RU2527069C2 - METHOD OF SPECIES AND STRAIN IDENTIFICATION OF BIFIDOBACTERIA OF PHYLOTYPE Bifidobacterium longum - Google Patents
METHOD OF SPECIES AND STRAIN IDENTIFICATION OF BIFIDOBACTERIA OF PHYLOTYPE Bifidobacterium longum Download PDFInfo
- Publication number
- RU2527069C2 RU2527069C2 RU2011145069/10A RU2011145069A RU2527069C2 RU 2527069 C2 RU2527069 C2 RU 2527069C2 RU 2011145069/10 A RU2011145069/10 A RU 2011145069/10A RU 2011145069 A RU2011145069 A RU 2011145069A RU 2527069 C2 RU2527069 C2 RU 2527069C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- longum
- oligonucleotides
- case
- species
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству бактериальных препаратов и продуктов питания, а также к медицинской микробиологии, и может быть использовано для идентификации штаммов бифидобактерий.The invention relates to biotechnology, in particular to the production of bacterial preparations and food products, as well as to medical microbiology, and can be used to identify strains of bifidobacteria.
Уровень техникиState of the art
Известно, что клинические проявления дисбактериоза кишечника, как правило, отмечаются на фоне отсутствия или дефицита бифидобактерий, которые в норме являются основой микрофлоры кишечника людей всех возрастов. (Бондаренко В.М., Грачева Н.М., Мацулевич Т.В. Дисбактериозы кишечника у взрослых. М.: КМК Scientifi с Press, 2003, 224 с; Leahy S.C., Higgins D.G., Fitzgerald G.F and van Sinderen D. Getting better with bifidobacteria. Journal of Applied Microbiology, 2005, 98, 1303-1315). Именно поэтому бифидобактерии широко используются в составе заквасок для приготовления различных кисломолочных продуктов и в виде бакпрепаратов, применяемых в лечебно-профилактических целях. В связи с этим очень важно разработать точные методы идентификации видов и штаммов бифидобактерий (Мазанкова Л.Н., Лыкова Е.А. Пробиотики: характеристика препаратов и выбор в педиатрической практике // Детские инфекции. 2004, №1, с.18-23; Бифидобактерии и их использование в клинике, медицинской промышленности и сельском хозяйстве / Под ред. Никитина В.А. М., 1986, 119 с. Бондаренко В.М., Воробьев А.А. Дисбиозы и препараты с пробиотической функцией // Журн. Микробиолог.- 2004. - №1. - С.84-92; Stanton С., Ross R.P., Fitzgerald G.F. and Van Sinderen, D. (2005) Fermented functional foods based on probiotics and their biogenic metabolites. Curr. Opin.Biotechnol. 16, 198-203).It is known that the clinical manifestations of intestinal dysbiosis, as a rule, are observed against the background of the absence or deficiency of bifidobacteria, which are normally the basis of the intestinal microflora of people of all ages. (Bondarenko V.M., Gracheva N.M., Matsulevich T.V. Intestinal dysbacteriosis in adults. M: KMK Scientifi with Press, 2003, 224 p .; Leahy SC, Higgins DG, Fitzgerald GF and van Sinderen D. Getting better with bifidobacteria. Journal of Applied Microbiology, 2005, 98, 1303-1315). That is why bifidobacteria are widely used in the composition of starter cultures for the preparation of various dairy products and in the form of bacterial preparations used for therapeutic and prophylactic purposes. In this regard, it is very important to develop accurate methods for identifying species and strains of bifidobacteria (Mazankova L.N., Lykova E.A. Probiotics: characterization of drugs and choice in pediatric practice // Children's Infections. 2004, No. 1, pp. 18-23 ; Bifidobacteria and their use in the clinic, medical industry and agriculture / Edited by Nikitin V.A. M., 1986, 119 pp. Bondarenko V. M., Vorobev A. A. Dysbiosis and drugs with probiotic function // Zhurn Microbiologist. - 2004. - No. 1. - P.84-92; Stanton C., Ross RP, Fitzgerald GF and Van Sinderen, D. (2005) Fermented functional foods based on probiotics and their biogenic meta bolites. Curr. Opin. Biotechnol. 16, 198-203).
В настоящее время для идентификации вида и рода бифидобактерий применяются следующие методы:Currently, the following methods are used to identify the species and genus of bifidobacteria:
1. Метод, основанный на амплификации фрагментов гена 16S pPHK. (Youn SY, Seo JM, Ji GE. Evaluation of the PCR method for identification of Bifidobacterium species. Lett Appl Microbiol. 2008, Jan, 46(1):7-13; Krizova, J., Spanova, A. and Rittich, B. Evaluation of amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) and species-specific PCR for identification of Bifidobacterium species. Syst Appl Microbiol. 2006, 29, 36-44; Kwon, H.S., Yang, E.H., Lee, S.H., Yeon, S.W., Kang, B.H. and Kim, T.Y. Rapid identification of potentially probiotic Bifidobacterium species by multiplex PCR using species-specific primers based on the region extending from 16S rRNA through 23S rRNA. FEMS Microbiol Lett. 2005, 250, 55-62; Mullie, С., Odou, M.F., Singer, E., Romond, M.D. and Izard, D. Multiplex PCR using 16S rRNA gene-targeted primers for the identification of Bifidobacteria from human origin. FEMS Microbiol Lett. 2003, 222, 129-136; Патент Япония, United States Patent 7,321,032, 2008; Патент P 200601788 ES, 2006; Патент KR 20050012505, 2005).1. A method based on the amplification of fragments of the 16S pPHK gene. (Youn SY, Seo JM, Ji GE. Evaluation of the PCR method for identification of Bifidobacterium species. Lett Appl Microbiol. 2008, Jan, 46 (1): 7-13; Krizova, J., Spanova, A. and Rittich, B. Evaluation of amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) and species-specific PCR for identification of Bifidobacterium species. Syst Appl Microbiol. 2006, 29, 36-44; Kwon, HS, Yang, EH, Lee, SH, Yeon, SW , Kang, BH and Kim, TY Rapid identification of potentially probiotic Bifidobacterium species by multiplex PCR using species-specific primers based on the region extending from 16S rRNA through 23S rRNA. FEMS Microbiol Lett. 2005, 250, 55-62; Mullie, C ., Odou, MF, Singer, E., Romond, MD and Izard, D. Multiplex PCR using 16S rRNA gene-targeted primers for the identification of Bifidobacteria from human origin. FEMS Microbiol Lett. 2003, 222, 129-136; Patent Japan, United States Patent 7,321,032, 2008; Patent P 200601788 ES, 2006; KR Patent 20050012505, 2 005).
По нуклеотидным последовательностям генов 16S рРНК разработаны родо-, группо- и видоспецифичные праймеры, амплификация с которыми в ряде случаев может проводиться одновременно в общей реакционной смеси (так называемая мультиплексная ПЦР - multiplex PCR) (Matsuki Т., Watanabe К., Fujimoto J., Kado Y., Takada Т., Matsumoto K., Tanaka R. Quantitative PCR with 16S rRNA-gene-targeted species-specific primers for analysis of human intestinal Bifidobacteria. Applied and environmental microbiology, Jan. 2004, p.167-173). Однако межвидовой уровень сходства по гену 16S рРНК варьирует в пределах 93-99%, и многие виды бифидобактерий филогенетически близки между собой.The nucleotide sequences of the 16S rRNA genes have developed rhodo-, group- and species-specific primers, amplification with which in some cases can be carried out simultaneously in a common reaction mixture (the so-called multiplex PCR - multiplex PCR) (Matsuki T., Watanabe K., Fujimoto J. , Kado Y., Takada T., Matsumoto K., Tanaka R. Quantitative PCR with 16S rRNA-gene-targeted species-specific primers for analysis of human intestinal Bifidobacteria. Applied and environmental microbiology, Jan. 2004, p.167-173 ) However, the interspecific level of similarity in the 16S rRNA gene varies between 93-99%, and many species of bifidobacteria are phylogenetically close to each other.
2. Метод двулокусного секвенирования, в частности, с использованием β-субъединицы F0F1-АТФазы. (Ventura М., Canchaya С., van Sinderen D,, Fitzgerald G.F., Zink R. Bifidobacterium lactis DSM 10140: Identification of the atp (atpBEFHAGDC) Operon and Analysis of Its Genetic Structure, Characteristics, and Phytogeny. Applied and environmental microbiology, May 2004, p.3110-3121.).2. The method of two-locus sequencing, in particular, using the β-subunit of F 0 F 1 -ATPase. (Ventura M., Canchaya S., van Sinderen D ,, Fitzgerald GF, Zink R. Bifidobacterium lactis DSM 10140: Identification of the atp (atpBEFHAGDC) Operon and Analysis of Its Genetic Structure, Characteristics, and Phytogeny. Applied and environmental microbiology, May 2004, p.3110-3121.).
3. Метод с использованием 7 консервативных генов «домашнего хозяйства» clpC, dnaB, dnaG, dnaJ1, purF, rpoC и xfp, комбинация последовательностей которых позволяет выявить филогенетические отличия между видами бифидобактерий. (Ventura, М., Canchaya, С., Del Casale, A., Dellaglio, F., Neviani, E., .Fitzgerald, G. F. and van Sinderen, D. Analysis of bifidobacterial evolution using a multilocus approach. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006, 56, 2783-2792.).3. A method using 7 conservative “housekeeping” genes clpC, dnaB, dnaG, dnaJ1, purF, rpoC and xfp, the combination of sequences of which allows revealing phylogenetic differences between the types of bifidobacteria. (Ventura, M., Canchaya, S., Del Casale, A., Dellaglio, F., Neviani, E., F.itzgerald, GF and van Sinderen, D. Analysis of bifidobacterial evolution using a multilocus approach. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006, 56, 2783-2792.).
Однако перечисленные выше методы не позволяют проводить штаммоспецифическую идентификацию, поскольку нуклеотидные последовательности генов, используемых для видовой идентификации, полностью идентичны для разных штаммов одного вида.However, the above methods do not allow strain-specific identification, since the nucleotide sequences of the genes used for species identification are completely identical for different strains of the same species.
Для генотипирования штаммов вида В. animalis subsp. lactis разработан метод, основанный на однонуклеотидных полиморфизмах, вставках и делениях. (Briczinski Е.Р., Loquasto J.R., Barrangou R., Dudley E.G., Roberts A.M., Roberts R.F. Strain-specific genotyping of Bifidobacterium animalis subsp. lactis by using single-nucleotide polymorphisms, insertions, and deletions. Appl Environ Microbiol. 2009 Dec; 75(23):7501-8. Epub 2009 Oct 2.).For genotyping of strains of the species B. animalis subsp. lactis developed a method based on single nucleotide polymorphisms, inserts and divisions. (Briczinski E.R., Loquasto JR, Barrangou R., Dudley EG, Roberts AM, Roberts RF Strain-specific genotyping of Bifidobacterium animalis subsp. Lactis by using single-nucleotide polymorphisms, insertions, and deletions. Appl Environ Microbiol. 2009 Dec ; 75 (23): 7501-8. Epub 2009 Oct 2.).
Для штаммов других видов Bifidobacterium (в том числе В.longum) до настоящего времени не разработаны методы идентификации.Identification methods have not yet been developed for strains of other species of Bifidobacterium (including B. longum).
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Задачей настоящего изобретения является создание экспресс-метода молекулярно-генетического типирования штаммов бифидобактерий и, в частности, В.longum.The objective of the present invention is to provide an express method for molecular genetic typing of strains of bifidobacteria and, in particular, B. longum.
В заявленном изобретении предложен метод идентификации штаммов филотипа В.longum, основанный на комбинации и полиморфизме генов токсин-антитоксин системы relBE. Действие систем токсин-антитоксин в ряде работ квалифицируют как адаптацию к стрессовым условиям (субстратное голодание или другие стрессы), что позволяет выжить остальным бактериям. (Прозоров А.А., Даниленко В.Н. Системы "токсин-антитоксин" у бактерий: инструмент апоптоза или модуляторы метаболизма? Микробиология. 2010. Т.79. №2. С.147-159).The claimed invention provides a method for identifying strains of the B. longum phylotype, based on the combination and polymorphism of the toxin-antitoxin genes of the relBE system. The action of the toxin-antitoxin systems in a number of studies qualifies as adaptation to stressful conditions (substrate starvation or other stresses), which allows the remaining bacteria to survive. (Prozorov A.A., Danilenko V.N. "Toxin-antitoxin" systems in bacteria: apoptosis tool or metabolism modulators? Microbiology. 2010. V.79. No. 2. P.147-159).
1. Биоинформатический анализ наличия генов систем токсин-антитоксин mazEF и relBE у бифидобактерий1. Bioinformatics analysis of the presence of mazEF and relBE toxin-antitoxin system genes in bifidobacteria
По данным на 1.10.2011 года, в базе данных представлено 11 геномов, относящихся к группе В.longum (7 штаммов подвида В.longum subsp. longum и 4 штамма подвида В.longum subsp. infantis), а также штамма Bifidobacterium sp. 12_1_47BFAA, также относящегося к виду В.longum.According to the data as of October 1, 2011, the database contains 11 genomes belonging to the group of B. longum (7 strains of the subspecies B. longum subsp. Longum and 4 strains of the subspecies B. longum subsp. Infantis), as well as the strain Bifidobacterium sp. 12_1_47BFAA, also related to the species B. longum.
Авторами настоящего изобретения был проведен компьютерный поиск генов систем MazEF и RelBE в геномах всех секвенированных штаммов бифидобактерий с использованием программ National Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) и UniProt (http://www.uniprot.org/). Сравнительный анализ последовательностей обнаруженных генов проводили с использованием программ Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) и CLUSTAL W (http://www.ch.embnet.org/software/ClustalW.html).The authors of the present invention conducted a computer search of the genes of MazEF and RelBE systems in the genomes of all sequenced strains of bifidobacteria using the National Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) and UniProt (http: //www.uniprot.org/). A comparative analysis of the sequences of the detected genes was performed using the Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) and CLUSTAL W (http://www.ch.embnet.org/software/ClustalW.html) programs.
В результате биоинформатического анализа обнаружены существенные различия штаммов филотипа B.longum по наличию генов данных систем токсин-антитоксин (см. табл.1). Модули системы mazEF (перекрывающиеся гены) присутствуют только в геномах 3 штаммов В.longum - АТСС 15697, JDM301 и 157F. Гены токсина relE присутствуют только в геномах 4 штаммов - АТСС 15697, JDM301,157F и 12_1_47BFAA.As a result of bioinformatics analysis, significant differences between B.longum phylotype strains by the presence of genes of these toxin-antitoxin systems were found (see Table 1). Modules of the mazEF system (overlapping genes) are present only in the genomes of 3 strains of B. longum -
Во всех геномах штаммов группы В.longum обнаружены гены антитоксина relB. В штамме В. longum subsp. infantis АТСС 15697 присутствует наибольшее количество (7) генов антитоксина relB (обозначены нами как relB1-relB7 в порядке расположения в геноме). В штамме В.longum subsp. longum JDM301 присутствует 6 генов антитоксина relB (отсутствуют гены, гомологичные генам relB1 и relB5, но присутствует ген, обозначенный как relB8). В других штаммах В.longum обнаружено от 1 до 3 генов антитоксина relB. Таким образом, нами был обнаружен полиморфизм генов антитоксина relB на штаммовом уровне.RelB genes were found in all genomes of B. longum group strains. In the strain B. longum subsp.
Ген, обозначенный как relB3, присутствует во всех геномах B.longum, имеет высокую гомологию от 98 до 99% по всей нуклеотидной последовательности, за исключением С-концевой области, и может быть использован для видовой идентификации штаммов филотипа В.longum.The gene designated as relB3 is present in all B. longum genomes, has a high homology of 98 to 99% throughout the nucleotide sequence, except for the C-terminal region, and can be used for species identification of strains of the B. longum phylotype.
Гены антитоксина relB1 - relB10 имеют низкую гомологию между собой (15-30%), что может служить штаммоспецифическим признаком, кроме того, в нуклеотидных последовательностях генов relB имеются точечные отличия и вставки, что позволяет разработать штаммоспецифические олигонуклеотиды.RelB1 - relB10 antitoxin genes have low homology between each other (15-30%), which can serve as a strain-specific sign, in addition, there are point differences and inserts in the nucleotide sequences of relB genes, which makes it possible to develop strain-specific oligonucleotides.
Гены систем токсин-антитоксин mazEF и relBE обнаружены и в геномах других видов рода Bifidobacterium: в геномах 6 штаммов вида В.animalis subsp. lactis присутствует по 1 модулю системы mazEF (перекрывающиеся гены), по 1 гену токсина relE и по 2 гена антитоксина relB; в геномах 3 штаммов вида В.bifidum - по 1 модулю системы mazEF и по 3 гена антитоксина relB; в геномах 3 штаммов вида В.breve - по 2 модуля системы mazEF, по 1 гену токсина relE и от 4 до 5 генов антитоксина relB. В геноме штамма B.adolescentis АТСС 15703 присутствует 1 модуль системы mazEF.Genes of mazEF and relBE toxin-antitoxin systems were also found in the genomes of other species of the genus Bifidobacterium: in the genomes of 6 strains of the species B. animalis subsp. lactis is present in 1 module of the mazEF system (overlapping genes), 1 relE toxin gene and 2 relB antitoxin genes; in the genomes of 3 strains of the species B. bifidum - 1 module of the mazEF system and 3 relB antitoxin genes; in the genomes of 3 strains of the species B. breve - 2 modules of the mazEF system, 1 gene of toxin relE and 4 to 5 genes of antitoxin relB. The genome of the B. adolescentis
Таким образом, с использованием генов систем mazEF и relBE можно также проводить видовую идентификацию всех видов бифидобактерий.Thus, using the genes of the mazEF and relBE systems, species identification of all types of bifidobacteria can also be carried out.
2. Разработка олигонуклеотидов для идентификации В.longum2. Development of oligonucleotides for identification of B. longum
2.1. Идентификация филотипа В.longum2.1. B. longum phylotype identification
Поскольку ген антитоксина, обозначенный нами как relB3, присутствует во всех геномах B.longum, на основании нуклеотидных последовательностей консервативного гена были сконструированы олигонуклеотиды для видовой идентификации с использованием Программ CLUSTALW (http://www.ch.embnet.org/software/ClustalW.html) и Adv.BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi).Since the antitoxin gene, designated by us as relB3, is present in all B. longum genomes, oligonucleotides for species identification were constructed using CLUSTALW Programs (http://www.ch.embnet.org/software/ClustalW based on the nucleotide sequences of the conserved gene). html) and Adv.BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi).
На последовательности 3 (см. перечень последовательностей) представлен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов антитоксина relB3 штаммов B.longum и локализация олигонуклеотидов ReBN и ReBC для видовой идентификации. На всех представленных нуклеотидных последовательностях отличия выделены красным цветом, вставки - желтым цветом.Sequence 3 (see list of sequences) presents a comparative analysis of the nucleotide sequences of the antitoxin relB3 genes of B.longum strains and the localization of the ReBN and ReBC oligonucleotides for species identification. On all nucleotide sequences presented, the differences are highlighted in red, the inserts in yellow.
2.2. Штаммоспецифическая идентификация2.2. Strain-specific identification
С увеличением числа доступных секвенированных геномов бифидобактерий появилась возможность идентифицировать участки ДНК, специфичные для каждого конкретного штамма.With an increase in the number of available sequenced genomes of bifidobacteria, it became possible to identify DNA regions specific for each particular strain.
Как было сказано выше, наибольшее количество (7) генов антитоксина relB присутствует в геноме штамма АТСС 15697, причем ген relB1 является штаммоспецифическим, т.к. отсутствует в геномах остальных штаммов. В связи с этим, для идентификации данного штамма нами были сконструированы олигонуклеотиды на основе нуклеотидной последовательности гена relB1 (последовательность 1).As mentioned above, the largest number (7) of relB antitoxin genes is present in the genome of the
Также гены relB8 и relB10 являются специфическими для штаммов JDM301 и ААСС 91563 соответственно (последовательности 6, 8).Also, the relB8 and relB10 genes are specific for the JDM301 and
Ген relB2 присутствует в геномах штаммов АТСС 15697, JDM301 и F8; ген relB4 - в геномах штаммов АТСС 15697, JDM301, 157F и 12_1_47BFAA; ген relB5 - геномах штаммов АТСС 15697 и 157F; ген relB9 - геномах штаммов АТСС 55813 и CCUG 52486. Сравнительный анализ последовательностей данных генов для разных штаммов выявил однонуклеотидные отличия, что также позволило сконструировать штаммоспецифические олигонуклеотиды (последовательности 2, 4, 5, 7).The relB2 gene is present in the genomes of the
Геномы штаммов DJO10A, NCC2705, BBMN68 и JCM 1217 содержат только ген антитоксина relB3, присутствующий также в геномах всех штаммов B.longum (последовательность 3).The genomes of strains DJO10A, NCC2705, BBMN68, and
По нуклеотидной последовательности гена антитоксина relB3 штаммы В.longum можно разбить на 2 основные группы:According to the nucleotide sequence of the antitoxin relB3 gene, B. longum strains can be divided into 2 main groups:
Группа relB3a. К ней относятся штаммы: АТСС 15697, АТСС 55813, DJO10A, 12_1_47BFAA, F8, NCC2705, JDM301,157F.Group relB3a. The following strains belong to it:
Группа relB3b. В отличие от группы relB3A (нумерация дана для штамма АТСС 15697) нуклеотидная последовательность содержит замены (A114→G; C216→T; A217→G; C309→T; A310→G; A312→G; G315→А; T316→G; A317→C; C318→Т; G324→А; А326→G; A327→G; Т330→G; G331→A; A334→G; T337→C; A338→G; C342→T; A344→G; C345→A; T347→G; A350→G; G351→C; A352→G; G354→A; C356→T; G358→T; A359→G) и вставки (15 нуклеотидов в области между 332 и 333 нуклеотидами; 4 нуклеотида в области между 342 и 343 нуклеотидами; 2 нуклеотида в области между 360 и 361 нуклеотидами).Group relB3b. In contrast to the relB3A group (numbering is given for strain ATCC 15697), the nucleotide sequence contains substitutions (A 114 → G; C 216 → T; A 217 → G; C 309 → T; A 310 → G; A 312 → G; G 315 → A; T 316 → G; A 317 → C; C 318 → T; G 324 → A; A 326 → G; A 327 → G; T 330 → G; G 331 → A; A 334 → G; T 337 → C; A 338 → G; C 342 → T; A 344 → G; C 345 → A; T 347 → G; A 350 → G; G 351 → C; A 352 → G; G 354 → A; C 356 → T; G 358 → T; A 359 → G) and inserts (15 nucleotides in the region between 332 and 333 nucleotides; 4 nucleotides in the region between 342 and 343 nucleotides; 2 nucleotides in the region between 360 and 361 nucleotides).
К ней относятся штаммы: CCUG 52486, BBMN68, JCM 1217 и КАСС 91563.It includes strains:
Группу relB3a можно разбить на подгруппы:The relB3a group can be divided into subgroups:
Подгруппа relB3a.1. К ней относится штамм АТСС 15697.Subgroup relB3a. 1. The
Подгруппа relB3a.2. Отличия от relB3A.1 - A114→G; C216→Т; А217→G; G228→А; А334→G.Subgroup relB3a. 2. Differences from relB3A.1 - A 114 → G; C 216 → T; A 217 → G; G 228 → A; A 334 → G.
К ней относятся штаммы: АТСС 55813 (содержит дополнительно ген relB9),The strains belong to it: ATCC 55813 (additionally contains the relB9 gene),
DJO10A (содержит только ген relB3),DJO10A (contains only the relB3 gene)
12_1_47BFAA (содержит дополнительно ген relB4),12_1_47BFAA (additionally contains the relB4 gene),
157F (содержит дополнительно гены relB4 и relB5).157F (additionally contains the relB4 and relB5 genes).
Подгруппа relB3a.3. Отличия от relB3A.1 - A114→G; С216→T; A217→G; G228→А.Subgroup relB3a. 3. Differences from relB3A.1 - A 114 → G; C 216 → T; A 217 → G; G 228 → A.
К ней относится штамм NCC2705.It includes strain NCC2705.
Подгруппа relB3a.4. Отличия от relB3A.1 - G87→A; А114→G; C216→T; A217→G; А334→G.Subgroup relB3a. 4. Differences from relB3A.1 - G 87 → A; A 114 → G; C 216 → T; A 217 → G; A 334 → G.
К ней относится штамм JDM301.The strain JDM301 belongs to it.
Подгруппа relB3a.5. Отличия от relB3A.1 - C21→T; A114→G; A168→G; A179→C; C216→T; А217→G; C356→T. К ней относится штамм F8.Subgroup relB3a. 5. Differences from relB3A.1 - C 21 → T; A 114 → G; A 168 → G; A 179 → C; C 216 → T; A 217 → G; C 356 → T. It includes strain F8.
Группу relB3b можно разбить на подгруппы:The relB3b group can be divided into subgroups:
Подгруппа relB3b.1. Содержит замену A144→С.Subgroup relB3b. 1. Contains replacement A 144 → C.
К ней относится штамм BBMN68.BBMN68 strain belongs to it.
Подгруппа relB3b.2. Содержит замены А144→C; A168→G.Subgroup relB3b. 2. Contains replacements A 144 → C; A 168 → G.
К ней относится штамм CCUG 52486.It includes the
Подгруппа relB3b.3. Содержит замены А144→С; G228→А.Subgroup relB3b. 3. Contains replacements A 144 → C; G 228 → A.
К ней относится штамм JCM 1217.It includes the
Подгруппа relB3b.4. Содержит замены А168→G; A179→C.Subgroup relB3b. 4. Contains substitutions A 168 → G; A 179 → C.
К ней относится штамм КАСС 91563.It includes the
Все выявленные при сравнении последовательностей генов антитоксина relB отличия позволяют проводить идентификацию штаммов В.longum.All differences revealed by comparing the sequences of antitoxin relB genes allow identification of B. longum strains.
3. Разработка олигонуклеотидов для видовой идентификации Bifidobacterium, не относящихся к филотипу В.longum3. Development of oligonucleotides for the species identification of Bifidobacterium not belonging to the B. longum phylotype
Биоинформатический анализ наличия генов токсин-антитоксин систем MazEF и RelBE у других видов бифидобактерий представлен в таблице 3.Bioinformatics analysis of the presence of genes of the toxin-antitoxin of the MazEF and RelBE systems in other species of bifidobacteria is presented in table 3.
В геномах штаммов вида В.bifidum присутствует по 3 гена антитоксина relB. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов relB штаммов В.bifidum с генами антитоксина relB1-relB10 штаммов В.longum показал, что 2 гена имеют высокую идентичность (от 98 до 99%) с генами relB2 и relB10, третий ген антитоксина имеет низкую идентичность (15-30%) и обозначен нами как relB11. В связи с этим, нами были сконструированы олигонуклеотиды RelB11BbN и RelB11BbC для проведения видовой идентификации В.bifidum на основе нуклеотидной последовательности гена relB11 (последовательность 9).In the genomes of strains of the species B. bifidum there are 3 genes of antitoxin relB. A comparative analysis of the nucleotide sequences of relB genes of B. bifidum strains with the antitoxin genes of relB1-relB10 of B. longum strains showed that 2 genes have a high identity (from 98 to 99%) with the relB2 and relB10 genes, the third antitoxin gene has a low identity (15- 30%) and is designated by us as relB11. In this regard, we constructed the RelB11BbN and RelB11BbC oligonucleotides for the species identification of B. bifidum based on the nucleotide sequence of the relB11 gene (sequence 9).
В геноме штамма В.adolescentis АТСС 15703 присутствует только 1 ген токсина mazF. Сравнительный анализ его нуклеотидной последовательности с mzzF генами показал низкую идентичность с подобными генами штаммов В.longum, В.animalis subsp. lactis, В.bifidum и В.breve. В связи с этим, для проведения идентификации бифидобактерий, относящихся к виду В.adolescentis, нами были сконструированы олигонуклеотиды MazBaN и MazBaC на основе последовательности гена токсина mazF (последовательность 10).Only 1 mazF toxin gene is present in the genome of B. adolescentis
Аналогично можно разработать олигонуклеотиды для идентификации других видов бифидобактерий - В.animalis subsp. lactis и В.breve.Similarly, oligonucleotides can be developed to identify other types of bifidobacteria - B. animalis subsp. lactis and B. breve.
Таким образом:In this way:
1) Метод идентификации бифидобактерий по настоящему изобретению основан на комбинации и полиморфизме генов токсин-антитоксин систем RelBE и MazEF.1) The method of identification of bifidobacteria of the present invention is based on the combination and polymorphism of the toxin-antitoxin gene systems RelBE and MazEF.
2) Предлагаемый метод предусматривает проведение амплификации с геномной ДНК с использованием предлагаемого набора пар олигонуклеотидов для видовой и штаммовой идентификации бифидобактерий группы В.longum.2) The proposed method involves amplification with genomic DNA using the proposed set of pairs of oligonucleotides for species and strain identification of bifidobacteria of the B. longum group.
3) Предлагаемый метод может быть использован и для видовой идентификации Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium adolescentis и других видов бифидобактерий.3) The proposed method can be used for species identification of Bifidobacterium bifidum and Bifidobacterium adolescentis and other types of bifidobacteria.
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Культуру бифидобактерий выращивают на агаризованной среде MPC с 0,05% цистеина в течение 48 часов при 37°C при анаэробных условиях в анаэростате HiAnaerobicTM (Компания "HiMedia" (Индия)), после чего выделяют геномную ДНК.The bifidobacteria culture was grown on MPC agar medium with 0.05% cysteine for 48 hours at 37 ° C under anaerobic conditions in a HiAnaerobicTM anaerostat (HiMedia Company (India)), after which genomic DNA was isolated.
Культуру бифидобактерий центрифугируют при 8000 об/мин в течение 10 минут. Осадок суспендируют в 0,6 мл буфера TEST (10 mM трис HCl pH 8,0; 5 mM ЭДТА pH 8,0; 1М NaCl; 1/200 объема Тритон-X100). Осторожно перемешивают. Инкубируют при 37°C в течение 12 часов. Добавляют 150 мкл свежеприготовленного раствора лизоцима (исходная концентрация 100 мг/мл); добавляют 10 мкл раствора РНКазы (исходный раствор 10 мг/мл). Осторожно перемешивают. Инкубируют при 37°C в течение 3 часов (суспензия должна стать слегка вязкой). Добавляют 150 мкл раствора протеиназы K (исходный раствор 20 мг/мл) и 150 мкл 10% саркозила. Осторожно перемешивают. Инкубируют при 37°C в течение 24 часов до полного лизиса. Добавляют 100 мкл 25% додецилсульфата натрия, перемешивают, инкубируют при 55°C в течение 2,5 часов (суспензия должна посветлеть). К лизату клеток добавляют 1 объем фенола. Содержимое эппендорфа интенсивно, но осторожно перемешивают переворачиванием в течение 1 мин. Центрифугируют 10 мин при 12000 об/мин. Водную фазу отбирают в новый эппендорф, повторяют обработку фенолом. Водную фазу отбирают в чистый эппендорф и добавляют 1 объем хлороформа с изоамиловым спиртом. Содержимое эппендорфа перемешивают переворачиванием в течение 1 мин. Центрифугируют 5 мин при 12000 об/мин. Водную фазу переносят в чистый эппендорф, добавляют 1 мл изопропанола, перемешивают переворачиванием (появится осадок в виде тяжей). Центрифугируют в течение 1 мин при 10000 об/мин, супернатант удаляют. Осадок промывают 70% этиловым спиртом, высушивают и растворяют в 150 мкл воды.The bifidobacteria culture is centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes. The precipitate was suspended in 0.6 ml of TEST buffer (10 mM Tris HCl pH 8.0; 5 mM EDTA pH 8.0; 1M NaCl; 1/200 volume of Triton-X100). Mix gently. Incubated at 37 ° C for 12 hours. Add 150 μl of a freshly prepared lysozyme solution (initial concentration of 100 mg / ml); add 10 μl of RNase solution (stock solution 10 mg / ml). Mix gently. Incubated at 37 ° C for 3 hours (suspension should become slightly viscous). Add 150 μl of a proteinase K solution (
Амплификацию ДНК проводят с использованием набора «Амплификация» фирмы «Dialat Ltd» на приборе «Терцик» («ДНК-технология»). Состав смеси для ПЦР (на 100 мкл): 10 мкл 10×ПЦР буфера, 10 мкл смеси 2,5 mM ΣdNTPs, 4 мкл 50 mM MgCl2, 0,3 мкг геномной ДНК и 0,8 мкл фермента Taq-полимеразы. Олигонуклеотидные праймеры добавляют в концентрации 20 пмоль на 100 мкл смеси.Amplification of DNA is carried out using the Amplification kit of Dialat Ltd company on the Tertsik instrument (DNA technology). The composition of the mixture for PCR (per 100 μl): 10 μl of 10 × PCR buffer, 10 μl of a mixture of 2.5 mM ΣdNTPs, 4 μl of 50 mM MgCl 2 , 0.3 μg of genomic DNA and 0.8 μl of Taq polymerase enzyme. Oligonucleotide primers are added at a concentration of 20 pmol per 100 μl of the mixture.
Параметры ПЦР реакции: 95°C в течение 5 мин (лизис клеток и денатурация геномной ДНК); затем 30 циклов амплификации - 94°C - 1 мин (денатурация), 56°C в течение 1 мин (отжиг олигонуклеотидов), 72°C - 2 мин (достройка (элонгация) цепи); финальная элонгация фрагментов при 72°C - 10 мин, хранение при 4°C.PCR reaction parameters: 95 ° C for 5 min (cell lysis and denaturation of genomic DNA); then 30 cycles of amplification - 94 ° C - 1 min (denaturation), 56 ° C for 1 min (annealing of oligonucleotides), 72 ° C - 2 min (completion (extension) of the chain); final elongation of fragments at 72 ° C - 10 min, storage at 4 ° C.
Результаты исследования учитывают путем анализа продуктов амплификации исследуемых образцов методом электрофореза в 1% агарозном геле. В пробирки с исследуемыми образцами после завершения амплификации вносят аккуратно под масло 1/5 объема раствора 6Х DNA Loading Dye («Fermentas»), перемешивают и 8 мкл полученного образца вносят в лунки агарозного геля. Электрофорез проводят в камере для горизонтального электрофореза "SE-2" (Компания «Хеликон») с источником питания "Эльф-4" («ДНК-технология») при напряжении 120 В в течение 60 мин. Результаты электрофореза учитывают в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на трансиллюминаторе ТСР-20 МС («Vilber Lourmat», Франция). В качестве контроля размера полученного фрагмента используют ДНК маркер GeneRuler™ 100+ п.н. («Fermentas»).The results of the study are taken into account by analyzing the amplification products of the test samples by electrophoresis in 1% agarose gel. After amplification is completed, 1/5 of the volume of a 6X DNA Loading Dye solution (Fermentas) is carefully added under oil to the test sample tubes after amplification, mixed, and 8 μl of the obtained sample is added to the wells of an agarose gel. Electrophoresis is performed in a SE-2 horizontal electrophoresis chamber (Helikon Company) with an Elf-4 power source (DNA technology) at a voltage of 120 V for 60 minutes. The results of electrophoresis are taken into account in ultraviolet light with a wavelength of 254 nm on a TCP-20 MS transilluminator (Vilber Lourmat, France). As a control of the size of the obtained fragment using DNA
Примеры идентификации вида и штаммов B.longum по настоящему изобретениюExamples of identification of the species and B. longum strains of the present invention
Пример 1. Видовая идентификация филотипа В.longumExample 1. Species identification of the B. longum phylotype
Видовую идентификацию бифидобактерий проводят путем амплификации ДНК с геномной ДНК бифидобактерий при описанных выше параметрах с использованием видоспецифических олигонуклеотидов RelBN (5′TGCGAAACTGAAGAACGAGG3′) и RelBC (5′CGCGGAACTGCTTGTAGGT3′).Species identification of bifidobacteria is carried out by amplification of DNA with the genomic DNA of bifidobacteria with the above parameters using the species-specific oligonucleotides RelBN ( 5 ′ TGCGAAACTGAAGAACGAGG 3 ′ ) and RelBC ( 5 ′ CGCGGAACTGCTTGTAGGT 3 ′ ).
При амплификации с ДНК штаммов, относящихся к филотипу В.longum, должен быть наработан фрагмент размером 275 п.н.When amplifying DNA of strains belonging to the B. longum phylotype, a fragment of 275 bp should be generated.
Пример 2. Идентификация штаммов В.longumExample 2. Identification of strains of B. longum
Для штамм-специфической идентификации проводят амплификацию с геномной ДНК с использованием олигонуклеотидов, представленых в таблице 2. ПЦР-продукты анализируют в 1% агарозном геле. Размер полученного фрагмента определяют с помощью ДНК-маркера GeneRuler™ 100+ п.н. («Fermentas»).For strain-specific identification, amplification with genomic DNA is performed using the oligonucleotides shown in Table 2. The PCR products are analyzed on a 1% agarose gel. The size of the obtained fragment is determined using the GeneRuler
Исследуемый штамм идентичен штамму В.longum subsp. infantis АТСС 15697 в случае наработки фрагментов при использовании олигонуклеотидов ReB1N-ReB1C (штамм-специфические), ReB2N-ReB2C и http://ReB3.lN-ReB3.2C. При использовании остальных олигонуклеотидов не должно быть ПЦР-продуктов.The studied strain is identical to the strain of B. longum subsp.
Исследуемый штамм идентичен штамму В.longum subsp. infantis АТСС 55813 в случае наличия ПЦР-продуктов только при использовании олигонуклеотидов ReB3.1N-ReB3.1C и ReB9.1N-ReB9.1C.The studied strain is identical to the strain of B. longum subsp.
Исследуемый штамм идентичен штамму B.longum subsp. infantis CCUG 52486 в случае наличия ПЦР-продуктов только при использовании олигонуклеотидов ReB3.1N-ReB3.1C, http://ReB3.4N-ReB3.4C и ReB9.1N-ReB9.2C.The studied strain is identical to the strain B.longum subsp.
Исследуемый штамм идентичен штамму В.longum DJO10A в случае наличия ПЦР-продуктов только при использовании олигонуклеотидов http://ReB3.lN-ReB3.lC.The studied strain is identical to the strain of B. longum DJO10A in the case of the presence of PCR products only when using oligonucleotides http://ReB3.lN-ReB3.lC.
Исследуемый штамм идентичен штамму Bifidobacterium sp. (B.longum) 12_1_47BFAA в случае наличия ПЦР-продуктов только при использовании олигонуклеотидов http://ReB3.lN-ReB3.lC и ReB4N-ReB4C.The studied strain is identical to the strain of Bifidobacterium sp. (B.longum) 12_1_47BFAA in the case of PCR products only when using the oligonucleotides http://ReB3.lN-ReB3.lC and ReB4N-ReB4C.
Исследуемый штамм идентичен штамму В.longum subsp. longum F8 в случае наличия ПЦР-продуктов только при использовании олигонуклеотидов ReB2N-ReB2C и ReB3.3N-ReBC.The studied strain is identical to the strain of B. longum subsp. longum F8 in the presence of PCR products only when using the oligonucleotides ReB2N-ReB2C and ReB3.3N-ReBC.
Исследуемый штамм идентичен штамму В.longum NCC2705 в случае наличия ПЦР-продуктов только при использовании олигонуклеотидов http://ReB3.lN-ReB3.2C.The studied strain is identical to B. longum strain NCC2705 in the case of PCR products only when using oligonucleotides http: //ReB3.lN-ReB3.2C.
Исследуемый штамм идентичен штамму В.longum subsp. longum JDM301 в случае амплификации фрагментов только при использовании олигонуклеотидов ReB8N-ReB8C (штамм-специфические), ReB2N-ReB2C и http://ReB3.lN-ReB3.lC.The studied strain is identical to the strain of B. longum subsp. longum JDM301 in the case of amplification of fragments only when using oligonucleotides ReB8N-ReB8C (strain-specific), ReB2N-ReB2C and http://ReB3.lN-ReB3.lC.
Исследуемый штамм идентичен штамму В.longum subsp. longum BBMN68 в случае наличия ПЦР-продуктов только при использовании олигонуклеотидов http://ReB3.lN-ReB3.lCи http://ReB3.4N-ReB3.4C.The studied strain is identical to the strain of B. longum subsp. longum BBMN68 in the case of PCR products only when using oligonucleotides http: //ReB3.lN-ReB3.lC and http: //ReB3.4N-ReB3.4C.
Исследуемый штамм идентичен штамму В.longum subsp. infantis 157F в случае наличия ПЦР-продуктов только при использовании олигонуклеотидов http://ReB3.lN-ReB3.lC, ReB4N-ReB4C и ReB5N-ReB5C.The studied strain is identical to the strain of B. longum subsp.
Исследуемый штамм идентичен штамму B.longum subsp. longum JCM1217 в случае наличия ПЦР-продуктов только при использовании олигонуклеотидов http://ReB3.lN-ReB3.lCи http://ReB3.5N-ReB3.4C.The studied strain is identical to the strain B.longum subsp. longum JCM1217 in the case of PCR products only when using oligonucleotides http: //ReB3.lN-ReB3.lC and http: //ReB3.5N-ReB3.4C.
Исследуемый штамм идентичен штамму В.longum subsp. longum КАСС 91563 в случае наличия ПЦР-продуктов только при использовании олигонуклеотидов ReB10N-ReB10C и ReB3.1N-ReB3.4C.The studied strain is identical to the strain of B. longum subsp.
Пример 3. Идентификация видов Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium adolescentisExample 3. Identification of the species Bifidobacterium bifidum and Bifidobacterium adolescentis
Идентификацию бифидобактерий, относящихся к виду B.bifidum, проводят путем амплификации с геномной ДНК бифидобактерий при описанных выше параметрах с использованием олигонуклеотидов RelB11BbN (5′ATGGCGAGCATACCCAC3′) и RelB11BbC (5′ATCTGCCATTCGACGTTTCCTT3′).Identification of bifidobacteria relating to the form B.bifidum, is carried out by amplification with genomic DNA of bifidobacteria at the above-described parameters using RelB11BbN oligonucleotides (5 'ATGGCGAGCATACCCAC 3') and RelB11BbC (5 'ATCTGCCATTCGACGTTTCCTT 3').
При амплификации с ДНК штаммов, относящихся к виду B.bifidum, должен быть наработан фрагмент размером 178 п.н.During amplification with DNA of strains belonging to the species B. bifidum, a fragment of 178 bp should be generated.
Идентификацию бифидобактерий В.adolescentis проводят путем амплификации с геномной ДНК бифидобактерий при описанных выше параметрах с использованием олигонуклеотидов MazBaN (5′GTGAGATCTGGACTGTGCT3′) и MazBaC (5′CTGGCGCATGACATCATCT3′).The identification of B. adolescentis bifidobacteria is carried out by amplification with the bifidobacteria genomic DNA using the above parameters using the MazBaN oligonucleotides ( 5 ′ GTGAGATCTGGACTGTGCT 3 ′ ) and MazBaC ( 5 ′ CTGGCGCATGACATCATCT 3 ′ ).
При амплификации с ДНК штаммов, относящихся к виду В.adolescentis, должен быть наработан фрагмент размером 277 п.н.When amplifying DNA of strains belonging to the species B. adolescentis, a fragment of 277 bp should be generated.
Пример 4. Идентификация штаммов бифидобактерий из российской коллекцииExample 4. Identification of strains of bifidobacteria from the Russian collection
С использованием сконструированных праймеров для генов систем токсин-антитоксин mazEF и relBE проведена идентификация 35 штаммов бифидобактерий из коллекции лаборатории генетики микроорганизмов Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, выделенных из гастроэнтерологического тракта практически здоровых людей Центрального региона России.Using the designed primers for mazEF and relBE toxin-antitoxin system genes, 35 strains of bifidobacteria were identified from the collection of the Laboratory of Microorganism Genetics of the Institute of General Genetics named after N.I. Vavilov RAS, isolated from the gastroenterological tract of practically healthy people in the Central region of Russia.
На первом этапе была проведена видовая идентификация. Из них 23 штамма были отнесены к филотипу B.longum, 6 штаммов - к виду В.adolescentis и 6 штаммов - к виду В.bifidum.At the first stage, species identification was carried out. Of these, 23 strains were assigned to the B. longum phylotype, 6 strains to the B. adolescentis species, and 6 strains to the B. bifidum species.
На втором этапе проводили штаммовую идентификацию B.longum. Исходя из композиции генов системы relBE среди 23 штаммов B.longum не обнаружено ни одного идентичного, т.е. данный подход позволяет идентифицировать штаммовую специфичность.At the second stage, B.longum strain identification was performed. Based on the composition of the genes of the relBE system among 23 strains of B. longum, no identical ones were found, i.e. this approach allows the identification of strain specificity.
Claims (1)
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2011145069/10A RU2527069C2 (en) | 2011-11-08 | 2011-11-08 | METHOD OF SPECIES AND STRAIN IDENTIFICATION OF BIFIDOBACTERIA OF PHYLOTYPE Bifidobacterium longum |
PCT/RU2012/000836 WO2013070115A1 (en) | 2011-11-08 | 2012-10-16 | Method for identifying species and strains of bifidobacteria using genes of the type ii toxin-antitoxin systems of the mazef and reibe superfamilies |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2011145069/10A RU2527069C2 (en) | 2011-11-08 | 2011-11-08 | METHOD OF SPECIES AND STRAIN IDENTIFICATION OF BIFIDOBACTERIA OF PHYLOTYPE Bifidobacterium longum |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2011145069A RU2011145069A (en) | 2013-05-20 |
RU2527069C2 true RU2527069C2 (en) | 2014-08-27 |
Family
ID=48290365
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2011145069/10A RU2527069C2 (en) | 2011-11-08 | 2011-11-08 | METHOD OF SPECIES AND STRAIN IDENTIFICATION OF BIFIDOBACTERIA OF PHYLOTYPE Bifidobacterium longum |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2527069C2 (en) |
WO (1) | WO2013070115A1 (en) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112908410B (en) * | 2021-03-01 | 2022-08-23 | 上海欧易生物医学科技有限公司 | Detection method and system for positive selection gene based on snakekeke process |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
UA53337U (en) * | 2010-02-03 | 2010-10-11 | Государственное Предприятие «Центр Иммунобиологических Препаратов» | Method for specification of strains of bifid bacteria for making of model samples of probiotic preparations |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE69316801T2 (en) * | 1992-07-20 | 1998-05-20 | Yakult Honsha Kk | Species-specific oligonucleotides against bifidobacteria and methods of detection using the same |
EP0826778A1 (en) * | 1996-09-03 | 1998-03-04 | Peter Kaufmann | Oligonucleotide probes for the detection of bifidobacteria |
EP1227152A1 (en) * | 2001-01-30 | 2002-07-31 | Société des Produits Nestlé S.A. | Bacterial strain and genome of bifidobacterium |
JP2006081429A (en) * | 2004-09-15 | 2006-03-30 | Morinaga Milk Ind Co Ltd | Method for detecting bifidobacterium longum bb536 |
JP2008142043A (en) * | 2006-12-12 | 2008-06-26 | Kobe Univ | Method for identifying genotype by dna polymorphism of bifidobacterium longum strain |
-
2011
- 2011-11-08 RU RU2011145069/10A patent/RU2527069C2/en not_active IP Right Cessation
-
2012
- 2012-10-16 WO PCT/RU2012/000836 patent/WO2013070115A1/en active Application Filing
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
UA53337U (en) * | 2010-02-03 | 2010-10-11 | Государственное Предприятие «Центр Иммунобиологических Препаратов» | Method for specification of strains of bifid bacteria for making of model samples of probiotic preparations |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
А.А.ПРОЗОРОВА и др., Системы "токсин-антитоксин" у бактерий: инструмент апоптоза или модуляторы метаболизма?, Микробиология, 2010, т.79, N2 с.147-159. ELIZABETH P. BRICZINSKI et al., Strain-Specific Genotyping of Bifidobacterium animalis subsp. lactis by Using Single-Nucleotide Polymorphisms, Insertions, and Deletions, APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Dec. 2009, Vol. 75, No. 23, p.p. 7501–7508. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2013070115A1 (en) | 2013-05-16 |
RU2011145069A (en) | 2013-05-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Srikhanta et al. | Phasevarion mediated epigenetic gene regulation in Helicobacter pylori | |
Chenal-Francisque et al. | Optimized multilocus variable-number tandem-repeat analysis assay and its complementarity with pulsed-field gel electrophoresis and multilocus sequence typing for Listeria monocytogenes clone identification and surveillance | |
US9700586B2 (en) | Probiotic compositions and methods | |
Ventura et al. | Characterization of the groEL and groES loci in Bifidobacterium breve UCC 2003: genetic, transcriptional, and phylogenetic analyses | |
Zhao et al. | Shotgun metagenomics approach reveals the bacterial community and metabolic pathways in commercial hongeo product, a traditional Korean fermented skate product | |
Skånseng et al. | Comparison of chicken gut colonisation by the pathogens Campylobacter jejuni and Clostridium perfringens by real-time quantitative PCR | |
Song et al. | Genetic diversity and population structure of Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus isolated from naturally fermented dairy foods | |
US20240035098A1 (en) | Highly polymorphic and modular extragenic (h.p.m.e.) markers within specific taxa of microorganisms and use thereof for their differentiation, identification and quantification | |
Vandamme et al. | Phylogenetics and systematics | |
Olsen et al. | Analysis of the genetic distribution among members of Clostridium botulinum group I using a novel multilocus sequence typing (MLST) assay | |
Volokhov et al. | Genetic analysis of housekeeping genes of members of the genus Acholeplasma: phylogeny and complementary molecular markers to the 16S rRNA gene | |
Nácher-Vázquez et al. | Dextransucrase expression is concomitant with that of replication and maintenance functions of the pMN1 plasmid in Lactobacillus sakei MN1 | |
Mishra et al. | Non-contiguous finished genome sequence and description of Bacillus massilioanorexius sp. nov. | |
Zuridah et al. | Identification of lipase producing thermophilic bacteria from Malaysian hot springs | |
Ferreira et al. | Increased expression of clp genes in Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20 exposed to acid stress and bile salts | |
Guglielmetti et al. | Molecular characterization of Bifidobacterium longum biovar longum NAL8 plasmids and construction of a novel replicon screening system | |
Schmid et al. | Alternative sigma factor σ H activates competence gene expression in Lactobacillus sakei | |
Berthenet et al. | Recent “omics” advances in Helicobacter pylori | |
Singh et al. | Multilocus sequence typing of Salmonella strains by high-throughput sequencing of selectively amplified target genes | |
RU2508406C2 (en) | METHOD OF SPECIES IDENTIFICATION OF L.casei/paracasei, L.fermentum, L.plantarum AND L.rhamnosus | |
RU2527069C2 (en) | METHOD OF SPECIES AND STRAIN IDENTIFICATION OF BIFIDOBACTERIA OF PHYLOTYPE Bifidobacterium longum | |
Mishra et al. | Non-contiguous finished genome sequence and description of Nosocomiicoccus massiliensis sp. nov. | |
Berthoud et al. | Comparison of partial gene sequences encoding a phosphoketolase for the identification of bifidobacteria | |
Hassan et al. | Molecular identification of Arcanobacterium bialowiezense and Arcanobacterium bonasi based on 16S–23S rRNA intergenic spacer region sequences | |
Badr et al. | Isolation and molecular identification of two novel cyanobacterial isolates obtained from a stressed aquatic system |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20201109 |