RU2525658C2 - NANOSCALE ENZYME BIOCATALYST FOR in vivo DETOXIFICATION OF ORGANOPHOSPHOROUS COMPOUNDS - Google Patents
NANOSCALE ENZYME BIOCATALYST FOR in vivo DETOXIFICATION OF ORGANOPHOSPHOROUS COMPOUNDS Download PDFInfo
- Publication number
- RU2525658C2 RU2525658C2 RU2012139201/10A RU2012139201A RU2525658C2 RU 2525658 C2 RU2525658 C2 RU 2525658C2 RU 2012139201/10 A RU2012139201/10 A RU 2012139201/10A RU 2012139201 A RU2012139201 A RU 2012139201A RU 2525658 C2 RU2525658 C2 RU 2525658C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- biocatalyst
- enzyme
- block copolymer
- enzymatic
- covalent
- Prior art date
Links
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к ферментным биокатализаторам в виде наноразмерных частиц, представляющих собой нековалентные полиэлектролитные комплексы, сформированные полигистидин-содержащим полипептидом с активностью органофосфатгидролазы и блок-сополимером полиэтиленгликоля с полианионом и предназначенных для детоксификации фосфорорганических соединений (ФОС) in vivo путем их гидролиза. Изобретение может быть использовано в качестве антидота для профилактики и элиминирования интоксикации, вызванной попаданием ФОС в организм человека или животных в результате чрезвычайных ситуаций (катастроф и террористических актов) или регулярного контакта с ФОС при их производстве, применении, хранении и утилизации.The invention relates to biotechnology, in particular to enzymatic biocatalysts in the form of nanosized particles, which are non-covalent polyelectrolyte complexes formed by a polyhistidine-containing polypeptide with an activity of organophosphate hydrolase and a block copolymer of polyethylene glycol with a polyanion and intended for detoxification of organophosphorus and organic phosphorus compounds ( . The invention can be used as an antidote for the prevention and elimination of intoxication caused by the release of FOS into the human or animal body as a result of emergency situations (catastrophes and terrorist acts) or regular contact with FOS during their production, use, storage and disposal.
ФОС представляют собой эфиры ортофосфорной и алкилфосфоновой кислот, а также их производных. К их числу относятся пестициды, широко применяемые в сельском, приусадебном и домашнем хозяйстве, а также ингибиторы коррозии, применяемые в теплоэнергетике, нефте- и газодобывающей промышленности, пластификаторы и стабилизаторы, используемые в строительной промышленности, в составе моющих и чистящих средств промышленного назначения, а также высокотоксичные боевые отравляющие вещества нервно-паралитического действия зоман, зарин, Vx и продукты их разложения (метилфосфоновая кислота и ее эфиры) [Kwong T.C. Organophosphate pesticides: biochemistry and clinical toxicology. // Ther. Drug. Monk., 2002, V.24(1), p.144-149; Юфит С.С. Яды вокруг нас. Вызов человечеству.// М.: Классик Стиль, 2002, 368 с.; Абрамов В.В. и др. (ред. Путилова В.Я.). Современные природоохранные технологии в электроэнергетике: Информационный сборник. // М.: Издат. дом МЭИ, 2007, 388 с.; Москвичев Ю.А., Фельдблюм В.Ш. Химия в нашей жизни (продукты органического синтеза и их применение). // Изд-во ЯГТУ, 2007, Ярославль, с.244-250].FOS are esters of orthophosphoric and alkylphosphonic acids, as well as their derivatives. These include pesticides that are widely used in agriculture, home gardens and households, as well as corrosion inhibitors used in the power industry, oil and gas production, plasticizers and stabilizers used in the construction industry, as part of detergents and cleaning products for industrial use, and also highly toxic chemical warfare agents of the nerve agent soman, sarin, Vx and their decomposition products (methylphosphonic acid and its esters) [Kwong TC Organophosphate pesticides: biochemistry and clinical toxicology. // Ther. Drug. Monk., 2002, V.24 (1), p. 144-149; Yufit S.S. Poisons around us. A challenge to humanity.// M .: Classic Style, 2002, 368 p .; Abramov V.V. and others (ed. Putilov V.Ya.). Modern environmental technologies in the electric power industry: Information collection. // M.: Publ. house MPEI, 2007, 388 p .; Moskvichev Yu.A., Feldblyum V.Sh. Chemistry in our lives (products of organic synthesis and their application). // Publishing house of YSTU, 2007, Yaroslavl, p. 244-250].
Ежегодное производство, хранение и применение ФОС в объеме сотен тысяч тонн [Gold, R.S., Wales, M.E., Grimsly, J.K., Green solution for chemical problems. // Disarm. Technol., 2000, V.23, p.263-286] для нужд сельского хозяйства, а также низкие скорости разложения ФОС в условиях окружающей среды приводят к накоплению и обнаружению этих веществ первоначально в почве. Далее происходит попадание ФОС в грунтовые и речные воды, продукты питания, табачные и хлопчатобумажные изделия, домашнюю пыль [Obendorf, S.K., Lemley, A.T., Hedge, A., Kline, A.A., Tan, К., Dokuchaeva, Т., Distribution of pesticide residues within homes in central New York state. // Arch. Environ. Contam. Toxicol., 2006, V.50(1), p.31-44; Lemley, A., Hedge, A., Obendorf, S.K., Hong, S., Kim, J., Muss, T.M., Varner, C.J., Selected pesticide residues in house dust from farmers homes in central New York state. // Bull. Environ. Contamin. Toxicol., 2002, V.69(2), p.155-163]. Проникновение ФОС в организм животных и в том числе человека может происходить не только вместе с водой и продуктами питания (перорально), но и ингаляторно - при дыхании, а также трансдермально при непосредственном контакте с ними. ФОС оказывают на организм человека нейротоксичное воздействие, которое в зависимости от концентрации ФОС может быть острым или отдаленным. Также ФОС являются мутагенами, вызывающими хромосомную аберрацию, при этом негативный эффект, как правило, носит кумулятивный характер.The annual production, storage and use of FOS in the amount of hundreds of thousands of tons [Gold, R.S., Wales, M.E., Grimsly, J.K., Green solution for chemical problems. // Disarm. Technol., 2000, V.23, p.263-286] for agricultural needs, as well as low FOS decomposition rates in environmental conditions lead to the accumulation and detection of these substances initially in the soil. Then FOS enters groundwater and river water, food, tobacco and cotton products, household dust [Obendorf, SK, Lemley, AT, Hedge, A., Kline, AA, Tan, K., Dokuchaeva, T., Distribution of pesticide residues within homes in central New York state. // Arch. Environ. Contam. Toxicol., 2006, V.50 (1), p.31-44; Lemley, A., Hedge, A., Obendorf, S.K., Hong, S., Kim, J., Muss, T.M., Varner, C.J., Selected pesticide residues in house dust from farmers homes in central New York state. // Bull. Environ. Contamin. Toxicol., 2002, V.69 (2), p. 155-163]. The penetration of FOS into the body of animals, including humans, can occur not only with water and food (oral), but also inhaled when breathing, as well as transdermally when in direct contact with them. FOS have a neurotoxic effect on the human body, which, depending on the concentration of FOS, can be acute or distant. FOS are also mutagens that cause chromosomal aberration, and the negative effect, as a rule, is cumulative.
Согласно Международной конвенции о химическом разоружении [United Nation, Convention on the prohibition of the development, production, stockpiling and use of chemical weapons and on their destruction, corrected version in accordance with Depositary Notification C.N.246.1994. <http://www.opcw.org/html/db/cwc/eng/cwc_frameset.html>] на территории Российской Федерации и США должны быть уничтожены фосфорорганические боевые отравляющие вещества (зарин, зоман и Vx). Безопасность этого процесса может быть обусловлена наличием комплекса высокоэффективных защитных средств, включая те, что могут быть применены in vivo путем их введения непосредственно в организм для профилактики и элиминирования нейротоксичного эффекта ФОС.According to the International Convention on Chemical Disarmament [United Nation, Convention on the prohibition of the development, production, stockpiling and use of chemical weapons and on their destruction, corrected version in accordance with Depositary Notification C.N.246.1994. <http://www.opcw.org/html/db/cwc/eng/cwc_frameset.html>] in the territory of the Russian Federation and the USA, organophosphorus chemical warfare agents (sarin, soman and Vx) must be destroyed. The safety of this process may be due to the presence of a complex of highly effective protective agents, including those that can be applied in vivo by introducing them directly into the body to prevent and eliminate the neurotoxic effect of FOS.
Известно, что ферментные системы кожи, крови, внутренних органов участвуют в естественной защите человека от эндогенных и экзогенных ядов. Роль ферментов печени, легких и почек, цитохромов Р450, оксидаз, трансфераз и амидокарбоксилэстераз в метаболизме лекарств и ксенобиотиков хорошо известна. Признана также важность эстераз плазмы крови в инактивации многочисленных токсикантов. Эти ферменты формируют эндогенные барьеры, защищающие физиологические системы от отдельных токсикантов, и, несмотря на то, что процессы ферментативной детоксификации протекают в соответствии с разными механизмами, их часто называют «биоловушками» токсикантов [Массой П., Рошу Д. Каталитические «биоловушки» против токсических эфиров, альтернативный подход для профилактики и лечения отравлений. // Acta naturae, 2009, №1, с.68-78], поскольку большей частью, взаимодействуя с токсикантами, ферменты либо необратимо инактивируются при детоксификации ФОС, образуя с ними высокоустойчивые комплексы, либо эти ферменты проявляют низкую гидролитическую активность и, образуя фермент-субстратный комплекс, надолго выбывают из процесса детоксификации. В этой связи актуально применение в качестве основы для антидотных средств тех ферментов, что обладают широким гидролитическим субстратным спектром действия и высокой каталитической активностью по отношению к ФОС.It is known that the enzyme systems of the skin, blood, and internal organs participate in the natural defense of a person from endogenous and exogenous poisons. The role of liver, lung and kidney enzymes, cytochrome P450, oxidases, transferases and amidocarboxyl esterases in the metabolism of drugs and xenobiotics is well known. The importance of plasma esterases in the inactivation of numerous toxicants is also recognized. These enzymes form endogenous barriers that protect physiological systems from individual toxicants, and although enzymatic detoxification processes proceed in accordance with different mechanisms, they are often called “biotraps” of toxicants [Massa P., Roshu D. Catalytic “biotraps” against toxic esters, an alternative approach for the prevention and treatment of poisoning. // Acta naturae, 2009, No. 1, pp. 68-78], because for the most part, interacting with toxicants, enzymes are either irreversibly inactivated during detoxification of FOS, forming highly stable complexes with them, or these enzymes exhibit low hydrolytic activity and, forming an enzyme -substrate complex, long out of the detoxification process. In this regard, the use of those enzymes that possess a broad hydrolytic substrate spectrum of action and high catalytic activity with respect to FOS as a basis for antidote agents is relevant.
Детоксификация различных ФОС с помощью таких биокатализаторов, как ферменты, имеет ряд преимуществ, а именно она проходит в мягких условиях, и продукты гидролиза, как правило, являются биологически деградируемыми соединениями. На сегодняшний день наиболее высоко активным ферментом, осуществляющим биодеструкцию самого широкого спектра ФОС, является органофосфатгидролаза (ОРН, ЕС 3.1.8.1, арилдиалкилфосфатаза), катализирующая гидролиз эфирной связи в производных ортофосфорной и фосфоновой кислот [Ефременко Е.Н., Варфоломеев С.Д. Ферменты деструкции фосфорорганических нейротоксинов. // Успехи биол. химии, Т.44, 2004, с.307-340].The detoxification of various FOS with the help of biocatalysts such as enzymes has several advantages, namely, it takes place under mild conditions, and hydrolysis products, as a rule, are biologically degradable compounds. To date, the most highly active enzyme that performs biodegradation of the widest spectrum of FOS is organophosphate hydrolase (ORN, EC 3.1.8.1, aryl dialkyl phosphatase), which catalyzes the hydrolysis of the ether bond in derivatives of orthophosphoric and phosphonic acids [Efremenko EN, Varfolomeev SD Organophosphorus neurotoxin destruction enzymes. // Successes biol. Chemistry, T.44, 2004, p.307-340].
На сегодняшний день известно несколько ферментных биокатализаторов, созданных на основе ОРН, для использования в качестве антидотов против нейротоксичного действия ФОС in vivo.To date, several enzymatic biocatalysts based on ORN are known for use as antidotes against the neurotoxic effect of FOS in vivo.
Известен иммобилизованный биокатализатор, полученный для детоксификации ФОС in vivo в виде ОРН, модифицированной пэгилированием [Jun D., Musilová L., Link M., Loiodice M., Nachon F., Rochu D., Renault F., Masson P. Preparation and characterization of methoxy polyethylene glycol-conjugated phosphotriesterase as a potential catalytic bioscavenger against organophosphate poisoning. // Chem.-Biol. Interact., 2010, V.187, p.380-383; Trovaslet-Leroy M., Musilova L., Renault F., Brazzolotto X., Misik J., Novotny L., Froment M.T., Gillon E., Loiodice M., Verdier L., Masson P., Rochu D., Jun D., Nachon F. Organophosphate hydrolases as catalytic bioscavengers of organophosphorus nerve agents. // Toxicol. Lett., 2011, V. 206 (1), p.14-23]. Для этого ПЭГ с молекулярной массой 2 или 5 кг/моль посредством концевой альдегидной группы ковалентно пришивают к NH2-группам лизина, находящимся на поверхности молекулы ОРН. Полимер растворяют в 200 мМ боратном буфере (рН 8,5), содержащем 0,1 мМ CoCl2 и восстанавливающий агент - цианоборгидрид натрия, и смешивают с ферментом в оптимальном мольном соотношении ОРН:ПЭГ:NaBH3CN равном 1:1200:48000 для ПЭГ с молекулярной массой 2 кг/моль или 1:800:40000 для ПЭГ с молекулярной массой 5 кг/моль при температуре 25°С в течение 24 ч. Реакцию останавливают добавлением 10% масс. раствора глицина, после чего удаляют непрореагировавший полимер ультрафильтрацией. С 1 моль фермента связывается до 16 моль ПЭГ.Known immobilized biocatalyst obtained for detoxification of FOS in vivo in the form of ORS modified with pegylation [Jun D., Musilová L., Link M., Loiodice M., Nachon F., Rochu D., Renault F., Masson P. Preparation and characterization of methoxy polyethylene glycol-conjugated phosphotriesterase as a potential catalytic bioscavenger against organophosphate poisoning. // Chem. Biol. Interact., 2010, V.187, p. 380-383; Trovaslet-Leroy M., Musilova L., Renault F., Brazzolotto X., Misik J., Novotny L., Froment MT, Gillon E., Loiodice M., Verdier L., Masson P., Rochu D., Jun D., Nachon F. Organophosphate hydrolases as catalytic bioscavengers of organophosphorus nerve agents. // Toxicol. Lett., 2011, V. 206 (1), p.14-23]. For this, PEGs with a molecular weight of 2 or 5 kg / mol by means of the terminal aldehyde group are covalently attached to the NH 2 groups of lysine located on the surface of the ORN molecule. The polymer is dissolved in 200 mM borate buffer (pH 8.5) containing 0.1 mM CoCl 2 and a reducing agent sodium cyanoborohydride and mixed with the enzyme in an optimal molar ratio of ORN: PEG: NaBH 3 CN equal to 1: 1200: 48000 for PEG with a molecular weight of 2 kg / mol or 1: 800: 40,000 for PEG with a molecular weight of 5 kg / mol at a temperature of 25 ° C for 24 hours. The reaction is stopped by adding 10% of the mass. glycine solution, after which the unreacted polymer is removed by ultrafiltration. Up to 16 mol of PEG binds to 1 mol of the enzyme.
Период полуинактивации такого ферментного биокатализатора при 37°С составляет 12,3 ч при введении препарата внутримышечно в дозе 1,19 мг/кг самкам крыс марки Wistar. При внутримышечном введении клиренс препарата не определяется.The half-inactivation period of such an enzymatic biocatalyst at 37 ° C is 12.3 hours when the drug is administered intramuscularly at a dose of 1.19 mg / kg to female Wistar rats. With intramuscular administration, the clearance of the drug is not determined.
К недостаткам описанного биокатализатора следует отнести:The disadvantages of the described biocatalyst should include:
- развитие иммунного ответа у животных независимо от типа ПЭГ, используемого для модификации ОРН;- the development of the immune response in animals, regardless of the type of PEG used to modify ORN;
- используется длительная и трудоемкая процедура получения пэгилированного фермента, в результате которой теряется 50% ферментативной активности;- uses a long and laborious procedure for producing a pegylated enzyme, as a result of which 50% of the enzymatic activity is lost;
- отсутствие данных по каталитическим характеристикам и возможности детоксификации других ФОС, кроме Параоксона, а также отсутствие данных по диапазону рН и температурного действия данного биокатализатора не позволяет оценить потенциал его практического применения.- the lack of data on the catalytic characteristics and the possibility of detoxification of other FOS, except Paraoxon, as well as the lack of data on the pH range and temperature action of this biocatalyst does not allow us to assess the potential of its practical application.
Известны биокатализаторы, представляющие собой конъюгаты ОРН с полиэтиленгликолем (ПЭГ), полученные в результате ковалентной модификации поверхности фермента [Novikov B.N., Grimsley J.K., Kern R.J., Wild J.R., Wales M.E. Improved pharmacokinetics and immunogenicity profile of organophosphorus hydrolase by chemical modification with polyethylene glycol. // J. Control. Release, 2010, V.146, p.318-325]. Для этого используют короткоцепочечные преполимеры с молекулярной массой от 333 до 686 г/моль, состоящие из 4, 8 или 12 звеньев этиленгликоля с концевой сукцинимидной группой, способной связываться с остатками лизина или аргинина на поверхности белка, или разветвленный полимер ПЭГ4-[ПЭГ12]3 (ПЭГ40) с наибольшей из всех молекулярной массой 2421 г/моль. Модификацию ОРН проводят в 10 мМ фосфатном буфере (рН 8,4), содержащем 20 мМ KCl и 50 мкМ CoCl2. Фермент в концентрации 1 г/л смешивают с полимером в мольном соотношении фермент:полимер, равном 1:800. Смесь выдерживают при +25°С в течение 30 мин, а затем экспонируют при +4°С в течение 12 ч. После этого модифицированный фермент диализуют против исходного буфера. Максимальная активность биокатализатора наблюдается при связывании 1 моль фермента с 6 моль ПЭГ40. Константа Михаэлиса наилучшего образца данного биокатализатора по Параоксону составляет 57±4 мкМ, каталитическая константа - 4629±23 с-1, а эффективность каталитического действия - 8,1×107 M-1c-1.Biocatalysts are known that are conjugates of ORN with polyethylene glycol (PEG) obtained by covalent modification of the surface of an enzyme [Novikov BN, Grimsley JK, Kern RJ, Wild JR, Wales ME Improved pharmacokinetics and immunogenicity profile of organophosphorus hydrolase by chemical modification with polyethylene glycol. // J. Control. Release, 2010, V.146, p. 318-325]. To do this, use short-chain prepolymers with a molecular weight of 333 to 686 g / mol, consisting of 4, 8 or 12 units of ethylene glycol with a terminal succinimide group capable of binding to lysine or arginine residues on the protein surface, or a branched polymer PEG 4 - [PEG 12 ] 3 (PEG 40 ) with the largest molecular mass of 2421 g / mol. Modification of ORN is carried out in 10 mM phosphate buffer (pH 8.4) containing 20 mM KCl and 50 μM CoCl 2 . The enzyme at a concentration of 1 g / l is mixed with the polymer in a molar ratio of enzyme: polymer equal to 1: 800. The mixture was kept at + 25 ° C for 30 minutes and then exposed at + 4 ° C for 12 hours. After that, the modified enzyme was dialyzed against the initial buffer. The maximum activity of the biocatalyst is observed when 1 mol of the enzyme is bound to 6 mol of PEG 40 . The Michaelis constant of the best sample of this biocatalyst according to Paraoxon is 57 ± 4 μM, the catalytic constant is 4629 ± 23 s -1 , and the efficiency of the catalytic action is 8.1 × 10 7 M -1 s -1 .
Основными недостатками этого биокатализатора являются:The main disadvantages of this biocatalyst are:
- все образцы биокатализатора вызывают сильнейший иммунный ответ после внутривенного введения морским свинкам марки Dunkin Hartley в дозе 0,75 мг/кг, что подтверждено обнаружением специфических антител к ОРН в плазме крови исследованных животных;- all samples of the biocatalyst cause a strong immune response after intravenous administration of Dunkin Hartley guinea pigs at a dose of 0.75 mg / kg, which is confirmed by the detection of specific antibodies to ORN in the blood plasma of the studied animals;
- используется длительная и трудоемкая процедура получения пэгилированного фермента, в результате которой теряется до 75% ферментативной активности.- A long and laborious procedure is used to obtain the pegylated enzyme, as a result of which up to 75% of the enzymatic activity is lost.
Известен ферментный биокатализатор на основе ОРН, нанокапсулированной в полиоксазолиновый разветвленный полимер и предназначенный для применения в качестве антидота [Petrikovics I., Wales М.Е., Jaszberenyi J.C., Budai M., Baskin S.I., Szilasi M., Logue B.A., Chapela P., Wild J.R. Enzyme-based intravascular defense against organophosphoms neurotoxins: Synergism of dendritic-enzyme complexes with 2-PAM and atropine. // Nanotoxicology, 2005, V.1(2), p.85-92]. Препарат получают в 50 мМ бис-трис-пропановом буфере (рН 8,5) путем смешивания полимера с ферментом в весовом соотношении 20:1. Конечная концентрация комплекса составляет 20 г/л, который далее лиофилизуют. Активность готового препарата составляет 1-5 Ед./мгпреп, или в пересчете на фермент - 48-238 Ед./гбелка. Внутривенное введение такого ферментного биокатализатора мужским особям мышей марки Balb/c в дозе 500-2500 мг/кг позволяет улучшить в 2,85 раза защиту животных от токсичного действия Параоксона, вводимого внутрибрюшинно через 1 ч после введения биокатализатора, по сравнению с результатом применения неинкапсулированного фермента в тех же условиях.Known enzyme biocatalyst based on ORN nanocapsulated in a polyoxazoline branched polymer and intended for use as an antidote [Petrikovics I., Wales M.E., Jaszberenyi JC, Budai M., Baskin SI, Szilasi M., Logue BA, Chapela P. , Wild JR Enzyme-based intravascular defense against organophosphoms neurotoxins: Synergism of dendritic-enzyme complexes with 2-PAM and atropine. // Nanotoxicology, 2005, V.1 (2), p. 85-92]. The drug is obtained in 50 mm bis-Tris-propane buffer (pH 8.5) by mixing the polymer with the enzyme in a weight ratio of 20: 1. The final concentration of the complex is 20 g / l, which is further lyophilized. The activity of the finished product is 1-5 U / mg prep , or in terms of the enzyme - 48-238 U / g protein . The intravenous administration of such an enzymatic biocatalyst to male Balb / c mice at a dose of 500-2500 mg / kg allows a 2.85-fold improvement in the protection of animals from the toxic effects of Paraoxon administered intraperitoneally 1 hour after the administration of the biocatalyst, compared with the result of using an unencapsulated enzyme in the same conditions.
Вместе с этим описанный ферментный биокатализатор обладает рядом существенных недостатков, а именно:Along with this, the described enzymatic biocatalyst has a number of significant disadvantages, namely:
- низкая удельная активность антидота приводит к необходимости введения его в огромных дозах для достижения целевого эффекта, что существенно усложняет саму процедуру введения, поскольку в расчете на 1 человека применяемая доза достигает 150 г сухого препарата внутривенно, а потому ставит вопрос об иммунотоксичности биокатализатора, экономической обоснованности и практической целесообразности использования подобного антидота;- the low specific activity of the antidote leads to the need to administer it in huge doses to achieve the target effect, which significantly complicates the administration procedure itself, since per dose the applied dose reaches 150 g of the dry preparation intravenously, and therefore raises the question of the biocatalyst immunotoxicity and economic feasibility and the practicality of using such an antidote;
- отсутствие данных по каталитическим характеристикам и возможности детоксификации других ФОС, кроме Параоксона, а также отсутствие данных по диапазону рН и температурного действия, термостабильности, фармакокинетических данных действия данного биокатализатора не позволяет оценить потенциал его практического применения.- the lack of data on the catalytic characteristics and the possibility of detoxification of other FOS, except Paraoxon, as well as the lack of data on the pH range and temperature action, thermal stability, pharmacokinetic data of the action of this biocatalyst does not allow us to evaluate the potential of its practical use.
Данное техническое решение как наиболее близкое к заявляемому по своему назначению и способу получения, а именно получению наноразмерного биокатализатора с органофосфатгидролазной активностью, представляющего собой нековалентный комплекс фермента с полимером и предназначенного для детоксификации ФОС, принято за прототип.This technical solution, as the closest to the claimed in its purpose and method of obtaining, namely the production of nanoscale biocatalyst with organophosphate hydrolase activity, which is a non-covalent complex of the enzyme with the polymer and intended for detoxification of FOS, is taken as a prototype.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка ферментного биокатализатора в виде наноразмерных частиц для детоксификации ФОС in vivo, представляющих собой высокоактивные и термостабильные нековалентные полиэлектролитные комплексы с широким субстратным спектром действия.The objective of the invention is the development of an enzymatic biocatalyst in the form of nanosized particles for detoxification of VOCs in vivo, which are highly active and thermostable non-covalent polyelectrolyte complexes with a wide substrate spectrum of action.
Поставленная задача решается тем, что ферментный биокатализатор в виде наноразмерных частиц для детоксификации фосфорорганических соединений in vivo получают в виде нековалентных полиэлектролитных комплексов, сформированных при рН 7,5-10,5 и температуре +8÷30°С полигистидин-содержащим полипептидом со свойствами органофосфатгидролазы и блок-сополимером полиэтиленгликоля с полианионом в виде полиглутаминовой кислоты разной степени полимеризации, взятыми в зарядовом соотношении фермент:блок-сополимер в диапазоне от 2:1 до 1:5.The problem is solved in that an enzymatic biocatalyst in the form of nanosized particles for the detoxification of organophosphorus compounds in vivo is obtained in the form of non-covalent polyelectrolyte complexes formed at a pH of 7.5-10.5 and a temperature of + 8 ÷ 30 ° C with a polyhistidine-containing polypeptide with the properties of organophosphate hydrolase and a block copolymer of polyethylene glycol with a polyanion in the form of polyglutamic acid of different degrees of polymerization, taken in the charge ratio of the enzyme: block copolymer in the range from 2: 1 to 1: 5.
В качестве основного каталитического начала в предлагаемом изобретении используется оригинальный полигистидин-содержащий полипептид с активностью органофосфатгидролазы, который характеризуется существенно улучшенными по отношению к исходному ферменту органофосфатгидролазе каталитическими характеристиками, позволяющими использовать его для гидролиза фосфорорганических отравляющих веществ в более широком диапазоне рН и температуры, а также проводить более эффективный и быстрый гидролиз различных ФОС [Патент РФ 2255975, МПК7 C12N 1/21, C12N 15/52, C12N 15/70. Рекомбинантная плазмидная ДНК pTES-His-OPH и продуцент олигогистидинсодержащей органофосфатгидролазы; Патент РФ 2296164, МПК7 C12S 13/00, A62D 3/00. Способ ферментативного гидролиза боевых отравляющих веществ. Вотчицева Ю.А., Ефременко Е.Н., Алиев Т.К., Варфоломеев С.Д. (2006) Свойства гексагистидин-содержащей органофосфатгидролазы» // Биохимия, Т.76 (2), с.216-222; Гудков Д.А., Вотчицева Ю.А., Ефременко Е.Н. (2006). Гидролиз параоксона, катализируемый органофосфатгидролазой, содержащей полигистидиновую последовательность на С-конце молекулы белка. // Вестник МГУ, сер. Хим., Т.47(1), с.15-20].As the main catalytic principle in the present invention, the original polyhistidine-containing polypeptide with organophosphate hydrolase activity is used, which is characterized by catalytic characteristics significantly improved with respect to the initial organophosphate hydrolase enzyme, allowing it to be used for the hydrolysis of organophosphate toxic substances in a wider range of pH and temperature, as well as more efficient and faster hydrolysis of various FOS [RF Patent 2255975, IPC 7 C12N 1/21, C1 2N 15/52, C12N 15/70. PTES-His-OPH recombinant plasmid DNA and producer of oligohistidine-containing organophosphate hydrolase; RF patent 2296164, IPC 7 C12S 13/00, A62D 3/00. The method of enzymatic hydrolysis of chemical warfare agents. Votchitseva Yu.A., Efremenko E.N., Aliev T.K., Varfolomeev S.D. (2006) Properties of hexahistidine-containing organophosphate hydrolase "// Biochemistry, T.76 (2), s.216-222; Gudkov D.A., Votchitsyova Yu.A., Efremenko E.N. (2006). Hydrolysis of paraoxon catalyzed by organophosphate hydrolase containing a polyhistidine sequence at the C-terminus of a protein molecule. // Bulletin of Moscow State University, ser. Chem., T.47 (1), p.15-20].
Наличие полигистидиновой последовательности в молекуле полипептида позволяет проводить быструю очистку и выделение такого фермента из клеток E.coli в одну стадию за счет образования множественных координационных связей между молекулой гибридного белка и металл-хелатирующими носителями [Efremenko E., Votchitseva Y., Plieva F., Galaev I., Mattiasson B. (2006). Purification of His6-organophosphate hydrolase using monolithic supermacroporous polyacrylamide cryogels developed for immobilized metal affinity chromatography. // Appl. Microb. Biotech., V.70 (5), p.558-563], и, следовательно, масштабирование процесса его наработки с целью использования при получении заявляемого ферментного биокатализатора легко реализуемо.The presence of a polyhistidine sequence in the polypeptide molecule allows for the rapid purification and isolation of such an enzyme from E. coli cells in one stage due to the formation of multiple coordination bonds between the hybrid protein molecule and metal-chelating carriers [Efremenko E., Votchitseva Y., Plieva F., Galaev I., Mattiasson B. (2006). Purification of His 6 -organophosphate hydrolase using monolithic supermacroporous polyacrylamide cryogels developed for immobilized metal affinity chromatography. // Appl. Microb. Biotech., V.70 (5), p.558-563], and, therefore, scaling up the process of its development with the aim of using it to obtain the inventive enzymatic biocatalyst is easily feasible.
Ранее данный полипептид для целей его применения в качестве антидота не использовался.Previously, this polypeptide was not used as an antidote for its use.
Для стабилизации ферментативной активности полигистидин-содержащего пептида в крови при его непосредственном введении в организм, согласно заявляемому изобретению, формируют нековалентный полиэлектролитный комплекс, для чего ферментный раствор смешивают в определенном соотношении с раствором блок-сополимера полиэтиленгликоля и полианиона. Получение такого комплекса способствует формированию наноразмерных частиц, удобных для применения in vivo [Patent WO 2008/141155 A1, 2008; Compositions for protein delivery and methods of use thereof; A61K 38/16; A61K 38/28] и использования в процессе детоксификации нейротоксинов. Кроме того, поскольку такая модификация поверхности фермента способствует снижению его иммуногенности как чужеродного белка, вводимого в организм животных, в том числе человека, а также позволяет увеличить время пребывания фермента в организме в каталитически активной форме за счет увеличения его стабильности и снижения его доступности к гидролитическому воздействию литических ферментов крови.To stabilize the enzymatic activity of a polyhistidine-containing peptide in the blood when it is directly introduced into the body, according to the claimed invention, a non-covalent polyelectrolyte complex is formed, for which the enzyme solution is mixed in a certain ratio with a solution of a block copolymer of polyethylene glycol and polyanion. The preparation of such a complex promotes the formation of nanosized particles suitable for in vivo use [Patent WO 2008/141155 A1, 2008; Compositions for protein delivery and methods of use thereof; A61K 38/16; A61K 38/28] and use in the process of detoxification of neurotoxins. In addition, since such a modification of the surface of the enzyme helps to reduce its immunogenicity as a foreign protein introduced into the body of animals, including humans, and also allows to increase the residence time of the enzyme in the body in a catalytically active form by increasing its stability and reducing its accessibility to hydrolytic exposure to lytic blood enzymes.
В качестве блок-сополимера для модификации полигистидин-содержащего полипептида с активностью ОРН в заявляемом изобретении используется блок-сополимер полиэтиленгликоля и полиглутаминовой кислоты, имеющей разную степень полимеризации. Такое техническое решение обеспечивает формирование устойчивого полиэлектролитного комплекса между положительно заряженными функциональными группами, локализованными на стороне, противоположной активному центру фермента, и полианионом. При этом блок-сополимер не затрагивает активный центр фермента, позволяя сохранять его высокую активность, но при этом существенно стабилизирует активную конформацию белка. Физический метод стабилизации полипептида, используемый в заявляемом изобретении, в отличие от ковалентного метода, применяемого в аналогах, гарантирует максимальное сохранение исходных характеристик фермента.As a block copolymer for modifying a polyhistidine-containing polypeptide with an OPH activity, the inventive invention uses a block copolymer of polyethylene glycol and polyglutamic acid having a different degree of polymerization. Such a technical solution ensures the formation of a stable polyelectrolyte complex between positively charged functional groups localized on the side opposite the active center of the enzyme and the polyanion. In this case, the block copolymer does not affect the active center of the enzyme, allowing it to maintain its high activity, but it significantly stabilizes the active conformation of the protein. The physical method of stabilization of the polypeptide used in the claimed invention, in contrast to the covalent method used in analogues, ensures maximum preservation of the initial characteristics of the enzyme.
Диапазон варьирования зарядового соотношения фермента и блок-сополимера (от 2:1 до 1:5), применяемый для получения заявляемого биокатализатора, выбран экспериментально и обеспечивает получение высокоактивного и термостабильного ферментного биокатализатора в виде наноразмерных частиц (в среднем 29±4 нм). Увеличение этого соотношения в сторону повышения доли фермента приводит к снижению стабильности его действия в диапазоне рН 7,0-12,0 и температуры 15-60°С, а увеличение доли полимера в соотношении фермент:полимер свыше 1:5 приводит к снижению каталитической активности биокатализатора и не приводит к заметному улучшению термостабильности ферментного биокатализатора.The range of variation of the charge ratio of the enzyme and block copolymer (from 2: 1 to 1: 5) used to obtain the inventive biocatalyst is selected experimentally and provides highly active and thermostable enzyme biocatalyst in the form of nanoscale particles (average 29 ± 4 nm). An increase in this ratio in the direction of increasing the proportion of the enzyme leads to a decrease in the stability of its action in the pH range of 7.0-12.0 and a temperature of 15-60 ° C, and an increase in the proportion of polymer in the ratio of the enzyme: polymer over 1: 5 leads to a decrease in catalytic activity biocatalyst and does not lead to a noticeable improvement in thermal stability of the enzyme biocatalyst.
Такое сочетание всех основных компонентов наноразмерного ферментного биокатализатора, которое указано в заявляемом техническом решении, да еще к тому же при заявляемых соотношениях фермента и блок-сополимера, эффективное взаимодействие которых осуществляется при рН 7,5-10,5 и температуре +8-30°С, ранее известно не было и позволяет характеризовать предлагаемое техническое решение как новое.This combination of all the main components of the nanoscale enzyme biocatalyst, which is indicated in the claimed technical solution, and also with the claimed ratios of the enzyme and block copolymer, the effective interaction of which is carried out at a pH of 7.5-10.5 and a temperature of + 8-30 ° C, it was previously not known and allows us to characterize the proposed technical solution as new.
Ниже приводятся конкретные примеры реализации заявляемого технического решения.The following are specific examples of the implementation of the proposed technical solution.
Пример 1. Ферментный биокатализатор в виде наноразмерных частиц на основе His6-OPH и ПЭГ-ПГК50 в зарядовом соотношении 2:1.Example 1. An enzymatic biocatalyst in the form of nanosized particles based on His 6 -OPH and PEG-PGA 50 in a charge ratio of 2: 1.
К очищенному ферменту His6-OPH, находящемуся в 100 мМ карбонатном буфере (рН 10,5) в концентрации 1 г/л, добавляют 20 г/л водный раствор ПЭГ119-ПГК50 (MW=13 кг/моль) так, чтобы концентрация блок-сополимера составила 0,09 г/л. Приготовленную смесь оставляют при комнатной температуре на 30 мин для формирования ферментного биокатализатора в виде нековалентного полиэлектролитного комплекса с зарядовым соотношением фермента и блок-сополимера 2:1.To a purified enzyme His 6 -OPH, located in 100 mM carbonate buffer (pH 10.5) at a concentration of 1 g / l, add 20 g / l aqueous solution of PEG 119 -PGA 50 (M W = 13 kg / mol) so so that the concentration of the block copolymer is 0.09 g / l. The prepared mixture is left at room temperature for 30 minutes to form an enzymatic biocatalyst in the form of a non-covalent polyelectrolyte complex with a charge ratio of the enzyme and block copolymer of 2: 1.
Полученный ферментный биокатализатор имеет размер частиц 29±4 нм, обладает каталитической константой действия по фосфорорганическому пестициду Параоксону 5010±60 с-1, константой Михаэлиса 16,7±0,9 мкМ и константой эффективности действия (3,0±0,2)×108 М-1с-1, функционирует в диапазоне рН 7,0-12,0 и температур 15-60°С. Каталитическая константа действия по фосфорорганическому пестициду Хлорпирифосу составляет 482±25 с-1, константа Михаэлиса - 150±10 мкМ и константа эффективности действия - (3,2±0,4)×106 М-1с-1. Снижение активности данного биокатализатора, выдержанного при 55°С в течение 15 мин, составляет менее 5%. Расчетный период полуинактивации биокатализатора при 37°С составляет как минимум 500 ч. При внутривенном введении ферментного биокатализатора в дозе 1 мг/кг клиренс у белых крыс (скорость выведения, CL) составляет 27,6 мл/ч. Специфические антитела к ферментному биокатализатору этого состава при его введении в указанной дозе в плазме крови исследованных животных отсутствуют.The obtained enzyme biocatalyst has a particle size of 29 ± 4 nm, has a catalytic constant for the action of the organophosphorus pesticide Paraoxon 5010 ± 60 s -1 , Michaelis constant 16.7 ± 0.9 μM and an action efficiency constant (3.0 ± 0.2) × 10 8 M -1 s -1 , operates in the range of pH 7.0-12.0 and temperatures 15-60 ° C. The catalytic action constant for the organophosphorus pesticide Chlorpyrifos is 482 ± 25 s -1 , the Michaelis constant is 150 ± 10 μM and the efficiency constant is (3.2 ± 0.4) × 10 6 M -1 s -1 . The decrease in the activity of this biocatalyst aged at 55 ° C for 15 minutes is less than 5%. The estimated half-inactivation period of the biocatalyst at 37 ° C is at least 500 hours. With intravenous administration of the enzyme biocatalyst at a dose of 1 mg / kg, clearance in white rats (excretion rate, CL) is 27.6 ml / h. There are no specific antibodies to the enzymatic biocatalyst of this composition when it is introduced at the indicated dose in the blood plasma of the animals studied.
Пример 2. Ферментный биокатализатор в виде наноразмерных частиц на основе His6-OPH и ПЭГ-ПГК10 в зарядовом соотношении 1:1.Example 2. An enzymatic biocatalyst in the form of nanosized particles based on His 6 -OPH and PEG-PGA 10 in a charge ratio of 1: 1.
К очищенному ферменту His6-OPH, находящемуся в 50 мМ фосфатно-солевом буфере (рН 7,5) в концентрации 1 г/л, добавляют 20 г/л водный раствор ПЭГ119-ПГК10 (MW=6.5 кг/моль) так, чтобы концентрация блок-сополимера составила 0,45 г/л. Приготовленную смесь оставляют при температуре +8°С на 40 мин для формирования ферментного биокатализатора в виде нековалентного полиэлектролитного комплекса с зарядовым соотношением фермента и блок-сополимера 1:1.To a purified His 6 -OPH enzyme in 50 mM phosphate-buffered saline (pH 7.5) at a concentration of 1 g / L, 20 g / L PEG 119 -PGC 10 aqueous solution (M W = 6.5 kg / mol) is added. so that the concentration of the block copolymer is 0.45 g / L. The prepared mixture is left at a temperature of + 8 ° C for 40 min to form an enzymatic biocatalyst in the form of a non-covalent polyelectrolyte complex with a charge ratio of the enzyme and block copolymer of 1: 1.
Полученный ферментный биокатализатор имеет размер частиц 30±5 нм, обладает каталитической константой действия по фосфорорганическому пестициду Паратиону 1040±80 с-1, константой Михаэлиса 20,1±1,7 мкМ и константой эффективности действия (5,2±0,8)×107 M-1c-1, функционирует в диапазоне рН 7,0-12,0 и температур 15-60°С. Каталитическая константа действия по фосфорорганическому пестициду Диазинону составляет 85,6±5,1 с-1, константа Михаэлиса - 202±13 мкМ и константа эффективности действия - (4,2±0,5)×105 М-1с-1. Снижение активности данного биокатализатора, выдержанного при 55°С в течение 15 мин, составляет менее 3%. При внутривенном введении ферментного биокатализатора в дозе 1 мг/кг клиренс у белых крыс (скорость выведения, CL) составляет 28,2 мл/ч. Специфические антитела к ферментному биокатализатору этого состава при его введении в указанной дозе в плазме крови исследованных животных отсутствуют.The obtained enzyme biocatalyst has a particle size of 30 ± 5 nm, has a catalytic constant for the action of the organophosphorus pesticide Parathion 1040 ± 80 s -1 , Michaelis constant 20.1 ± 1.7 μM and an action efficiency constant (5.2 ± 0.8) × 10 7 M -1 s -1 , operates in the range of pH 7.0-12.0 and temperatures 15-60 ° C. The catalytic action constant for the organophosphorus pesticide Diazinon is 85.6 ± 5.1 s -1 , the Michaelis constant is 202 ± 13 μM and the efficiency constant is (4.2 ± 0.5) × 10 5 M -1 s -1 . The decrease in the activity of this biocatalyst aged at 55 ° C for 15 minutes is less than 3%. With the intravenous administration of an enzymatic biocatalyst at a dose of 1 mg / kg, the clearance in white rats (excretion rate, CL) is 28.2 ml / h. There are no specific antibodies to the enzymatic biocatalyst of this composition when it is introduced at the indicated dose in the blood plasma of the animals studied.
Пример 3. Ферментный биокатализатор в виде наноразмерных частиц на основе His6-OPH и ПЭГ-ПГК50 в зарядовом соотношении 1:2.Example 3. An enzymatic biocatalyst in the form of nanosized particles based on His 6 -OPH and PEG-PGA 50 in a charge ratio of 1: 2.
К очищенному ферменту His6-OPH, находящемуся в 100 мМ карбонатном буфере (рН 9,5) в концентрации 1 г/л, добавляют 20 г/л водный раствор ПЭГ119-ПГК50 (MW=13 кг/моль) так, чтобы концентрация блок-сополимера составила 0,36 г/л. Приготовленную смесь оставляют при температуре 30°С на 20 мин для формирования ферментного биокатализатора в виде нековалентного полиэлектролитного комплекса с зарядовым соотношением фермента и блок-сополимера 1:2.To a purified His 6 -OPH enzyme located in 100 mM carbonate buffer (pH 9.5) at a concentration of 1 g / L, 20 g / L PEG 119 -PHC 50 aqueous solution (M W = 13 kg / mol) is added so so that the concentration of the block copolymer is 0.36 g / l. The prepared mixture is left at a temperature of 30 ° C for 20 min to form an enzymatic biocatalyst in the form of a non-covalent polyelectrolyte complex with a charge ratio of the enzyme and block copolymer of 1: 2.
Полученный ферментный биокатализатор имеет размер частиц 28±3 нм, обладает каталитической константой действия по фосфорорганическому пестициду Метилпаратиону 309±15 с-1, константой Михаэлиса 34,5±1,9 мкМ и константой эффективности действия (9,0±0,9)×106 M-c-1, функционирует в диапазоне рН 7,0-12,0 и температур 15-60°С. Снижение активности данного биокатализатора, выдержанного при 55°С в течение 15 мин, составляет менее 4%. При внутривенном введении ферментного биокатализатора в дозе 1 мг/кг клиренс у белых крыс (скорость выведения, CL) составляет 32,2 мл/ч. Специфические антитела к ферментному биокатализатору этого состава при его введении в указанной дозе в плазме крови исследованных животных отсутствуют.The obtained enzyme biocatalyst has a particle size of 28 ± 3 nm, has a catalytic constant for the action of the organophosphorus pesticide Methyl parathion 309 ± 15 s -1 , Michaelis constant 34.5 ± 1.9 μM and an action efficiency constant (9.0 ± 0.9) × 10 6 M - s -1 , operates in the pH range of 7.0-12.0 and temperatures of 15-60 ° C. The decrease in the activity of this biocatalyst, aged at 55 ° C for 15 minutes, is less than 4%. With intravenous administration of an enzymatic biocatalyst at a dose of 1 mg / kg, the clearance in white rats (excretion rate, CL) is 32.2 ml / h. There are no specific antibodies to the enzymatic biocatalyst of this composition when it is introduced at the indicated dose in the blood plasma of the animals studied.
Пример 4. Ферментный биокатализатор в виде наноразмерных частиц на основе His6-OPH и ПЭГ-ПГК50 в зарядовом соотношении 1:5.Example 4. An enzymatic biocatalyst in the form of nanosized particles based on His 6 -OPH and PEG-PGA 50 in a charge ratio of 1: 5.
К очищенному ферменту His6-OPH, находящемуся в 50 мМ карбонатном буфере (рН 10,5) в концентрации 1 г/л, добавляют 20 г/л водный раствор ПЭГ119-ПГК50 (MW=13 кг/моль) так, чтобы концентрация блок-сополимера составила 0,9 г/л. Приготовленную смесь оставляют при температуре 20°С на 30 мин для формирования ферментного биокатализатора в виде нековалентного полиэлектролитного комплекса с зарядовым соотношением фермента и блок-сополимера 1:5.To a purified His 6 -OPH enzyme located in 50 mM carbonate buffer (pH 10.5) at a concentration of 1 g / L, 20 g / L PEG 119 -PGA 50 aqueous solution (M W = 13 kg / mol) is added so so that the concentration of the block copolymer is 0.9 g / l. The prepared mixture is left at a temperature of 20 ° C for 30 min to form an enzymatic biocatalyst in the form of a non-covalent polyelectrolyte complex with a charge ratio of the enzyme and block copolymer of 1: 5.
Полученный ферментный биокатализатор имеет размер частиц 27±4 нм, обладает каталитической константой действия по фосфорорганическому пестициду Параоксону 4190±100 с-1, константой Михаэлиса 38,0±1,7 мкМ и константой эффективности действия (1,1±0,1)×10 М-1с-1, функционирует в диапазоне рН 7,0-12,0 и температур 15-60°С. Каталитическая константа действия по фосфорорганическому пестициду Кумафосу составляет 335±15 с-1, константа Михаэлиса - 350±20 мкМ и константа эффективности действия - (9,6±1,0)×10 М-1с-1. Снижение активности данного биокатализатора, выдержанного при 55°С в течение 15 мин, составляет менее 5%. При внутривенном введении ферментного биокатализатора в дозе 1 мг/кг клиренс у белых крыс (скорость выведения, CL) составляет 41,5 мл/ч. Специфические антитела к ферментному биокатализатору этого состава при его введении в указанной дозе в плазме крови исследованных животных отсутствуют.The obtained enzyme biocatalyst has a particle size of 27 ± 4 nm, has a catalytic constant for the action of the organophosphorus pesticide Paraoxon 4190 ± 100 s -1 , Michaelis constant 38.0 ± 1.7 μM and an action efficiency constant (1.1 ± 0.1) × 10 M -1 s -1 , operates in the range of pH 7.0-12.0 and temperatures of 15-60 ° C. The catalytic constant for the organophosphorus pesticide Kumafos is 335 ± 15 s -1 , the Michaelis constant is 350 ± 20 μM and the constant for the effectiveness is (9.6 ± 1.0) × 10 M -1 s -1 . The decrease in the activity of this biocatalyst aged at 55 ° C for 15 minutes is less than 5%. With the intravenous administration of an enzymatic biocatalyst at a dose of 1 mg / kg, the clearance in white rats (excretion rate, CL) is 41.5 ml / h. There are no specific antibodies to the enzymatic biocatalyst of this composition when it is introduced at the indicated dose in the blood plasma of the animals studied.
Пример 5. Ферментный биокатализатор в виде наноразмерных частиц на основе His12-OPH и ПЭГ-ПГК50 в зарядовом соотношении 1:4.Example 5. Enzymatic biocatalyst in the form of nanosized particles based on His 12 -OPH and PEG-PGA 50 in a charge ratio of 1: 4.
К очищенному ферменту His12-OPH, находящемуся в 50 мМ фосфатном буфере (рН 8,0) в концентрации 1 г/л, добавляют 20 г/л водный раствор ПЭГ119-ПГК50 (MW=13 кг/моль) так, чтобы концентрация блок-сополимера составила 0,72 г/л. Приготовленную смесь оставляют при комнатной температуре на 30 мин для формирования ферментного биокатализатора в виде нековалентного полиэлектролитного комплекса с зарядовым соотношением фермента и блок-сополимера 1:4.To a purified enzyme His 12- OPH, located in 50 mM phosphate buffer (pH 8.0) at a concentration of 1 g / L, 20 g / L aqueous PEG 119 -PGA 50 solution (M W = 13 kg / mol) is added so so that the concentration of the block copolymer is 0.72 g / l. The prepared mixture is left at room temperature for 30 minutes to form an enzymatic biocatalyst in the form of a non-covalent polyelectrolyte complex with a charge ratio of the enzyme and block copolymer of 1: 4.
Полученный ферментный биокатализатор имеет размер частиц 30±5 нм, обладает каталитической константой действия по фосфорорганическому пестициду Параоксону 4008±235 с-1, константой Михаэлиса 253±40 мкМ и константой эффективности действия (1,6±0,3)×107 М-1с-1, функционирует в диапазоне рН 7,0-12,0 и температур 15-60°С. Снижение активности данного биокатализатора, выдержанного при 55°С в течение 15 мин, составляет менее 2%. При внутривенном введении ферментного биокатализатора в дозе 1 мг/кг клиренс у белых крыс (скорость выведения, CL) составляет 37,6 мл/ч. Специфические антитела к ферментному биокатализатору этого состава при его введении в указанной дозе в плазме крови исследованных животных отсутствуют.The obtained enzyme biocatalyst has a particle size of 30 ± 5 nm, has a catalytic constant for the action of the organophosphorus pesticide Paraoxon 4008 ± 235 s -1 , the Michaelis constant 253 ± 40 μM and the action efficiency constant (1.6 ± 0.3) × 10 7 M - 1 s -1 , operates in the range of pH 7.0-12.0 and temperatures 15-60 ° C. The decrease in the activity of this biocatalyst, aged at 55 ° C for 15 minutes, is less than 2%. With intravenous administration of an enzymatic biocatalyst at a dose of 1 mg / kg, the clearance in white rats (excretion rate, CL) is 37.6 ml / h. There are no specific antibodies to the enzymatic biocatalyst of this composition when it is introduced at the indicated dose in the blood plasma of the animals studied.
Пример 6. Свойства заявляемого ферментного биокатализатора как антидота in vivo при детоксификации отравляющего вещества Vx.Example 6. The properties of the claimed enzyme biocatalyst as an antidote in vivo in the detoxification of the toxic substance Vx.
Ферментный биокатализатор в виде нековалентного полиэлектролитного комплекса с зарядовым соотношением фермента и блок-сополимера 1:5, полученный как описано в Примере 1, вводят внутривенно белым крысам марки Sprague Dawley в дозе 1 мг/кг. Через 1 ч крысам внутривенно вводят вещество Vx в дозе LD50, фиксируют гибель 25,0% животных и наблюдают уменьшение количества погибших животных в 2 раза по сравнению с контрольной группой.An enzymatic biocatalyst in the form of a non-covalent polyelectrolyte complex with a charge ratio of the enzyme and block copolymer of 1: 5, obtained as described in Example 1, is administered intravenously to white Sprague Dawley rats at a dose of 1 mg / kg. After 1 h, rats were injected intravenously with Vx at a dose of LD 50 , the death of 25.0% of the animals was recorded, and a 2-fold decrease in the number of dead animals was observed compared to the control group.
Ферментный биокатализатор в виде нековалентного полиэлектролитного комплекса с зарядовым соотношением фермента и блок-сополимера 1:5, полученный как описано в Примере 4, вводят внутривенно белым крысам марки Sprague Dawley в дозе 1 мг/кг. Через 1 ч крысам внутривенно вводят вещество Vx в дозе LD50, фиксируют гибель 16,7% животных и наблюдают уменьшение количества погибших животных в 3 раза по сравнению с контрольной группой.An enzymatic biocatalyst in the form of a non-covalent polyelectrolyte complex with a charge ratio of the enzyme and block copolymer of 1: 5, obtained as described in Example 4, is administered intravenously to white Sprague Dawley rats at a dose of 1 mg / kg. After 1 h, rats were injected intravenously with Vx at a dose of LD 50 , death of 16.7% of the animals was recorded, and a 3-fold decrease in the number of dead animals was observed compared to the control group.
Таким образом, заявляемое изобретение в сравнении с известными аналогами и прототипом характеризуется:Thus, the claimed invention in comparison with the known analogues and prototype is characterized by:
- существенным упрощением технологии получения, не требующей применения сшивающих химических агентов, формирующих ковалентные связи между функциональными группами фермента и полимера, модифицирующего белковую поверхность;- a significant simplification of the production technology that does not require the use of crosslinking chemical agents that form covalent bonds between the functional groups of the enzyme and the polymer that modifies the protein surface;
- получение нековалентных комплексов вместо ковалентных, как основы формирования заявляемого ферментного биокатализатора, а также применение более каталитически активного, чем ОРН, полигистидин-содержащего полипептида позволяет значительно увеличить каталитическую эффективность действия получаемых наночастиц;- obtaining non-covalent complexes instead of covalent, as the basis for the formation of the inventive enzyme biocatalyst, as well as the use of a more catalytically active than ORN, polyhistidine-containing polypeptide can significantly increase the catalytic efficiency of the obtained nanoparticles;
- высокая активность заявляемого ферментного биокатализатора позволяет значительно снизить вводимую дозу, существенным образом улучшив экономическую сторону применения подобных антидотов и уменьшив возможность их иммунотоксичного эффекта;- high activity of the inventive enzyme biocatalyst can significantly reduce the administered dose, significantly improving the economic side of the use of such antidotes and reducing the possibility of their immunotoxic effect;
- заявляемый ферментный биокатализатор характеризуется существенным снижением количества полимера, используемого для получения наноразмерных стабильных частиц (снижение соотношения фермент:полимер от 1:400-800, характерной для аналогов и прототипа до 1:5 в максимуме для предлагаемого решения), что также улучшает экономическую характеристику заявляемого ферментного биокатализатора;- the inventive enzyme biocatalyst is characterized by a significant reduction in the amount of polymer used to obtain nanosized stable particles (reduction in the ratio of enzyme: polymer from 1: 400-800, typical for analogues and prototype to 1: 5 at the maximum for the proposed solution), which also improves the economic performance the claimed enzyme biocatalyst;
- заявляемый ферментный биокатализатор обладает широким субстратным спектром действия в отношении ФОС и проявляет высокую активность в реакциях гидролиза пестицидов и отравляющих веществ (на примере вещества Vx) in vivo.- the inventive enzyme biocatalyst has a wide substrate spectrum of activity in relation to FOS and is highly active in the hydrolysis of pesticides and toxic substances (for example, substance Vx) in vivo.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012139201/10A RU2525658C2 (en) | 2012-09-13 | 2012-09-13 | NANOSCALE ENZYME BIOCATALYST FOR in vivo DETOXIFICATION OF ORGANOPHOSPHOROUS COMPOUNDS |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012139201/10A RU2525658C2 (en) | 2012-09-13 | 2012-09-13 | NANOSCALE ENZYME BIOCATALYST FOR in vivo DETOXIFICATION OF ORGANOPHOSPHOROUS COMPOUNDS |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2012139201A RU2012139201A (en) | 2014-03-27 |
| RU2525658C2 true RU2525658C2 (en) | 2014-08-20 |
Family
ID=50342590
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012139201/10A RU2525658C2 (en) | 2012-09-13 | 2012-09-13 | NANOSCALE ENZYME BIOCATALYST FOR in vivo DETOXIFICATION OF ORGANOPHOSPHOROUS COMPOUNDS |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2525658C2 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2575627C1 (en) * | 2014-12-18 | 2016-02-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | FERMENTAL BIOCATALYST FOR NEUTRALISATION OF ORGANOPHOSPHORUS COMPOUNDS in vivo |
| RU2615176C1 (en) * | 2015-12-24 | 2017-04-04 | Елена Николаевна Ефременко | Cryo-formed biocatalyst enzyme for organophosphorus compounds detoxification |
| RU2648169C1 (en) * | 2017-01-16 | 2018-03-22 | Елена Николаевна Ефременко | Enzymic biocatalyst with antioxidant activity for detoxification of phosphororhange compounds |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2261911C1 (en) * | 2004-03-18 | 2005-10-10 | Ефременко Елена Николаевна | Method for preparing biocatalyst and biocatalyst for detoxifying organophosphorus compounds |
| RU2451077C1 (en) * | 2011-01-12 | 2012-05-20 | Химический Факультет Московского Государственного Университета Имени М.В. Ломоносова | Method for enzymatic hydrolysis of organophosphorous soil compounds |
-
2012
- 2012-09-13 RU RU2012139201/10A patent/RU2525658C2/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2261911C1 (en) * | 2004-03-18 | 2005-10-10 | Ефременко Елена Николаевна | Method for preparing biocatalyst and biocatalyst for detoxifying organophosphorus compounds |
| RU2451077C1 (en) * | 2011-01-12 | 2012-05-20 | Химический Факультет Московского Государственного Университета Имени М.В. Ломоносова | Method for enzymatic hydrolysis of organophosphorous soil compounds |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| PETRIKOVICS I., et al., Enzyme-based intravascular defense against organophosphoms neurotoxins: Synergism of dendritic-enzyme complexes with 2-PAM and atropine. // Nanotoxicology, 2005, V.1(2), p.85-92. * |
| ЕФРЕМЕНКО Е.Н., Гетерогенные биокатализаторы на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов: фундаментальные и прикладные аспекты, Автореферат, 2009, Москва, стр.28-33. ЛЯГИН И.В., Иммобилизованные биокатализаторы на основе полигистидинсодержащих производных органофосфатгидролазы: получение и свойства, Автореферат, 2009, Москва, стр.5-20 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2575627C1 (en) * | 2014-12-18 | 2016-02-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | FERMENTAL BIOCATALYST FOR NEUTRALISATION OF ORGANOPHOSPHORUS COMPOUNDS in vivo |
| RU2615176C1 (en) * | 2015-12-24 | 2017-04-04 | Елена Николаевна Ефременко | Cryo-formed biocatalyst enzyme for organophosphorus compounds detoxification |
| RU2648169C1 (en) * | 2017-01-16 | 2018-03-22 | Елена Николаевна Ефременко | Enzymic biocatalyst with antioxidant activity for detoxification of phosphororhange compounds |
| RU2780376C2 (en) * | 2022-02-25 | 2022-09-22 | Елена Николаевна Ефременко | Self-cleaning material with chemical-biological protection properties |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2012139201A (en) | 2014-03-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Efremenko et al. | A simple and highly effective catalytic nanozyme scavenger for organophosphorus neurotoxins | |
| Parvaz et al. | A brief survey on the advanced brain drug administration by nanoscale carriers: with a particular focus on AChE reactivators | |
| Bigley et al. | The evolution of phosphotriesterase for decontamination and detoxification of organophosphorus chemical warfare agents | |
| Çokuğraş | Butyrylcholinesterase: structure and physiological importance | |
| Liu et al. | Enzyme therapeutics for systemic detoxification | |
| Zhang et al. | Butyrylcholinesterase nanocapsule as a long circulating bioscavenger with reduced immune response | |
| CN107530285B (en) | Detoxification using nanoparticles | |
| Wales et al. | Organophosphorus hydrolase as an in vivo catalytic nerve agent bioscavenger | |
| Goldsmith et al. | Catalytic bioscavengers as countermeasures against organophosphate nerve agents | |
| EP2142644B1 (en) | Mutated hyperthermophilic phosphotriesterases and uses thereof | |
| Iyengar et al. | Organophosphate-hydrolyzing enzymes as first-line of defence against nerve agent-poisoning: Perspectives and the road ahead | |
| Blum et al. | Inhibitory potency against human acetylcholinesterase and enzymatic hydrolysis of fluorogenic nerve agent mimics by human paraoxonase 1 and squid diisopropyl fluorophosphatase | |
| De Castro et al. | Organophosphorus degrading enzymes: Molecular basis and perspectives for enzymatic bioremediation of agrochemicals | |
| RU2525658C2 (en) | NANOSCALE ENZYME BIOCATALYST FOR in vivo DETOXIFICATION OF ORGANOPHOSPHOROUS COMPOUNDS | |
| JP2009545329A (en) | Long half-life recombinant butyrylcholinesterase | |
| Bajaj et al. | Refolded recombinant human paraoxonase 1 variant exhibits prophylactic activity against organophosphate poisoning | |
| Katyal et al. | Enhancing organophosphate hydrolase efficacy via protein engineering and immobilization strategies | |
| Wong et al. | Shielded α-nucleophile nanoreactor for topical decontamination of reactive organophosphate | |
| KR20090078324A (en) | Anti-cocaine compositions and treatment | |
| Petrikovics et al. | Nano-intercalated organophosphorus-hydrolyzing enzymes in organophosphorus antagonism | |
| Doctor et al. | New approaches to medical protection against chemical warfare nerve agents | |
| US20110064716A1 (en) | Materials and methods for treating or preventing organophosphate exposure associated damage | |
| Thakur et al. | Packaging of diisopropyl fluorophosphatase (DFPase) in bacterial outer membrane vesicles protects its activity at extreme temperature | |
| Saxena et al. | Novel approaches to medical protection against chemical warfare nerve agents | |
| Allahyari et al. | Diisopropyl-fluorophosphatase as a Catalytic Bioscavenger |