RU2530170C1 - Method of detecting stem cancer cells - Google Patents
Method of detecting stem cancer cells Download PDFInfo
- Publication number
- RU2530170C1 RU2530170C1 RU2013113328/10A RU2013113328A RU2530170C1 RU 2530170 C1 RU2530170 C1 RU 2530170C1 RU 2013113328/10 A RU2013113328/10 A RU 2013113328/10A RU 2013113328 A RU2013113328 A RU 2013113328A RU 2530170 C1 RU2530170 C1 RU 2530170C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- dna
- fragments
- double
- stranded dna
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии и молекулярной биологии, и может быть использовано для детекции (обнаружения) популяции раковых клеток, обладающих инициирующими свойствами (стволовые - туморогенные раковые клетки).The invention relates to medicine, in particular to oncology and molecular biology, and can be used to detect (detect) a population of cancer cells with initiating properties (stem - tumorigenic cancer cells).
Представление о существовании стволовой (инициирующей) раковой клетки ставит основной вопрос, связанный с возможностью терапевтического изменения статуса раковой клетки или ее прямой элиминации. Первым и необходимым условием целевого воздействия на стволовую (инициирующую) раковую клетку является ее индивидуализация в массе опухолевых клеток. Существует несколько подходов и методов идентификации стволовых (инициирующих) раковых клеток.The idea of the existence of a stem (initiating) cancer cell raises the main question related to the possibility of a therapeutic change in the status of a cancer cell or its direct elimination. The first and necessary condition for targeting a stem (initiating) cancer cell is its individualization in the mass of tumor cells. There are several approaches and methods for identifying stem (initiating) cancer cells.
Наиболее общепринятым способом считается метод лимитирующих разведений (LDA) [1, 2]. Используя многочисленные разведения, клеточную культуру титруют до разведения, когда при пересадке трансплантата развития опухоли не происходит. Тестирование большого числа разведений в многочисленных повторах и статистическая обработка результатов позволяют выбрать образец, содержащий одну клетку с необходимым признаком. Указанный способ трудоемкий, занимает много времени и имеет ограниченность применения, поскольку не все опухоли могут быть диссоциированы до индивидуальной клетки.The most common way is the method of limiting dilutions (LDA) [1, 2]. Using numerous dilutions, the cell culture is titrated prior to dilution, when tumor development does not occur during transplant transplantation. Testing a large number of dilutions in numerous repetitions and statistical processing of the results allows you to select a sample containing one cell with the necessary trait. This method is time-consuming, time-consuming and has limited application, since not all tumors can be dissociated to an individual cell.
Также известен способ, называемый методом формирования сфер [3, 4]. Метод формирования сфер является классическим способом определения плюрипотентной стволовой клетки, которая в полужидкой среде формирует вокруг себя сферу из клеток-потомков. Для оценки туморогенных (инициирующих) свойств полученных сфер используется их последующая трансплантация и цитологическая и биохимическая характеристика опухолевого графта. Указанный способ также трудоемкий, занимает много времени и имеет ограниченность применения, поскольку также не может быть применен к опухолям, которые не могут быть диссоциированы до индивидуальной клетки.Also known is a method called the method of forming spheres [3, 4]. The method of forming spheres is a classic way of determining a pluripotent stem cell, which in a semi-fluid medium forms a sphere of descendant cells around itself. To evaluate the tumorigenic (initiating) properties of the obtained spheres, their subsequent transplantation and the cytological and biochemical characteristics of the tumor graft are used. The indicated method is also laborious, time consuming and has limited application, since it also cannot be applied to tumors that cannot be dissociated into an individual cell.
Другой способ, широко использующийся в экспериментальной онкологической практике, основан на применении биохимических маркеров стволовых (инициирующих) раковых клеток. Наиболее широко распространенными являются CD133 (проминин-1), CD44 (рецептор для гиолуронана), CD166, CD34, CD38 (маркеры острого миелогенного лейкоза), CD138 (маркер для терминально дифференцированных В лимфоцитов), CD24 (маркер фактора эпителиальной клеточной адгезии ЕрСАМ или ESA), В5 (АВСВ5 АТР связывающий белок) [5]. К сожалению, до настоящего времени не обнаружены универсальные опухолевые маркеры. В этом проявляется недостаточная эффективность использования биохимических маркеров для идентификации инициирующих (стволовых) раковых клеток.Another method that is widely used in experimental oncological practice is based on the use of biochemical markers of stem (initiating) cancer cells. The most common are CD133 (prominin-1), CD44 (receptor for hyoluronan), CD166, CD34, CD38 (markers of acute myelogenous leukemia), CD138 (marker for terminally differentiated B lymphocytes), CD24 (marker of epithelial cell adhesion factor EpCAM or ESA ), B5 (ABCB5 ATP binding protein) [5]. Unfortunately, to date, no universal tumor markers have been found. This shows a lack of effectiveness in the use of biochemical markers for the identification of initiating (stem) cancer cells.
Еще одним способом выявления стволовых (инициирующих) раковых клеток является подход, реализованный на примере двух типов клеток MDA-MB-436 и MCF-7, позволяющий сортировать раковые клетки по их способности к деформации. Известно, что раковая клетка, обладающая инициирующими характеристиками, способна к миграции и имеет многочисленные нарушения в системах формирования актинового цитоскелета. Подверженные деформации раковые клетки обладают повышенной метастазирующей способностью и способностью формировать мамосферы. Используя метод проточной селекции по деформационной способности раковых клеток, была получена популяция клеток, обладающая характеристиками стволовой (инициирующей) раковой клетки [6]. Указанный способ определения стволовых (инициирующих) раковых клеток технически сложен, трудно адаптируется к клеткам других опухолей, имеющих различный физический размер и плоидность, и имеет ограниченность применения, поскольку также не может быть применен к опухолям, которые не могут быть диссоциированы до индивидуальной клетки.Another way to identify stem (initiating) cancer cells is the approach implemented using two types of cells, MDA-MB-436 and MCF-7, which allow cancer cells to be sorted by their deformability. It is known that a cancer cell with initiating characteristics is capable of migration and has numerous abnormalities in the actin cytoskeleton formation systems. Deformed cancer cells have an increased metastatic ability and the ability to form mammospheres. Using the method of flow selection for the deformation ability of cancer cells, a cell population was obtained that has the characteristics of a stem (initiating) cancer cell [6]. The indicated method for determining stem (initiating) cancer cells is technically complicated, it is difficult to adapt to cells of other tumors having different physical sizes and ploidy, and has limited application, since it also cannot be applied to tumors that cannot be dissociated into an individual cell.
Близким к предложенному является способ, при котором для выявления стволовых (инициирующих) раковых клеток используется их способность выбрасывать из цитоплазмы определенные липофильные флуоресцентные красители, такие, как Хехст (Hoechst) 33342 или родамин-123. Эта особенность позволяет не только идентифицировать стволовые клетки при проточной цитофлуориметрии, но и собирать их для различных исследований как фракцию неокрашенных или слабоокрашенных клеток с помощью сортировки клеток. Однако близкий способ также имеет ограниченность применения, поскольку при такого рода детекции теряется возможность таргетного воздействия на стволовую (инициирующую) раковую клетку, поскольку способ основан на использовании, во-первых, одиночных липофильных молекул и, во-вторых, связан с их исключением из состава клетки. Обе характеристики предполагают отсутствие принципиальной возможности использования этих красителей в качестве курьерных агентов, доставляющих в раковую клетку активные химические молекулы, способные разрушить стволовую (инициирующую) раковую клетку.Close to the proposed one is a method in which to detect stem (initiating) cancer cells, their ability to eject certain lipophilic fluorescent dyes from the cytoplasm, such as Hoechst 33342 or rhodamine-123, is used. This feature allows not only to identify stem cells during flow cytometry, but also to collect them for various studies as a fraction of unstained or slightly stained cells using cell sorting. However, a similar method also has limited application, since such detection loses the possibility of targeted exposure to a stem (initiating) cancer cell, since the method is based on the use, firstly, of single lipophilic molecules and, secondly, associated with their exclusion from the composition cells. Both characteristics suggest that there is no fundamental possibility of using these dyes as couriers that deliver active chemical molecules to the cancer cell that can destroy the stem (initiating) cancer cell.
Указанные характеристики свидетельствуют о том, что на настоящий момент времени не существует универсального способа детекции всей совокупности или части популяции инициирующих (раковых) клеток или они трудоемки, занимают много времени и в этой связи неприменимы в реальных клинических условиях.These characteristics indicate that at the moment there is no universal way to detect the entire population or part of the population of initiating (cancerous) cells or they are laborious, take a lot of time and, therefore, are not applicable in real clinical conditions.
Наиболее близким но своей сущности к предложенному является способ, основанный на использовании соединения, содержащего, по крайней мере, один направляющий модуль, который способен к взаимодействию со специфическим молекулярным маркером рака, выбранным из группы, состоящей из DD3 и теломеразной обратной транскриптазы (TERT), и, по меньшей мере, один детектируемый компонент, выбранный из группы, состоящей из флуоресцеина или других родственных производных [RU 2450832, A61K 49/14, A61K 49/18, 20.05.2012].Closest to its essence, the proposed one is a method based on the use of a compound containing at least one directing module, which is capable of interacting with a specific molecular marker of cancer selected from the group consisting of DD3 and telomerase reverse transcriptase (TERT), and at least one detectable component selected from the group consisting of fluorescein or other related derivatives [RU 2450832, A61K 49/14, A61K 49/18, 05.20.2012].
Недостатком способа является относительно узкая область применения, поскольку способ не позволяет выявить раковые клетки с инициирующими свойствами (стволовые - туморогенные раковые клетки).The disadvantage of this method is the relatively narrow scope, since the method does not allow to identify cancer cells with initiating properties (stem - tumorigenic cancer cells).
Целью настоящего изобретение является расширение области применения.The aim of the present invention is to expand the scope.
Требуемый технический результат заключается в расширении области применения путем введения технических средств, позволяющих осуществить детекцию стволовых раковых клеток.The required technical result is to expand the scope by introducing technical means that allow the detection of stem cancer cells.
Поставленная цель реализуется, а требуемый технический результат достигается тем, что в способе детекции стволовых раковых клеток, основанном на инкубациии образцов клеток с флюоресциентными липофильными красителями и последующей идентификации раковых клеток в ультрафиолетовом свете, при инкубации образцов клеток, которая проводится с флуоресцентным красителем, ковалентно инкорпорированным во фрагменты двуцепочечной ДНК, обеспечивается интернализация экстраклеточных экзогенных фрагментов двуцепочечной ДНК во внутриклеточное пространство стволовых клеток, входящих в состав образцов клеток, путем проведения инкубации образцов клеток в растворе препарата фрагментированной двуцепочечной ДНК в соотношении 0.5-1 мкг ДНК на 1000000 клеток, находящихся в суспензии или на срезе ткани в течение 60-120 минут, а идентификацию раковых клеток в качестве стволовых осуществляют в ультрафиолетовом свете с длиной волны, соответствующей максимуму поглощения введенного в молекулы фрагментов двуцепочечной ДНК флуорохрома (в частности, TAMRA), причем, в качестве фрагментов двуцепочечной ДНК используют фрагменты, энзиматически меченые предшественником, содержащим ковалентно пришитый флуорохромный краситель, или меченые прямым химическим введением флуорохрома.The goal is realized, and the desired technical result is achieved by the fact that in a method for detecting stem cancer cells, based on incubation of cell samples with fluorescent lipophilic dyes and subsequent identification of cancer cells in ultraviolet light, during incubation of cell samples, which is carried out with a fluorescent dye covalently incorporated into fragments of double-stranded DNA, internalization of extracellular exogenous fragments of double-stranded DNA into intracellular the stem cells included in the cell samples by incubating cell samples in a solution of a fragmented double-stranded DNA preparation in a ratio of 0.5-1 μg DNA per 1,000,000 cells in suspension or on a tissue section for 60-120 minutes, and the identification of cancer cells as stem cells, they are carried out in ultraviolet light with a wavelength corresponding to the maximum absorption of fluorochrome obtained in molecules of double-stranded DNA fragments (in particular, TAMRA), moreover, as fragments of double-stranded D By using fragments enzymatically labeled precursor containing covalently sewn fluorochrome dye or direct chemical introduction labeled fluorochrome.
Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что в качестве флуорохромного красителя используют флуорохромный краситель, который может быть ковалентно объединен с предшественником полимерной формы ДНК в местах, не мешающих процессу инкорпорации трифосфата в нуклеотидную цепь, или введен химимческим путем непосредственно в молекулу фрагмента двуцепочечной ДНК.In addition, the desired technical result is achieved in that a fluorochrome dye is used as a fluorochrome dye, which can be covalently combined with the precursor of the polymeric form of DNA in places that do not interfere with the process of incorporation of the triphosphate into the nucleotide chain, or introduced chemically directly into the molecule of a double-stranded DNA fragment .
Предложенный способ основан на естественной способности стволовых (инициирующих) раковых клеток интернализовать экзогенные экстраклеточные не объединенные в компартменты фрагменты двуцепочечной ДНК и на совместной инкубации индивидуальных клеток опухоли или сегмента ткани опухоли или культуры опухолевых или асцитных клеток с мечеными флуорохромным красителем фрагментами двуцепочечной ДНК.The proposed method is based on the natural ability of stem (initiating) cancer cells to internalize exogenous extracellular double-stranded DNA fragments and to jointly incubate individual tumor cells or a tumor tissue segment or a tumor or ascites cell culture with fluorochrome stained double-stranded DNA fragments.
Предложенный способ характеризуется возможностью использования фрагментов двуцепочечной ДНК в качестве курьера, доставляющего биологически или химически активные молекулярные группы, ковалентно присоединенные к этим фрагментам и вступающие во взаимодействие с компонентами раковой инициирующей клетки, приводящие к ее апоптотической, некротической или иной гибели.The proposed method is characterized by the possibility of using double-stranded DNA fragments as a carrier, delivering biologically or chemically active molecular groups covalently attached to these fragments and interacting with the components of the cancer initiating cell, leading to its apoptotic, necrotic or other death.
В современной литературе отсутствуют указания на предлагаемый способ обнаружения, идентификации, сортинга и разрушения или необратимой обратной трансформации популяции раковых клеток, обладающих инициирующими свойствами (стволовые-туморогенные раковые клетки), в популяции свободно существующих раковых клеток и в клетках опухолей, растущих в массе ткани.There is no evidence in the modern literature on the proposed method for detecting, identifying, sorting and destroying or irreversibly reverse transforming a population of cancer cells with initiating properties (stem-tumorigenic cancer cells) in a population of freely existing cancer cells and in tumor cells growing in a mass of tissue.
Следовательно, предложение отвечает критериям новизны и изобретательского уровня.Therefore, the proposal meets the criteria of novelty and inventive step.
Ниже приводятся теоретические и экспериментальные данные, подтверждающие, что изобретение отвечает критерию практической (промышленной) применимости.The following are theoretical and experimental data confirming that the invention meets the criterion of practical (industrial) applicability.
На чертеже представлены:The drawing shows:
на фиг.1 - Цитологический анализ содержания TAMRA меченой ДНК Alu повтора человека в CD34+ клетках костного мозга после совместного инкубирования ex vivo. А) Двумерное изображение CD34+ клеток, полученное при помощи микроскопа Axioskop 2 plus (Zeiss) и программы Axio VisionLE. 1 - DAPI, окраска на хроматин, 2 - FITC, специфический маркер CD34+ клеток, 3 - TAMRA, сигнал экзогенных фрагментов двуцепочечной ДНК. Стрелками указаны сигналы TAMRA, свидетельствующие о присутствии экзогенной ДНК в CD34+ клетках. Приведенный масштаб является одинаковым для всех блоков. В) Объемное изображение ядра CD34+ клетки, полученное при помощи конфокального микроскопа LSM 510 МЕТА (Zeiss). DAPI (синий цвет) - окраска на хроматин, показывает границы ядра; TAMRA (красный цвет) - специфичная окраска фрагментов экзогенной ДНК. Как видно из рисунка, сигнал TAMRA локализуется внутри ядра.figure 1 - Cytological analysis of the content of TAMRA labeled DNA Alu repeat human CD34 + bone marrow cells after co-incubation ex vivo. A) Two-dimensional image of CD34 + cells obtained with an Axioskop 2 plus microscope (Zeiss) and Axio VisionLE. 1 - DAPI, chromatin staining, 2 - FITC, specific marker of CD34 + cells, 3 - TAMRA, signal of exogenous double-stranded DNA fragments. Arrows indicate TAMRA signals indicating the presence of exogenous DNA in CD34 + cells. The scale shown is the same for all blocks. C) A 3D image of the nucleus of a CD34 + cell obtained using a LSM 510 META confocal microscope (Zeiss). DAPI (blue color) - color on chromatin, shows the boundaries of the nucleus; TAMRA (red color) - specific color of exogenous DNA fragments. As can be seen from the figure, the TAMRA signal is localized inside the core.
на фиг.2 - Цитологический анализ содержания TAMRA-меченой ДНК во фракции клеток костного мозга, не содержащей CD34+ клеток (CD34- клетки костного мозга). А) Двумерное изображение CD34- клеток, полученное при помощи микроскопа Axioskop 2 plus и программы Axio VisionLE; 1 - сигнал TAMRA, свидетельствующий о присутствии в ядерном пространстве клеток костного мозга фрагментов экзогенной ДНК, 2 - сигнал DAPI, окраска на хроматин. В) Изображение ортогональных проекций ядер CD34- клеток костного мозга (X - область справа, Y - область сверху, Z - центральное изображение), полученное при помощи конфокального микроскопа LSM 510 МЕТА (Zeiss). Из рисунка видно, что сигнал TAMRA, свидетельствующий о присутствии экзогенной ДНК Alu повтора человека, располагается внутри ядерного пространства клетки.figure 2 - Cytological analysis of the content of TAMRA-labeled DNA in the fraction of bone marrow cells that do not contain CD34 + cells (CD34-bone marrow cells). A) Two-dimensional image of CD34 cells obtained with an Axioskop 2 plus microscope and Axio VisionLE; 1 - TAMRA signal, indicating the presence of exogenous DNA fragments in the bone marrow cells, 2 - DAPI signal, chromatin staining. C) Image of orthogonal projections of the nuclei of bone marrow CD34 cells (X is the region on the right, Y is the region on the top, Z is the central image) obtained with the LSM 510 META confocal microscope (Zeiss). The figure shows that the TAMRA signal, indicating the presence of exogenous Alu repeat DNA, is located inside the nuclear space of the cell.
на фиг.3 - Анализ геномной ДНК, выделенной из клеток костного мозга после коинкубирования с экзогенной ДНК плазмиды pEGFP-N1. A) Фракционированная геномная ДНК, выделенная из клеток костного мозга мышей после совместного инкубирования с экзогенной ДНК плазмиды pEGFP-N1 и центрифугирования в градиенте NaCl; 6-10, 23 - номера фракций; М - маркер молекулярного веса 1 kb. В) Плазмиды, полученные в результате трансформации компетентных клеток ДНК 8 фракции, выделенной из клеток костного мозга после совместного инкубирования с ДНК плазмиды pEGFP-N1 и последующего лигирования саму на себя; плазмиды 8lig1 и 8lig7 - меньше по размеру, чем исходная форма плазмиды pEGFP-N1. С) Анализ нуклеотидной последовательности укороченных плазмид 8lig1 и 8lig7. Карта исходной плазмиды pEGFP-N1, а также двух плазмид, выделенных из геномной ДНК клеток костного мозга, после совместного инкубирования клеток с исходной формой указанной плазмиды, линеаризованной по сайту рестрикции HindIII.figure 3 - Analysis of genomic DNA isolated from bone marrow cells after co-incubation with exogenous DNA of plasmid pEGFP-N1. A) Fractionated genomic DNA isolated from mouse bone marrow cells after co-incubation with exogenous DNA of plasmid pEGFP-N1 and centrifugation in a NaCl gradient; 6-10, 23 - numbers of fractions; M is a molecular weight marker of 1 kb. C) Plasmids obtained as a result of transformation of competent cells of the DNA of the 8 fraction isolated from bone marrow cells after co-incubation with the DNA of plasmid pEGFP-N1 and subsequent ligation on itself; plasmids 8lig1 and 8lig7 are smaller in size than the initial form of plasmid pEGFP-N1. C) Analysis of the nucleotide sequence of truncated plasmids 8lig1 and 8lig7. Map of the original plasmid pEGFP-N1, as well as two plasmids isolated from the genomic DNA of bone marrow cells, after co-incubation of the cells with the initial form of the indicated plasmid linearized at the HindIII restriction site.
на фиг.4 - Цитологический анализ содержания TAMRA-меченой ДНК в асцитных клетках опухоли Кребс-2. А) Двумерное изображение асцитных клеток, полученное при помощи микроскопа Axioskop 2 plus и программы Axio VisionLE; 1 - сигнал TAMRA, свидетельствующий о присутствии в ядерном пространстве асцитных клеток фрагментов экзогенной ДНК, 2 - контрольные клетки. Правые блоки - сигнал DAPI, окраска на хроматин. В) Изображение ортогональных проекций ядер асцитных клеток (X - область справа, Y - область сверху, Z - центральное изображение), полученное при помощи конфокального микроскопа LSM 510 МЕТА (Zeiss). Из рисунка видно, что сигнал TAMRA, свидетельствующий о присутствии экзогенной ДНК Alu повтора человека, располагается внутри ядерного пространства клетки.figure 4 - Cytological analysis of the content of TAMRA-labeled DNA in ascites cells of the Krebs-2 tumor. A) Two-dimensional image of ascites cells obtained with an Axioskop 2 plus microscope and Axio VisionLE; 1 - TAMRA signal, indicating the presence in the nuclear space of ascites cells of exogenous DNA fragments, 2 - control cells. Right blocks - DAPI signal, chromatin staining. C) Image of orthogonal projections of the nuclei of ascites cells (X is the region on the right, Y is the region on the top, Z is the central image) obtained with the LSM 510 META confocal microscope (Zeiss). The figure shows that the TAMRA signal, indicating the presence of exogenous Alu repeat DNA, is located inside the nuclear space of the cell.
на фиг.5 - Интернализация фрагментов экзогенной, экстраклеточной двуцепочечной ДНК в клетки опухоли Кребс-2, растущей в форме асцита. А) Радиоавтографы, демонстрирующие интернализацию αР32 ПЦР меченого GFP гена в асцитные клетки Кребс-2. Два левых блока - маркеры молекулярных весов: gGFP - ПЦР меченый ген GFP (1) и HindIII гидролизат ДНК фага λ (2). (3) - (5): левые блоки - электрофореграмма, правые блоки - радиоавтография этих же блоков после высушивания и экспонирования на фосфоиммеджере. Для электрофореза использовалась ДНК, выделенная из асцитных клеток, взятых из асцитной жидкости мышей через 18 часов после обработки цитостатиком циклофосфаном (3), выделенная из асцитных клеток, взятых из асцитной жидкости мышей без обработки цитостатиком циклофосфаном (4) и выделенная из клеток костного мозга мышей без обработки цитостатиком циклофосфаном (5). Клетки инкубировались различное время (указано вверху блоков) с αР32 ПЦР меченым геном GFP. Везде видно очевидное присутствие меченого фрагмента ДНК в исходной форме. Сила сигнала в раковых клетках намного интенсивнее, чем в клетках костного мозга. В) Блоты, демонстрирующие интернализацию линеаризованной по HindIII плазмиды pGFP в асцитные клетки опухоли Кребс-2. 1) маркер молекулярных весов HindIII гидролизат ДНК фага λ. (2)-(4): левые блоки - электрофореграмма, правые блоки - радиоавтография блотов после гибридизации фракционированной ДНК асцитных клеток (2, 3) и клеток костного мозга (4) с αР32 меченой по HindIII концу ДНК плазмиды pGFP после ее рестрикции по указанной рестриктазе. Для электрофореза использовалась ДНК, выделенная из асцитных клеток, полученных из асцитной жидкости мышей через 18 часов после инъекции цитостатика циклофосфана (2), выделенная из асцитных клеток, полученных из асцитной жидкости мышей без обработки цитостатиком (3) и выделенная из клеток костного мозга мышей (4). С) Диаграммы, демонстрирующие количество (%) экзогенной двуцепочечной ДНК, доставляемой во внутренние компартменты асцитных клеток и клеток костного мозга, из расчета на общее количество клеток в образце.figure 5 - Internalization of fragments of exogenous, extracellular double-stranded DNA into Krebs-2 tumor cells growing in the form of ascites. A) Radio autographs demonstrating the internalization of αP 32 PCR of the labeled GFP gene in Krebs-2 ascites cells. Two left blocks are molecular weight markers: gGFP - PCR-labeled GFP gene (1) and HindIII phage λ DNA hydrolyzate (2). (3) - (5): the left blocks are the electrophoregram, the right blocks are the radio-autographs of the same blocks after drying and exposure on the phosphoimager. For electrophoresis, DNA was isolated from ascites cells taken from the ascites fluid of
на фиг.6 - А) Плоты, демонстрирующие зависимость количества клеток, интернализующих меченый двуцепочечный ДНК зонд, от количества экстраклеточной ДНК, присутствующей в культуральной среде. В) График, отражающий эту зависимость. При логарифмическом возрастании количества ДНК происходит линейное увеличение % клеток с содержанием TAMRA.6 - A) Rafts showing the dependence of the number of cells internalizing a labeled double-stranded DNA probe on the amount of extracellular DNA present in the culture medium. C) A graph reflecting this relationship. With a logarithmic increase in the amount of DNA, a linear increase in% of cells with TAMRA content occurs.
на фиг.7 - А) Клеточный цикл клеток ацита Кребс-2. В) Плоты, демонстрирующие присутствие в асцитных клетках двух популяций клеток, содержащих TAMRA сигнал (фрагменты двуцепочечной ДНК) и несущие маркер CD34+, характерный для гемопоэтических стволовых клеток мыши. С) Цитологический анализ, демонстрирующий совместную локализацию CD34+ сигнала и сигнала TAMRA.Fig.7 - A) the Cell cycle of the cells of the Krebs-2 acyte. C) Rafts showing the presence in ascitic cells of two populations of cells containing a TAMRA signal (fragments of double-stranded DNA) and bearing the CD34 + marker, characteristic of mouse hematopoietic stem cells. C) Cytological analysis demonstrating the joint localization of the CD34 + signal and the TAMRA signal.
на фиг.8 - Приведены результаты оценки вероятности существования промежутка времени в клеточном цикле, в течение которого клетки асцита приобретают, сохраняют и теряют свойство интернализации фрагментов экстраклеточной экзогенной дцДНК. Многократно показано, что в течение первого часа от 1 до 2% клеток асцита становятся TAMRA позитивными. Если интернализация фрагментов ДНК связана с временным, переходящим состоянием клеток, то при инкубации с меченым ДНК зондом в течение нескольких часов можно было бы наблюдать линейное (или близкое к таковому) увеличение количества клеток интернализующих TAMRA-ДНК зонд, поскольку через «временные ворота» ежечасно проходило бы в развитии клеточного цикла количество клеток, равное количеству, получившему TAMRA-маркер в течение первого часа. Из результатов анализа следует, что при длительной инкубации (1-4 часа) клеток асцита с ДНК зондом количество TAMRA позитивных клеток увеличивается на приблизительно 10%-30%. Такое увеличение скорее связано с завершением интенализации маркера во все компетентные клетки, чем с проходом асцитных клеток через «компетентный» промежуток времени клеточного цикла и приобретением ими способности к интернализации. А) Результаты проточной цитометрии TAMRA обработанных клеток асцита Кребс-2. На плотах представлена динамика изменения популяции TAMRA позитивных клеток на протяжении 1-4 часа инкубации. Б) Графическое изображение результатов проточной цитометрии клеток асцита Кребс-2, обработанных на протяжении 1-4 часа TAMRA меченным фрагментом дцДНК.Fig. 8 shows the results of assessing the probability of the existence of a period of time in the cell cycle during which ascites cells acquire, retain and lose the property of internalization of fragments of extracellular exogenous dsDNA. It has been repeatedly shown that during the first hour from 1 to 2% of ascites cells become TAMRA positive. If the internalization of DNA fragments is associated with a temporary, transitional state of the cells, then during incubation with a labeled DNA probe for several hours, one could observe a linear (or close to that) increase in the number of cells internalizing the TAMRA DNA probe, since through the “temporary gate” hourly in the development of the cell cycle, the number of cells equal to the number receiving the TAMRA marker in the first hour would pass. From the results of the analysis it follows that with prolonged incubation (1-4 hours) of ascites cells with a DNA probe, the number of TAMRA positive cells increases by approximately 10% -30%. Such an increase is more likely associated with the completion of marker internalization in all competent cells than with the passage of ascites cells through a “competent” period of time in the cell cycle and their acquisition of the ability to internalize. A) Flow cytometry results of TAMRA-treated Krebs-2 ascites cells. The rafts show the dynamics of changes in the population of TAMRA positive cells during 1-4 hours of incubation. B) A graphical representation of the results of flow cytometry of Krebs-2 ascites cells treated for 1-4 hours with a TAMRA-labeled dsDNA fragment.
на фиг.9 - Инициирующая способность двух популяций асцитных клеток опухоли Кребс-2 инициировать рост новой опухоли. А) Плоты, характеризующие распределение двух клеточных популяций и процентное соотношение клеток после сортировки содержащих сигнал TAMRA (фрагменты двуцепочечной ДНК) и не содержащих сигнал TAMRA. В) Время появления трансплантатов у мышей после перевивки двух различных популяций клеток, содержащих сигнал TAMRA (фрагменты двуцепочечной ДНК) и не содержащих сигнал TAMRA.figure 9 - The initiating ability of two populations of ascitic tumor cells Krebs-2 to initiate the growth of a new tumor. A) Rots characterizing the distribution of two cell populations and the percentage of cells after sorting containing a TAMRA signal (fragments of double-stranded DNA) and not containing a TAMRA signal. C) The time of appearance of transplants in mice after transplantation of two different populations of cells containing the TAMRA signal (fragments of double-stranded DNA) and not containing the TAMRA signal.
на фиг.10 - Инициирующая способность CD34+ популяций асцитных клеток опухоли Кребс-2 инициировать рост новой опухоли. А) Плоты, характеризующие количество CD34 позитивных клеток в популяции асцитных клеток опухоли Кребс-2. В) Время появления трансплантатов у мышей после перевивки сортированной СВ34+ популяции клеток в сравнении с перевивкой суммарной популяции клеток асцита.figure 10 - The initiating ability of CD34 + populations of ascitic tumor cells Krebs-2 to initiate the growth of a new tumor. A) Rots characterizing the number of CD34 positive cells in a population of ascites cells of the Krebs-2 tumor. C) The time of the appearance of grafts in mice after inoculation of a sorted CB34 + cell population compared with inoculation of the total ascites cell population.
На фиг.11 - Интернализация меченого TAMRA ДНК зонда в клетки солидной формы опухоли Кребс-2. На рисунке представлена серия срезов опухолевой капсулы, содержащей островок клеток, интернализующих TAMRA ДНК зонд. Стрелками отмечены области скопления раковых клеток, интернализующих TAMRA ДНК. Масштаб указан в барах. Слева от панелей указаны флуорохромы DAPI, TAMRA, DAPI+TAMRA.11 - Internalization of TAMRA-labeled DNA probe into cells of the solid form of the Krebs-2 tumor. The figure shows a series of sections of a tumor capsule containing an island of cells internalizing a TAMRA DNA probe. The arrows indicate the accumulation of cancer cells internalizing TAMRA DNA. The scale is indicated in bars. To the left of the panels are fluorochromes DAPI, TAMRA, DAPI + TAMRA.
Актуальность данного изобретения подтверждается обобщающим, наиболее полным и вместе с тем лаконичным обзором, характеризующим общие положения концепции раковых стволовых клеток, описывающим способы выявления и характеристики раковых стволовых клеток из различных опухолей и, наконец, определяющих значение раковых стволовых клеток в биомедицинских исследованиях [7]. Основные положения обзора можно суммировать в следующих тезисах.The relevance of this invention is confirmed by a generalized, most complete and at the same time concise review, characterizing the general provisions of the concept of cancer stem cells, describing methods for identifying and characterizing cancer stem cells from various tumors and, finally, determining the significance of cancer stem cells in biomedical research [7]. The main points of the review can be summarized in the following theses.
В настоящее время существует две модели, характеризующие (описывающие) опухоль как иерархическую систему организации популяции неотрансформированных клеток. Стохастическая модель предполагает, что все клетки опухоли имеют одинаковый потенциал в индукции развития новой опухоли [8-11]. Вторая модель предполагает иерархическую организацию опухоли, где наверху иерархической лестницы находятся стволовые раковые клетки [12, 13].Currently, there are two models that characterize (describe) a tumor as a hierarchical system of organization of a population of non-transformed cells. The stochastic model assumes that all tumor cells have the same potential in inducing the development of a new tumor [8-11]. The second model assumes a hierarchical organization of the tumor, where stem cancer cells are located at the top of the hierarchical ladder [12, 13].
Предположение о существовании стволовой или инициирующей раковой клетки было впервые выдвинуто в работах Дайка с коллегами [12, 13], где было показано, что только незначительное количество CD34-CD38- клеток, выделенных из крови больных лейкемией, имеют перевивочный потенциал. Остальные клетки оказались не в состоянии индуцировать развитие рака. В дальнейшем это предположение получило свое подтверждение в исследованиях, проведенных на опухолях различной этиологии [14-26].The assumption of the existence of a stem or initiating cancer cell was first put forward in the work of Dyke and colleagues [12, 13], where it was shown that only a small number of CD34-CD38 cells isolated from the blood of patients with leukemia have leno potential. The remaining cells were not able to induce the development of cancer. In the future, this assumption was confirmed in studies conducted on tumors of various etiologies [14-26].
Основными свойствами, характерными для стволовых раковых клеток, являются самоподдержание в ряду неограниченного числа делений, способность производить коммитированную дочернюю клетку, обладающую высоким пролиферативным потенциалом, но не способной инициировать новую опухоль, устойчивость к многократной пересадке с сохранением гистологических характеристик опухоли.The main properties characteristic of stem cancer cells are self-maintenance in the series of an unlimited number of divisions, the ability to produce a committed daughter cell with high proliferative potential, but not capable of initiating a new tumor, resistance to multiple transplantation while maintaining the histological characteristics of the tumor.
Предлагаемый способ обнаружения, идентификации, сортинга и разрушения или необратимой обратной трансформации популяции раковых клеток, обладающих инициирующими свойствами (стволовые-туморогенные раковые клетки) в популяции свободно существующих раковых клеток и в клетках опухолей, растущих в массе ткани, реализуется следующим образом.The proposed method for the detection, identification, sorting and destruction or irreversible reverse transformation of a population of cancer cells with initiating properties (stem-tumorigenic cancer cells) in a population of freely existing cancer cells and in tumor cells growing in a mass of tissue is implemented as follows.
Основываясь на обнаруженном свойстве стволовых (инициирующих) раковых клеток интернализовать экзогенные экстраклеточные фрагменты двуцепочечной ДНК, проводится совместная инкубация индивидуальных клеток опухоли, или сегмента ткани опухоли, или культуры опухолевых или асцитных клеток с мечеными флуорохромным красителем (например, TAMRA) фрагментами двуцепочечной ДНК. Стволовые инициирующие раковые клетки интернализуют фрагменты двуцепочечной ДНК, содержащие ковалентно связанный с ними краситель. Клетки, интернализовавшие меченый ДНК субстрат, могут быть идентифицированы, выделены как популяция клеток или как индивидуальная клетка любым известным способом, где в качестве маркера селекции используется флуорохром (цитологические манипуляции, проточная цитометрия, клеточный сортинг). В ткани стволовые (инициирующие) клетки могут быть обнаружены после инкубации сегмента опухоли с ДНК зондом, стандартной процедурой получения замороженных срезов ткани толщиной в 1-10 клеток и анализом на конфокальном или флуоресцентном микроскопе. Для целей воздействия на инициирующую (стволовую) раковую клетку к фрагментам двуцепочечной ДНК ковалентно присоединяется активная химическая группа или молекула, находящаяся в неактивном состоянии в результате блокировки ее активных центров блокирующими реагентами. После доставки в клеточное пространство блокирующие группы диссоциируют либо под действием метаболических процессов раковой клетки, либо в результате дополнительной обработки. Также в результате дополнительных обработок может быть произведена активация активных химических групп, ассоциированных с фрагментами двуцепочечной ДНК непосредственно в стволовой (инициирующей) раковой клетке после их интернализации.Based on the discovered property of stem (initiating) cancer cells to internalize exogenous extracellular fragments of double-stranded DNA, a joint incubation of individual tumor cells, or a segment of tumor tissue, or a culture of tumor or ascites cells with fluorochrome-labeled dye (e.g., TAMRA) fragments of double-stranded DNA is performed. Stem-initiating cancer cells internalize fragments of double-stranded DNA containing a dye covalently linked to them. Cells internalizing the labeled DNA substrate can be identified, isolated as a population of cells or as an individual cell by any known method, where fluorochrome is used as a selection marker (cytological manipulations, flow cytometry, cell sorting). Stem (initiating) cells can be detected in tissue after incubation of a tumor segment with a DNA probe, a standard procedure for obtaining frozen tissue sections 1-10 cells thick and analysis using a confocal or fluorescence microscope. For the purpose of influencing an initiating (stem) cancer cell, fragments of double-stranded DNA are covalently attached to an active chemical group or molecule that is in an inactive state as a result of blocking of its active centers with blocking reagents. After delivery to the cell space, the blocking groups dissociate either under the influence of the metabolic processes of the cancer cell, or as a result of additional processing. Also, as a result of additional treatments, activation of active chemical groups associated with fragments of double-stranded DNA directly in the stem (initiating) cancer cell after their internalization can be performed.
Ниже приводятся экспериментальные доказательства обнаружения, идентификации, сортинга стволовых (инициирующих-туморогенных) раковых клеток в популяции свободно существующих раковых клеток и в клетках опухолей, растущих в массе ткани.The following is experimental evidence for the detection, identification, sorting of stem (initiating-tumorigenic) cancer cells in a population of freely existing cancer cells and in tumor cells growing in a mass of tissue.
Используемые методики.Used techniques.
Приготовление TAMRA-меченой ДНК Alu повтора человека проводили при помощи ПЦР [27]. В качестве матрицы использовали клонированную в плазмиде pUC19 последовательность Alu-повтора человека, которая состоит из конечной и начальной частей двух тандемно расположенных повторов: AluJ и AluY (АС002400.1, 53494-53767). В качестве праймеров использовали стандартные М13 праймеры: М13 for: GTAAAACGACGGCCAGT; М13 rev: CAGGAAACAGCTATGAC. От не включившихся нуклеотидов избавлялись переосаждением ДНК.TAMRA-labeled human Alu repeat DNA was prepared by PCR [27]. The sequence of the Alu-repeat of a person cloned in plasmid pUC19 was used as a matrix, which consists of the final and initial parts of two tandemly located repeats: AluJ and AluY (AC002400.1, 53494-53767). Standard M13 primers were used as primers: M13 for: GTAAAACGACGGCCAGT; M13 rev: CAGGAAACAGCTATGAC. Not included nucleotides were disposed of by reprecipitation of DNA.
Для очистки ПЦР продукта от невключившихся нуклеотидов объем реакционной смеси доводили до 100 мкл, добавляли равный объем фенол-хлороформа, и после встряхивания центрифугировали при комнатной температуре в течение 2 мин, 3000 g. Верхнюю фазу переносили в новую пробирку. Добавляли ¼ объема 10М ацетата аммония и перемешивали. Добавляли равный объем изопропанола и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. ДНК осаждали центрифугированием при комнатной температуре, 12000 g, в течение 15 мин. Осадок промывали 70% этанолом и растворяли в 200 мкл воды [27]. Концентрацию ДНК и включение dUTP-TAMRA проверяли на спектрофотометре Nanodrop (Eppendorf, США), высчитывая процент сигнала до и после переосаждения препарата.To clean the PCR product from unincorporated nucleotides, the volume of the reaction mixture was brought to 100 μl, an equal volume of phenol-chloroform was added, and after shaking, it was centrifuged at room temperature for 2 min, 3000 g. The upper phase was transferred to a new tube. ¼ volume of 10M ammonium acetate was added and mixed. An equal volume of isopropanol was added and incubated for 10 min at room temperature. DNA was precipitated by centrifugation at room temperature, 12,000 g, for 15 minutes. The precipitate was washed with 70% ethanol and dissolved in 200 μl of water [27]. DNA concentration and dUTP-TAMRA incorporation were checked on a Nanodrop spectrophotometer (Eppendorf, USA), calculating the percentage of signal before and after reprecipitation of the preparation.
Для анализа интернализации TAMRA-меченой экзогенной ДНК в CD34+ и в CD34- клетках клетки костного мозга вымывали из трубчатых костей интактных мышей средой RPMI-1640, осаждали при 400 g, 4°C в течение 5 мин и промывали в 1 мл среды RPMI-1640 один раз. После разрушения эритроцитов при помощи лизирующего буфера (0,15 М NH4Cl; 10 мМ Tris-HCl pH 7,5; 0,5 мМ ЭДТА) 10 млн. клеток инкубировали с 0,8-1 мкг ДНК TAMRA-меченого Alu повтора человека в 0,5 мл среды в течение 3 часов. По окончании инкубирования клетки промывали 3-4 раза средой, как описано выше. Затем клетки ресуспендировали в PBS с 0,1% NaN3, 1% FBS. К образцам добавляли антитела (FITC Rat anti-Mouse CD34, BD Pharmingen) и изотип контроль (FITC Rat IgG2a, к Isotype Control, BD Pharmingen) из расчета 3 мкг на 3 млн. клеток в 1 мл и инкубировали в течение 40 мин при 4°C. Затем клетки селектировали на CD34+ и CD34- при помощи проточного цитофотометра BD FACSAria. Границу разделения на CD34+ и CD34- устанавливали с учетом результатов измерения при окрашивании изотип контролем. После сортировки клетки осаждали при 400 g, 4°С в течение 5 мин, фиксировали метанол: уксусная кислота (3:1) в течение часа. Суспензию клеток наносили на влажное обезжиренное стекло, препарат высушивали на воздухе, добавляли каплю Antifade DABCO, содержащего 0,4 мкг/мл DAPI, и анализировали на флуоресцентном микроскопе Axioskop 2 plus с использованием программы Axio VisionLE, либо на лазерном сканирующем микроскопе LSM 510 МЕТА.To analyze the internalization of TAMRA-labeled exogenous DNA in CD34 + and CD34 cells, bone marrow cells were washed from the tubular bones of intact mice with RPMI-1640 medium, precipitated at 400 g, 4 ° C for 5 min and washed in 1 ml of RPMI-1640 medium once. After the destruction of red blood cells using a lysis buffer (0.15 M NH 4 Cl; 10 mm Tris-HCl pH 7.5; 0.5 mm EDTA) 10 million cells were incubated with 0.8-1 μg of TAMRA-labeled Alu repeat DNA person in 0.5 ml of medium for 3 hours. At the end of the incubation, the cells were washed 3-4 times with medium, as described above. Then the cells were resuspended in PBS with 0.1% NaN 3 , 1% FBS. Antibodies (FITC Rat anti-Mouse CD34, BD Pharmingen) and isotype control (FITC Rat IgG2a, to Isotype Control, BD Pharmingen) were added to the samples at the rate of 3 μg per 3 million cells in 1 ml and incubated for 40 min at 4 ° C. Then the cells were selected on CD34 + and CD34- using a BD FACSAria flow cytophotometer. The separation boundary between CD34 + and CD34- was established taking into account the measurement results when staining the isotype control. After sorting, the cells were besieged at 400 g, 4 ° С for 5 min, methanol: acetic acid (3: 1) was fixed for one hour. The cell suspension was applied to wet defatted glass, the preparation was dried in air, a drop of Antifade DABCO containing 0.4 μg / ml DAPI was added, and analyzed using an
Для проведения процедуры инкубирования клеток костного мозга с pEGFP-N1 плазмидную ДНК pEGFP-N1 (200 мкг) вскрывали по находящемуся в полилинкере сайту рестрикции HindIII. Мышам внутрибрюшинно была сделана инъекция цитостатика циклофосфана в дозе 200 мг/кг. Через 18 часов после инъекции цитостатика были вымыты клетки костного мозга средой для стволовых клеток (D-MEM+Glu+NEAA+LIF+antibiotics). Клетки были дважды промыты этой же средой и ресуспендированы в 4 мл среды. Далее клетки инкубировали с 100 мкг плазмидной ДНК 4 часа в СО2-инкубаторе, при 95%-ной влажности воздуха, 37°С (Memmert, Германия).To perform an incubation procedure of bone marrow cells with pEGFP-N1, plasmid DNA pEGFP-N1 (200 μg) was opened at the HindIII restriction site located in the polylinker. The mice received an intraperitoneal injection of a cyclophosphamide cytostatic at a dose of 200 mg / kg. 18 hours after cytostatic injection, bone marrow cells were washed with stem cell medium (D-MEM + Glu + NEAA + LIF + antibiotics). Cells were washed twice with the same medium and resuspended in 4 ml of medium. Then the cells were incubated with 100 μg of plasmid DNA for 4 hours in a CO 2 incubator, at 95% air humidity, 37 ° C (Memmert, Germany).
Выделение и фракционирование ДНК проводили следующим образом. После инкубации клетки отмывали 3 раза PBS и ресуспендировали в 1 мл буфера А [28], дополненного 0.1% тритоном Х-100. Клетки инкубировали 5 мин на льду и аккуратно наслаивали на 3V 10% сахарозы. Градиент центрифугировали 20 мин при 500 g, 4°C. Осадок ядер промывали 1 раз буфером А, дополненным 0,1% Triton-X100, и центрифугировали при 1000 g, 4°C в течение 5 мин. Осадок клеток ресуспендировали в лизирующем буфере (10 мМ Tris-HCl pH 7.4; 50 мМ ЭДТА, 1% SDS, 200 мкг/мл Протеиназы К) и инкубировали 2 часа при 58°С. ДНК очищали фенолом, хлороформом, осаждали этанолом и растворяли в воде. Полученная геномная ДНК была фракционирована в градиенте NaCl, приготовленном на 50 мМ ЭДТА. Градиент готовили наслаиванием 1 мл каждой фракции: 30%, 25%, 20%, 15%, 10% (по массе), затем на градиент аккуратно наслаивали ДНК и центрифугировали 43000 rpm 2,5 часа на ультрацентрифуге. Отбирали фракции объемом 250 мкл, ДНК переосаждали и анализировали электрофорезом.Isolation and fractionation of DNA was carried out as follows. After incubation, the cells were washed 3 times with PBS and resuspended in 1 ml of buffer A [28], supplemented with 0.1% Triton X-100. Cells were incubated for 5 min on ice and carefully layered on
Электрокомпетентные клетки XLBlue-MRF' трансформировали различными фракциями ДНК: выделенной из клеток костного мозга после совместного инкубирования с экзогенной ДНК либо предварительно лигированной саму на себя ДНК-лигазой Т4. Всю суспензию клеток высевали на чашку Петри с LB агаром и селективным антибиотиком канамицином (25 мкг/мл). Из всех выросших колоний выделяли плазмидную ДНК методом щелочного лизиса [29] и анализировали гель-электрофорезом.XLBlue-MRF 'electrocompetent cells were transformed with various fractions of DNA: isolated from bone marrow cells after co-incubation with exogenous DNA or preliminarily ligated onto T4 DNA ligase itself. The entire cell suspension was plated on a Petri dish with LB agar and a selective antibiotic kanamycin (25 μg / ml). Plasmid DNA was isolated from all grown colonies by alkaline lysis [29] and analyzed by gel electrophoresis.
Для анализа интернализации TAMRA-меченой экзогенной ДНК в асцитной форме клеток опухоли Кребс-2 клетки опухоли отбирали из брюшной полости мышей с помощью шприца, дважды промывали PBS, после чего инкубировали с ДНК TAMRA-меченого Alu повтора человека аналогично методу, описанному для клеток костного мозга. Содержание меченого материала в клетках Кребс-2 оценивали также аналогичным образом.To analyze the internalization of TAMRA-labeled exogenous DNA in the ascites form of Krebs-2 tumor cells, tumor cells were taken from the abdominal cavity of mice with a syringe, washed twice with PBS, and then incubated with TAMRA-labeled Alu human repeat DNA, similar to the method described for bone marrow cells . The content of labeled material in Krebs-2 cells was also evaluated in a similar manner.
Для анализа доставки меченой ДНК в клетки асцитной формы опухоли мыши Кребс-2 клетки опухоли отбирали из брюшной полости у одной мыши без обработки и у одной мыши после инъекции цитостатика циклофосфана (200 мг/кг) с помощью шприца, дважды промывали PBS, при 400 g, 4°C. Затем клетки считали в камере Горяева и инкубировали определенный интервал времени (1, 2, 4 и 8 часов) в количестве 10 млн клеток в 500 мкл среды RPMI-1640 с предварительно подготовленной ДНК - 32Р-меченый в ПНР ген GFP размером 1162 п.н., а также линейную форму pEGFP-N1, гидролизованную рестриктазой HindIII. По окончании инкубации клетки собирали, промывали два раза этой же средой, заливали в блоки легкоплавкой агарозы и, в случае добавления 32P меченой ДНК, блоки считали на счетчике 1209 Rackbeta (Wallac, Финляндия). Затем материал в блоках фракционировали электрофорезом и, в зависимости от эксперимента, либо высушивали гель и проводили засветку на Molecular Imager FX Pro+ (при добавлении меченого материала), либо переносили по Саузерну на мембрану Zeta-ProbeGenomicTestedBlottingMembrane (Bio-Rad) (при добавлении гидролизата плазмиды) и проводили гибридизацию с меченой ДНК. В качестве контроля доставки ДНК в данном эксперименте аналогичные процедуры были проделаны с клетками костного мозга мыши.To analyze the delivery of labeled DNA to ascites cells of a mouse tumor, the Krebs-2 tumor cells were taken from the abdominal cavity in one mouse without treatment and in one mouse after injection of cyclophosphamide cytostatic (200 mg / kg) using a syringe, washed twice with PBS at 400 g , 4 ° C. Then, the cells were counted in a Goryaev’s chamber and incubated for a certain time interval (1, 2, 4, and 8 hours) in the amount of 10 million cells in 500 μl of RPMI-1640 medium with pre-prepared DNA — 32 P-labeled GPR gene 1162 p in size. N., as well as the linear form of pEGFP-N1, hydrolyzed by restriction enzyme HindIII. At the end of the incubation, the cells were harvested, washed twice with the same medium, poured into blocks of low-melting agarose, and, if 32 P labeled DNA was added, the blocks were counted on a 1209 Rackbeta counter (Wallac, Finland). Then the material in the blocks was fractionated by electrophoresis and, depending on the experiment, either gel was dried and flashed on a Molecular Imager FX Pro + (with the addition of labeled material), or transferred through a Southern membrane to a Zeta-ProbeGenomicTestedBlottingMembrane (Bio-Rad) (when plasmid hydrolyzate was added ) and hybridized with labeled DNA. In order to control DNA delivery in this experiment, similar procedures were performed with mouse bone marrow cells.
При анализе количества материала, доставленного в клетки асцитной формы опухоли Кребс-2, в программе QuantityOne оценивали процент засветки, приходящийся на размер добавленного фрагмента по отношению ко всему меченому материалу, вошедшему в гель или оставшемуся на старте. При известных силах радиактивного сигнала добавленной к клеткам меченой ДНК и блока, содержащего определенное количество этих клеток, вычисляли количество чистых фрагментов, доставленных в клетку.When analyzing the amount of material delivered to the cells of the ascites form of the Krebs-2 tumor, the QuantityOne program evaluated the percentage of exposure to the size of the added fragment with respect to all labeled material that entered the gel or remained at the start. With known strengths of the radioactive signal added to the cells of labeled DNA and a block containing a certain number of these cells, the number of pure fragments delivered to the cell was calculated.
Анализ количества клеток Кребс-2, содержащих меченую TAMRA-ДНК, после совместной инкубации в культуральной среде проводили при помощи проточного цитофлуориметра BD FACSAria (Becton Dickinson, США).The analysis of the number of Krebs-2 cells containing TAMRA-labeled DNA after co-incubation in the culture medium was carried out using a BD FACSAria flow cytometer (Becton Dickinson, USA).
Для анализа распределения клеток асцитной формы опухоли мыши Кребс-2 по клеточному циклу клетки опухоли отбирали из брюшной полости мышей с помощью шприца, дважды промывали PBS при 400 g, 4°C в течение 5 мин. Далее клетки фиксировали в 60% метаноле в течение 1 часа при 4°С. Клетки осаждали, промывали PBS и обрабатывали РНКазой (200 мкг/мл) в течение 30 мин при 37°С. Затем клетки осаждали, осадок ресуспендировали в PBS с 0,1% NaN3, 1% FBS (Fetal Bovine Serum) и красили антителами против CD34+, как описано выше. Затем к суспензии клеток добавляли 20 мкл пропидиума йодида (5 мг/мл) и окрашивали клетки в течение 10 мин при комнатной температуре. Клеточный цикл CD34+ клеток определяли при помощи проточного цитофлуориметра BD FACSAria (Becton Dickinson, США).To analyze the distribution of cells of the ascites form of the Krebs-2 mouse tumor over the cell cycle, tumor cells were taken from the abdominal cavity of mice with a syringe, washed twice with PBS at 400 g, 4 ° C for 5 min. Next, the cells were fixed in 60% methanol for 1 hour at 4 ° C. Cells were besieged, washed with PBS and treated with RNase (200 μg / ml) for 30 min at 37 ° C. Then the cells were besieged, the pellet was resuspended in PBS with 0.1% NaN 3 , 1% FBS (Fetal Bovine Serum) and stained with anti-CD34 + antibodies as described above. Then, 20 μl of propidium iodide (5 mg / ml) was added to the cell suspension and the cells were stained for 10 min at room temperature. The cell cycle of CD34 + cells was determined using a BD FACSAria flow cytometer (Becton Dickinson, USA).
Для проведения процедуры перевивки клеток асцитной формы опухоли мыши Кребс-2 после коинкубации клеток Кребс-2 с TAMRA-меченой ДНК или обработки суммарной популяции асцитных клеток CD34 AT клетки сортировали на содержащие и не содержащие TAMRA-меченую ДНК или на клетки, маркированные CD34+ при помощи проточного цитофлуориметра BD FACSAria (Becton Dickinson, США). Затем клетки осаждали центрифугированием в течение 5 минут при 400 g, 4°C и ресуспендировали в небольшом объеме среды. Количество клеток считали в камере Горяева. Далее два полученных типа клеток прививали мышам в количестве 170 тыс. (1 эксперимент) или 60 тыс. клеток (2 эксперимент) для TAMRA ДНК и 60 тыс. клеток для CD34+ клеток. Измерение объема опухоли проводили с помощью штангенциркуля. Размеры опухоли подсчитывали, используя стандартную формулу: длина × высота × ширина.To transplant cells of the ascites form of the Krebs-2 mouse tumor after co-incubation of Krebs-2 cells with TAMRA-labeled DNA or to process the total population of ascites CD34 cells, AT cells were sorted with and without TAMRA-labeled DNA or with cells labeled CD34 + with BD FACSAria flow cytometer (Becton Dickinson, USA). Then the cells were besieged by centrifugation for 5 minutes at 400 g, 4 ° C and resuspended in a small volume of medium. The number of cells was counted in the Goryaev chamber. Next, the two obtained cell types were inoculated into mice in an amount of 170 thousand (1 experiment) or 60 thousand cells (2 experiment) for TAMRA DNA and 60 thousand cells for CD34 + cells. Tumor volume was measured using a caliper. Tumor dimensions were calculated using the standard formula: length × height × width.
Для анализа интернализации TAMRA-меченой экзогенной ДНК в клетки солидной опухоли, капсула Кребс-2 размером около 1 см3 препарировалась. Опухоль разрезалась на две части, после чего одна половина делилась еще на две части. Сегменты опухоли инкубировали с ДНК TAMRA-меченого Alu повтора человека аналогично методу, описанному для клеток костного мозга. После инкубации сегменты ткани промывались трижды PBS. Обработанная опухолевая ткань замораживалась, после чего при помощи микротома нарезалась на пластины толщиной 7 мкм. Срезы заливались в антифейд, содержащий 0.4 мкг/мл DAPI, и анализировались на конфокальном микроскопе.To analyze the internalization of TAMRA-labeled exogenous DNA into cells of a solid tumor, a Krebs-2 capsule about 1 cm 3 in size was prepared. The tumor was cut into two parts, after which one half was divided into two more parts. Tumor segments were incubated with TAMRA-labeled human Alu repeat DNA in the same manner as described for bone marrow cells. After incubation, tissue segments were washed three times with PBS. The treated tumor tissue was frozen, after which, using a microtome, it was cut into plates with a thickness of 7 μm. Sections were poured into an antipheid containing 0.4 μg / ml DAPI and analyzed using a confocal microscope.
Рассмотрим более подробно феномен интернализации фрагментов экзогенной ДНК во внутренние компартменты стволовых клеток высших организмов.Let us consider in more detail the phenomenon of internalization of exogenous DNA fragments into the internal compartments of stem cells of higher organisms.
Ранее были выполнены многочисленные исследования, характеризующие доставку экзогенной ДНК в эукариотическую клетку [30-34]. В частности, были исследованы на способность интернализовать экзогенные экстраклеточные фрагменты двуцепочечной ДНК стволовые гемопоэтические клетки мыши, человеческие эмбриональные стволовые клетки, дендритные клетки человека и мыши, клетки культуры клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 [30-34]. В цитируемых источниках показано, в клеточное пространство может интернализоваться двуцепочечная ДНК, в состав которой входят различные дополнительные молекулярные группы - биотин, различные флуорохромы, радиоактивно меченый предшественник. Также установлено, что в клетку могут быть доставлены молекулы ДНК, достигающие размера 10000 п.о.Numerous studies have been performed previously that characterize the delivery of exogenous DNA to a eukaryotic cell [30–34]. In particular, the ability to internalize exogenous extracellular fragments of double-stranded DNA mouse hematopoietic stem cells, human embryonic stem cells, human and mouse dendritic cells, MCF-7 human breast adenocarcinoma cell culture cells was studied [30-34]. The cited sources show that double-stranded DNA can be internalized in the cell space, which includes various additional molecular groups - biotin, various fluorochromes, and a radioactively labeled precursor. It was also found that DNA molecules reaching a size of 10,000 bp can be delivered to the cell.
В ходе исследования способности стволовых гемопоэтических клеток интернализовать фрагменты экзогенной двуцепочечной ДНК проводился анализ взаимодействия двуцепочечной ДНК как с интактными клетками костного мозга, так и с клетками костного мозга, находящимися под воздействием или цитостатика, или гамма радиации. Было показано, что клетки костного мозга взаимодействуют с фрагментами двуцепочечной ДНК, и что такие фрагменты интернализуются во внутренние компартменты клеток. Действие фрагментов экзогенной ДНК на клетку было различным в зависимости от типа обработок и времени попадания ДНК в клетку после воздействия повреждающего фактора. В случае облучения инъекции препарата двуцепочечной ДНК спасали стволовые клетки крови от повреждений, вызванных радиацией. В случае обработки кросслинкирующим цитостатиком циклофосфаном стволовые клетки изменяли свою генетическую моду и становились неспособными длительное время развиваться в лимфоидный кроветворный росток, что сопровождалось возникновением иммунодефицита и гибелью экспериментальных животных. Полученные многочисленные данные свидетельствовали, что фрагменты двуцепочечной ДНК достигают стволовых клеток крови и принимают участие в происходящих в клетке молекулярных процессах. Поскольку действие экзогенной ДНК ярко проявлялось на фоне повреждающих агентов, приводящих к формированию двуцепочечных разрывов, то было сделано предположение, которое было обосновано экспериментально, что фрагменты двуцепочечной ДНК принимают участие в репарационных процессах при репарации двуцепочечных разрывов [33].In the study of the ability of stem hematopoietic cells to internalize fragments of exogenous double-stranded DNA, the interaction of double-stranded DNA was analyzed both with intact bone marrow cells and with bone marrow cells under the influence of either cytostatic or gamma radiation. It has been shown that bone marrow cells interact with double-stranded DNA fragments, and that such fragments are internalized into the internal compartments of the cells. The effect of exogenous DNA fragments on a cell was different depending on the type of treatments and the time that DNA entered the cell after exposure to a damaging factor. In the case of irradiation, injections of the double-stranded DNA preparation saved the blood stem cells from damage caused by radiation. In the case of treatment with cross-linking cytostatic cyclophosphamide, stem cells changed their genetic mode and became incapable for a long time to develop into a lymphoid hematopoietic sprout, which was accompanied by the occurrence of immunodeficiency and the death of experimental animals. Numerous data obtained showed that fragments of double-stranded DNA reach blood stem cells and take part in the molecular processes occurring in the cell. Since the action of exogenous DNA was clearly manifested against the background of damaging agents leading to the formation of double-stranded breaks, an assumption was made that was experimentally justified that fragments of double-stranded DNA take part in repair processes during the repair of double-strand breaks [33].
Исследуя свойство клеток костного мозга интернализовать фрагменты экстраклеточной экзогенной ДНК, было обнаружено, что из всей популяции клеток костного мозга только 2% клеток демонстрировали интернализацию меченых фрагментов. Из определенных двух процентов 1% составляли CD34- клетки, а 1% составляли CD34+. При этом общее содержание CD34+ клеток было равно 2.2%. Это означало, что 40% гемопоэтических стволовых клеток интернализуют фрагменты экстраклеточной экзогенной ДНК. На долю CD34- клеток приходится 1% (фиг.1, 2).Investigating the property of bone marrow cells to internalize fragments of extracellular exogenous DNA, it was found that of the entire population of bone marrow cells, only 2% of the cells demonstrated the internalization of labeled fragments. Of the defined two percent, 1% were CD34 cells, and 1% were CD34 +. The total content of CD34 + cells was 2.2%. This meant that 40% of hematopoietic stem cells internalize fragments of extracellular exogenous DNA. The share of CD34-cells accounts for 1% (figure 1, 2).
Для доказательства того, что меченый внутриклеточный материал представляет собой именно интернализованные фрагменты, а не является следствием инкорпорации меченых предшественников, образованных в результате деградации ДНК фрагментов в хромосомы клетки в результате происходящих в ней синтетических процессов, была проведена серия экспериментов, результаты которых свидетельствуют о том, что в клетку доставляются и депонируются в ядерном пространстве целые фрагменты экстраклеточной двуцепочечной ДНК [33] (фиг.5).To prove that the labeled intracellular material is specifically internalized fragments, and not a consequence of the incorporation of labeled precursors formed as a result of degradation of DNA fragments into the chromosomes of the cell as a result of synthetic processes occurring in it, a series of experiments were carried out, the results of which indicate that whole fragments of extracellular double-stranded DNA are delivered to the cell and deposited in the nuclear space [33] (Fig. 5).
При анализе судьбы фрагментов двуцепочечной ДНК, интернализованных во внутренних компартментах стволовых клеток крови, было установлено, что линейные фрагменты двуцепочечной ДНК подвергаются процессингу, связному с активностью репарирующих систем клетки. Это было прямым доказательством того, что фрагменты экзогенной ДНК, доставляемые во внутриядерное пространство, участвуют в репаративных процессах в качестве субстрата для репаративно-рекомбинационной молекулярной машины клетки (фиг.3) и что благодаря такому участию в стволовой гемопоэтической клетке происходят изменения, нарушающие механизмы клеточной дифференцировки, как это было показано в работе [33]. Характер продуктов процессинга предполагал, что активированные молекулярные репаративные факторы могут нарушать структуру двуцепочечных концов хромосом, существующих как интермедиаты репарации межцепочечных сшивок в случае обработки циклофосфаном, таким образом, что функциональная топология хроматина будет необратимо нарушена.When analyzing the fate of double-stranded DNA fragments internalized in the internal compartments of blood stem cells, it was found that linear fragments of double-stranded DNA undergo processing associated with the activity of the cell's reparative systems. This was direct evidence that fragments of exogenous DNA delivered into the intranuclear space participate in reparative processes as a substrate for the reparative molecular recombinant machine of the cell (Fig. 3) and that due to this participation in the hematopoietic stem cell, changes occur that disrupt the mechanisms of the cellular differentiation, as was shown in [33]. The nature of the processing products suggested that activated molecular repair factors could disrupt the structure of the double-stranded ends of the chromosomes, which exist as intermediates for the repair of inter-chain cross-links in the case of treatment with cyclophosphamide, so that the functional topology of the chromatin will be irreversibly disturbed.
Как было отмечено выше, проведенный анализ клеток костного мозга на способность различных клеточных популяций интернализовать экзогенные фрагменты двуцепочечной ДНК показал, что основным типом клеток, интернализующим фрагменты ДНК, являются CD34+ стволовые клетки крови. Это привело нас к предположению, что этот признак, а именно способность интернализовать экзогенные фрагменты двуцепочечной ДНК, является характерным признаком для стволовых клеток различной этиологии. Это предполагало, что стволовые (инициирующие) раковые клетки также обладают такой способностью. Для доказательства этого предположения была выбрана аллогенная модель агрессивной опухоли Кребс-2.As noted above, the analysis of bone marrow cells for the ability of various cell populations to internalize exogenous fragments of double-stranded DNA showed that the main type of cells internalizing DNA fragments are CD34 + stem cells. This led us to speculate that this trait, namely the ability to internalize exogenous fragments of double-stranded DNA, is a characteristic trait for stem cells of various etiologies. This suggested that stem (initiating) cancer cells also possess this ability. An allogeneic model of the aggressive Krebs-2 tumor was chosen to prove this assumption.
Анализируя способность клеток опухоли мыши Кребс-2, растущих в форме асцита, захватывать фрагменты экстраклеточной экзогенной ДНК, было обнаружено, что только около 2% клеток интернализуют меченый материал ДНК (фиг.4).Analyzing the ability of Krebs-2 mouse tumor cells growing in the form of ascites to capture fragments of extracellular exogenous DNA, it was found that only about 2% of the cells internalize the labeled DNA material (Fig. 4).
Для доказательства того, что меченый внутриклеточный материал представляет собой именно интернализованные фрагменты, а не является следствием инкорпорации меченых предшественников, образованных в результате деградации ДНК фрагментов в хромосомы клетки в результате происходящих в ней синтетических процессов, была проведена серия экспериментов, результаты которых свидетельствуют о том, что в клетку доставляются и депонируются в ядерном пространстве целые фрагменты экстраклеточной двуцепочечной ДНК (фиг.5).To prove that the labeled intracellular material is specifically internalized fragments, and not a consequence of the incorporation of labeled precursors formed as a result of degradation of DNA fragments into the chromosomes of the cell as a result of synthetic processes occurring in it, a series of experiments were carried out, the results of which indicate that whole fragments of extracellular double-stranded DNA are delivered to the cell and deposited in the nuclear space (Fig. 5).
В результате обнаруженного феномена были поставлены следующие вопросы:As a result of the discovered phenomenon, the following questions were posed:
Как зависит количество клеток, способных интерполировать фрагменты экзогенной ДНК, от концентрации экзогенной ДНК в околоклеточной среде? Оказалось, что при прогрессивном увеличении концентрации экзогенной ДНК происходит линейное увеличение количества клеток, интернализующих экзогенные фрагменты. Это предполагало, что способность клеток к интернализации фрагментов экзогенной ДНК конечна и что популяция клеток с таким свойством ограничена (фиг.6).How does the number of cells capable of interpolating fragments of exogenous DNA depend on the concentration of exogenous DNA in the pericellular environment? It turned out that with a progressive increase in the concentration of exogenous DNA, a linear increase in the number of cells internalizing exogenous fragments occurs. This suggested that the ability of cells to internalize fragments of exogenous DNA is finite and that the population of cells with this property is limited (Fig.6).
Какова связь между пролиферирующей частью раковых клеток и количеством раковых клеток, интернализующих фрагменты экзогенной ДНК? Известно, что активно делящиеся клетки способны захватывать экстраклеточные молекулы нуклеиновых кислот. В этой связи можно было предположить, что именно процесс деления является причиной интернализации фрагментов экстраклеточной ДНК. И, таким образом, мы сравнили количество клеток, находящихся в S+G2 фазах, и количество клеток, интернализующих фрагменты экстраклеточной ДНК. Оказалось, что около 50% асцитных клеток находятся в S+G2 фазе и только ~2% клеток интернализуют фрагменты экзогенной ДНК. Это означало, что признаки не связаны между собой прямой связью или в процессе деления существует некий промежуток времени, когда клетки асцита способны интернализовать экзогенные фрагменты (фиг.7).What is the relationship between the proliferating portion of cancer cells and the number of cancer cells internalizing exogenous DNA fragments? It is known that actively dividing cells are able to capture extracellular nucleic acid molecules. In this regard, it could be assumed that it is the division process that causes the internalization of extracellular DNA fragments. And thus, we compared the number of cells in the S + G2 phases and the number of cells internalizing extracellular DNA fragments. It turned out that about 50% of ascitic cells are in the S + G2 phase and only ~ 2% of the cells internalize exogenous DNA fragments. This meant that the signs are not connected by a direct connection or during the division there is a certain period of time when ascites cells are able to internalize exogenous fragments (Fig. 7).
Для проверки этого предположения клетки асцита инкубировали с меченой TAMRA ДНК в течение 4 часов. Показано, что в течение одного часа порядка 1-2% клеток асцита демонстрируют интернализацию фрагментов дцДНК. Если существует промежуток клеточного цикла, где клетки находятся в состоянии способности интернализовать дцДНК, то можно было бы наблюдать последовательное прямолинейное увеличение количества клеток, захвативших TAMRA на протяжении 4 часа инкубации. Результат проведенного эксперимента свидетельствует, что на протяжении 4 часов инкубации не происходит значимого увеличения количества клеток интернализующих дц фрагменты ДНК. Это означает, что в популяции исходно существуют клетки, обладающие способностью интернализовать дцДНК и их количество составляет около 2% (фиг.8).To verify this assumption, ascites cells were incubated with TAMRA-labeled DNA for 4 hours. It was shown that within one hour, about 1-2% of ascites cells demonstrate the internalization of dsDNA fragments. If there is a cell cycle gap where the cells are able to internalize dsDNA, then a sequential, rectilinear increase in the number of cells that capture TAMRA during 4 hours of incubation could be observed. The result of the experiment indicates that during 4 hours of incubation there is no significant increase in the number of cells internalizing dc DNA fragments. This means that in the population initially there are cells with the ability to internalize dsDNA and their number is about 2% (Fig. 8).
Являются ли одними и теми же клетками раковые асцитные клетки Кребс-2, позитивные по маркерам CD34 и TAMRA ДНК? CD34 гликопротеид является маркером стволовости гемопоэтических предшественников костного мозга мыши. Оказалось, что в асците опухоли Кребс 2 присутствует популяция клеток, несущая маркер гемопоэтических клеток мыши CD34. Мы предположили, что популяция таких клеток может перекрываться с популяцией клеток, интернализующих фрагменты экстраклеточной двуцепочечной ДНК. Оказалось, что обе популяции клеток перекрываются при анализе в проточной цитометрии. При цитологическом анализе распределения двух флуорохромов было установлено, что более 90% CD34+ позитивных клеток в то же время являются TAMRA позитивными клетками. Также показано, что около половины TAMRA позитивных клеток несут маркер CD34, а оставшееся количество TAMRA позитивных клеток CD34 негативно (фиг.7).Are the Krebs-2 cancer ascites cells positive for the CD34 and TAMRA DNA markers the same cells? CD34 glycoprotein is a stem marker for hematopoietic mouse bone marrow precursors. It turned out that in the ascites of the
Следствием проведенных экспериментов было предположение, что клетки асцитной раковой формы Кребс-2, захватывающие экстраклеточную экзогенную ДНК, также обладают характеристиками стволовой клетки. Проведенные эксперименты по трансплантации сортированных популяций клеток, содержащих ДНК, меченую TAMRA, и не содержащих меченые фрагменты ДНК, подтвердили способность клеток, интернализующих дцДНК инициировать развитие опухолевого графта (фиг.9).The consequence of the experiments was the assumption that the Krebs-2 ascites cancerous cells that capture extracellular exogenous DNA also possess stem cell characteristics. The experiments on transplantation of sorted populations of cells containing TAMRA-labeled DNA and not containing labeled DNA fragments confirmed the ability of cells internalizing dsDNA to initiate the development of a tumor graft (Fig. 9).
Анализируя описанное, инициирующее развитие новой опухоли свойство клеток, в которых интернализовались фрагменты экзогенной дцДНК, возникает вопрос, а не связано ли это свойство с изменениями в клеточных молекулярных механизмах определенной популяции асцитных клеток опосредованным появлением фрагментов ДНК в клетке. Для ответа на этот вопрос было использовано описанное свойство популяции инициирующих асцитных клеток, интернализующих TAMRA одновременно нести маркер СГК CD34 (фиг.7). Было сделано предположение, что если признак интернализации TAMRA-ДНК не связан с инициирующими свойствами определенной популяции асцитных клеток, то клетки, сортированные по присутствию CD34 маркера должны обладать аналогичным инициирующим свойством. Для проверки этого предположения CD34+ асцитные клетки были перевиты в эквивалентном количестве. Оказалось, что возникновение и развитие опухолевого графта практически не отличается от такового определенного для TAMRA - ДНК клеток. Это свидетельствовало, что интернализация дцДНК является признаком СРК, а не причиной возникновения этого свойства (фиг.10).Analyzing the described, initiating the development of a new tumor, property of cells in which fragments of exogenous dsDNA were internalized, the question arises whether this property is associated with changes in the cellular molecular mechanisms of a certain population of ascites cells due to the indirect appearance of DNA fragments in the cell. To answer this question, the described property of a population of initiating ascites cells internalizing TAMRA was simultaneously used to carry the CDK marker CD34 (Fig. 7). It has been suggested that if the sign of TAMRA DNA internalization is not associated with the initiating properties of a certain population of ascites cells, then cells sorted by the presence of a CD34 marker should have a similar initiating property. To test this hypothesis, CD34 + ascites cells were transplanted in an equivalent amount. It turned out that the appearance and development of a tumor graft is practically no different from that defined for TAMRA - DNA cells. This indicated that the internalization of dsDNA is a sign of IBS, and not the cause of this property (Fig. 10).
Наиболее интригующим был анализ интернализации TAMRA ДНК зонда в клетки опухоли, растущей в солидной форме. Для проведения такого анализа капсула опухоли размером 1 см3 выделялась из организма (бедренная часть лапки) и препарировалась и обрабатывалась согласно процедуре, описанной в разделе используемые методики. Было обнаружено, что внутреннее содержимое опухолевого трансплантата представляет собой перемешанную массу клеточных массивов, трабикул, пустот. Меченые островки клеток обнаружены во внутренней части опухолевой капсулы. Размер островков составляет порядка 200/100 мкм с общим количеством клеток в одном островке около 500. На проанализированную толщину (около 20 срезов 7 мкм каждый) обнаружено 3 выраженных колонии (при сравнении количества клеток, меченых TAMRA, с общим количеством клеток одного среза соотношение ориентировочно составляет 1/100, то есть 1% от всей клеточной массы (фиг.11).The most intriguing was the analysis of the internalization of the TAMRA DNA probe into tumor cells growing in solid form. To carry out such an analysis, a 1 cm 3 tumor capsule was excreted from the body (the femoral part of the paw) and was prepared and processed according to the procedure described in the procedures used. It was found that the internal contents of the tumor transplant is a mixed mass of cell arrays, trabeculae, voids. Labeled islets of cells are found in the interior of the tumor capsule. The size of the islands is about 200/100 μm with a total number of cells in one island of about 500. For the analyzed thickness (about 20 sections of 7 μm each), 3 distinct colonies were found (when comparing the number of cells labeled with TAMRA with the total number of cells of one section, the ratio is approximately is 1/100, that is, 1% of the total cell mass (Fig. 11).
Таким образом, благодаря усовершенствованию известного способа достигается требуемый технический результат, который заключается в расширении области применения, поскольку благодаря введению дополнительных операций способа и их конкретной реализации обеспечивается эффективная детекция стволовых раковых клеток.Thus, due to the improvement of the known method, the required technical result is achieved, which consists in expanding the scope, since due to the introduction of additional operations of the method and their specific implementation, effective detection of stem cancer cells is provided.
Список использованных источниковList of sources used
1. Hu Y, Smyth GK. ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. J Immunol Methods. 2009 Aug 15; 347(1-2):70-8.1. Hu Y, Smyth GK. ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. J Immunol Methods. 2009
2. Frisan T, Levitsky V, Masucci M. Limiting dilution assay. Methods Mol Biol. 2001; 174:213-6.2. Frisan T, Levitsky V, Masucci M. Limiting dilution assay. Methods Mol Biol. 2001; 174: 213-6.
3. Cao L, Zhou Y, Zhai B, Liao J, Xu W, Zhang R, Li J, Zhang Y, Chen L, Qian H, Wu M, Yin Z. Sphere-forming cell subpopulations with cancer stem cell properties in human hepatoma cell lines. BMC Gastroenterol. 2011 Jun 14; 11:71.3. Cao L, Zhou Y, Zhai B, Liao J, Xu W, Zhang R, Li J, Zhang Y, Chen L, Qian H, Wu M, Yin Z. Sphere-forming cell subpopulations with cancer stem cell properties in human hepatoma cell lines. BMC Gastroenterol. 2011
4. Rajasekhar VK. Analytical methods for cancer stem cells. Methods Mol Biol. 2007; 407:83-95.4. Rajasekhar VK. Analytical methods for cancer stem cells. Methods Mol Biol. 2007; 407: 83-95.
5. O'Brien CA, Kreso A, Jamieson CH. Cancer stem cells and self-renewal. Clin Cancer Res. 2010 Jun 15; 16(12):3113-20.5. O'Brien CA, Kreso A, Jamieson CH. Cancer stem cells and self-renewal. Clin Cancer Res. 2010
6. Zhang W, Kai K, Choi DS, Iwamoto T, Nguyen YH, Wong H, Landis MD, Ueno NT, Chang J, Qin L. Microfluidics separation reveals the stem-cell-like deformability of tumor-initiating cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2012 Nov 13; 109(46):18707-12.6. Zhang W, Kai K, Choi DS, Iwamoto T, Nguyen YH, Wong H, Landis MD, Ueno NT, Chang J, Qin L. Microfluidics separation reveals the stem-cell-like deformability of tumor-initiating cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2012
7. http://www.ibmc.msk.ru/ru/departments/1977.http: //www.ibmc.msk.ru/ru/departments/197
8. Dick JE. Stem cells: Self-renewal writ in blood. Nature. 2003 May 15; 423(6937):231-3.8. Dick JE. Stem cells: Self-renewal writ in blood. Nature. 2003 May 15; 423 (6937): 231-3.
9. Dick JE. Breast cancer stem cells revealed. Proc Natl Acad Sci USA. 2003 Apr 1; 100(7):3547-9.9. Dick JE. Breast cancer stem cells revealed. Proc Natl Acad Sci USA. 2003
10. Al-Hajj M, Clarke MF. Self-renewal and solid tumor stem cells. Oncogene. 2004 Sep 20; 23(43):7274-82.10. Al-Hajj M, Clarke MF. Self-renewal and solid tumor stem cells. Oncogene. 2004
11. Clarke MF, Dick JE, Dirks PB, Eaves CJ, Jamieson CH, Jones DL, Visvader J, Weissman IL, Wahl GM. Cancer stem cells-perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. Cancer Res. 2006 Oct 1; 66(19):9339-44.11. Clarke MF, Dick JE, Dirks PB, Eaves CJ, Jamieson CH, Jones DL, Visvader J, Weissman IL, Wahl GM. Cancer stem cells-perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. Cancer Res. 2006
12. Lapidot T, Sirard C, Vormoor J, Murdoch B, Hoang T, Caceres-Cortes J, Minden M, Paterson B, Caligiuri MA, Dick JE. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 1994 Feb 17; 367(6464):645-8.12. Lapidot T, Sirard C, Vormoor J, Murdoch B, Hoang T, Caceres-Cortes J, Minden M, Paterson B, Caligiuri MA, Dick JE. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 1994
13. Bonnet D, Dick JE. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat Med. 1997 Jul; 3(7):730-7.13. Bonnet D, Dick JE. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat Med. 1997 Jul; 3 (7): 730-7.
14. Singh SK, Hawkins С, Clarke ID, Squire JA, Bayani J, Hide T, Henkelman RM, Cusimano MD, Dirks PB. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 2004 Nov 18; 432(7015):396-401.14. Singh SK, Hawkins C, Clarke ID, Squire JA, Bayani J, Hide T, Henkelman RM, Cusimano MD, Dirks PB. Identification of human brain tumor initiating cells. Nature. 2004
15. Collins AT, Berry PA, Hyde C, Stower MJ, Maitland NJ. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Res. 2005 Dec 1; 65(23): 10946-51.15. Collins AT, Berry PA, Hyde C, Stower MJ, Maitland NJ. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Res. 2005
16. Ricci-Vitiani L, Lombardi DG, Pilozzi E, Biffoni M, Todaro M, Peschle C, De Maria R. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 2007 Jan 4; 445(7123):111-5.16. Ricci-Vitiani L, Lombardi DG, Pilozzi E, Biffoni M, Todaro M, Peschle C, De Maria R. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 2007
17. O'Brien CA, Pollett A, Gallinger S, Dick JE. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature. 2007 Jan 4; 445(7123):106-10.17. O'Brien CA, Pollett A, Gallinger S, Dick JE. A human colon cancer cell capable of initiating tumor growth in immunodeficient mice. Nature. 2007
18. Dalerba P, Dylla SJ, Park IK, Liu R, Wang X, Cho RW, Hoey T, Gurney A, Huang EH, Simeone DM, Shelton AA, Parmiani G, Castelli C, Clarke MF. Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2007 Jun 12; 104(24):10158-63.18. Dalerba P, Dylla SJ, Park IK, Liu R, Wang X, Cho RW, Hoey T, Gurney A, Huang EH, Simeone DM, Shelton AA, Parmiani G, Castelli C, Clarke MF. Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2007
19. Wu C, Wei Q, Utomo V, Nadesan P, Whetstone H, Kandel R, Wunder JS, Alman BA. Side population cells isolated from mesenchymal neoplasms have tumor initiating potential. Cancer Res. 2007 Sep 1; 67(17):8216-22.19. Wu C, Wei Q, Utomo V, Nadesan P, Whetstone H, Kandel R, Wunder JS, Alman BA. Side population cells isolated from mesenchymal neoplasms have tumor initiating potential. Cancer Res. 2007
20. Prince ME, Sivanandan R, Kaczorowski A, Wolf GT, Kaplan MJ, Dalerba P, Weissman IL, Clarke MF, Ailles LE. Identification of a subpopulation of cells with cancer stem cell properties in head and neck squamous cell carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA. 2007 Jan 16; 104(3):973-8.20. Prince ME, Sivanandan R, Kaczorowski A, Wolf GT, Kaplan MJ, Dalerba P, Weissman IL, Clarke MF, Ailles LE. Identification of a subpopulation of cells with cancer stem cell properties in head and neck squamous cell carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA. 2007
21. Li C, Heidt DG, Dalerba P, Burant CF, Zhang L, Adsay V, Wicha M, Clarke MF, Simeone DM. Identification of pancreatic cancer stem cells. Cancer Res. 2007 Feb 1; 67(3):1030-7.21. Li C, Heidt DG, Dalerba P, Burant CF, Zhang L, Adsay V, Wicha M, Clarke MF, Simeone DM. Identification of pancreatic cancer stem cells. Cancer Res. 2007
22. Hermann PC, Huber SL, Herrler T, Aicher A, Ellwart JW, Guba M, Bruns CJ, Heeschen C. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 2007 Sep 13; 1(3):313-23.22. Hermann PC, Huber SL, Herrler T, Aicher A, Ellwart JW, Guba M, Bruns CJ, Heeschen C. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 2007
23. Schatton T, Murphy GF, Frank NY, Yamaura K, Waaga-Gasser AM, Gasser M, Zhan Q, Jordan S, Duncan LM, Weishaupt C, Fuhlbrigge RC, Kupper TS, Sayegh MH, Frank MH. Identification of cells initiating human melanomas. Nature. 2008 Jan 17; 451(7176):345-9.23. Schatton T, Murphy GF, Frank NY, Yamaura K, Waaga-Gasser AM, Gasser M, Zhan Q, Jordan S, Duncan LM, Weishaupt C, Fuhlbrigge RC, Kupper TS, Sayegh MH, Frank MH. Identification of cells initiating human melanomas. Nature. 2008
24. Yang ZF, Ho DW, Ng MN, Lau CK, Yu WC, Ngai P, Chu PW, Lam CT, Poon RT, Fan ST. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 2008 Feb; 13(2):153-66.24. Yang ZF, Ho DW, Ng MN, Lau CK, Yu WC, Ngai P, Chu PW, Lam CT, Poon RT, Fan ST. Significance of CD90 + cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 2008 Feb; 13 (2): 153-66.
25. Eramo A, Lotti F, Sette G, Pilozzi E, Biffoni M, Di Virgilio A, Conticello C, Ruco L, Peschle C, De Maria R. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death Differ. 2008 Mar; 15(3):504-14.25. Eramo A, Lotti F, Sette G, Pilozzi E, Biffoni M, Di Virgilio A, Conticello C, Ruco L, Peschle C, De Maria R. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death Differ. 2008 Mar; 15 (3): 504-14.
26. Curley MD, Therrien VA, Cummings CL, Sergent PA, Koulouris CR, Friel AM, Roberts DJ, Seiden MV, Scadden DT, Rueda BR, Foster R. CD133 expression defines a tumor initiating cell population in primary human ovarian cancer. Stem Cells. 2009 Dec; 27(12):2875-83.26. Curley MD, Therrien VA, Cummings CL, Sergent PA, Koulouris CR, Friel AM, Roberts DJ, Seiden MV, Scadden DT, Rueda BR, Foster R. CD133 expression defines a tumor initiating cell population in primary human ovarian cancer. Stem Cells. 2009 Dec; 27 (12): 2875-83.
27. Сайфитдинова А.Ф. Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов. Учебно-методическое пособие. - СПб.: «СОЛО», 2008. - 72 с.27. Sayfitdinova A.F. Two-dimensional fluorescence microscopy for the analysis of biological samples. Teaching aid. - St. Petersburg: "SOLO", 2008. - 72 p.
28. Roberts DB: Drosophila: A Practical Approach IRL Press, Oxford; 1986.28. Roberts DB: Drosophila: A Practical Approach IRL Press, Oxford; 1986.
29. Маниатис Е., Фрич Э., Сэмбрук Дж. «Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. / M.: Мир, 1984. - 480 с.29. Maniatis E., Fritsch E., Sambrook J. “Methods of genetic engineering. Molecular Cloning: Per. from English / M .: Mir, 1984. - 480 p.
30. Rogachev VA, Likhacheva A, Vratskikh O, Mechetina LV, Sebeleva ТЕ, Bogachev SS, Yakubov LA, Shurdov MA. Qualitative and quantitative characteristics of the extracellular DNA delivered to the nucleus of a living cell. Cancer Cell Int. 2006 Oct 11; 6:23. http://cancerci.com/content/6/1/23.30. Rogachev VA, Likhacheva A, Vratskikh O, Mechetina LV, Sebeleva TE, Bogachev SS, Yakubov LA, Shurdov MA. Qualitative and quantitative characteristics of the extracellular DNA delivered to the nucleus of a living cell. Cancer Cell Int. 2006
31. Likhacheva AS, Nikolin VP, Popova NA, Rogachev VA, Prokhorovich MA, Sebeleva ТЕ, Bogachev SS, Shurdov MA. Exogenous DNA can be captured by stem cells and be involved in their rescue from death after lethal-dose γ-radiation. Gene Ther Mol Biol. 2007; 11:305-314.31. Likhacheva AS, Nikolin VP, Popova NA, Rogachev VA, Prokhorovich MA, Sebeleva TE, Bogachev SS, Shurdov MA. Exogenous DNA can be captured by stem cells and be involved in their rescue from death after lethal-dose γ-radiation. Gene Ther Mol Biol. 2007; 11: 305-314.
32. Alyamkina EA, Dolgova EV, Likhacheva AS, Rogachev VA, Sebeleva ТЕ, Nikolin VP, Popova NA, Kiseleva EV, Orishchenko KE, Sakhno LV, Gel'fgat EL, Ostanin AA, Chernykh ER, Zagrebelniy SN, Bogachev SS, Shurdov MA. Exogenous allogenic fragmented double-stranded DNA is internalized into human dendritic cells and enhances their allostimulatory activity. Cell Immunol. 2010; 262: 120-126.32. Alyamkina EA, Dolgova EV, Likhacheva AS, Rogachev VA, Sebeleva TE, Nikolin VP, Popova NA, Kiseleva EV, Orishchenko KE, Sakhno LV, Gel'fgat EL, Ostanin AA, Chernykh ER, Zagrebelniy SN, Bogachev SS, Shurdov MA. Exogenous allogenic fragmented double-stranded DNA is internalized into human dendritic cells and enhances their allostimulatory activity. Cell Immunol. 2010; 262: 120-126.
33. Dolgova EV, Proskurina AS, Nikolin VP, Popova NA, Alyamkina EA, Orishchenko KE, Rogachev VA, Efremov YR, Dubatolova TD, Prokopenko AV, Chernykh ER, Ostanin AA, Taranov OS, Omigov VV, Zagrebelniy SN, Bogachev SS, Shurdov MA. "Delayed death" phenomenon: A synergistic action of cyclophosphamide and exogenous DNA. Gene. 2012; 495: 134-145.33. Dolgova EV, Proskurina AS, Nikolin VP, Popova NA, Alyamkina EA, Orishchenko KE, Rogachev VA, Efremov YR, Dubatolova TD, Prokopenko AV, Chernykh ER, Ostanin AA, Taranov OS, Omigov VV, Zagrebelniy SN, Bogachev SS, Shurdov MA. "Delayed death" phenomenon: A synergistic action of cyclophosphamide and exogenous DNA. Gene. 2012; 495: 134-145.
34. Dolgova EV, Nikolin VP, Popova NA, Proskurina AS, Orishenko KE, Alyamkina EA, Efremov YR, Chernykh ER, Ostanin AA, Malkova EM, Taranov OS, Rogachev VA, Sidorov SV, Bogachev SS, Shurdov MA. Internalization of exogenous DNA into internal compartments of murine bone marrow cells. Russian Journal of Genetics: Applied Research. 2012; 2(6): 440-452.34. Dolgova EV, Nikolin VP, Popova NA, Proskurina AS, Orishenko KE, Alyamkina EA, Efremov YR, Chernykh ER, Ostanin AA, Malkova EM, Taranov OS, Rogachev VA, Sidorov SV, Bogachev SS, Shurdov MA. Internalization of exogenous DNA into internal compartments of murine bone marrow cells. Russian Journal of Genetics: Applied Research. 2012; 2 (6): 440-452.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013113328/10A RU2530170C1 (en) | 2013-03-27 | 2013-03-27 | Method of detecting stem cancer cells |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013113328/10A RU2530170C1 (en) | 2013-03-27 | 2013-03-27 | Method of detecting stem cancer cells |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2013113328A RU2013113328A (en) | 2014-10-10 |
| RU2530170C1 true RU2530170C1 (en) | 2014-10-10 |
Family
ID=53379600
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013113328/10A RU2530170C1 (en) | 2013-03-27 | 2013-03-27 | Method of detecting stem cancer cells |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2530170C1 (en) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050226812A1 (en) * | 2003-04-14 | 2005-10-13 | Nuvelo, Inc. | Methods of therapy and diagnosis using targeting of cells that express killer cell immunoglobulin-like receptor-like proteins |
| US20070218480A1 (en) * | 2006-01-25 | 2007-09-20 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Detection and diagnosis of smoking related cancers |
| RU2420595C2 (en) * | 2005-01-31 | 2011-06-10 | Кабусики Кайся Якулт Хонса | METHOD OF QUANTITATIVE ANALYSIS OF CELL NUMBER OF ALIVE BACTERIUM OF INTEREST WITH APPLYING rRNA AS TARGET |
| EP2007905B1 (en) * | 2006-03-15 | 2012-08-22 | Micronics, Inc. | Integrated nucleic acid assays |
-
2013
- 2013-03-27 RU RU2013113328/10A patent/RU2530170C1/en active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050226812A1 (en) * | 2003-04-14 | 2005-10-13 | Nuvelo, Inc. | Methods of therapy and diagnosis using targeting of cells that express killer cell immunoglobulin-like receptor-like proteins |
| RU2420595C2 (en) * | 2005-01-31 | 2011-06-10 | Кабусики Кайся Якулт Хонса | METHOD OF QUANTITATIVE ANALYSIS OF CELL NUMBER OF ALIVE BACTERIUM OF INTEREST WITH APPLYING rRNA AS TARGET |
| US20070218480A1 (en) * | 2006-01-25 | 2007-09-20 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Detection and diagnosis of smoking related cancers |
| EP2007905B1 (en) * | 2006-03-15 | 2012-08-22 | Micronics, Inc. | Integrated nucleic acid assays |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2013113328A (en) | 2014-10-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Buczacki et al. | Intestinal label-retaining cells are secretory precursors expressing Lgr5 | |
| CN107429254A (en) | Protein delivery in primary hematopoietic cell | |
| Schumacher et al. | Mapping the life histories of T cells | |
| CN108174607A (en) | For adjusting the composition and method of inhibition interaction in genetically engineered cell | |
| CN107075483A (en) | The engineered cell treated for adoptive cellular | |
| US20200390786A1 (en) | Compositions and methods for treating ovarian tumors | |
| Douet-Guilbert et al. | MLL partner genes in secondary acute lymphoblastic leukemia: report of a new partner PRRC1 and review of the literature | |
| Dolgova et al. | Properties of internalization factors contributing to the uptake of extracellular DNA into tumor-initiating stem cells of mouse Krebs-2 cell line | |
| US20240156816A1 (en) | Methods and compositions for predicting and preventing relapse of acute lymphoblastic leukemia | |
| EP3149167B1 (en) | Aptamer targeting mage-a3 peptide and uses thereof | |
| Ramesh et al. | Chimeric antigen receptor T‐cells: Properties, production, and quality control | |
| McLelland et al. | Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis | |
| RU2530170C1 (en) | Method of detecting stem cancer cells | |
| WO2017114008A1 (en) | Bcr gene and abl gene detection probe, preparation method therefor, and reagent kit | |
| CN117616126A (en) | Reprogrammable TNPB polypeptides and uses thereof | |
| KR20140049993A (en) | Dsrna/dna hybrid genome replication intermediate of metakaryotic stem cells | |
| Park et al. | Protocol to analyze antitumor immunity of orthotopic injection and spontaneous murine high-grade glioma models using flow cytometry and single-cell RNA sequencing | |
| Youn et al. | Neutrophil-derived extracellular vesicles: proinflammatory trails and anti-inflammatory microvesicles | |
| Nagorska | Translational control of leftright patterning by a 3’UTR RNA element | |
| Parra Acero | Capsaspora owczarzaki as a unicellular model to study the pre-metazoan integrin adhesome | |
| Kasimanickam et al. | A method to isolate cd34+ mononuclear cells from canine peripheral blood | |
| LaMarca | R-Loops as Mechanisms Governing Neural Differentiation and Cell Type-Specific Transcription | |
| Pal et al. | Human bone marrow milieu identifies a clinically actionable driver of niche-mediated treatment resistance in leukaemia | |
| Banfalvi et al. | Applications of Permeabilization | |
| Mohnani | New Treatment Opportunity for Acute Myeloid Leukemias Harbouring a UBTF Tandem Duplication |