть получен при решении такой задачи, состоит в изменении уровня регуляторных пептидов (РП) для модуляции активности РАС в организме.However, in the field of studying alcoholism and in assessing the effects of ethanol in experimental studies, the dynamics of such factors are taken into account only in isolated cases. In this regard, the task to be solved when creating the claimed method is to conduct comprehensive studies of the dynamics of indicators reflecting the formation of free radical compounds and the state of antioxidant defense systems, in correlation with behavioral and immunological data at different stages of the formation and implementation of alcohol dependence of an individual - humans and animals in model experiments. The result that can be obtained by solving this problem is to change the level of regulatory peptides (RP) to modulate the activity of ASD in the body.

Для достижения поставленного результата, предлагается способ предупреждения развития и/или уменьшения выраженности алкогольной мотивации, заключающийся в иммунизации особи путем введения ей конъюгата ангиотензина с бычьим сывороточным альбумином (БСА), при этом в качестве ангиотензина предпочтительно использовать ангиотензин-I (A-I).To achieve the result, a method is proposed for preventing the development and / or reducing the severity of alcoholic motivation, which consists in immunizing an individual by administering to it an angiotensin conjugate with bovine serum albumin (BSA), while angiotensin-I (A-I) is preferably used as an angiotensin.

Способ иллюстрируется рис.1, на котором представлена схема среднесуточного потребления воды и этанола в условиях свободного выбора у крыс, подвергнутых активной иммунизации БПК ангиотензина-I до и после алкоголизации (в процентах к суммарному объему потребляемой жидкости).The method is illustrated in Fig. 1, which shows the average daily intake of water and ethanol under free choice in rats subjected to active immunization of BOD angiotensin-I before and after alcoholization (as a percentage of the total volume of fluid consumed).

Возможность достижения поставленного результата, по мнению авторов, обусловлена следующим.The possibility of achieving the set result, according to the authors, is due to the following.

Известно, что ангиотензиноген (Анг) под воздействием ренина преобразуется в ангиотензин-I (A-I), который характеризуется слабовыраженным сродством к специфическим ангиотензиновым рецепторам и не проявляет отчетливой физиологической активности. A-I под действием ангиотензин-превращающего фермента (АПФ) превращается в основной эффекторный пептид PAC - А-II, который, в свою очередь, под действием различных амино- и карбоксипептидаз подвергается дальнейшему процессингу с образованием более коротких пептидов: ангиотензина-III (А-III), ангиотензина-IV (A-IV) и ангиотензин-II_1-7 (A-II_1-7). Наиболее изучены физиологическая активность и мембранные рецепторы A-II (ATI или АТ2). A-III сходен по физиологическому действию с A-II, взаимодействует с этими же рецепторами. В отличие от него, пептиды A-IV и A-II_1-7 имеют собственные специфические рецепторы и физиологическую активность (Albrecht D. Physiological and pathophysiological functions of different angiotensins in the brain // Br. J. Pharmacol. 2010. V.159. P.1392-1401).It is known that angiotensinogen (Ang) under the influence of renin is converted into angiotensin-I (AI), which is characterized by a mild affinity for specific angiotensin receptors and does not show a distinct physiological activity. AI under the influence of angiotensin-converting enzyme (ACE) is converted into the main effector peptide PAC - A-II, which, in turn, under the action of various amino and carboxypeptidases undergoes further processing with the formation of shorter peptides: angiotensin-III (A-III ), angiotensin-IV (A-IV) and angiotensin-II _1-7 (A-II _1-7 ). The most studied physiological activity and membrane receptors A-II (ATI or AT2). A-III is similar in physiological effect to A-II, interacts with the same receptors. In contrast, peptides A-IV and A-II _1-7 have their own specific receptors and physiological activity (Albrecht D. Physiological and pathophysiological functions of different angiotensins in the brain // Br. J. Pharmacol. 2010. V.159 P.1392-1401).

Экспериментальный опыт иммунизации интактных животных конъюгатами некоторых РП (Анг, A-I, А-II, А-III, бета-эндорфин и др.) свидетельствует о возможности достижения эффекта долгосрочного и существенного увеличения содержания указанных эндогенных РП в организме на фоне отчетливого специфического иммунного ответа, а также характерных для данных пептидов проявлений их физиологического действия (по поведенческим и биохимическим показателям). Ранее показано, что процедура иммунизации конъюгатом белка-предшественника всех ангиотензинов - Анг до и после окончании алкоголизации приводит к разнонаправленным эффектам в произвольном потреблении этанола у опытных животных, соответственно подавляя или активируя проявления искусственно выработанной алкогольной зависимости. Эти эффекты сопряжены с фазными изменениям в образовании свободнорадикальных соединений и в процессах антиоксидантной защиты. Выявлены также однонаправленные сдвигов показателей гуморального и клеточного иммунитета в динамике активной иммунизации животных конъюгатом Анг, осуществляемой до и после алкоголизации крыс (Котов А.В., Толпыго С.М., Певцова Е.И. с соавторами Ангиотензиноген в механизмах становления и реализации алкогольной зависимости // Нейрохимия. 2006. Т.23, №2. С.143-155). Увеличение содержания Анг приводит к генерализованной активации РАС и увеличению образования всех ангиотензинов - продуктов его процессинга. Напротив, A-I обладает наименее выраженной физиологической активностью, по сравнению с другими пептидами РАС. Известно, что в A-I при действии АПФ, превращается в А-II, а под действием структурного гомолога АПФ-АПФ2 превращается в А-II_1-7, который является функциональным антагонистом А-II. Данный альтернативный путь расщепления A-I является преобладающим в условиях значительного увеличения его концентрации (Kurdi М., De Mello W., Booz G.W. Working outside the system: an update on the unconventional behavior of the renin-angiotensin system components // International J. Biol. Chem. Cell Biol. 2005. V.37. 1357-1367). Это позволяет сделать вывод, что в условиях иммунизации животных БПК A-I и вызванного таким способом длительного повышения уровня A-I в организме можно выявить его собственную, вероятно, компенсаторную роль в нейрохимических механизмах искусственно выработанной алкогольной зависимости у животных.The experimental experience of immunizing intact animals with some RP conjugates (Ang, AI, A-II, A-III, beta-endorphin, etc.) indicates the possibility of achieving the effect of a long-term and significant increase in the content of these endogenous RPs in the body against a background of a distinct specific immune response, as well as the manifestations of their physiological action characteristic of these peptides (according to behavioral and biochemical parameters). It was previously shown that the immunization procedure with the conjugate of the protein precursor of all angiotensins - Ang before and after alcoholization leads to multidirectional effects in the arbitrary consumption of ethanol in experimental animals, respectively suppressing or activating the manifestations of artificially developed alcohol dependence. These effects are associated with phase changes in the formation of free radical compounds and in antioxidant defense processes. Unidirectional shifts of indicators of humoral and cellular immunity in the dynamics of active immunization of animals with Ang conjugate carried out before and after alcoholization of rats (Kotov A.V., Tolpygo S.M., Pevtsova E.I. et al. Angiotensinogen in the mechanisms of formation and implementation of alcohol dependences // Neurochemistry. 2006. V.23, No. 2. S.143-155). An increase in Ang content leads to generalized activation of ASD and an increase in the formation of all angiotensins, the products of its processing. In contrast, AI has the least pronounced physiological activity compared to other PAC peptides. It is known that in AI, under the action of ACE, it turns into A-II, and under the influence of the structural homolog, ACE-ACE2 turns into A-II _1-7 , which is a functional antagonist of A-II. This alternative way of splitting AI is predominant in conditions of a significant increase in its concentration (Kurdi M., De Mello W., Booz GW Working outside the system: an update on the unconventional behavior of the renin-angiotensin system components // International J. Biol. Chem. Cell Biol. 2005. V.37. 1357-1367). This allows us to conclude that under the conditions of animal immunization, BOD AI and the prolonged increase in AI level in the body caused by this method can reveal its own, probably compensatory role in the neurochemical mechanisms of artificially developed alcohol dependence in animals.

Пример. Влияние конъюгата ангиотензина-I (A-I) с бычьим сывороточным альбумином (БСА) на процессы формирования и реализации алкогольной мотивации у крыс с искусственно выработанной алкогольной зависимостью.Example. The effect of angiotensin-I (A-I) conjugate with bovine serum albumin (BSA) on the formation and implementation of alcohol motivation in rats with artificially developed alcohol dependence.

В первой серии эксперименты были выполнены на 25 крысах-самцах популяции «Wistar» (13 опытных и 12 контрольных животных). Крысы были предварительно иммунизированы конъюгатом A-I с БСА, а затем через 2 недели после иммунизации, также как контрольные животные, были подвергнуты принудительной хронической алкоголизации путем замены воды на 20% раствор этилового спирта в течение 3 месяцев и помещены в условия свободного выбора между водой и 20% раствором этанола.In the first series, experiments were performed on 25 male rats of the Wistar population (13 experimental and 12 control animals). Rats were pre-immunized with AI conjugate with BSA, and then 2 weeks after immunization, as well as control animals, were subjected to forced chronic alcoholization by replacing water with a 20% solution of ethyl alcohol for 3 months and placed in a free choice between water and 20 % ethanol solution.

Во второй серии опыты проводили на 25 крысах-самцах популяции «Wistar» (13 опытных и 12 контрольных животных). В этой серии животные были иммунизированы конъюгатом A-I с БСА после предшествующей хронической алкоголизации в течение 3 месяцев через 2 недели содержания в условиях свободного выбора между водой и 20% раствором этанола. В условиях свободного выбора у всех крыс оценивали суточное количество воды и алкоголя, произвольно потребляемого каждым животным в течение 4 месяцев.In the second series, experiments were performed on 25 male rats of the Wistar population (13 experimental and 12 control animals). In this series, animals were immunized with A-I conjugate with BSA after a previous chronic alcoholization of 3 months after 2 weeks of keeping under free choice between water and 20% ethanol. Under conditions of free choice, the daily amount of water and alcohol, randomly consumed by each animal for 4 months, was evaluated in all rats.

Животные были иммунизированы конъюгатом A-I с БСА в смеси с полным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1, п/к, пятикратно с интервалом 14 дней, в дозе 300 мкг/кг A-I, химически связанного с БСА. Контрольным крысам по такой же схеме инъецировали физиологический раствор.Animals were immunized with A-I conjugate BSA mixed with Freund's complete adjuvant in a ratio of 1: 1, sc, five times with an interval of 14 days, at a dose of 300 μg / kg A-I chemically bound to BSA. Control rats were injected with saline in the same manner.

Конъюгат A-I с БСА синтезировали с использованием карбодиимидного метода. При использовании бифункционального связывающего соединения (1-циклогексил-3(2-морфолиноэтил)-карбодиимид) химически соединяли молекулы пептида A-I (фирмы «Ameri-can Peptide Company Inc.», USA) с молекулами БСА (фирмы «Sigma», USA), образуя тем самым конъюгаты ангиотензина-I с белком. Степень связывания пептида с белком-носителем определяли с применением хроматографического анализа по изменению аминокислотного состава кислотных гидролизатов конъюгата и белка-носителя, обработанных связующим соединением. Наряду с этим оценивали включение в состав конъюгата меченого по I¹²⁵ пептида. Полученный данным способом конъюгат содержал 10-12 молекул пептида на 1 молекулу белка.Conjugate AI with BSA was synthesized using the carbodiimide method. When using a bifunctional binding compound (1-cyclohexyl-3 (2-morpholinoethyl) -carbodiimide), the AI peptide molecules (Ameri-can Peptide Company Inc., USA) were chemically coupled with BSA molecules (Sigma, USA), thereby forming angiotensin-I conjugates with protein. The degree of binding of the peptide to the carrier protein was determined using chromatographic analysis by changing the amino acid composition of the acid hydrolysates of the conjugate and the carrier protein treated with a binder. Along with this, the inclusion in the conjugate of an I ^125- labeled peptide was evaluated. The conjugate obtained by this method contained 10-12 peptide molecules per 1 protein molecule.

У всех животных на 10-12 день после 2-й и 5-й иммунизации, а также через 1 и 3 месяца после начала алкоголизации отбирали пробы крови для определения титров антител к A-I, биохимических показателей и иммуноклеточного статуса. Определения уровня антител к A-I проводили в сыворотке крови крыс с помощью твердофазного иммуноферментного анализа с использованием микропланшет Costar (фирмы Corning Inc, США), сенсибилизированных Анг или БСА, и последующего связывания исследуемой антисыворотки конъюгатами иммуноглобулинов G против Ig G крысы с пероксидазой хрена. Конечное определение проводили с субстратной смесью, содержащей орто-фенилендиамин и перекись водорода, при сканировании на автоматическом микрофотометре «Multiscan ЕХ» (фирма Lab system, Швейцария) при длине волны 492 нм.In all animals, blood samples were taken on the 10-12th day after the 2nd and 5th immunization, as well as 1 and 3 months after the onset of alcoholization, to determine antibody titers to A-I, biochemical parameters, and immunocellular status. Determination of the level of antibodies to A-I was performed in rat blood serum using an enzyme-linked immunosorbent assay using a Costar microplate (Corning Inc, USA), sensitized Ang or BSA, and subsequent binding of the studied antiserum to rat immunoglobulin G conjugates with horseradish peroxidase. The final determination was carried out with a substrate mixture containing ortho-phenylenediamine and hydrogen peroxide when scanned on a Multiscan EX automatic microphotometer (Lab system, Switzerland) at a wavelength of 492 nm.

В ходе проведения экспериментов учитывали токсическое действие алкоголя на центральную нервную систему и внутренние органы по ряду биохимических показателей в сыворотке крови крыс. При этом оценивали свободнорадикальное перекисное окисление липидов (ПОЛ) - малоновый диальдегид (МДА), ферментативную (каталаза) и неферментативную (сульфгидрильные группы - SH-группы) антиокислительную активность, а также содержание триглицеридов. Одновременно определяли активность органоспецифических ферментов, как маркеров повреждения тканей, - аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT) и гамма-глутамилтрансферазы (ГГТ).In the course of the experiments, the toxic effect of alcohol on the central nervous system and internal organs was taken into account for a number of biochemical parameters in rat blood serum. At the same time, free radical lipid peroxidation (POL) was evaluated - malondialdehyde (MDA), enzymatic (catalase) and non-enzymatic (sulfhydryl groups - SH-groups) antioxidant activity, as well as triglyceride content. At the same time, the activity of organ-specific enzymes, as markers of tissue damage, was determined - alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (ACT) and gamma-glutamyl transferase (GGT).

Уровень МДА в плазме крови определяли по методу Gorog P. et al., SH-групп - по методу Wayner D.D. М. et al., активность каталазы по методу Королюк М.А. с соавт. Активность АЛТ, ACT, γ-ГТ и содержание триглицеридов оценивали с использованием стандартных диагностических наборов фирмы Diasys (Германия).The level of MDA in plasma was determined by the method of Gorog P. et al., SH-groups by the method of Wayner D.D. M. et al., Catalase activity according to the method of Korolyuk M.A. et al. ALT, ACT, γ-GT activity and triglyceride content were evaluated using standard diagnostic kits from Diasys (Germany).

Исследовались следующие показатели иммуноклеточного статуса: общее количество лейкоцитов, процентное и абсолютное количество лимфоцитов, T-лимфоцитов и их субпопуляций - T-хелперов/индукторов и Т-эффекторов/супрессоров, DN-клеток или Т-лимфоцитов с двойной отрицательной меткой, не несущих ни Т-хелперных, ни Т-супрессорных маркеров, В-лимфоцитов, NK-клеток (или естественных киллерных клеток) и клеток фагоцитарной системы: микрофагов - нейтрофилов и эозинофилов, и макрофагов - моноцитов, а также иммунорегуляторный индекс (отношение Т-хелперы/Т-супрессоры). В клетках крови: в фагоцитах, Т-лимфоцитах и тромбоцитах - проводили окрашивание на гистохимический маркер NO-синтазы - НАДФН-диафоразу. Определяли также уровень стабильных метаболитов оксида азота в плазме крови.The following indicators of immunocellular status were studied: the total number of leukocytes, the percentage and absolute number of lymphocytes, T-lymphocytes and their subpopulations - T-helper cells / inducers and T-effectors / suppressors, DN cells or T-cells with a double negative label, bearing neither T-helper, nor T-suppressor markers, B-lymphocytes, NK cells (or natural killer cells) and cells of the phagocytic system: microphages - neutrophils and eosinophils, and macrophages - monocytes, as well as an immunoregulatory index (T-helper / T ratio - suppressors). In blood cells: in phagocytes, T-lymphocytes and platelets - staining was performed on the histochemical marker of NO synthase - NADPH-diaphorase. The level of stable plasma nitrate metabolites was also determined.

В результате исследования установлено, что активная иммунизация крыс конъюгатом А-I до и после их принудительной алкоголизации оказывает подавляющее действие на проявления алкогольной зависимости. Животные демонстрируют длительные (в течение 4-5 месяцев) однонаправленные эффекты в произвольном потреблении этанола в условиях свободного выбора между водой и раствором этанола, проявлявшиеся в виде уменьшения потребления алкоголя и увеличения приема воды по сравнению с контролем (Рис.1). Суммарный объем потребляемой жидкости при этом достоверно не изменялся. Данное воздействие не вызывало и значимых изменений артериального давления (АД) и частоты сердечных сокращений (ЧСС).As a result of the study, it was found that active immunization of rats with conjugate A-I before and after their forced alcoholization has an overwhelming effect on the manifestations of alcohol dependence. Animals demonstrate long-term (for 4-5 months) unidirectional effects in arbitrary consumption of ethanol under conditions of a free choice between water and ethanol solution, manifested in the form of a decrease in alcohol consumption and an increase in water intake compared to control (Fig. 1). The total volume of fluid consumed was not significantly changed. This effect did not cause significant changes in blood pressure (BP) and heart rate (HR).

У всех животных после активной иммунизации конъюгатом A-I с БСА регистрировали большие значения титров специфических антител к A-I, причем уровень антител у крыс с предварительно сформированной алкогольной мотивацией был выше, чем у животных, иммунизированных конъюгатом A-I до алкоголизации. Следует отметить, что у неиммунизированных крыс, подвергнутых хронической алкоголизации, в отличие от интактных, не алкоголизированных животных, также были выявлены антитела к A-I, но с относительно небольшими величинами титров (Табл.1).In all animals, after active immunization with A-I conjugate with BSA, large titers of specific antibodies to A-I were recorded, and the antibody level in rats with preformed alcohol motivation was higher than in animals immunized with A-I conjugate before alcoholization. It should be noted that in non-immunized rats subjected to chronic alcoholization, in contrast to intact, non-alcoholized animals, antibodies to A-I were also detected, but with relatively small titers (Table 1).

Установлено, что иммунизация крыс конъюгатом A-I с БСА до их принудительной алкоголизации сопровождается сдвигами иммуноклеточного статуса, характерными для нормального хода развития иммунологических реакций на конъюгат белок-гаптен и предупреждает такие сдвиги иммуноклеточного статуса, как дефицит Т-супрессоров/эффекторов, увеличение количества клеток, готовых к апоптозу, нейтрофилию и эозинофилию в ходе последующей длительной алкоголизации (Табл.2А).It was established that immunization of rats with AI conjugate with BSA prior to their forced alcoholization is accompanied by shifts in the immunocellular status that are characteristic of the normal course of development of immunological reactions to the protein-hapten conjugate and prevents such shifts in the immune cell status as deficiency of T-suppressors / effectors, an increase in the number of cells ready to apoptosis, neutrophilia and eosinophilia during subsequent prolonged alcoholization (Table 2A).

Также установлено, что в ходе хронического потребления этанола наблюдаются вторичное иммунодефицитное состояние, охватывающее многие популяции иммунокомпетентных клеток. Последующая иммунизация крыс конъюгатом A-I с БСА уменьшает выраженность нарушений иммуноклеточного статуса, развившихся в ходе их длительной принудительной алкоголизации (Табл.2Б).It was also found that during chronic consumption of ethanol, a secondary immunodeficiency state is observed, covering many populations of immunocompetent cells. Subsequent immunization of rats with A-I conjugate with BSA reduces the severity of violations of the immunocellular status that developed during their long-term forced alcoholization (Table 2B).

При иммунизации крыс конъюгатом A-I с БСА до алкоголизации выявлен также сдвиг баланса активности разных форм NO-синтазы в пользу iNOS фагоцитов, участвующей в элиминации апоптотических Т-лимфоцитов и в уменьшении риска развития аутоиммунных осложнений (Табл.3A). При иммунизации конъюгатом A-I после хронической принудительной алкоголизации отмечено уменьшение изменений иммуноклеточного статуса, таких как дефицит Т-супрессоров/эффекторов, В-лимфоцитов, увеличение количества клеток, готовых к апоптозу, выявляемых у контрольных крыс при длительном потреблении этанола. При этом показано смещение баланса NO-содержащих продуктов NOS-катализа в пользу оксида азота (Табл.3Б).Immunization of rats with A-I conjugate with BSA before alcoholization also revealed a shift in the balance of activity of various forms of NO synthase in favor of iNOS phagocytes, which is involved in elimination of apoptotic T-lymphocytes and in reducing the risk of developing autoimmune complications (Table 3A). Immunization with A-I conjugate after chronic forced alcoholization showed a decrease in changes in the immunocellular status, such as deficiency of T-suppressors / effectors, B-lymphocytes, an increase in the number of cells ready for apoptosis detected in control rats with prolonged consumption of ethanol. At the same time, a shift in the balance of NO-containing NOS-catalysis products in favor of nitric oxide is shown (Table 3B).

Результаты исследований указывают на избирательное вовлечение иммунных механизмов с участием пептидных компонентов ренин-ангиотензиновой системы (РАС) в процессы формирования и реализации алкогольной зависимости у животных.The research results indicate the selective involvement of immune mechanisms with the participation of the peptide components of the renin-angiotensin system (RAS) in the formation and implementation of alcohol dependence in animals.

На фоне иммунизации конъюгатом A-I с БСА не наблюдали достоверных изменений активности АЛТ, ACT и ГТГ. В ходе иммунизации отмечено умеренное возрастание активности каталазы по сравнению с фоновым периодом и с контролем. При этом содержание SH-групп достоверно снижается по сравнению с фоном и соответствующим контролем, что отражает некоторое истощение запасов антиокислительных факторов. Последующая (после иммунизации) алкоголизация в течение 3 месяцев не приводила к изменению активности органоспецифических ферментов и содержания триглицеридов, уменьшала активность каталазы, увеличивала содержания SH-групп, и несколько снижала содержание МДА, что свидетельствует об усилении процессов, как ПОЛ, так и антиоксидантной защиты. Указанное, по-видимому, обусловлено развивающейся при предварительной иммунизации A-I с БСА активацией компенсаторных биохимических процессов, и обеспечивает уменьшение повреждающего действия этанола в ходе последующей принудительной алкоголизации (Табл.4А).On the background of immunization with conjugate A-I with BSA, no significant changes in the activity of ALT, ACT, and GTG were observed. During immunization, a moderate increase in catalase activity was noted compared with the background period and with the control. In this case, the content of SH-groups is significantly reduced compared to the background and the corresponding control, which reflects a certain depletion of antioxidant factors. Subsequent (after immunization) alcoholization for 3 months did not lead to a change in the activity of organ-specific enzymes and triglyceride content, decreased catalase activity, increased the content of SH-groups, and slightly reduced the content of MDA, which indicates an increase in the processes of both lipid peroxidation and antioxidant protection . This, apparently, is due to the activation of compensatory biochemical processes that develops during preliminary immunization of A-I with BSA and ensures a decrease in the damaging effect of ethanol during subsequent forced alcoholization (Table 4A).

Предварительная алкоголизация животных инициировала значимое повышение активности АЛТ и ГГТ, содержания триглицеридов, МДА, снижение содержания SH-групп и активности каталазы, что является характерным для алкогольной интоксикации и указывает на поражение тканей печени и сердца и нарушения липидного обмена на фоне активации ПОЛ и истощения антиоксидантной защиты. Последующая активная иммунизация конъюгатом A-I с БСА усиливала изменения ПОЛ (по уровню МДА), ослабляла изменения активности ферментов-маркеров повреждения тканей (АЛТ и ГТТ), препятствовала истощению факторов антиоксидантной защиты, главным за счет повышения активности каталазы (Табл.4Б).Pre-alcoholization of animals initiated a significant increase in the activity of ALT and GGT, triglycerides, MDA, a decrease in the content of SH-groups and catalase activity, which is characteristic of alcohol intoxication and indicates damage to the liver and heart tissues and lipid metabolism disturbances due to LPO activation and antioxidant depletion protection. Subsequent active immunization with A-I conjugate with BSA increased the changes in lipid peroxidation (according to the MDA level), weakened changes in the activity of tissue damage marker enzymes (ALT and GTT), and prevented the depletion of antioxidant defense factors, mainly due to an increase in catalase activity (Table 4B).

Таблица 1.Table 1. Средние значения титров антител к ангиотензину-I у крыс, иммунизированных БПК A-I с БСА до и после алкоголизации (M±SD)The average values of titers of antibodies to angiotensin-I in rats immunized with BOD A-I with BSA before and after alcoholization (M ± SD) Условия иммунизацииImmunization Conditions Период экспериментаExperiment period ОпытExperience КонтрольThe control до воздействияbefore exposure 1:180±801: 180 ± 80 1:190±601: 190 ± 60 до алкоголизации (группа I)before alcoholization (group I) после 2-й иммунизацииafter 2nd immunization 1:6400±3500***1: 6400 ± 3500 *** 1:250±801: 250 ± 80 после 4-й иммунизацииafter 4th immunization 1:14550±5790***1: 14550 ± 5790 *** 1:290±801: 290 ± 80 после 1 мес. алкоголизацииafter 1 month alcohol abuse 1:8730±3230***1: 8730 ± 3230 *** 1:470±120*1: 470 ± 120 * после 3 мес. алкоголизацииafter 3 months alcohol abuse 1:4360±1610***1: 4360 ± 1610 *** 1:740±210**1: 740 ± 210 ** после алкоголизации (группа II)after alcoholization (group II) после 1 мес. алкоголизацииafter 1 month alcohol abuse 1:390±901: 390 ± 90 1:370±801: 370 ± 80 после 3 мес. алкоголизацииafter 3 months alcohol abuse 1:530±100*1: 530 ± 100 * 1:670±150*1: 670 ± 150 * после 2-й иммунизацииafter 2nd immunization 1:14930±6870***1: 14930 ± 6870 *** 1:690±140*1: 690 ± 140 * после 4-й иммунизацииafter 4th immunization 1:18670±7450***1: 18670 ± 7450 *** 1:760±200**1: 760 ± 200 ** * - р<0.05, ** - р<0.01, *** - р<0.001 по сравнению с исходными значениями до воздействия.* - p <0.05, ** - p <0.01, *** - p <0.001 in comparison with the initial values before exposure.

Таблица 2А.Table 2A. Иммуноцитологические показатели (M±SD) у крыс в процессе иммунизации БПК A-I с БСА и последующей алкоголизации (I группа)Immunocytological parameters (M ± SD) in rats during immunization of BOD A-I with BSA and subsequent alcoholization (group I) Иммунологический показательImmunological indicator Единица измеренияunit of measurement До воздействияBefore exposure После 3 мес. алкоголизацииAfter 3 months alcohol abuse опытexperience контрольthe control опытexperience контрольthe control лейкоцитыwhite blood cells тыс./мклthousand / μl 15,76±1,0915.76 ± 1.09 14,67±1,3514.67 ± 1.35 13,12±0,7713.12 ± 0.77 13,01±1,2313.01 ± 1.23 лимфоциты суммарныеtotal lymphocytes %% 79,71±2,2679.71 ± 2.26 80,44±2,4780.44 ± 2.47 62,09±3,39*62.09 ± 3.39 * 64,75±2,96***64.75 ± 2.96 *** тыс./мклthousand / μl 12,01±0,9812.01 ± 0.98 11,62±0,8211.62 ± 0.82 8,01±0,41*8.01 ± 0.41 * 8,44±0,93*/**8.44 ± 0.93 * / ** T-лимфоцитыT lymphocytes %% 81,00±2,6581.00 ± 2.65 81,22±2,3581.22 ± 2.35 83,73±2,0983.73 ± 2.09 85,17±1,75*85.17 ± 1.75 * тыс./мклthousand / μl 10,10±0,8110.10 ± 0.81 9,35±0,529.35 ± 0.52 6,73±0,40*6.73 ± 0.40 * 7,22±0,85*7.22 ± 0.85 * T-хелперыT-helpers %% 41,0±3,4441.0 ± 3.44 42,83±3,5342.83 ± 3.53 39,10±3,6739.10 ± 3.67 35,75±3,7735.75 ± 3.77 тыс./мклthousand / μl 6,60±0,866.60 ± 0.86 5,46±0,935.46 ± 0.93 3,17±0,85*3.17 ± 0.85 * 3,87±0,78*3.87 ± 0.78 * Т-супрессорыT suppressors %% 27,5±1,4527.5 ± 1.45 27,0±2,6727.0 ± 2.67 24,0±1,2724.0 ± 1.27 31,75±3,90^∧ 31.75 ± 3.90 ^∧ тыс./мклthousand / μl 3,70±0,443.70 ± 0.44 2,51±0,862.51 ± 0.86 1,51±0,17*1.51 ± 0.17 * 2,70±0,77 л2.70 ± 0.77 L Tx/TcTx / tc усл. ед.conv. units 1,37±0,671.37 ± 0.67 1,47±0,881.47 ± 0.88 1,21±0,511.21 ± 0.51 1,21±0,251.21 ± 0.25 DN-клеткиDN cells %% 16,07±0,5416.07 ± 0.54 18,33±0,5718.33 ± 0.57 8,55±1,27*8.55 ± 1.27 * 15,56±2,30^∧ 15.56 ± 2.30 ^∧ тыс./мклthousand / μl 2,58±0,862.58 ± 0.86 2,67±0,712.67 ± 0.71 0,54±0,33*0.54 ± 0.33 * 1,31±0,89^∧ 1.31 ± 0.89 ^∧ В-лимфоцитыB lymphocytes %% 5,71±0,715.71 ± 0.71 6,89±1,386.89 ± 1.38 3,91±0,773.91 ± 0.77 2,50±0,50*/**2,50 ± 0,50 * / ** тыс./мклthousand / μl 0,71±0,100.71 ± 0.10 0,83±0,200.83 ± 0.20 0,31±0,06*0.31 ± 0.06 * 0,19±0,03**0.19 ± 0.03 ** NK-клеткиNK cells %% 5,14±0,855.14 ± 0.85 4,56±0,914.56 ± 0.91 5,73±1,245.73 ± 1.24 3,75±0,733.75 ± 0.73 тыс./мклthousand / μl 0,67±0,140.67 ± 0.14 0,58±0,150.58 ± 0.15 0,46±0,100.46 ± 0.10 0,30±0,050.30 ± 0.05 нейтрофилыneutrophils %% 13,57±2,0913.57 ± 2.09 12,78±1,4812.78 ± 1.48 28,09±3,3028.09 ± 3.30 25,08±3,02**25.08 ± 3.02 ** тыс./мклthousand / μl 2,12±0,352.12 ± 0.35 1,99±0,451.99 ± 0.45 3,81±0,63.81 ± 0.6 3,28±0,45**3.28 ± 0.45 ** эозинофилыeosinophils %% 0,43±0,200.43 ± 0.20 1,0±0,331.0 ± 0.33 3,73±0,93*3.73 ± 0.93 * 3,33±0,92**3.33 ± 0.92 ** тыс./мклthousand / μl 0,07±0,030,07 ± 0,03 0,15±0,050.15 ± 0.05 0,52±0,150.52 ± 0.15 0,42±0,11*/**0.42 ± 0.11 * / ** моноцитыmonocytes %% 6,29±1,536.29 ± 1.53 5,78±1,355.78 ± 1.35 6,09±1,036.09 ± 1.03 6,83±0,976.83 ± 0.97 тыс./мклthousand / μl 0,99±0,270.99 ± 0.27 0,89±0,230.89 ± 0.23 0,79±0,130.79 ± 0.13 0,87±0,120.87 ± 0.12 * - р<0.05, ** - р<0.01, *** - р<0.001 - достоверность различий по сравнению с предыдущим периодом обследования в одной и той же подгруппе крыс (определялась парным двухвыборочным t-тестом для средних);* - p <0.05, ** - p <0.01, *** - p <0.001 - significance of differences compared with the previous examination period in the same subgroup of rats (determined by a paired two-sample t-test for mediums); ^∧ - р<0.05, ^∧∧ - р<0.01, ^∧∧∧ - р<0.001 - достоверность различий между опытной и контрольной подгруппами крыс в один и тот же период обследования (определялась двухвыборочным t-тестом с различными дисперсиями). ^∧ - p <0.05, ^∧∧ - p <0.01, ^∧∧∧ - p <0.001 - significance of differences between the experimental and control subgroups of rats in the same examination period (determined by a two-sample t-test with different variances).

Таблица 2Б.Table 2B. Иммунопатологические показатели (M±SD) у крыс в процессе принудительной алкоголизации и последующей иммунизации БПК A-I с БСА (II группа)Immunopathological parameters (M ± SD) in rats during forced alcoholization and subsequent immunization of BOD A-I with BSA (group II) Иммунологический показательImmunological indicator Единица измеренияunit of measurement До воздействияBefore exposure После 3 мес. алкоголизацииAfter 3 months alcohol abuse После 5-ой иммунизацииAfter the 5th immunization опытexperience контрольthe control опытexperience контрольthe control опытexperience контрольthe control лейкоцитыwhite blood cells тыс./мклthousand / μl 17,3±0,9117.3 ± 0.91 16,66±1,7716.66 ± 1.77 11,52±0,8**11.52 ± 0.8 ** 11,16±1,02**11.16 ± 1.02 ** 10,57±0,710.57 ± 0.7 10,74±0,7810.74 ± 0.78 лимфоциты суммарныеtotal lymphocytes %% 75,86±1,2975.86 ± 1.29 75,29±3,5075.29 ± 3.50 70,83±2,7270.83 ± 2.72 67,09±4,5867.09 ± 4.58 57,92±3,24*57.92 ± 3.24 * 62,90±3,9062.90 ± 3.90 тыс./мклthousand / μl 13,11±0,6713.11 ± 0.67 12,34±1,1412.34 ± 1.14 8,08±0,54**8.08 ± 0.54 ** 7,19±0,66**7.19 ± 0.66 ** 6,14±0,53**6.14 ± 0.53 ** 6,70±0,606.70 ± 0.60 Т-лимфоцитыT lymphocytes %% 76,43±3,2276.43 ± 3.22 83,14±2,7783.14 ± 2.77 84,58±1,8784.58 ± 1.87 82,91±2,1582.91 ± 2.15 82,58±1,6782.58 ± 1.67 82,30±1,8082.30 ± 1.80 тыс./мклthousand / μl 10,05±0,7610.05 ± 0.76 10,18±0,8010.18 ± 0.80 6,86±0,52**6.86 ± 0.52 ** 5,89±0,48***5.89 ± 0.48 *** 5,06±0,42*/**5.06 ± 0.42 * / ** 5,56±0,555.56 ± 0.55 Т-хелперыT-helpers %% 39,0±9,3739.0 ± 9.37 38,4±5,2938.4 ± 5.29 29,5±4,9829.5 ± 4.98 23,0±3,2923.0 ± 3.29 38,38±2,89*38.38 ± 2.89 * 39,0±9,45*39.0 ± 9.45 * тыс./мклthousand / μl 3,97±0,923.97 ± 0.92 4,27±0,884.27 ± 0.88 2,38±0,49*2.38 ± 0.49 * 2,40±0,58*2.40 ± 0.58 * 2,49±0,202.49 ± 0.20 2,60±0,612.60 ± 0.61 Т-супрессорыT suppressors %% 23,25±3,1223.25 ± 3.12 23,50±3,1823.50 ± 3.18 20,3±2,8820.3 ± 2.88 29,0±4,9429.0 ± 4.94 29,45±2,5029.45 ± 2.50 20,6±3,9520.6 ± 3.95 тыс./мклthousand / μl 3,21±0,253.21 ± 0.25 2,88±0,352.88 ± 0.35 1,34±0,37*1.34 ± 0.37 * 1,94±0,491.94 ± 0.49 1,87±0,251.87 ± 0.25 1,30±0,391.30 ± 0.39 Тх/ТсTX / TS усл. ед.conv. units 1,19±0,291.19 ± 0.29 1,81±0,381.81 ± 0.38 1,40±0,751.40 ± 0.75 1,0±0,231.0 ± 0.23 1,43±0,171.43 ± 0.17 1,91±0,851.91 ± 0.85 DN-клеткиDN cells %% 20,0±3,2520.0 ± 3.25 19,5±3,8419.5 ± 3.84 32,0±5,78*32.0 ± 5.78 * 27,0±0,23*27.0 ± 0.23 * 13,87±3,42*13.87 ± 3.42 * 24,0±2,8^∧ 24.0 ± 2.8 ^∧ тыс./мклthousand / μl 3,00±0,973.00 ± 0.97 3,56±0,923.56 ± 0.92 3,01±0,923.01 ± 0.92 2,72±0,942.72 ± 0.94 0,96±0,29**0.96 ± 0.29 ** 2,05±0,29^∧ 2.05 ± 0.29 ^∧ B-лимфоцитыB lymphocytes %% 6,86±1,296.86 ± 1.29 4,57±0,754.57 ± 0.75 2,50±0,41**2,50 ± 0,41 ** 3,18±0,793.18 ± 0.79 2,93±0,542.93 ± 0.54 1,70±0,21^∧ 1.70 ± 0.21 ^∧ тыс./мклthousand / μl 0,91±0,180.91 ± 0.18 0,56±0,110.56 ± 0.11 0,21±0,04**0.21 ± 0.04 ** 0,25±0,07**0.25 ± 0.07 ** 0,20±0,050.20 ± 0.05 0,11±0,010.11 ± 0.01 NK-клеткиNK cells %% 5,57±1,325.57 ± 1.32 5,43±1,795.43 ± 1.79 6,0±1,426.0 ± 1.42 4,91±1,254.91 ± 1.25 5,83±0,915.83 ± 0.91 6,20±0,696.20 ± 0.69 тыс./мклthousand / μl 0,73±0,180.73 ± 0.18 0,71±0,260.71 ± 0.26 0,46±0,100.46 ± 0.10 0,38±0,110.38 ± 0.11 0,35±0,060.35 ± 0.06 0,40±0,040.40 ± 0.04 нейтрофилыneutrophils %% 13,29±1,5013.29 ± 1.50 15,86±3,5415.86 ± 3.54 19,67±1,97**19.67 ± 1.97 ** 20,64±3,6320.64 ± 3.63 29,25±2,03**29.25 ± 2.03 ** 25,9±3,2225.9 ± 3.22 тыс./мклthousand / μl 2,28±0,242.28 ± 0.24 2,88±0,762.88 ± 0.76 2,31±0,292.31 ± 0.29 2,47±0,722.47 ± 0.72 3,06±0,26**3.06 ± 0.26 ** 2,85±0,462.85 ± 0.46 эозинофилыeosinophils %% 1,14±0,701.14 ± 0.70 0,29±0,180.29 ± 0.18 2,25±0,692.25 ± 0.69 2,82±0,48***2.82 ± 0.48 *** 6,08±0,99**6.08 ± 0.99 ** 3,0±0,443.0 ± 0.44 тыс./мклthousand / μl 0,21±0,130.21 ± 0.13 0,14±0,030.14 ± 0.03 0,26±0,070.26 ± 0.07 0,3±0,04*0.3 ± 0.04 * 0,64±0,11**0.64 ± 0.11 ** 0,31±0,06^∧∧ 0.31 ± 0.06 ^∧∧ моноцитыmonocytes %% 9,71±0,779.71 ± 0.77 7,57±1,577.57 ± 1.57 7,33±1,317.33 ± 1.31 9,45±1,699.45 ± 1.69 6,75±1,236.75 ± 1.23 8,3±1,58.3 ± 1.5 тыс./мклthousand / μl 1,7±0,181.7 ± 0.18 1,29±0,271.29 ± 0.27 0,89±0,2**/***0.89 ± 0.2 ** / *** 1,16±0,291.16 ± 0.29 0,73±0,140.73 ± 0.14 0,88±0,160.88 ± 0.16 * - р<0.05, ** - р<0.01, *** - р<0.001 - достоверность различий по сравнению с предыдущим периодом обследования в одной и той же подгруппе крыс (определялась парным двухвыборочным t-тестом для средних);* - p <0.05, ** - p <0.01, *** - p <0.001 - significance of differences compared with the previous examination period in the same subgroup of rats (determined by a paired two-sample t-test for mediums); ^∧ - р<0.05, ^∧∧ - р<0.01, ^∧∧∧ - р<0.001 - достоверность различий между опытной и контрольной подгруппами крыс в один и тот же период обследования (определялась двухвыборочным t-тестом с различными дисперсиями). ^∧ - p <0.05, ^∧∧ - p <0.01, ^∧∧∧ - p <0.001 - significance of differences between the experimental and control subgroups of rats in the same examination period (determined by a two-sample t-test with different variances).

Таблица 3A.Table 3A. Система оксида азота (M±SD) у крыс после иммунизации БПК A-I с БСА и последующей алкоголизации (I группа)Nitric oxide system (M ± SD) in rats after immunization of BOD A-I with BSA and subsequent alcoholization (group I) ПоказательIndicator Ед. измеренияUnits measuring Период экспериментаExperiment period ОпытExperience КонтрольThe control активность НАДФН-диафоразы - гистохимического маркера NO-синтазыactivity of NADPH-diaphorase, a histochemical marker of NO synthase в фагоцитахin phagocytes цитохимический индексcytochemical index до воздействияbefore exposure 0,05±0,010.05 ± 0.01 0,09±0,030.09 ± 0.03 после 3 месяцев алкоголизацииafter 3 months of alcoholization 0,28±0,03###0.28 ± 0.03 ### 0,22±0,02#0.22 ± 0.02 # в Т-лимфоцитахin T lymphocytes до воздействияbefore exposure 0,25±0,040.25 ± 0.04 0,23±0,030.23 ± 0.03 после 3 месяцев алкоголизацииafter 3 months of alcoholization 0,50±0,060.50 ± 0.06 0,54±0,040.54 ± 0.04 в тромбоцитахin platelets до воздействияbefore exposure 0,06±0,010.06 ± 0.01 0,04±0,010.04 ± 0.01 после 3 месяцев алкоголизацииafter 3 months of alcoholization 0,12±0,020.12 ± 0.02 0,14±0,030.14 ± 0.03 уровень стабильных метаболитов оксида азота в плазмеthe level of stable metabolites of nitric oxide in plasma мкМ/лμM / L до воздействияbefore exposure 16,58±1,5316.58 ± 1.53 19,33±1,7419.33 ± 1.74 после 3 месяцев алкоголизаиииafter 3 months of alcoholism 25,25±2,5525.25 ± 2.55 33,06±4,0233.06 ± 4.02 # - р<0.05, # - р<0.01, ### - р<0.001 - значимость различий по сравнению с предыдущим периодом в одной и той же подгруппе крыс (определялась парным двухвыборочным t-тестом для средних).# - p <0.05, # - p <0.01, ### - p <0.001 - the significance of differences compared with the previous period in the same subgroup of rats (determined by a paired two-sample t-test for averages). Таблица 3Б.Table 3B. Система оксида азота (M±SD) у крыс в процессе алкоголизции и последующей иммунизации БПК A-I с БСА (II группа)The system of nitric oxide (M ± SD) in rats during alcoholization and subsequent immunization of BOD A-I with BSA (group II) ПоказательIndicator Ед. измеренияUnits measuring Период экспериментаExperiment period ОпытExperience КонтрольThe control активность НАДФН-диафоразы - гистохимического маркера NO-синтазыactivity of NADPH-diaphorase, a histochemical marker of NO synthase в фагоцитах в Т-лимфоцитах в тромбоцитахin phagocytes in T-lymphocytes in platelets цитохимический индексcytochemical index до воздействияbefore exposure 0,09±0,030.09 ± 0.03 0,04±0,010.04 ± 0.01 5-кратная иммунизация после алкоголизации5-fold immunization after alcoholization 0,14±0,020.14 ± 0.02 0,13±0,020.13 ± 0.02 до воздействияbefore exposure 0,30±0,040.30 ± 0.04 0,24±0,030.24 ± 0.03 5-кратная иммунизация после алкоголизации5-fold immunization after alcoholization 0,44±0,040.44 ± 0.04 0,38±0,03*0.38 ± 0.03 * до воздействияbefore exposure 0,07±0,020,07 ± 0,02 0,0±0,010,0 ± 0,01 5-кратная иммунизация после алкоголизации5-fold immunization after alcoholization 0,22±0,030.22 ± 0.03 0,18±0,02*0.18 ± 0.02 * уровень стабильных метаболитов оксида азота в плазмеthe level of stable metabolites of nitric oxide in plasma мкМ/лμM / L до воздействияbefore exposure 9,22±0,839.22 ± 0.83 12,06±2,2112.06 ± 2.21 5-кратная иммунизация после алкоголизации5-fold immunization after alcoholization 29,69±4,6629.69 ± 4.66 28,44±3,4628.44 ± 3.46 * - р<0.05, ** - р<0.01, *** - р<0.001 -значимость различий по сравнению с исходным уровнем показателя в одной и той же подгруппе крыс (определялась парным двухвыборочным t-тестом).* - p <0.05, ** - p <0.01, *** - p <0.001 - significance of differences compared with the initial level of the indicator in the same subgroup of rats (determined by paired two-sample t-test).

Таблица 4A.Table 4A. Содержание SH-групп, МДА, триглицеридов и активность каталазы, АЛТ, ACT и γ-ГТ (M±SD) в сыворотке крови крыс в процессе иммунизации БПК A-I с БСА и последующей алкоголизации (I группа)The content of SH-groups, MDA, triglycerides and the activity of catalase, ALT, ACT and γ- GT (M ± SD) in rat blood serum during the immunization of BOD AI with BSA and subsequent alcoholization (group I) Период экспериментаExperiment period ГруппыGroups SH-группы, мкмоль/лSH-groups, µmol / l МДА, мкмоль/лMDA, μmol / L Триглицериды, ммоль/лTriglycerides, mmol / L Каталаза, м кат/лCatalase, m cat / l АЛТ, ед./лALT, units / l ACT, ед./лACT, units / l γ-ГТ, ед./лγ-HT, units / l до воздействияbefore exposure опытexperience 134,8±13,2134.8 ± 13.2 30,6±1,930.6 ± 1.9 0,99±0,250.99 ± 0.25 97,7±10,297.7 ± 10.2 113,6±4,94113.6 ± 4.94 207,4±17,8207.4 ± 17.8 2,66±0,832.66 ± 0.83 контрольthe control 130,0±9,9130.0 ± 9.9 32,9±2,132.9 ± 2.1 0,84±0,0760.84 ± 0.076 117,7±6,3117.7 ± 6.3 134,3±7,6134.3 ± 7.6 202,3±12,3202.3 ± 12.3 2,05±0,62.05 ± 0.6 после 2-ой иммунизацииafter the 2nd immunization опытexperience 108,9±9,4108.9 ± 9.4 32,6±1,332.6 ± 1.3 0,91±0,00790.91 ± 0.0079 118,4±4,2^∧∧ 118.4 ± 4.2 ^∧∧ 139,1±6,18**139.1 ± 6.18 ** 218,5±14,6218.5 ± 14.6 1,48±0,871.48 ± 0.87 контрольthe control 133,5±8,3133.5 ± 8.3 34,5±1,834.5 ± 1.8 1,22±0,094**1.22 ± 0.094 ** 96,8±5,596.8 ± 5.5 136,8±5,75136.8 ± 5.75 222,8±7,9222.8 ± 7.9 1,49±0,491.49 ± 0.49 после 5-ой иммунизацииafter the 5th immunization опытexperience 101,0±8,6*/^∧∧∧ 101.0 ± 8.6 * / ^∧∧∧ 34,0±2,534.0 ± 2.5 1,20±0,111.20 ± 0.11 94,5±5,594.5 ± 5.5 109,8±5,87109.8 ± 5.87 189,7±5,77189.7 ± 5.77 2,94±0,762.94 ± 0.76 контрольthe control 132,6±8,0132.6 ± 8.0 35,4±1,935.4 ± 1.9 1,45±0,131.45 ± 0.13 94,6±8,8*94.6 ± 8.8 * 107,8±7,9107.8 ± 7.9 181,2±8,7181.2 ± 8.7 1,86±0,41.86 ± 0.4 после 1 месяца алкоголизацииafter 1 month of alcoholization опытexperience 141,3±9,7141.3 ± 9.7 25,7±1,1*25.7 ± 1.1 * 1,18±0,171.18 ± 0.17 109,0±5,3109.0 ± 5.3 97,4±6,0397.4 ± 6.03 161,0±10,3*161.0 ± 10.3 * 4,48±1,584.48 ± 1.58 контрольthe control 169,4±13,9*169.4 ± 13.9 * 27,6±1,1*27.6 ± 1.1 * 1,51±0,2*1.51 ± 0.2 * 86,7±10,2*86.7 ± 10.2 * 100,0±5,0**100.0 ± 5.0 ** 153,2±6,96**153.2 ± 6.96 ** 2,6±0,562.6 ± 0.56 после 3 месяцев алкоголизацииafter 3 months of alcoholization опытexperience 187,1±10,4**/^∧ 187.1 ± 10.4 ** / ^∧ 27,2±0,927.2 ± 0.9 1,0±0,151.0 ± 0.15 78,5±5,178.5 ± 5.1 118,6±4,68118.6 ± 4.68 149,5±7,27**149.5 ± 7.27 ** 3,0±1,063.0 ± 1.06 контрольthe control 155,6±10,6155.6 ± 10.6 28,0±1,1*28.0 ± 1.1 * 0,93±0,170.93 ± 0.17 78,7±10,4*78.7 ± 10.4 * 115,7±5,08115.7 ± 5.08 169,0±8,14**169.0 ± 8.14 ** 5,38±1,935.38 ± 1.93 * - р<0.05, ** - р<0.01, *** - р<0.001 - значимость различий по сравнению с исходным уровнем в одной и той же подгруппе крыс (определялась парным двухвыборочным t-тестом).* - p <0.05, ** - p <0.01, *** - p <0.001 - significance of differences compared with the initial level in the same subgroup of rats (determined by paired two-sample t-test). ^∧ - р<0.05, ^∧∧ - р<0.01, ^∧∧∧ - р<0.001 - значимость различий между опытной и контрольной подгруппами крыс в один и тот же период обследования (определялась двухвыборочным t-тестом для выборок с различными дисперсиями). ^∧ - p <0.05, ^∧∧ - p <0.01, ^∧∧∧ - p <0.001 - significance of differences between the experimental and control subgroups of rats in the same examination period (determined by a two-sample t-test for samples with different variances).

Таблица 4БTable 4B Содержание SH-групп, МДА, триглицеридов и активность каталазы, АЛТ, ACT и γ-ГТ (M±SD) в сыворотке крови крыс, иммунизированных БПК A-I с БСА после алкоголизации (II группа)The content of SH-groups, MDA, triglycerides and the activity of catalase, ALT, ACT and γ-GT (M ± SD) in the blood serum of rats immunized with BOD A-I with BSA after alcoholization (group II) Период экспериментаExperiment period ГруппыGroups SH-группы, мкмоль/лSH-groups, µmol / l МДА, мкмоль/лMDA, μmol / L Триглицериды, ммоль/лTriglycerides, mmol / L Каталаза, м кат/лCatalase, m cat / l АЛТ, ед./лALT, units / l ACT, ед./лACT, units / l γ-ГТ, ед./лγ-HT, units / l до воздействияbefore exposure опытexperience 171,5±2,0171.5 ± 2.0 15,0±0,715.0 ± 0.7 1,25±0,091.25 ± 0.09 98,4±7,998.4 ± 7.9 135,6±4,6135.6 ± 4.6 191,7±10,3191.7 ± 10.3 2,23±0,82.23 ± 0.8 контрольthe control 160,1±14,5160.1 ± 14.5 16,0±0,716.0 ± 0.7 0,99±0,120.99 ± 0.12 100,3±4,9100.3 ± 4.9 122,9±5,52122.9 ± 5.52 204,3±11,6204.3 ± 11.6 1,56±0,481.56 ± 0.48 после 1 месяца алкоголизацииafter 1 month of alcoholization опытexperience 129,3±1,1*/^∧∧ 129.3 ± 1.1 * / ^∧∧ 33,9±1,7***33.9 ± 1.7 *** 1,31±0,221.31 ± 0.22 89,9±5,389.9 ± 5.3 119,4±3,4**119.4 ± 3.4 ** 174,7±13,3174.7 ± 13.3 6,9±1,22**6.9 ± 1.22 ** контрольthe control 159,7±8,5159.7 ± 8.5 34,6±1,7***34.6 ± 1.7 *** 1,41±0,211.41 ± 0.21 97,3±7,797.3 ± 7.7 130,5±6,14130.5 ± 6.14 194,9±5,3194.9 ± 5.3 3,41±0,753.41 ± 0.75 после 3 месяцев алкоголизацииafter 3 months of alcoholization опытexperience 141,3±9,3141.3 ± 9.3 28,6±1,4***28.6 ± 1.4 *** 1,88±0,231.88 ± 0.23 114,0±3,5^∧∧∧ 114.0 ± 3.5 ^∧∧∧ 105±6,4***105 ± 6.4 *** 166,4±8,58166.4 ± 8.58 4,90±1,34.90 ± 1.3 контрольthe control 157,9±11,8157.9 ± 11.8 25,0±1,5***25.0 ± 1.5 *** 1,37±0,221.37 ± 0.22 66,1±7,3***66.1 ± 7.3 *** 106,1±5,35*106.1 ± 5.35 * 175,4±9,4175.4 ± 9.4 1,74±0,51.74 ± 0.5 после 2-ой иммунизацииafter the 2nd immunization опытexperience 89,4±5,7***/^∧ 89.4 ± 5.7 *** / ^∧ 28,2±1,1***28.2 ± 1.1 *** 1,30±0,141.30 ± 0.14 85,5±8,185.5 ± 8.1 115,9±7,5115.9 ± 7.5 184,8±15,6184.8 ± 15.6 4,81±1,44.81 ± 1.4 контрольthe control 114,1±5,9**114.1 ± 5.9 ** 31,3±1,3***31.3 ± 1.3 *** 1,43±0,221.43 ± 0.22 67,4±8,1***67.4 ± 8.1 *** 119,1±10,0119.1 ± 10.0 173,2±7,85173.2 ± 7.85 1,8+0,571.8 + 0.57 после 5-ой иммунизацииafter the 5th immunization опытexperience 138,5±10,4*/^∧ 138.5 ± 10.4 * / ^∧ 36,7±1,4***36.7 ± 1.4 *** 1,27±0,121.27 ± 0.12 72,8±4,4*/^∧ 72.8 ± 4.4 * / ^∧ 95,7±6,4***95.7 ± 6.4 *** 166,9±13,3166.9 ± 13.3 7,0+1,67.0 + 1.6 контрольthe control 175,5±9,4175.5 ± 9.4 36,4±1,4***36.4 ± 1.4 *** 1,18±0,191.18 ± 0.19 89,0±2,3*89.0 ± 2.3 * 89,1±6,78***89.1 ± 6.78 *** 184,3±15,1184.3 ± 15.1 12,5±4,212.5 ± 4.2 * - р<0.05, ** - р<0.01, *** - р<0.001 - значимость различий по сравнению с исходным уровнем в одной и той же подгруппе крыс (определялась парным двухвыборочным t-тестом).* - p <0.05, ** - p <0.01, *** - p <0.001 - significance of differences compared with the initial level in the same subgroup of rats (determined by paired two-sample t-test). ^∧ - р<0.05, ^∧∧ - р<0.01, ^∧∧∧ - р<0.001 - значимость различий между опытной и контрольной подгруппами крыс в один и тот же период обследования (определялась двухвыборочным t-тестом для выборок с различными дисперсиями). ^∧ - p <0.05, ^∧∧ - p <0.01, ^∧∧∧ - p <0.001 - significance of differences between the experimental and control subgroups of rats in the same examination period (determined by a two-sample t-test for samples with different variances).

Claims

A method of preventing the development and / or suppression of alcoholic motivation, which consists in immunizing an individual by administering to it a conjugate of angiotensin I with bovine serum albumin (BSA) at a dose of 300 μg / kg.