RU2526125C1 - METHOD OF DETERMINING ANTI-OXIDANT ACTIVITY OF ESSENTIAL OIL OF VEGETABLE ORIGIN in vitro - Google Patents
METHOD OF DETERMINING ANTI-OXIDANT ACTIVITY OF ESSENTIAL OIL OF VEGETABLE ORIGIN in vitro Download PDFInfo
- Publication number
- RU2526125C1 RU2526125C1 RU2013137874/15A RU2013137874A RU2526125C1 RU 2526125 C1 RU2526125 C1 RU 2526125C1 RU 2013137874/15 A RU2013137874/15 A RU 2013137874/15A RU 2013137874 A RU2013137874 A RU 2013137874A RU 2526125 C1 RU2526125 C1 RU 2526125C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- essential oil
- vitro
- rate
- reaction
- activity
- Prior art date
Links
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине и может быть использовано, в частности, в фармакологии.The invention relates to medicine and can be used, in particular, in pharmacology.
Совершенствование и создание новых методов экспериментальной оценки фармакологических веществ, а также новые источники получения потенциальных лекарственных средств, значительно расширяют принципиальные возможности фармакотерапии основных заболеваний человека.The improvement and creation of new methods for the experimental evaluation of pharmacological substances, as well as new sources of potential medicines, significantly expand the fundamental possibilities of pharmacotherapy of major human diseases.
Эфирные масла - это вещества сложного химического состава, широко использующиеся в производстве косметических товаров, средств гигиены и медицинских препаратов, что обусловлено наличием в них биологически активных компонентов. Например, противокашлевое действие эфирного масла багульника болотного связано с содержанием в эфирном масле сесквитерпенового спирта ледола.Essential oils are substances of complex chemical composition that are widely used in the manufacture of cosmetic products, hygiene products and medical preparations, due to the presence of biologically active components in them. For example, the antitussive effect of marsh rosemary essential oil is associated with the content of ice sesquiterpene alcohol in the essential oil.
Компонентный состав является важнейшей характеристикой эфирного масла и определяет все его полезные свойства антифунгальные, гипотензивные, цитотоксические, противовоспалительные, противомикробные, рострегулирующие, инсектицидные.The component composition is the most important characteristic of essential oil and determines all of its useful properties antifungal, hypotensive, cytotoxic, anti-inflammatory, antimicrobial, growth-regulating, insecticidal.
В литературе редко встречается совместное описание состава эфирного масла и его биологического действия, упоминается эфирное масло как таковое и идет речь о его биологических свойствах, при этом полностью отсутствуют данные о химическом составе того образца, с которым проводились те или иные испытания [Белоусова Н.И. Химический состав эфирного масла багульников / Белоусова Н.И., Хан В.А., Ткачев А.В. // Химия растительного сырья. - 1999. - №3. - С.5-38]. Между тем выявление биологической активности эфирных масел, в том числе, выделенного из древесной зелени пихты (Abies Sibirica), осуществимо лишь при условии детального изучения химического состава и его влияния на фармакологическую активность на этапе экспериментальных исследований.In the literature, a joint description of the composition of the essential oil and its biological effect is rarely found, the essential oil is mentioned as such and its biological properties are mentioned, while there is completely no data on the chemical composition of the sample with which certain tests were carried out [N. Belousova . The chemical composition of essential oils of Ledum / Belousova N.I., Khan V.A., Tkachev A.V. // Chemistry of plant materials. - 1999. - No. 3. - S.5-38]. Meanwhile, the identification of the biological activity of essential oils, including that extracted from woody green fir (Abies Sibirica), is feasible only if the chemical composition and its influence on the pharmacological activity are studied in detail at the stage of experimental studies.
Пихта сибирская является одним из самых распространенных эфироносов в России, при переработке хвои которой можно получить высококачественное эфирное масло, способное влиять на концентрации легких отрицательных ионов, благоприятно действующих на человека, и выполняющее функцию по "обеспечению" атмосферного воздуха биологически активным кислородом.Siberian fir is one of the most common etheronos in Russia. When processing needles, it is possible to obtain high-quality essential oil that can affect the concentration of light negative ions that have a beneficial effect on humans and performs the function of “providing” atmospheric air with biologically active oxygen.
В настоящее время имеются способы исследования определения биологических свойств эфирных масел, в том числе с использованием микроорганизмов.Currently, there are research methods for determining the biological properties of essential oils, including the use of microorganisms.
Известен стандартный микробиологический метод хемолюминесценции, позволяющий выявлять вещества, обладающие антиоксидантной активностью, с помощью тест-объекта, в качестве которого используют перитонеальные макрофаги [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, Минздрав РФ, 2000 г.].The standard microbiological method of chemoluminescence is known, which allows the detection of substances with antioxidant activity using a test object, which is used as peritoneal macrophages [Manual on experimental (preclinical) study of new pharmacological substances, Ministry of Health of the Russian Federation, 2000].
Известен способ определения антиоксидантной активности (пат. РФ №2144674) супероксиддисмутазы и химических соединений путем оценки их способности ингибировать скорость реакции аутоокисления адреналина в щелочной среде, которую оценивали спектрофотометрически по величине оптической плотности продукта аутоокисления адреналина, образующегося в отсутствии и присутствии исследуемых препаратов. Антиоксидантную активность определяют по накоплению продукта аутоокисления адреналина, поглощающего при длине волны 347 нм (волновое число 28,8). Добавляют адреналин, используя готовую аптечную форму 0,1% раствора адреналин гидрохлорида pH среды, в которой проводят реакцию, составляет не менее 10,65 ед. Реакцию проводят при любой комнатной температуре, но не ниже 15°C. Опытным путем было установлено, что коммерческий препарат СОД, гемолизат эритроцитов, известные антиоксиданты (аскорбат, цистеин) способны ингибировать процесс накопления этого соединения, что позволяет использовать этот способ измерения как тест-систему для экспресс оценки антиоксидантных свойств различных препаратов и химических соединений. Существенным преимуществом предлагаемого подхода является возможность использования легкодоступных, недорогих химических реактивов: 0,1% аптечного раствора гидрохлорид адреналина и 0,2 М карбонатного буфера, pH 10,65.A known method for determining the antioxidant activity (US Pat. RF No. 2144674) of superoxide dismutase and chemical compounds by assessing their ability to inhibit the rate of auto-oxidation of adrenaline in an alkaline medium, which was evaluated spectrophotometrically by the optical density of the product of auto-oxidation of adrenaline, formed in the absence and presence of the studied drugs. Antioxidant activity is determined by the accumulation of the product of the autooxidation of adrenaline, absorbing at a wavelength of 347 nm (wave number 28.8). Adrenaline is added using the finished pharmacy form of a 0.1% solution of adrenaline hydrochloride. The pH of the medium in which the reaction is carried out is at least 10.65 units. The reaction is carried out at any room temperature, but not lower than 15 ° C. It was experimentally established that the commercial drug SOD, erythrocyte hemolysate, and well-known antioxidants (ascorbate, cysteine) are able to inhibit the accumulation of this compound, which allows the use of this measurement method as a test system for the rapid assessment of the antioxidant properties of various drugs and chemical compounds. A significant advantage of the proposed approach is the possibility of using readily available, inexpensive chemicals: 0.1% pharmacy solution of adrenaline hydrochloride and 0.2 M carbonate buffer, pH 10.65.
Исследование биологической активности БАВ из экстрактов растительного сырья описано в пат. РФ №2115425. Так, например, исследования по изучению антиоксидантной активности БАВ проводилось на нейтрофилах крови. Индуцировался зимозаном процесс кислородного взрыва и исследовался процесс его ингибирования исследуемым препаратом. Препараты, ингибирующие индуцированный кислородный взрыв, по литературным данным, обладают антиоксидантной и противовоспалительной активностью. Исследование проводилось на цельной крови донора. Гепаринизированная кровь, полученная из локтевой вены, в количестве 0,1 мл добавлялась в анализатор хемолюминометра, затем добавлялось по 0,1 мл растворов люминола и зимозана (для индуцированного кислородного взрыва в нейтрофилах крови). В клетках крови нарастал кислородный взрыв, что регистрировалось по увеличению хемолюминесценции. На пике кислородного взрыва в анализатор вводился препарат в конечной концентрации 0,5% и замерялось изменение люминесценции. Контролем служила кровь, к которой не добавлялся препарат. В результате было установлено, что БАВ достоверно ингибирует в клетках крови активные формы кислорода, участвующие в воспалительных реакциях в организме. Фоновая люминесценция сыворотки крови и препарата ничтожно мала и не влияет на полученный результат. Так как растительный экстракт БАВ достоверно ингибирует индуцированный зимозаном кислородный взрыв, его можно отнести к группе препаратов, обладающих антиоксидантной, противовоспалительной активностью, и он может быть использован в качестве профилактического средства при воздействии повышенных температур.A study of the biological activity of biologically active substances from extracts of plant materials is described in US Pat. RF №2115425. For example, studies on the antioxidant activity of biologically active substances were carried out on blood neutrophils. The oxygen explosion process was induced by zymosan and the process of its inhibition by the studied drug was studied. According to published data, drugs that inhibit an induced oxygen explosion have antioxidant and anti-inflammatory activity. The study was conducted on whole blood from a donor. 0.1 ml heparinized blood obtained from the ulnar vein was added to the chemoluminometer analyzer, then 0.1 ml of luminol and zymosan solutions were added (for an induced oxygen explosion in blood neutrophils). An oxygen explosion increased in blood cells, which was recorded by an increase in chemoluminescence. At the peak of the oxygen explosion, the drug was injected into the analyzer at a final concentration of 0.5% and the change in luminescence was measured. The control was blood, to which the drug was not added. As a result, it was found that BAS significantly inhibits the active forms of oxygen in blood cells that are involved in inflammatory reactions in the body. Background luminescence of blood serum and the drug is negligible and does not affect the result. Since the plant extract of biologically active substances reliably inhibits zymosan-induced oxygen explosion, it can be attributed to a group of drugs with antioxidant, anti-inflammatory activity, and it can be used as a prophylactic when exposed to elevated temperatures.
Недостатком этих способов выявления веществ, обладающих антиоксидантной активностью, является большая трудоемкость и необходимость постоянного контроля за сохранностью и чистотой стандартных тест-объектов, что значительно увеличивает экономические и временные затраты на первичный скрининг.The disadvantage of these methods for detecting substances with antioxidant activity is the great complexity and the need for constant monitoring of the safety and purity of standard test objects, which significantly increases the economic and time costs of primary screening.
Наиболее близким способом к заявляемому относится известный способ выявления веществ (пат. РФ №2181892), обладающих антиоксидантными свойствами, in vitro, заключающийся в использовании тест-объектов. В качестве тест-объекта используют ферменты глутатионредуктазу (ГР) и один из антиоксидантных ферментов супероксиддисмутаза (СОД), глутатионпероксидаза (ГП) и каталаза (КАТ), определяют скорость ферментативной реакции веществ на тест-объектах, при этом соотношение скорости ферментативной реакции на тест-объекте после добавления вещества и скорости ферментативной реакции до добавления вещества должно быть больше 1.The closest way to the claimed relates to a known method for identifying substances (US Pat. RF No. 2181892) with antioxidant properties, in vitro, which consists in the use of test objects. As a test object, the enzymes glutathione reductase (GR) and one of the antioxidant enzymes superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GP) and catalase (CAT) are used, the rate of the enzymatic reaction of substances on the test objects is determined, and the ratio of the rate of the enzymatic reaction to the test after adding a substance and the speed of the enzymatic reaction before adding a substance must be greater than 1.
Так как эфирные масла - это вещества сложного химического состава, то недостатком прототипа является невозможность определения биологической активности эфирного масла пихты сибирской, в том числе антиоксидантной активности.Since essential oils are substances of complex chemical composition, the disadvantage of the prototype is the inability to determine the biological activity of the essential oil of Siberian fir, including antioxidant activity.
Выявление биологической активности эфирных масел должно сопровождаться детальным исследованием химического состава, изучением биологической активности отдельных фракций эфирного масла.The identification of the biological activity of essential oils should be accompanied by a detailed study of the chemical composition, the study of the biological activity of individual fractions of the essential oil.
Использование высокочувствительных ферментных тест-систем in vitro позволяет определять не только антиоксидантную активность эфирного масла в целом, но и фракций, отобранных в процессе отгонки, что позволяет контролировать наличие биологической активности в многокомпонентных эфирных маслах растительного происхождения, в том числе их фракций, т.к. не всегда известно сочетанное действие компонентов и направленность их биологического действия.The use of highly sensitive enzyme test systems in vitro allows us to determine not only the antioxidant activity of the essential oil in general, but also the fractions selected during the distillation process, which allows us to control the presence of biological activity in multicomponent essential oils of plant origin, including their fractions, because . the combined action of the components and the orientation of their biological action are not always known.
Целью данного изобретения является повышение точности определения антиоксидантной активности эфирного масла растительного происхождения с помощью тест-объектов, таких как ГР и КАТ.The aim of this invention is to improve the accuracy of determining the antioxidant activity of essential oils of plant origin using test objects such as GR and CAT.
Поставленная цель достигается за счет использования способа определения антиоксидантной активности эфирного масла растительного происхождения in vitro, заключающийся в использовании в качестве тест-объектов ферментов ГР и КАТ для определения антиоксидантной активности по соотношению скорости ферментативной реакции на тест-объекте после добавления вещества и скорости ферментативной реакции до добавления вещества, которое должно быть больше 1, при этом предварительно перед добавлением в инкубационную среду образцы эфирного масла разводят диметилсульфоксидом в соотношении 1:1.This goal is achieved through the use of a method for determining the antioxidant activity of essential oils of plant origin in vitro, which consists in the use of enzymes GR and CAT as test objects to determine antioxidant activity by the ratio of the rate of the enzymatic reaction on the test object after adding the substance and the speed of the enzymatic reaction to addition of a substance that should be greater than 1, while previously before adding to the incubation medium, samples of essential oil dimethyl sulfoxide in a ratio of 1: 1.
Предлагаемый способ позволяет определить биологическую активность таких химически сложных смесей, как эфирные масла растительного происхождения in vitro.The proposed method allows to determine the biological activity of such chemically complex mixtures, such as in vitro essential oils of plant origin.
В доступных источниках научно-технической и патентной информации не выявлены сведения об определении биологической активности эфирного масла растительного происхождения с помощью тест систем in vitro. Поэтому предлагаемое техническое решение способа обладает новизной и соответствует критерию патентоспособности "изобретательский уровень".Available sources of scientific, technical and patent information did not reveal information on the determination of the biological activity of essential oils of plant origin using in vitro test systems. Therefore, the proposed technical solution of the method has a novelty and meets the patentability criterion of "inventive step".
Способ определения биологической активности эфирного масла растительного происхождения в соответствии с изобретением осуществляется на примере эфирного масла пихты сибирской следующим образом.The method for determining the biological activity of essential oils of plant origin in accordance with the invention is carried out on the example of Siberian fir essential oil as follows.
Эфирное масло получали известным способом из древесной зелени пихты сибирской (Abies Sibirica) методом исчерпывающей гидропародистилляции в течение 20 часов с использованием цельнометаллической установки с насадкой Клевенджера. Разовая загрузка воздушно сухого исходного сырья составляла не менее 1,00 кг. Фракции эфирного масла отбирали в процессе получения эфирного масла следующим образом: первую фракцию получали в течение 30 минут от начала выделения масла; вторую - после двух часов; третью - через четыре часа; четвертую - после 5 часов; пятую - через восемь часов.Essential oil was obtained in a known manner from woody green Siberian fir (Abies Sibirica) by exhaustive steam distillation for 20 hours using an all-metal plant with a Clevenger nozzle. A single charge of air-dry feedstock was at least 1.00 kg. The fractions of the essential oil were selected in the process of obtaining the essential oil as follows: the first fraction was obtained within 30 minutes from the start of the isolation of the oil; the second after two hours; the third - after four hours; the fourth - after 5 hours; the fifth - in eight hours.
Состав эфирного масла в его отдельных фракциях определяли методом хроматомасс-спектрометрии на приборе Agilent Technologies 6890.The composition of the essential oil in its individual fractions was determined by chromatography-mass spectrometry on an Agilent Technologies 6890 instrument.
Биологическую активность исследуемого эфирного масла определяли с помощью молекулярных тест-систем in vitro, в которых в качестве тест-объектов использовали ферменты системы антиоксидантной защиты: ГР и КАТ [пат. РФ №2181892].The biological activity of the studied essential oil was determined using in vitro molecular test systems, in which enzymes of the antioxidant defense system were used as test objects: GR and CAT [US Pat. RF No. 2181892].
Использованы молекулярные тест-системы in vitro прототипа, в которых в качестве тест-объектов применяли ферменты системы антиоксидантной защиты: ГР и КАТ. Эти ферменты играют ключевую роль в обеспечении регуляции свободно радикального окисления клетки и могут служить мишенью для лекарственных средств. Ингибирование ферментов антиоксидантной защиты способствует накоплению радикалов в патогенной клетке, что вызывает пероксидацию белков и нуклеиновых кислот и приводит к остановке роста и гибели клетки, поэтому способность активировать КАТ и ГР связано с наличием антиоксидантных свойств изучаемого эфирного масла, в том числе и пихты сибирской.Molecular test systems of the in vitro prototype were used, in which enzymes of the antioxidant defense system: GR and CAT were used as test objects. These enzymes play a key role in regulating the free radical oxidation of cells and can serve as targets for drugs. Inhibition of antioxidant enzymes promotes the accumulation of radicals in a pathogenic cell, which causes peroxidation of proteins and nucleic acids and leads to a halt in cell growth and death, therefore, the ability to activate CAT and GR is associated with the antioxidant properties of the studied essential oil, including Siberian fir.
Каталитическую активность каталазы определяли по скорости разложения субстрата - перекиси водорода (H2O2). В состав реакционной смеси входил фосфатный буфер (pH 7,8), H2O2 в концентрации - 0,03%, концентрация фермента составляла 0,2 мкг/мл. Продолжительность реакции разложения субстрата (H2O2) ферментом 5-10 мин. Реакцию останавливали добавлением в реакционную смесь аммонния молибденовокислого ((NH4)6Mo7O24·4H2O). Оставшуюся перекись водорода измеряли в виде комплекса с (NH4)6Mo7O24·4H2O на спектрофотометре Shimadzu MPS-2000 при λ=410 нм.The catalytic activity of catalase was determined by the rate of decomposition of the substrate - hydrogen peroxide (H 2 O 2 ). The composition of the reaction mixture included phosphate buffer (pH 7.8), H 2 O 2 at a concentration of 0.03%, the concentration of the enzyme was 0.2 μg / ml. The duration of the decomposition reaction of the substrate (H 2 O 2 ) by the enzyme is 5-10 minutes. The reaction was stopped by adding to the reaction mixture of ammonium molybdenum ((NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 · 4H 2 O). The remaining hydrogen peroxide was measured as a complex with (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 · 4H 2 O on a Shimadzu MPS-2000 spectrophotometer at λ = 410 nm.
Скорость глутатионредуктазной реакции (ГР) определяли в кварцевых кюветах при спектрофотометрической регистрации убыли НАДФН при λ=340 нм. Инкубационная среда состояла из буфера 0,05М трис-(оксиметил)-аминометан - HCl, содержащего 0,25 mM ЭДТА -Na, pH - 7,4 и 0,033М глутатиона окисленного (Г-SS-Г). Реакцию запускали добавлением 2 mM НАДФН. Продолжительность записи реакции - 1-1,5 мин.The rate of glutathione reductase reaction (GR) was determined in quartz cuvettes with spectrophotometric recording of NADPH loss at λ = 340 nm. The incubation medium consisted of a buffer of 0.05 M Tris- (oxymethyl) -aminomethane-HCl containing 0.25 mM EDTA-Na, pH 7.4 and 0.033 M oxidized glutathione (G-SS-G). The reaction was started by the addition of 2 mM NADPH. The duration of the reaction recording is 1-1.5 minutes.
Для эффективного определения биологической активности эфирного масла необходимо провести пробоподготовку. Для улучшения смешиваемости эфирного масла с компонентами инкубационной пробы, эфирное масло разводили в диметилсульфоксиде (ДМСО) перед добавлением в инкубационную среду. Как выяснилось в результате эксперимента, ДМСО в наименьшей степени оказывает влияние на указанные ферменты, что позволяет более точно проводить анализ. Количество ДМСО при разведении эфирного масла, позволяющего в полной мере выявлять биологическую активность эфирного масла определено в соотношении 1:1, что в пробе соответствует количеству - 10 мкл/мл. Также были проведены опыты с использованием спирта и ПАВа в качестве разбавителя тест-объектов. Но при этом выбранные разбавители оказывали влияние на указанные ферменты, что не позволяло объективно определить их биологическую активность.To effectively determine the biological activity of essential oil, sample preparation is necessary. To improve the miscibility of the essential oil with the components of the incubation sample, the essential oil was diluted in dimethyl sulfoxide (DMSO) before being added to the incubation medium. As it turned out as a result of the experiment, DMSO has the least effect on these enzymes, which allows more accurate analysis. The amount of DMSO in the dilution of essential oil, which allows fully detecting the biological activity of essential oil, is determined in a ratio of 1: 1, which in the sample corresponds to the amount of 10 μl / ml. Also, experiments were conducted using alcohol and surfactant as a diluent for test objects. But at the same time, the chosen diluents influenced these enzymes, which did not allow to objectively determine their biological activity.
Сопоставляя полученные данные отобранных фракций эфирного масла и изменения антиоксидантной активности, характеризующиеся скоростями реакции ферментов КАТ, ГР, можно определить влияние химического состава на фармакологическое действие эфирного масла не только пихты сибирской, но и других эфирных масел.Comparing the obtained data of the selected fractions of essential oil and changes in antioxidant activity, characterized by the reaction rates of the enzymes CAT, GR, we can determine the effect of the chemical composition on the pharmacological effect of the essential oil of not only Siberian fir, but also other essential oils.
В работе использовали лиофилизированные препараты ферментов - ГР, КАТ.In the work we used lyophilized preparations of enzymes - GR, CAT.
Ниже приведены примеры с использованием эфирного масла пихты сибирской.The following are examples using Siberian fir essential oil.
Пример 1. Каталитическая активность каталазы (КАТ)Example 1. Catalytic activity of catalase (CAT)
Каталитическую активность каталазы определяли по скорости разложения субстрата - перекиси водорода (H2O2) ферментом КАТ в реакционной смеси. Реакционная смесь состояла из фермента, растворенного в фосфатном буфере (pH 7,8), концентрация которого составляла 0,2 мкл/мл., субстрата (H2O2) в концентрации - 0,03% и исследуемого эфирного масла - 10 мкл/мл. При этом для улучшения смешиваемости эфирного масла с компонентами инкубационной пробы, эфирное масло разводили растворителем перед добавлением в инкубационную среду. В качестве растворителя использовали ДМСО (диметилсульфоксид), который в наименьшей степени оказывает влияние на фермент, что позволяет более точно проводить анализ. Количество ДМСО при разведении эфирного масла, позволяющего в полной мере выявлять биологическую активность, определено в соотношении 1:1, что в пробе соответствует количеству - 10 мкл/мл. Продолжительность реакции разложения субстрата ферментом (H2O2) 5-10 мин.The catalytic activity of catalase was determined by the rate of decomposition of the substrate - hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) by the enzyme KAT in the reaction mixture. The reaction mixture consisted of an enzyme dissolved in phosphate buffer (pH 7.8), the concentration of which was 0.2 μl / ml., Substrate (H 2 O 2 ) at a concentration of 0.03% and the investigated essential oil 10 μl / ml In order to improve the miscibility of the essential oil with the components of the incubation sample, the essential oil was diluted with a solvent before being added to the incubation medium. DMSO (dimethyl sulfoxide) was used as a solvent, which has the least effect on the enzyme, which allows more accurate analysis. The amount of DMSO in the dilution of essential oil, which allows to fully detect biological activity, is determined in a ratio of 1: 1, which in the sample corresponds to the amount of 10 μl / ml. The duration of the decomposition of the substrate by the enzyme (H 2 O 2 ) 5-10 minutes
Реакцию останавливали путем добавления в реакционную смесь аммонния молибденовокислого ((NH4)6Mo7O24·4H2O). Оставшуюся после реакции разложения ферментом КАТ перекись водорода измеряли в виде комплекса с (NH4)6Mo7O24·4H2O путем определения оптической плотности на спектрофотометре при λ=410 нм (опыт). Расчет скорости каталазной реакции (КАТ) осуществлялся по следующей формуле:The reaction was stopped by adding to the reaction mixture of ammonium molybdenum acid ((NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 · 4H 2 O). The hydrogen peroxide remaining after the decomposition by the KAT enzyme was measured as a complex with (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 · 4H 2 O by determining the optical density on a spectrophotometer at λ = 410 nm (experiment). The calculation of the rate of catalase reaction (CAT) was carried out according to the following formula:
КАТ=ΔAD(холостая-опыт)/(ε*10 мин*b)/4, где холостая - оптическая плотность пробы без добавления фермента; опыт - оптическая плотность оставшейся перекиси водорода после реакции разложения; ε - коэффициент поглощения перекиси водорода; b - концентрация фермента в реакционной смеси (мкг).CAT = ΔAD (idle experience) / (ε * 10 min * b) / 4, where idle is the optical density of the sample without the addition of the enzyme; experience - the optical density of the remaining hydrogen peroxide after the decomposition reaction; ε is the absorption coefficient of hydrogen peroxide; b is the concentration of the enzyme in the reaction mixture (μg).
Пример 2. Скорость глутатионредуктазной реакции (ГР)Example 2. The rate of glutathione reductase reaction (GR)
Скорость глутатионредуктазной реакции (ГР) определяли в кварцевых кюветах при спектрофотометрической регистрации убыли НАДФН при λ=340 нм на двулучевом спектрофотометре Shimadzu MPS-2000. Инкубационная среда состояла из буфера 0,05М трис-(оксиметил)-аминометан - HCl, содержащего 0,25 mM ЭДТА - Na, pH-7,4 и 0,033М глутатиона окисленного (Г-SS-Г). Реакцию запускали добавлением 2 mM ИАДФН и включали запись. Продолжительность записи - 1-1,5 мин. ГР реакцию записывали без добавления испытуемого вещества (контроль) и в присутствии разбавленного эфирного масла в концентрации 10 мкл/мл (опытная проба). Скорость ГР реакции рассчитывали по формулеThe rate of glutathione reductase reaction (GR) was determined in quartz cuvettes with spectrophotometric recording of NADPH loss at λ = 340 nm using a Shimadzu MPS-2000 double-beam spectrophotometer. The incubation medium consisted of a buffer of 0.05 M Tris (oxymethyl) aminomethane - HCl, containing 0.25 mM EDTA - Na, pH 7.4 and 0.033 M oxidized glutathione (G-SS-G). The reaction was started by adding 2 mM IADPH and recording was started. The recording time is 1-1.5 minutes. The GR reaction was recorded without adding the test substance (control) and in the presence of diluted essential oil at a concentration of 10 μl / ml (experimental sample). The rate of GR reaction was calculated by the formula
v=(ΔD)/(α*t*β), где v - скорость реакции, мкмоль/мин.мг белка; ΔD - измеренная убыль оптической плотности за период измерения; α - коэффициент миллимолярной экстинкции, равный 6,22 mM; β - количество фермента в пробе, мкг/мл.v = (ΔD) / (α * t * β), where v is the reaction rate, µmol / min.mg of protein; ΔD is the measured decrease in optical density over the measurement period; α is the coefficient of millimolar extinction, equal to 6.22 mM; β is the amount of enzyme in the sample, μg / ml.
В качестве растворителя также использовали ДМСО (диметилсульфоксид) в соотношении 1:1, что в пробе соответствует количеству - 10 мкл/мл.DMSO (dimethyl sulfoxide) in a ratio of 1: 1 was also used as a solvent, which corresponds to an amount of 10 μl / ml in the sample.
Скорость ферментативных реакций в % для всех анализируемых ферментов рассчитывали по соотношению скорости реакции в опытной пробе и скорости реакции в контроле.The rate of enzymatic reactions in% for all analyzed enzymes was calculated by the ratio of the reaction rate in the experimental sample and the reaction rate in the control.
При добавлении в инкубационную среду первых трех фракций эфирного масла пихты сибирской активность ферментов является наивысшей, постепенно снижаясь в 4-й и 5-й фракции. Максимально высокая скорость ферментативных реакций КАТ и ГР составляет соответственно 165,70 и 908,02% и по мере процесса отгонки эфирного масла снижается не значительно, в то время как последние отобранные фракции резко снижают активацию ферментов до 111,41% (КАТ) и 191,44% (ГР) (см. табл.1).When the first three fractions of fir essential oil of Siberian oil are added to the incubation medium, the activity of enzymes is the highest, gradually decreasing in the 4th and 5th fractions. The maximum high rate of enzymatic reactions of CAT and GR is 165.70 and 908.02%, respectively, and as the process of distillation of the essential oil is not significantly reduced, while the last selected fractions sharply reduce the activation of enzymes to 111.41% (CAT) and 191 , 44% (GR) (see table 1).
Аналогичные примеры были проведены на эфирном масле багульника болотного, сосны обыкновенной, тысячелистника. Предварительное разбавление тест-объекта в ДМСО позволило определить антиоксидантную активность исследуемых эфирных масел.Similar examples were carried out on the essential oil of marsh rosemary, Scots pine, and yarrow. Preliminary dilution of the test object in DMSO made it possible to determine the antioxidant activity of the studied essential oils.
Корреляция изменения химического состава и активности ферментов в процессе выделения эфирного масла, определяемая с помощью тест-систем in vitro, позволяет в дальнейшем при наличии значительной базы данных оптимизировать и упростить технологический процесс получения целевой биологической активности, определяя компонентный состав фракций эфирного масла и используя только дешевые и высокоэффективные ферментные тест-системы in vitro.The correlation of changes in the chemical composition and activity of enzymes in the process of extracting essential oil, determined using in vitro test systems, allows, in the future, with a significant database, to optimize and simplify the process of obtaining the target biological activity by determining the composition of essential oil fractions and using only cheap and highly effective in vitro enzyme test systems.
Таким образом, специфические ферментные биотест-системы in vitro могут быть использованы при оценке антиоксидантной активности различных эфирных масел и их отдельных фракций. Причем биотест-системы позволяют проводить сравнительную оценку биологической активности вместе с предварительным определением химического состава изучаемого объекта, что особенно важно при тестировании веществ сложного химического состава.Thus, in vitro specific enzyme biotest systems can be used to evaluate the antioxidant activity of various essential oils and their individual fractions. Moreover, biotest systems allow a comparative assessment of biological activity, together with a preliminary determination of the chemical composition of the studied object, which is especially important when testing substances of complex chemical composition.
Выводыfindings
1. Состав эфирного масла пихты сибирской изменяется в зависимости от времени выделения масла.1. The composition of the Siberian fir essential oil varies depending on the time the oil was released.
2. Показана возможность применения тест-систем in vitro для анализа биологической активности цельного эфирного масла и фракций с измененным количественным составом компонентов эфирного масла пихты сибирской.2. The possibility of using in vitro test systems for the analysis of the biological activity of whole essential oils and fractions with a changed quantitative composition of the components of Siberian fir essential oil has been shown.
3. Данный способ оценки биологически активных веществ позволяет находить новые источники получения потенциальных лекарственных средств и значительно расширять принципиальные возможности фармакотерапии основных заболеваний человека.3. This method of evaluating biologically active substances allows you to find new sources of potential medicines and significantly expand the fundamental possibilities of pharmacotherapy of major human diseases.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013137874/15A RU2526125C1 (en) | 2013-08-14 | 2013-08-14 | METHOD OF DETERMINING ANTI-OXIDANT ACTIVITY OF ESSENTIAL OIL OF VEGETABLE ORIGIN in vitro |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013137874/15A RU2526125C1 (en) | 2013-08-14 | 2013-08-14 | METHOD OF DETERMINING ANTI-OXIDANT ACTIVITY OF ESSENTIAL OIL OF VEGETABLE ORIGIN in vitro |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2526125C1 true RU2526125C1 (en) | 2014-08-20 |
Family
ID=51384752
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013137874/15A RU2526125C1 (en) | 2013-08-14 | 2013-08-14 | METHOD OF DETERMINING ANTI-OXIDANT ACTIVITY OF ESSENTIAL OIL OF VEGETABLE ORIGIN in vitro |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2526125C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112912062A (en) * | 2018-10-16 | 2021-06-04 | 株式会社爱茉莉太平洋 | Skin barrier strengthening composition containing Abies sibirica oil |
| RU2757873C2 (en) * | 2019-12-03 | 2021-10-22 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Инитиум-Фарм" | Liposomal form of abies sibirica resin for non-invasive delivery of biologically active substance of abies sibirica oleoresin to brain, which has antioxidant, cytotoxic activity against cervical cancer cells, and method for its preparation |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2157531C1 (en) * | 1999-09-13 | 2000-10-10 | Саратовский научно-исследовательский институт кардиологии при Саратовском государственном медицинском университете | Method for determining total antioxidation activity of the blood |
| RU2181892C1 (en) * | 2001-06-06 | 2002-04-27 | Научно-исследовательский и учебно-методический центр биомедицинских технологий ВИЛАР | Method for selecting substances manifesting antioxidation properties in vitro |
| RU2199749C1 (en) * | 2001-08-03 | 2003-02-27 | Научно-исследовательский институт кардиологии Томского научного центра СО РАМН | Method for determining antiradical activity of biological fluids |
| RU2465593C1 (en) * | 2011-07-06 | 2012-10-27 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кемеровская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации | Method for evaluation of antioxidant activity of microorganisms |
-
2013
- 2013-08-14 RU RU2013137874/15A patent/RU2526125C1/en active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2157531C1 (en) * | 1999-09-13 | 2000-10-10 | Саратовский научно-исследовательский институт кардиологии при Саратовском государственном медицинском университете | Method for determining total antioxidation activity of the blood |
| RU2181892C1 (en) * | 2001-06-06 | 2002-04-27 | Научно-исследовательский и учебно-методический центр биомедицинских технологий ВИЛАР | Method for selecting substances manifesting antioxidation properties in vitro |
| RU2199749C1 (en) * | 2001-08-03 | 2003-02-27 | Научно-исследовательский институт кардиологии Томского научного центра СО РАМН | Method for determining antiradical activity of biological fluids |
| RU2465593C1 (en) * | 2011-07-06 | 2012-10-27 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кемеровская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации | Method for evaluation of antioxidant activity of microorganisms |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112912062A (en) * | 2018-10-16 | 2021-06-04 | 株式会社爱茉莉太平洋 | Skin barrier strengthening composition containing Abies sibirica oil |
| RU2757873C2 (en) * | 2019-12-03 | 2021-10-22 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Инитиум-Фарм" | Liposomal form of abies sibirica resin for non-invasive delivery of biologically active substance of abies sibirica oleoresin to brain, which has antioxidant, cytotoxic activity against cervical cancer cells, and method for its preparation |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Pennycooke et al. | Relationship of cold acclimation, total phenolic content and antioxidant capacity with chilling tolerance in petunia (Petunia× hybrida) | |
| Lundqvist‐Gustafsson et al. | Activation of the granule pool of the NADPH oxidase accelerates apoptosis in human neutrophils | |
| Brewer et al. | Chemical approaches to discovery and study of sources and targets of hydrogen peroxide redox signaling through NADPH oxidase proteins | |
| Saleh et al. | Effects of anti-inflammatory drugs upon nitrate and myeloperoxidase levels in the mouse pleurisy induced by carrageenan☆ | |
| Lahnsteiner et al. | Antioxidant systems of brown trout (Salmo trutta f. fario) semen | |
| Sowndhararajan et al. | Antioxidant and free radical scavenging capacity of the underutilized legume, Vigna vexillata (L.) A. Rich | |
| Topal et al. | Evaluation of the in vitro antioxidant, antidiabetic and anticholinergic properties of rosmarinic acid from rosemary (Rosmarinus officinalis L.) | |
| Russo et al. | Ochratoxin A-induced DNA damage in human fibroblast: protective effect of cyanidin 3-O-β-D-glucoside | |
| Patruno et al. | Novel aminobenzyl-acetamidine derivative modulate the differential regulation of NOSs in LPS induced inflammatory response: role of PI3K/Akt pathway | |
| Boudiaf et al. | Thymoquinone strongly inhibits fMLF-induced neutrophil functions and exhibits anti-inflammatory properties in vivo | |
| Li et al. | Antifungal effect of nerol via transcriptome analysis and cell growth repression in sweet potato spoilage fungi Ceratocystis fimbriata | |
| Suravajjala et al. | Glycation of human erythrocyte glutathione peroxidase: effect on the physical and kinetic properties | |
| RU2526125C1 (en) | METHOD OF DETERMINING ANTI-OXIDANT ACTIVITY OF ESSENTIAL OIL OF VEGETABLE ORIGIN in vitro | |
| Saha et al. | Comparative evaluation of the medicinal activities of methanolic extract of seeds, fruit pulps and fresh juice of Syzygium cumini in vitro | |
| Rossoni-Júnior et al. | Annato extract and β-carotene modulate the production of reactive oxygen species/nitric oxide in neutrophils from diabetic rats | |
| Kazemirad et al. | Nitric oxide plays a pivotal role in cardioprotection induced by pomegranate juice against myocardial ischemia and reperfusion | |
| Mesa-Herrera et al. | A sensitive, accurate, and versatile method for the quantification of superoxide dismutase activities in biological preparations | |
| Piechowiak et al. | One-time ozone treatment improves the postharvest quality and antioxidant activity of Actinidia arguta fruit | |
| Chakraborty et al. | Induction of autophagy under nitrosative stress: A complex regulatory interplay between SIRT1 and AMPK in MCF7 cells | |
| YAPÇA et al. | The effect of agomelatine on oxidative stress induced with ischemia/reperfusion in rat ovaries | |
| Chargaff et al. | Nucleoproteins, nucleic acids, and related substances | |
| Song et al. | p97 dysfunction underlies a loss of quality control of damaged membrane proteins and promotes oxidative stress and sickling in sickle cell disease | |
| US20140004547A1 (en) | Rapid Tests for the Detection of Inhibitors of Enzymes and Human Exposure to the Same | |
| Maccaglia et al. | Differential effects of quercetin and resveratrol on Band 3 tyrosine phosphorylation signalling of red blood cells | |
| Kupaeva et al. | Current view on the assessment of antioxidant and antiradical activities: A mini review |