RU2529356C2 - Modified yeast-2-hybrid for effective study of interactions between proteins and their domains - Google Patents

Modified yeast-2-hybrid for effective study of interactions between proteins and their domains Download PDF

Info

Publication number
RU2529356C2
RU2529356C2 RU2012141166/10A RU2012141166A RU2529356C2 RU 2529356 C2 RU2529356 C2 RU 2529356C2 RU 2012141166/10 A RU2012141166/10 A RU 2012141166/10A RU 2012141166 A RU2012141166 A RU 2012141166A RU 2529356 C2 RU2529356 C2 RU 2529356C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
protein
domains
proteins
dna
activation
Prior art date
Application number
RU2012141166/10A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2012141166A (en
Inventor
Оксана Геннадьевна Максименко
Ольга Викторовна Кырчанова
Валентин Александрович Бабоша
Петр Евгеньевич Прохоров
Вячеслав Леонтьевич Стахов
Павел Георгиевич Георгиев
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук filed Critical Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук
Priority to RU2012141166/10A priority Critical patent/RU2529356C2/en
Publication of RU2012141166A publication Critical patent/RU2012141166A/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2529356C2 publication Critical patent/RU2529356C2/en

Links

Images

Abstract

FIELD: medicine, pharmaceutics.
SUBSTANCE: invention refers to biological engineering, molecular biology, and biotechnology. What is presented is a yeast cell applicable for detecting an interaction between proteins and their domains co-transformed by two plasmids modified for expression of two proteins in the yeast cells, wherein a nucleotide sequence coding the first protein is cloned into one plasmid, while the nucleotide surface coding the second protein - into the other plasmid, wherein the nucleotide sequences coding the proteins are fused with the nucleotide sequences coding the activation and DNA-binding domains of the protein GAL4; the nucleotide sequences coding the studied proteins are separated from the nucleotide sequences coding the activation or DNA-binding domains of the protein GAL4 by means of a nucleotide sequence coding a peptide representing the sequence GluLeuGluAlaAlaAlaLysGluAlaAlaAlaLysGluAlaAlaAlaLysGluAlaAlaAla which is expressed in the form of a protein bridge between the studied protein and the protein GAL4 domains.
EFFECT: invention enables minimising the mutual interaction of the tested protein domains and DNA-binding/activation domains of a vector and can be used for detecting the mutual interaction between the protein molecules for medical and studying applications.
4 dwg, 2 ex

Description

Область техники, к которой относится изобретение TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION

Настоящее изобретение относится к области биоинженерии, молекулярной биологии и биотехнологии, в частности к методам тестирования взаимодействий между белковыми молекулами. The present invention relates to the field of bioengineering, molecular biology and biotechnology, in particular to methods of testing the interactions between protein molecules.

Уровень техники BACKGROUND

Одна из ключевых проблем молекулярной и клеточной биологии связана с исследованием взаимодействий между белками. One of the key problems of molecular and cell biology related to the study of interactions between proteins. Среди всех известных способов исследований таких взаимодействий дрожжевая двугибридная система - наиболее эффективный и экономичный метод, на основе которого многими фирмами были проведены первые протеомные исследования с попыткой установить все возможные взаимодействия между дрожжевыми и дрозофильными белками. Among all the known methods of research such interactions Yeast two-hybrid system - the most effective and economical method, based on which many firms have conducted the first proteomic studies in an attempt to establish all possible interactions between yeast and drozofilnymi proteins. Исходным материалом для анализа являются две плазмиды, в которые в нужной рамке считывания клонируются последовательности к ДНК двух белков (один из них оказывается слит в единой рамке трансляции с ДНК-связывающим доменом фактора транскрипции, а второй - с его доменом, активирующим транскрипцию), исследуемых на предмет взаимодействия. The starting material for the analysis are the two plasmids, in which the desired reading frame cloned sequence of DNA of two proteins (one of them is fused in a single frame broadcast with the DNA-binding domain of the transcription factor, and the second - to its transcription-activating domain) studied for interaction. При этом физическое связывание друг с другом исследуемых белков приводит к сближению ДНК-связывающего и активационного доменов и, как следствие, активируется либо репрессируется экспрессия репортерного гена. In this physical binding to each other proteins under study leads to the convergence of the DNA-binding and activation domains and, consequently, is activated or repressed reporter gene expression. В наиболее распространенном варианте двугибридной системы используются ДНК-связывающий и активационный домены белка GAL4 и дрожжевой штамм, содержащий репортерные гены с GAL4-связывающими сайтами в промоторной области (US 5283173, US 5468614). In the most common embodiment, the two-hybrid system uses the DNA-binding and activation domains are GAL4 protein and the yeast strain containing the reporter genes with GAL4-binding sites in the promoter region (US 5,283,173, US 5,468,614). Основной недостаток этой системы связан со структурными ограничениями, накладываемыми близко расположенными доменами в химерном белке, в результате которых происходит либо инактивация ДНК-связывающего или активационного домена белка GAL4, либо соответствующих доменов исследуемых белков. The main disadvantage of this system is connected with the structural constraints imposed by the closely spaced domains in a chimeric protein that result in any inactivation of the DNA-binding protein or GAL4 activation domain, or domains corresponding proteins examined. В результате более половины всех потенциальных взаимодействий не детектируется, что значительно снижает возможности применения метода. As a result, more than half of all potential interactions are detected, which greatly reduces the possibility of applying the method.

Функционирование некоторых современных дрожжевых двугибридных систем обеспечивается модификациями, улучшающими детекцию белок-белковых взаимодействий при наличии возможных ложных сигналов путем использования сплит-систем (чаще всего основанные на молекуле убиквитина), которые работают независимо от активации или репрессии транскрипции репортерного гена, на которую могут оказывать сильное влияние тестируемые белковые молекулы (US 6562576, US 6911311, US 20090298089 A1). Functioning of some modern yeast two-hybrid system is provided by modifications that improve the detection of protein-protein interactions in the presence of possible false alarms through the use of split-systems (often based on the molecule ubiquitin), which operate independently of the activation or repression of transcription of the reporter gene, which can have a strong impact test protein molecules (US 6,562,576, US 6,911,311, US 20090298089 A1).

Также существуют модификации векторов, используемые в двугибридной системе, в основном направленные на применение других доменов (в отличие от классической с использованием активатора GAL4) в дрожжевой двугибридной системе: например, репрессионные (US 5885779) или домены белков-участников сигнальных путей, связанных с мембранами клеток (US 2010/0075326 А1). Also there are versions of the vectors used in the two-hybrid system, mainly directed to the application of other domain (unlike classical using GAL4 activator) in a yeast two-hybrid system: e.g., repressionnye (US 5,885,779) or domains of proteins participating signaling pathways associated with membranes cells (US 2010/0075326 A1). Кроме этого существуют модификации векторов, основанные на использовании рекомбинации и используемые в двугибридной системе, которые упрощают клонирование кДНК в соответствующие плазмиды (US 7323313). Also there are versions of vectors based on the use of recombination and used in the two-hybrid system, which simplify the cloning of the cDNA in appropriate plasmids (US 7,323,313). Наконец, известен вариант применения гибких линкеров между искусственными доменами «цинковые пальцы», использование которых увеличивает аффинность химерных белков к их ДНК-мишеням (US 6479626). Finally, a variant known use of flexible linkers between domains artificial "zinc fingers," the use of which increases the affinity of the chimeric proteins for their DNA targets (US 6,479,626).

Тем не менее, не существует способов, в которых бы вектора для дрожжевой двугибридной системы модифицировались таким образом, чтобы домены тестируемых белков были бы отделены от ДНК-связывающего и/или активационного доменов гибкими белковыми мостиками, которые бы изолировали домены друг от друга и тем самым нивелировали влияние стерических эффектов. However, there is no way in which to vector for yeast two-hybrid system have been modified so that the domains of the test protein would be separated from the DNA-binding and / or activation domains flexible protein bridges to be isolated domains from each other and thereby neutralize the influence of steric effects.

Сущность изобретения SUMMARY OF THE iNVENTION

В настоящем изобретении предлагается новый способ снижения взаимозависимости доменов в дрожжевой двугибридной системе. The present invention provides a new method of reducing the domains in the yeast two-hybrid interdependent system. Вектора, используемые в дрожжевой двугибридной системе, модифицируются таким образом, чтобы исследуемые белки были отделены от ДНК-связывающего или активационного доменов белка GAL4 при помощи нейтрального гибкого белкового мостика. Vector used in the yeast two-hybrid system, are modified in such a way that the investigated proteins were separated from the DNA binding protein or GAL4 activation domain using neutral protein flexible bridge. Для подтверждения эффективности выбранного подхода ряд известных взаимодействий, которые не выявляются в обычном варианте метода, протестированы с использованием модифицированных векторов. To confirm the effectiveness of the approach chosen number of known interactions which are not detected in the usual embodiment method have been tested using modified vectors.

Предлагаемое изобретение может быть использовано для детекции взаимодействия между белковыми молекулами, которые могут быть использованы в медицинских и исследовательских целях. The invention can be used to detect the interaction between protein molecules that can be used for medical and research purposes.

Сущность описываемого изобретения поясняется чертежом (фиг.1), на котором представлены схемы векторов, предназначенные для клонирования в них кДНК-последовательностей тестируемых белков и последующего скрининга в дрожжевой двугибридной системе, где Summary of the drawing (Figure 1) is explained in the disclosed invention, which shows the scheme of vectors designed for the cloning in the cDNA sequences are tested and subsequent screening proteins in a yeast two-hybrid system where

А - вектора pG4AD_h1 и pG4AD_h2, в которых ниже активационного домена GAL4 клонированы последовательности, кодирующие гибкий белковый мостик 1 или 2; A - the vector and pG4AD_h1 pG4AD_h2, in which the lower GAL4 activation domain cloned sequences encoding protein flexible bridge 1 or 2;

Б - вектор ph1_G4AD, в котором выше активационного домена GAL4 клонирована последовательность, кодирующая гибкий белковый мостик 1; B - the vector ph1_G4AD, wherein the above GAL4 activation domain cloned sequence encoding a protein flexible bridge 1;

В - вектор pG4BD_h1 и pG4BD_h2, в которых ниже ДНК-связывающего домена GAL4 клонированы последовательности, кодирующие гибкий белковый мостик 1 или 2; B - the vector and pG4BD_h1 pG4BD_h2, in which the lower GAL4 DNA binding domain were cloned sequences encoding protein flexible bridge 1 or 2;

Г - вектор ph1_G4BD, в котором выше ДНК-связывающего домена GAL4 клонирована последовательность, кодирующая гибкий белковый мостик 1; T - vector ph1_G4BD, wherein the above DNA-binding domain GAL4 cloned sequence encoding a protein flexible bridge 1;

Д - вектор plexABD_h1, в котором ниже ДНК-связывающего домена lexA клонирована последовательность, кодирующая гибкий белковый мостик 1; D - vector plexABD_h1, wherein following the DNA-binding domain lexA cloned sequence encoding a protein flexible bridge 1;

Е - вектор ph1_lexABD, в котором выше ДНК-связывающего домена lexA клонирована последовательность, кодирующая гибкий белковый мостик 1; E - vector ph1_lexABD, wherein the above lexA DNA-binding domain of the cloned sequences encoding the protein flexible bridge 1;

Ж - аминокислотные последовательности используемых белковых мостиков 1 и 2. F - amino acid sequence of the protein used in the bridges 1 and 2.

Пример 1. Создание модификаций векторов, предназначенных для дрожжевой двугибридной системы. Example 1. Construction of vectors modifications intended for the yeast two-hybrid system.

Дрожжевая двугибридная система основана на использовании факторов транскрипции, которые характеризуются модульностью строения и состоят из физически и функционально разделимых доменов: ДНК-связывающего (BD - binding domain) и домена, активирующего транскрипцию (AD - activation domain). The yeast two-hybrid system is based on the transcription factors which are characterized by the structure of modular and consist of physically and functionally separable domains: a DNA binding (BD - binding domain) and transcription-activating domain (AD - activation domain). Физическое разделение BD и AD доменов приводит к инактивации фактора транскрипции. Physical separation of BD and AD domains lead to the inactivation of the transcription factor. BD и AD домены сливают с исследуемыми белками Х («наживка») и Y («добыча»), соответственно. BD and AD domains of the studied protein is fused to X ( "bait") and Y ( «Production"), respectively. Реконструкция фактора становится возможна в случае взаимодействия Х с Y, тогда происходит активация транскрипции генов, зависимых от используемого фактора транскрипции (Bartel, Chien et al. 1993). Reconstruction factor becomes possible in the case of interaction X to Y, then the activation of gene transcription, depending on the transcription factor (Bartel, Chien et al. 1993). Для создания двугибридной системы чаще всего используют фактор транскрипции S. cerevisiae GAL4, разделенный на ДНК-связывающий и активационный домены. To create a two-hybrid system is often used a transcription factor S. cerevisiae GAL4, divided by the DNA-binding and activation domains. Также в качестве ДНК-связывающего мотива часто используют домен бактериального репрессорного белка lexA. Also, as a DNA-binding motif is often used domain of the bacterial repressor protein lexA.

Исходным материалом для анализа являются две плазмиды, в которые в нужной рамке считывания клонируются последовательности кДНК двух белков, исследуемых на предмет взаимодействия. The starting material for the analysis are the two plasmids, in which the desired reading frame cloned cDNA sequences of two proteins investigated for interaction. Последовательность первого белка клонируется в единой рамке с BD-доменом в одной плазмиде, а последовательность второго - в единой рамке с AD-доменом Gal4 в другой плазмиде. The sequence of the first protein is cloned in frame with a single BD-domain in a single plasmid, and the second sequence - in a single frame with the Gal4 AD-domain into another plasmid.

Дрожжевые клетки котрансформируют двумя такими плазмидами, белковые конструкции экспрессируются в клетках и направляются с помощью особого сигнала ядерной локализации из цитоплазмы в ядро клетки. Yeast cells were cotransformed with two such plasmids protein constructs expressed in cells and routed via special nuclear localization signal from the cytoplasm into the cell nucleus. BD-домен, соединенный со вторым белком, связывается с промоторами репортерных генов, в которые встроены либо GAL4-, либо lexA-связывающие последовательности ДНК, и если первый и второй белки взаимодействуют, то в результате AD-домен привлекается к регуляторной части репортерного гена и активирует его экспрессию. BD-domain joined to a second protein that binds to the promoters of the reporter genes, in which are embedded or GAL4-, or lexA-DNA binding sequence, and if the first and second proteins interact, the resulting AD-domain is involved in the regulatory portion of the reporter gene and activates its expression.

Необходимо отметить, что в клетках S. cerevisiae слитый белок экспрессируется в относительно небольшом количестве с минимального конститутивного ADH1-промотора, в составе вектора также присутствует последовательность терминирующего сигнала ADH1. It should be noted that in S. cerevisiae cells, the fusion protein is expressed in a relatively small amount from the minimum of the constitutive ADH1-promoter in the vector sequence is also present ADH1 termination signal. Слитый белок направляется в ядро клеток S. cerevisiae с помощью сигнала ядерной локализации, являющегося частью BD или имеющего гетерологичное происхождение (из вируса SV40). The fusion protein was directed into the nucleus of cells S. cerevisiae via a nuclear localization signal, a part having a BD or heterologous origin (from SV40 virus). Вектора способны автономно реплицироваться в клетках Е. coli и в клетках S. cerevisiae. Vectors capable of autonomously replicating in cells of E. coli and cells of S. cerevisiae. Вектора содержат ген β-лактамазы, обуславливающий резистентность Е. coli к ампициллину. Vectors contain β-lactamase gene may influence the resistance of E. coli to ampicillin. В варианте вектора с активационным доменом GAL4 есть LEU2 ген, а с ДНК-связывающим доменом - TRP1 ген, позволяющие гетеротрофным клеткам S. cerevisiae расти в условиях, лимитированных по лейцину или триптофану, соответственно. In an embodiment, the activation domain vector with GAL4 is LEU2 gene and the DNA-binding domain - TRP1 gene to enable heterotrophic S. cerevisiae cells to grow under conditions of limited leucine or tryptophan, respectively.

Эксперимент включает несколько этапов. The experiment involves several steps.

- Получение экспрессирующих векторов - плазмид, в которых последовательности кДНК исследуемых белков клонированы в единой рамке с ДНК-связывающим или активационным доменом. - Preparation of expression vectors - plasmids in which the proteins of the cDNA sequence cloned into a single frame with the DNA binding or activation domain.

- Котрансформация дрожжей двумя типами плазмид и посев трансформантов на чашки Петри с селективной средой, не содержащей селективные аминокислоты (например, в классическом варианте - триптофан и лейцин). - Yeast cotransformation with two types of plasmids and transformant for seeding Petri dishes with selective medium containing no selective amino acid (e.g., the classical variant - tryptophan and leucine). В гены биосинтеза этих аминокислот в геноме используемого дрожжевого штамма искусственно внесены мутации, нарушающие образование функционально активных белков. In these amino acid biosynthesis genes in the genome of yeast strain used artificially introduced mutation disrupting the formation of functionally active proteins. Эти гены без мутаций экспрессируются с трансформированных плазмид. These genes are expressed without mutations transformed with plasmids. В результате на чашках происходит селекция, если котрансформация прошла успешно, то на чашке через 2-3 суток вырастают отдельные колонии. As a result, there is the selection of dishes, if co-transformation is successful, then the cup after 2-3 days, individual colonies grow.

- Несколько колоний пересеваются истощающим штрихом на чашки Петри с селективной средой (например, без триптофана, лейцина, гистидина и аденина). - Several colonies were reseeded debilitating stroke on Petri dishes with selective medium (for example, without tryptophan, leucine, histidine and adenine).

- Чаще всего, гены биосинтеза гистидина и аденина ADE2 и HIS3, а также ген β-галактозидазы LacZ являются репортерными. - In most cases, genes of the biosynthesis of histidine and adenine ADE2 and HIS3, and the β-galactosidase gene LacZ reporter are. Если белки взаимодействуют, то активируются гены ADE2 и HIS3 и, следовательно, колонии вырастают. If the proteins interact, then activated genes HIS3 and ADE2, and hence grow colonies. Если белки не взаимодействуют, то рост колоний не наблюдается. If proteins do not interact, the growth of colonies is observed. Кроме этого можно параллельно детектировать уровень активации гена LacZ. Besides it is possible to detect the level of parallel activation of LacZ gene.

Основным ограничением в использовании дрожжевой двугибридной системы является частое появление ложноотрицательных и ложноположительных результатов. The main limitation in the use of a yeast two-hybrid system is the frequent occurrence of false-negative and false-positive results. Есть несколько подходов на пути преодоления данных проблем: There are several approaches to overcoming these problems:

1) использование нескольких генов-репортеров, 1) the use of multiple reporter genes,

2) перемещение в плазмидах доменов белка Gal4/lexA на С-конец химерного белка, 2) moving in plasmids domains of the protein Gal4 / lexA at the C-terminus of the chimeric protein

3) проверка не целого белка на взаимодействие, а только его отдельных доменов, 3) checking not whole protein interactions, but only some of its domains,

4) использование ингибиторов, которые в определенных концентрациях исключают ложноположительный рост. 4) use of inhibitors that at certain concentrations exclude false positive growth.

Однако, несмотря на все эти подходы, многие взаимодействия не удается детектировать с использованием классического варианта дрожжевой двугибридной системы из-за того, что в последовательности химерного белка домены тестируемого белка, по всей видимости, оказываются жестко связаны с последовательностями, кодирующими ДНК-связывающий/активационный домены. However, despite these approaches, many interactions can not be detected using classical variant yeast two-hybrid system because of the fact that in the sequence of chimeric protein domains test protein apparently are rigidly linked to sequences encoding the DNA binding / activation domains. В связи с этим было высказано предположение, согласно которому использование в векторах для дрожжевой двугибридной системы гибких белковых мостиков, отделяющих последовательность тестируемого белка от последовательностей ДНК-связывающего/активационного доменов, позволит стерически изолировать домены белков и добиться детектируемого сигнала взаимодействия белковых молекул. In this regard, it has been suggested, according to which vectors for use in yeast two-hybrid protein system of flexible bridges separating the sequence of test protein sequences from DNA binding / activation domain allows sterically insulate domains of proteins and to achieve detectible signal interaction of protein molecules.

В качестве модифицируемых векторов были выбраны pGAD424 и pGBT9 (Clontech), предназначенные для использования в дрожжевой двугибридной системе и основанные на GAL4-активаторе. As modified vectors were selected and pGAD424 pGBT9 (Clontech), for use in a yeast two-hybrid system, and based on GAL4-activator. Дополнительно в качестве ДНК-связывающего домена был использован соответствующий мотив lexA, который был клонирован в вектор pGBT9 вместо ДНК-связывающего домена GAL4. Additionally, as the DNA-binding domain, the lexA motif was used, which was cloned into the vector pGBT9 instead GAL4 DNA binding domain.

Были разработаны и синтезированы ДНК-последовательности, кодирующие 21- и 22-аминокислотные линкеры, представляющие собой достаточно гибкие α-спирали. They were designed and synthesized a DNA sequence encoding the 21- and 22-amino acid linkers, which are flexible enough α-helix. Разработанные аминокислотные последовательности представлены на Фиг.1Ж. Designed amino acid sequence shown in Fig.1Zh.

ДНК-последовательности линкера были клонированы в вектора для дрожжевой двугибридной системы либо на N- (Фиг.1Б, Г, Е), либо на С-конце (Фиг.1А, В, Д) относительно ДНК-связывающего (Фиг.1В, Г, Д, Е)/активационного (Фиг.1А, Б) доменов. DNA linker sequences were cloned into a vector for yeast two-hybrid system or a N- (1B, D, E), or at the C-terminus (Figure 1A, B, D) with respect to the DNA-binding (Figure 1B, D , D, E) / activation (Figure 1A, B) domain. Для клонирования ДНК-последовательности, кодирующей белковый мостик, на N-конец ДНК-связывающего/активационного доменов был использован сайт рестрикции HindIII. To clone the DNA sequence encoding a protein bridge, on N-end of the DNA binding / activation domain was used restriction site HindIII. Для клонирования ДНК-последовательности, кодирующей белковый мостик, на С-конец ДНК-связывающего/активационного доменов был использован сайт рестрикции EcoRI. To clone the DNA sequence encoding a protein bridge at the C-terminus of the DNA binding / activation domain was used restriction site EcoRI. Соответствующие рестриктные сайты были заложены в последовательности олигонуклеотидов, используемых для синтеза последовательности ДНК, кодирующей белковый мостик. Appropriate restriction enzyme sites were incorporated in the oligonucleotide sequence used for the synthesis of a DNA sequence encoding a protein bridge. Последовательности олигонуклеотидов были подобраны таким образом, чтобы открытая рамка считывания клонируемых фрагментов в итоговых конструкциях не была нарушена. The sequences of the oligonucleotides are selected so that the open reading frame of the cloned fragments in the final constructs was not broken.

В итоге получено 8 векторов, в которых последовательности изучаемых белков можно клонировать в единой рамке считывания с ДНК-связывающим/активационным доменами либо на N- либо на С-конце, и во всех случаях белковые домены тестируемых белков будут отделены от ДНК-связывающего/активационного доменов 21- или 22-аминокислотным белковым мостиком. The result obtained 8 vectors in which the sequences of the studied proteins may be cloned in a single reading frame with the DNA binding / activation domain or a N- or C-terminus, and in all cases of test protein domains will be separated from the protein-DNA binding / activation domain 21- or 22-amino acid protein bridge.

Пример 2. Тестирование модифицированных векторов на предмет детекции взаимодействия между белковыми молекулами. Example 2. Testing the modified vectors for the detection of interactions between protein molecules.

На основе модифицированных векторов были созданы плазмиды для тестирования эффективности разработанного подхода. On the basis of the modified vectors were created plasmids to test the efficacy of the developed approach. Для этого как в классические вектора для дрожжевой двугибридной системы (pGAD424 и pGBT9), так и в модифицированные (pG4AD_h1, pG4AD_h2, ph1_G4AD, pG4BD_h1, pG4BD_h2, ph1_G4BD, plexABD_h1, ph1_lexABD) были клонированы кДНК-последовательности тестируемых белков. For this purpose, both classical vector for yeast two-hybrid system (pGAD424 and pGBT9), and a modified (pG4AD_h1, pG4AD_h2, ph1_G4AD, pG4BD_h1, pG4BD_h2, ph1_G4BD, plexABD_h1, ph1_lexABD) were cloned cDNA sequence of the test protein. В качестве положительного контроля корректности функционирования всех плазмид было использовано хорошо изученное взаимодействие белков Дрозофилы CTCF и СР190. As a positive control the correctness of the operation of all plasmids were used well-studied protein interaction Drosophila CTCF and SR190. В качестве отрицательных контролей были использованы исходные плазмиды. The starting plasmids were used as negative controls. Результаты проверки всех вариантов векторов представлены на Фиг.2, из которой видно, что как на селективной среде без гистидина и аденина, так и в β-галактозидазном тесте детектируются положительные сигналы только в парах dCTCF-CP190. Results for this test all the vectors represented in Figure 2, which shows that both on selective medium lacking histidine and adenine, and in the β-galactosidase assay Positive signals are detected only in pairs dCTCF-CP190.

Затем были выбраны белки и отдельные белковые домены, для которых из экспериментов in vitro известно, что они могут формировать гомодимеры, однако в классическом варианте дрожжевой двугибридной системы не удавалось детектировать положительный сигнал. Then the proteins were selected and the individual protein domains that from in vitro experiments it is known that they can form homodimers, but in the classic version yeast two-hybrid system was not possible to detect a positive signal. Это полноразмерные белки CTCF Дрозофилы и человека и его N-концевые домены, белки Pita, Zw5 Дрозофилы, и их N-концевые домены, представляющие собой цинковый палец С4-типа (так называемый ZAD-домен). This full-length proteins of human and Drosophila CTCF and its N-terminal domains, Pita proteins, Zw5 Drosophila, and their N-terminal domains representing C4 zinc finger-type (so-called ZAD-domain). Для всех этих белков в экспериментах in vitro показано, что они могут формировать гомодимеры, и для такой димеризации необходимы N-концевые домены данных белков. For all of these proteins in in vitro experiments demonstrated that they can form homodimers and this requires dimerization N-terminal domains of these proteins. На Фиг.3 представлены результаты дрожжевой двугибридной системы, полученные с использованием классических векторов, в которые были клонированы кДНК-последовательности данных белков. Figure 3 shows the results of a yeast two-hybrid system, obtained using the classical vectors, which were cloned in the cDNA sequences of these proteins. Видно, что в случае отдельных доменов во всех экспериментах были получены отрицательные результаты, и только в некоторых вариантах с использованием полноразмерных белков детектируется положительный сигнал. It is seen that in the case of individual domains in all experiments, negative results were obtained, and only in some embodiments, using a full-size protein is detected by a positive signal.

Все изучаемые последовательности были клонированы в модифицированные вектора, и на Фиг.4 представлены результаты данного варианта дрожжевой двугибридной системы. All the studied sequences were cloned into the modified vector, and Figure 4 shows the results of this embodiment yeast two-hybrid system. Так, во многих комбинациях, в которых N-конец тестируемых белков оставался свободным и при этом отделялся от ДНК-связывающего/активационного доменов белковым мостиком, удалось детектировать положительные сигналы, которые ранее были недетектируемы. Thus, in many combinations in which the N-end of the test proteins remained free and thus separated from the DNA binding / activation domain protein bridge could detect positive signals that were previously undetectable. На основании полученных результатов действительно видно, что молекулы изучаемых белков взаимодействуют друг с другом за счет N-концевых доменов. Based on these results indeed evident that the molecules studied proteins interact with each other by the N-terminal domain.

Список литературы Bibliography

1. Bartel, Р., С.Т. 1. Bartel, P., ST Chien, et al. Chien, et al. (1993). (1993). ″Elimination of false positives that arise in using the two-hybrid system.″ Biotechniques 14(6): 920-4. "Elimination of false positives that arise in using the two-hybrid system." Biotechniques 14 (6): 920-4.

Claims (1)

  1. Дрожжевая клетка, предназначенная для детекции взаимодействия между белками и их доменами, котрансформированная двумя плазмидами, модифицированными для экспрессии в клетках дрожжей двух белков, где нуклеотидная последовательность, кодирующая первый белок, клонирована в одну плазмиду, а нуклеотидная последовательность, кодирующая второй белок,- в другую плазмиду, где нуклеотидные последовательности, кодирующие белки, слиты с нуклеотидными последовательностями, кодирующими активационный и ДНК-связывающий домены белка GAL4, при этом нук Yeast cells are designed for the detection of interaction between proteins and their domains cotransformed with two plasmids, modified for expression in yeast cells the two proteins, where the nucleotide sequence encoding the first protein, cloned into one plasmid and the nucleotide sequence encoding a second protein - in other plasmid wherein the nucleotide sequences encoding the proteins fused to the nucleotide sequences encoding the activation and DNA binding domains of GAL4 protein, the CQI еотидные последовательности, кодирующие исследуемые белки, отделены от нуклеотидных последовательностей, кодирующих активационный или ДНК-связывающий домен белка GAL4, при помощи нуклеотидной последовательности, кодирующей пептид, представляющий собой последовательность GluLeuGluAlaAlaAlaLysGluAlaAlaAlaLysGluAlaAlaAlaLysGluAlaAlaAla, который экспрессируется в виде белкового мостика между исследуемым белком и доменами белка GAL4. eotidnye sequences encoding proteins under study, separated from nucleotide sequences encoding the activation or the DNA binding domain of GAL4 protein, using the nucleotide sequence encoding a peptide representing a sequence GluLeuGluAlaAlaAlaLysGluAlaAlaAlaLysGluAlaAlaAlaLysGluAlaAlaAla, which is expressed as a protein bridge between the test protein and the protein domains of GAL4.
RU2012141166/10A 2012-09-27 2012-09-27 Modified yeast-2-hybrid for effective study of interactions between proteins and their domains RU2529356C2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2012141166/10A RU2529356C2 (en) 2012-09-27 2012-09-27 Modified yeast-2-hybrid for effective study of interactions between proteins and their domains

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2012141166/10A RU2529356C2 (en) 2012-09-27 2012-09-27 Modified yeast-2-hybrid for effective study of interactions between proteins and their domains

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2012141166A RU2012141166A (en) 2014-04-10
RU2529356C2 true RU2529356C2 (en) 2014-09-27

Family

ID=50435650

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2012141166/10A RU2529356C2 (en) 2012-09-27 2012-09-27 Modified yeast-2-hybrid for effective study of interactions between proteins and their domains

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2529356C2 (en)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2241748C2 (en) * 1999-02-11 2004-12-10 Институт Молекулярной Агробиологии Nac1 - plant gene encoding transcription factor taking part in development of seed lobe and lateral root
US20070031815A1 (en) * 2003-05-01 2007-02-08 University Of Liverpool Screening method for identifying hsp90 modulators
EP1975620A2 (en) * 2001-03-02 2008-10-01 GPC Biotech AG Three hybrid assay system
RU2403287C2 (en) * 2004-10-25 2010-11-10 Авентис Фарма С.А. Double hybrid system based on gene silencing by transcriptional interference
RU2447449C2 (en) * 2006-11-14 2012-04-10 Дженентек, Инк. Neuronal regeneration modulators

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2241748C2 (en) * 1999-02-11 2004-12-10 Институт Молекулярной Агробиологии Nac1 - plant gene encoding transcription factor taking part in development of seed lobe and lateral root
EP1975620A2 (en) * 2001-03-02 2008-10-01 GPC Biotech AG Three hybrid assay system
US20070031815A1 (en) * 2003-05-01 2007-02-08 University Of Liverpool Screening method for identifying hsp90 modulators
RU2403287C2 (en) * 2004-10-25 2010-11-10 Авентис Фарма С.А. Double hybrid system based on gene silencing by transcriptional interference
RU2447449C2 (en) * 2006-11-14 2012-04-10 Дженентек, Инк. Neuronal regeneration modulators

Also Published As

Publication number Publication date
RU2012141166A (en) 2014-04-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hu et al. A role for β-actin in RNA polymerase III transcription
Pabo et al. Design and selection of novel Cys2His2 zinc finger proteins
Szurek et al. Eukaryotic features of the Xanthomonas type III effector AvrBs3: protein domains involved in transcriptional activation and the interaction with nuclear import receptors from pepper
Bogdanove et al. TAL effectors: finding plant genes for disease and defense
Pfeiffer et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila
Sorci et al. RAGE in tissue homeostasis, repair and regeneration
Kushnirov Rapid and reliable protein extraction from yeast
Forsburg et al. Identification and characterization of HAP4: a third component of the CCAAT-bound HAP2/HAP3 heteromer.
Fujiwara et al. Rho1p-Bni1p-Spa2p interactions: implication in localization of Bni1p at the bud site and regulation of the actin cytoskeleton in Saccharomyces cerevisiae
Akarsu et al. Crystal structure of the M1 protein‐binding domain of the influenza A virus nuclear export protein (NEP/NS2)
Nikolov et al. RNA polymerase II transcription initiation: a structural view
Gordon et al. DNA segregation in bacteria
EP0929691B1 (en) Methods and compositions for identifying receptor effectors
Burri et al. A complete set of SNAREs in yeast
Maucuer et al. Stathmin interaction with a putative kinase and coiled-coil-forming protein domains.
Kay et al. The importance of being proline: the interaction of proline-rich motifs in signaling proteins with their cognate domains
He et al. Upf1p, Nmd2p, and Upf3p are interacting components of the yeast nonsense-mediated mRNA decay pathway.
Stam et al. Identification of candidate transcriptional modulators involved in successful regeneration after nerve injury
CA2398155C (en) Methods and compositions for linking binding domains in nucleic acid binding proteins
Kahmann et al. Ustilago maydis: how its biology relates to pathogenic development
Jantzen et al. Multiple domains of the RNA polymerase I activator hUBF interact with the TATA-binding protein complex hSL1 to mediate transcription.
Duman et al. What is the role of SNARE proteins in membrane fusion?
Nachury et al. Cloning and characterization of hSRP1γ, a tissue-specific nuclear transport factor
Ju et al. REB1, a yeast DNA-binding protein with many targets, is essential for growth and bears some resemblance to the oncogene myb.
Zawel et al. Advances in RNA polymerase II transcription

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20150928