RU2525658C2 - НАНОРАЗМЕРНЫЙ ФЕРМЕНТНЫЙ БИОКАТАЛИЗАТОР ДЛЯ ДЕТОКСИФИКАЦИИ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ in vivo - Google Patents
НАНОРАЗМЕРНЫЙ ФЕРМЕНТНЫЙ БИОКАТАЛИЗАТОР ДЛЯ ДЕТОКСИФИКАЦИИ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ in vivo Download PDFInfo
- Publication number
- RU2525658C2 RU2525658C2 RU2012139201/10A RU2012139201A RU2525658C2 RU 2525658 C2 RU2525658 C2 RU 2525658C2 RU 2012139201/10 A RU2012139201/10 A RU 2012139201/10A RU 2012139201 A RU2012139201 A RU 2012139201A RU 2525658 C2 RU2525658 C2 RU 2525658C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- biocatalyst
- enzyme
- block copolymer
- enzymatic
- covalent
- Prior art date
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 126
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 126
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 150000002903 organophosphorus compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 6
- 229940058344 antitrematodals organophosphorous compound Drugs 0.000 title abstract 2
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 claims abstract description 55
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 claims abstract description 26
- 229920000867 polyelectrolyte Polymers 0.000 claims abstract description 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 claims abstract description 10
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 229920002643 polyglutamic acid Polymers 0.000 claims abstract description 5
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 36
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 25
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 24
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 16
- 108010053512 phosphorylphosphatase Proteins 0.000 claims description 10
- 108010020346 Polyglutamic Acid Proteins 0.000 claims description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 abstract description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 19
- 230000007423 decrease Effects 0.000 abstract description 10
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 abstract description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 abstract description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000002625 immunotoxic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 abstract 1
- 231100000110 immunotoxic Toxicity 0.000 abstract 1
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract 1
- -1 polyethylene Polymers 0.000 abstract 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 abstract 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 abstract 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 16
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 15
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 239000000729 antidote Substances 0.000 description 9
- 239000003987 organophosphate pesticide Substances 0.000 description 8
- WYMSBXTXOHUIGT-UHFFFAOYSA-N paraoxon Chemical compound CCOP(=O)(OCC)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WYMSBXTXOHUIGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229960004623 paraoxon Drugs 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 8
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 7
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 7
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 7
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 4
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical group OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000002887 neurotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 3
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 108010008184 Aryldialkylphosphatase Proteins 0.000 description 2
- 102000006996 Aryldialkylphosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- DYAHQFWOVKZOOW-UHFFFAOYSA-N Sarin Chemical compound CC(C)OP(C)(F)=O DYAHQFWOVKZOOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GRXKLBBBQUKJJZ-UHFFFAOYSA-N Soman Chemical compound CC(C)(C)C(C)OP(C)(F)=O GRXKLBBBQUKJJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940075522 antidotes Drugs 0.000 description 2
- 239000002575 chemical warfare agent Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 239000000447 pesticide residue Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930003347 Atropine Natural products 0.000 description 1
- 239000007989 BIS-Tris Propane buffer Substances 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005944 Chlorpyrifos Substances 0.000 description 1
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 1
- 102220474557 Connector enhancer of kinase suppressor of ras 1_C12S_mutation Human genes 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 102000002004 Cytochrome P-450 Enzyme System Human genes 0.000 description 1
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- RKUNBYITZUJHSG-UHFFFAOYSA-N Hyosciamin-hydrochlorid Natural products CN1C(C2)CCC1CC2OC(=O)C(CO)C1=CC=CC=C1 RKUNBYITZUJHSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035051 Malignant migrating focal seizures of infancy Diseases 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 description 1
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 208000007964 Organophosphate Poisoning Diseases 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 108090000754 Phosphoric Triester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004203 Phosphoric Triester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 208000005374 Poisoning Diseases 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- RKUNBYITZUJHSG-SPUOUPEWSA-N atropine Chemical compound O([C@H]1C[C@H]2CC[C@@H](C1)N2C)C(=O)C(CO)C1=CC=CC=C1 RKUNBYITZUJHSG-SPUOUPEWSA-N 0.000 description 1
- 229960000396 atropine Drugs 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 231100000481 chemical toxicant Toxicity 0.000 description 1
- SBPBAQFWLVIOKP-UHFFFAOYSA-N chlorpyrifos Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC1=NC(Cl)=C(Cl)C=C1Cl SBPBAQFWLVIOKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000005 chromosome aberration Toxicity 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 231100000313 clinical toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000007797 corrosion Effects 0.000 description 1
- 238000005260 corrosion Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000000495 cryogel Substances 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- FHIVAFMUCKRCQO-UHFFFAOYSA-N diazinon Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC1=CC(C)=NC(C(C)C)=N1 FHIVAFMUCKRCQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003673 groundwater Substances 0.000 description 1
- 238000011597 hartley guinea pig Methods 0.000 description 1
- 238000001597 immobilized metal affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 231100000386 immunotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007688 immunotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 208000012054 malignant migrating partial seizures of infancy Diseases 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical compound CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 231100000623 nanotoxicology Toxicity 0.000 description 1
- 230000037125 natural defense Effects 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N parathion Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RLBIQVVOMOPOHC-UHFFFAOYSA-N parathion-methyl Chemical compound COP(=S)(OC)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 RLBIQVVOMOPOHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 150000003009 phosphonic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000004014 plasticizer Substances 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 1
- 229920000765 poly(2-oxazolines) Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- JBKPUQTUERUYQE-UHFFFAOYSA-O pralidoxime Chemical compound C[N+]1=CC=CC=C1\C=N\O JBKPUQTUERUYQE-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 102220115768 rs886039839 Human genes 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical group O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 239000012855 volatile organic compound Substances 0.000 description 1
- 239000002676 xenobiotic agent Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен ферментный биокатализатор в виде наноразмерных частиц для детоксификации фосфорорганических соединений in vivo. Биокатализатор представляет собой нековалентные полиэлектролитные комплексы. Данные комплексы состоят из полигистидин-содержащего полипептида со свойствами органофосфатгидролазы и блок-сополимера полиэтиленгликоля и полиглутаминовой кислоты в зарядовом соотношении фермент:блок-сополимер в диапазоне от 2:1 до 1:5. Изобретение обеспечивает существенное упрощение технологии получения биокатализатора, увеличение его каталитической эффективности, снижение вводимой дозы, уменьшение иммунотоксичного эффекта, а также повышение активности в реакциях гидролиза пестицидов и отравляющих веществ. 3 з.п. ф-лы, 6 пр.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к ферментным биокатализаторам в виде наноразмерных частиц, представляющих собой нековалентные полиэлектролитные комплексы, сформированные полигистидин-содержащим полипептидом с активностью органофосфатгидролазы и блок-сополимером полиэтиленгликоля с полианионом и предназначенных для детоксификации фосфорорганических соединений (ФОС) in vivo путем их гидролиза. Изобретение может быть использовано в качестве антидота для профилактики и элиминирования интоксикации, вызванной попаданием ФОС в организм человека или животных в результате чрезвычайных ситуаций (катастроф и террористических актов) или регулярного контакта с ФОС при их производстве, применении, хранении и утилизации.
ФОС представляют собой эфиры ортофосфорной и алкилфосфоновой кислот, а также их производных. К их числу относятся пестициды, широко применяемые в сельском, приусадебном и домашнем хозяйстве, а также ингибиторы коррозии, применяемые в теплоэнергетике, нефте- и газодобывающей промышленности, пластификаторы и стабилизаторы, используемые в строительной промышленности, в составе моющих и чистящих средств промышленного назначения, а также высокотоксичные боевые отравляющие вещества нервно-паралитического действия зоман, зарин, Vx и продукты их разложения (метилфосфоновая кислота и ее эфиры) [Kwong T.C. Organophosphate pesticides: biochemistry and clinical toxicology. // Ther. Drug. Monk., 2002, V.24(1), p.144-149; Юфит С.С. Яды вокруг нас. Вызов человечеству.// М.: Классик Стиль, 2002, 368 с.; Абрамов В.В. и др. (ред. Путилова В.Я.). Современные природоохранные технологии в электроэнергетике: Информационный сборник. // М.: Издат. дом МЭИ, 2007, 388 с.; Москвичев Ю.А., Фельдблюм В.Ш. Химия в нашей жизни (продукты органического синтеза и их применение). // Изд-во ЯГТУ, 2007, Ярославль, с.244-250].
Ежегодное производство, хранение и применение ФОС в объеме сотен тысяч тонн [Gold, R.S., Wales, M.E., Grimsly, J.K., Green solution for chemical problems. // Disarm. Technol., 2000, V.23, p.263-286] для нужд сельского хозяйства, а также низкие скорости разложения ФОС в условиях окружающей среды приводят к накоплению и обнаружению этих веществ первоначально в почве. Далее происходит попадание ФОС в грунтовые и речные воды, продукты питания, табачные и хлопчатобумажные изделия, домашнюю пыль [Obendorf, S.K., Lemley, A.T., Hedge, A., Kline, A.A., Tan, К., Dokuchaeva, Т., Distribution of pesticide residues within homes in central New York state. // Arch. Environ. Contam. Toxicol., 2006, V.50(1), p.31-44; Lemley, A., Hedge, A., Obendorf, S.K., Hong, S., Kim, J., Muss, T.M., Varner, C.J., Selected pesticide residues in house dust from farmers homes in central New York state. // Bull. Environ. Contamin. Toxicol., 2002, V.69(2), p.155-163]. Проникновение ФОС в организм животных и в том числе человека может происходить не только вместе с водой и продуктами питания (перорально), но и ингаляторно - при дыхании, а также трансдермально при непосредственном контакте с ними. ФОС оказывают на организм человека нейротоксичное воздействие, которое в зависимости от концентрации ФОС может быть острым или отдаленным. Также ФОС являются мутагенами, вызывающими хромосомную аберрацию, при этом негативный эффект, как правило, носит кумулятивный характер.
Согласно Международной конвенции о химическом разоружении [United Nation, Convention on the prohibition of the development, production, stockpiling and use of chemical weapons and on their destruction, corrected version in accordance with Depositary Notification C.N.246.1994. <http://www.opcw.org/html/db/cwc/eng/cwc_frameset.html>] на территории Российской Федерации и США должны быть уничтожены фосфорорганические боевые отравляющие вещества (зарин, зоман и Vx). Безопасность этого процесса может быть обусловлена наличием комплекса высокоэффективных защитных средств, включая те, что могут быть применены in vivo путем их введения непосредственно в организм для профилактики и элиминирования нейротоксичного эффекта ФОС.
Известно, что ферментные системы кожи, крови, внутренних органов участвуют в естественной защите человека от эндогенных и экзогенных ядов. Роль ферментов печени, легких и почек, цитохромов Р450, оксидаз, трансфераз и амидокарбоксилэстераз в метаболизме лекарств и ксенобиотиков хорошо известна. Признана также важность эстераз плазмы крови в инактивации многочисленных токсикантов. Эти ферменты формируют эндогенные барьеры, защищающие физиологические системы от отдельных токсикантов, и, несмотря на то, что процессы ферментативной детоксификации протекают в соответствии с разными механизмами, их часто называют «биоловушками» токсикантов [Массой П., Рошу Д. Каталитические «биоловушки» против токсических эфиров, альтернативный подход для профилактики и лечения отравлений. // Acta naturae, 2009, №1, с.68-78], поскольку большей частью, взаимодействуя с токсикантами, ферменты либо необратимо инактивируются при детоксификации ФОС, образуя с ними высокоустойчивые комплексы, либо эти ферменты проявляют низкую гидролитическую активность и, образуя фермент-субстратный комплекс, надолго выбывают из процесса детоксификации. В этой связи актуально применение в качестве основы для антидотных средств тех ферментов, что обладают широким гидролитическим субстратным спектром действия и высокой каталитической активностью по отношению к ФОС.
Детоксификация различных ФОС с помощью таких биокатализаторов, как ферменты, имеет ряд преимуществ, а именно она проходит в мягких условиях, и продукты гидролиза, как правило, являются биологически деградируемыми соединениями. На сегодняшний день наиболее высоко активным ферментом, осуществляющим биодеструкцию самого широкого спектра ФОС, является органофосфатгидролаза (ОРН, ЕС 3.1.8.1, арилдиалкилфосфатаза), катализирующая гидролиз эфирной связи в производных ортофосфорной и фосфоновой кислот [Ефременко Е.Н., Варфоломеев С.Д. Ферменты деструкции фосфорорганических нейротоксинов. // Успехи биол. химии, Т.44, 2004, с.307-340].
На сегодняшний день известно несколько ферментных биокатализаторов, созданных на основе ОРН, для использования в качестве антидотов против нейротоксичного действия ФОС in vivo.
Известен иммобилизованный биокатализатор, полученный для детоксификации ФОС in vivo в виде ОРН, модифицированной пэгилированием [Jun D., Musilová L., Link M., Loiodice M., Nachon F., Rochu D., Renault F., Masson P. Preparation and characterization of methoxy polyethylene glycol-conjugated phosphotriesterase as a potential catalytic bioscavenger against organophosphate poisoning. // Chem.-Biol. Interact., 2010, V.187, p.380-383; Trovaslet-Leroy M., Musilova L., Renault F., Brazzolotto X., Misik J., Novotny L., Froment M.T., Gillon E., Loiodice M., Verdier L., Masson P., Rochu D., Jun D., Nachon F. Organophosphate hydrolases as catalytic bioscavengers of organophosphorus nerve agents. // Toxicol. Lett., 2011, V. 206 (1), p.14-23]. Для этого ПЭГ с молекулярной массой 2 или 5 кг/моль посредством концевой альдегидной группы ковалентно пришивают к NH2-группам лизина, находящимся на поверхности молекулы ОРН. Полимер растворяют в 200 мМ боратном буфере (рН 8,5), содержащем 0,1 мМ CoCl2 и восстанавливающий агент - цианоборгидрид натрия, и смешивают с ферментом в оптимальном мольном соотношении ОРН:ПЭГ:NaBH3CN равном 1:1200:48000 для ПЭГ с молекулярной массой 2 кг/моль или 1:800:40000 для ПЭГ с молекулярной массой 5 кг/моль при температуре 25°С в течение 24 ч. Реакцию останавливают добавлением 10% масс. раствора глицина, после чего удаляют непрореагировавший полимер ультрафильтрацией. С 1 моль фермента связывается до 16 моль ПЭГ.
Период полуинактивации такого ферментного биокатализатора при 37°С составляет 12,3 ч при введении препарата внутримышечно в дозе 1,19 мг/кг самкам крыс марки Wistar. При внутримышечном введении клиренс препарата не определяется.
К недостаткам описанного биокатализатора следует отнести:
- развитие иммунного ответа у животных независимо от типа ПЭГ, используемого для модификации ОРН;
- используется длительная и трудоемкая процедура получения пэгилированного фермента, в результате которой теряется 50% ферментативной активности;
- отсутствие данных по каталитическим характеристикам и возможности детоксификации других ФОС, кроме Параоксона, а также отсутствие данных по диапазону рН и температурного действия данного биокатализатора не позволяет оценить потенциал его практического применения.
Известны биокатализаторы, представляющие собой конъюгаты ОРН с полиэтиленгликолем (ПЭГ), полученные в результате ковалентной модификации поверхности фермента [Novikov B.N., Grimsley J.K., Kern R.J., Wild J.R., Wales M.E. Improved pharmacokinetics and immunogenicity profile of organophosphorus hydrolase by chemical modification with polyethylene glycol. // J. Control. Release, 2010, V.146, p.318-325]. Для этого используют короткоцепочечные преполимеры с молекулярной массой от 333 до 686 г/моль, состоящие из 4, 8 или 12 звеньев этиленгликоля с концевой сукцинимидной группой, способной связываться с остатками лизина или аргинина на поверхности белка, или разветвленный полимер ПЭГ4-[ПЭГ12]3 (ПЭГ40) с наибольшей из всех молекулярной массой 2421 г/моль. Модификацию ОРН проводят в 10 мМ фосфатном буфере (рН 8,4), содержащем 20 мМ KCl и 50 мкМ CoCl2. Фермент в концентрации 1 г/л смешивают с полимером в мольном соотношении фермент:полимер, равном 1:800. Смесь выдерживают при +25°С в течение 30 мин, а затем экспонируют при +4°С в течение 12 ч. После этого модифицированный фермент диализуют против исходного буфера. Максимальная активность биокатализатора наблюдается при связывании 1 моль фермента с 6 моль ПЭГ40. Константа Михаэлиса наилучшего образца данного биокатализатора по Параоксону составляет 57±4 мкМ, каталитическая константа - 4629±23 с-1, а эффективность каталитического действия - 8,1×107 M-1c-1.
Основными недостатками этого биокатализатора являются:
- все образцы биокатализатора вызывают сильнейший иммунный ответ после внутривенного введения морским свинкам марки Dunkin Hartley в дозе 0,75 мг/кг, что подтверждено обнаружением специфических антител к ОРН в плазме крови исследованных животных;
- используется длительная и трудоемкая процедура получения пэгилированного фермента, в результате которой теряется до 75% ферментативной активности.
Известен ферментный биокатализатор на основе ОРН, нанокапсулированной в полиоксазолиновый разветвленный полимер и предназначенный для применения в качестве антидота [Petrikovics I., Wales М.Е., Jaszberenyi J.C., Budai M., Baskin S.I., Szilasi M., Logue B.A., Chapela P., Wild J.R. Enzyme-based intravascular defense against organophosphoms neurotoxins: Synergism of dendritic-enzyme complexes with 2-PAM and atropine. // Nanotoxicology, 2005, V.1(2), p.85-92]. Препарат получают в 50 мМ бис-трис-пропановом буфере (рН 8,5) путем смешивания полимера с ферментом в весовом соотношении 20:1. Конечная концентрация комплекса составляет 20 г/л, который далее лиофилизуют. Активность готового препарата составляет 1-5 Ед./мгпреп, или в пересчете на фермент - 48-238 Ед./гбелка. Внутривенное введение такого ферментного биокатализатора мужским особям мышей марки Balb/c в дозе 500-2500 мг/кг позволяет улучшить в 2,85 раза защиту животных от токсичного действия Параоксона, вводимого внутрибрюшинно через 1 ч после введения биокатализатора, по сравнению с результатом применения неинкапсулированного фермента в тех же условиях.
Вместе с этим описанный ферментный биокатализатор обладает рядом существенных недостатков, а именно:
- низкая удельная активность антидота приводит к необходимости введения его в огромных дозах для достижения целевого эффекта, что существенно усложняет саму процедуру введения, поскольку в расчете на 1 человека применяемая доза достигает 150 г сухого препарата внутривенно, а потому ставит вопрос об иммунотоксичности биокатализатора, экономической обоснованности и практической целесообразности использования подобного антидота;
- отсутствие данных по каталитическим характеристикам и возможности детоксификации других ФОС, кроме Параоксона, а также отсутствие данных по диапазону рН и температурного действия, термостабильности, фармакокинетических данных действия данного биокатализатора не позволяет оценить потенциал его практического применения.
Данное техническое решение как наиболее близкое к заявляемому по своему назначению и способу получения, а именно получению наноразмерного биокатализатора с органофосфатгидролазной активностью, представляющего собой нековалентный комплекс фермента с полимером и предназначенного для детоксификации ФОС, принято за прототип.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка ферментного биокатализатора в виде наноразмерных частиц для детоксификации ФОС in vivo, представляющих собой высокоактивные и термостабильные нековалентные полиэлектролитные комплексы с широким субстратным спектром действия.
Поставленная задача решается тем, что ферментный биокатализатор в виде наноразмерных частиц для детоксификации фосфорорганических соединений in vivo получают в виде нековалентных полиэлектролитных комплексов, сформированных при рН 7,5-10,5 и температуре +8÷30°С полигистидин-содержащим полипептидом со свойствами органофосфатгидролазы и блок-сополимером полиэтиленгликоля с полианионом в виде полиглутаминовой кислоты разной степени полимеризации, взятыми в зарядовом соотношении фермент:блок-сополимер в диапазоне от 2:1 до 1:5.
В качестве основного каталитического начала в предлагаемом изобретении используется оригинальный полигистидин-содержащий полипептид с активностью органофосфатгидролазы, который характеризуется существенно улучшенными по отношению к исходному ферменту органофосфатгидролазе каталитическими характеристиками, позволяющими использовать его для гидролиза фосфорорганических отравляющих веществ в более широком диапазоне рН и температуры, а также проводить более эффективный и быстрый гидролиз различных ФОС [Патент РФ 2255975, МПК7 C12N 1/21, C12N 15/52, C12N 15/70. Рекомбинантная плазмидная ДНК pTES-His-OPH и продуцент олигогистидинсодержащей органофосфатгидролазы; Патент РФ 2296164, МПК7 C12S 13/00, A62D 3/00. Способ ферментативного гидролиза боевых отравляющих веществ. Вотчицева Ю.А., Ефременко Е.Н., Алиев Т.К., Варфоломеев С.Д. (2006) Свойства гексагистидин-содержащей органофосфатгидролазы» // Биохимия, Т.76 (2), с.216-222; Гудков Д.А., Вотчицева Ю.А., Ефременко Е.Н. (2006). Гидролиз параоксона, катализируемый органофосфатгидролазой, содержащей полигистидиновую последовательность на С-конце молекулы белка. // Вестник МГУ, сер. Хим., Т.47(1), с.15-20].
Наличие полигистидиновой последовательности в молекуле полипептида позволяет проводить быструю очистку и выделение такого фермента из клеток E.coli в одну стадию за счет образования множественных координационных связей между молекулой гибридного белка и металл-хелатирующими носителями [Efremenko E., Votchitseva Y., Plieva F., Galaev I., Mattiasson B. (2006). Purification of His6-organophosphate hydrolase using monolithic supermacroporous polyacrylamide cryogels developed for immobilized metal affinity chromatography. // Appl. Microb. Biotech., V.70 (5), p.558-563], и, следовательно, масштабирование процесса его наработки с целью использования при получении заявляемого ферментного биокатализатора легко реализуемо.
Ранее данный полипептид для целей его применения в качестве антидота не использовался.
Для стабилизации ферментативной активности полигистидин-содержащего пептида в крови при его непосредственном введении в организм, согласно заявляемому изобретению, формируют нековалентный полиэлектролитный комплекс, для чего ферментный раствор смешивают в определенном соотношении с раствором блок-сополимера полиэтиленгликоля и полианиона. Получение такого комплекса способствует формированию наноразмерных частиц, удобных для применения in vivo [Patent WO 2008/141155 A1, 2008; Compositions for protein delivery and methods of use thereof; A61K 38/16; A61K 38/28] и использования в процессе детоксификации нейротоксинов. Кроме того, поскольку такая модификация поверхности фермента способствует снижению его иммуногенности как чужеродного белка, вводимого в организм животных, в том числе человека, а также позволяет увеличить время пребывания фермента в организме в каталитически активной форме за счет увеличения его стабильности и снижения его доступности к гидролитическому воздействию литических ферментов крови.
В качестве блок-сополимера для модификации полигистидин-содержащего полипептида с активностью ОРН в заявляемом изобретении используется блок-сополимер полиэтиленгликоля и полиглутаминовой кислоты, имеющей разную степень полимеризации. Такое техническое решение обеспечивает формирование устойчивого полиэлектролитного комплекса между положительно заряженными функциональными группами, локализованными на стороне, противоположной активному центру фермента, и полианионом. При этом блок-сополимер не затрагивает активный центр фермента, позволяя сохранять его высокую активность, но при этом существенно стабилизирует активную конформацию белка. Физический метод стабилизации полипептида, используемый в заявляемом изобретении, в отличие от ковалентного метода, применяемого в аналогах, гарантирует максимальное сохранение исходных характеристик фермента.
Диапазон варьирования зарядового соотношения фермента и блок-сополимера (от 2:1 до 1:5), применяемый для получения заявляемого биокатализатора, выбран экспериментально и обеспечивает получение высокоактивного и термостабильного ферментного биокатализатора в виде наноразмерных частиц (в среднем 29±4 нм). Увеличение этого соотношения в сторону повышения доли фермента приводит к снижению стабильности его действия в диапазоне рН 7,0-12,0 и температуры 15-60°С, а увеличение доли полимера в соотношении фермент:полимер свыше 1:5 приводит к снижению каталитической активности биокатализатора и не приводит к заметному улучшению термостабильности ферментного биокатализатора.
Такое сочетание всех основных компонентов наноразмерного ферментного биокатализатора, которое указано в заявляемом техническом решении, да еще к тому же при заявляемых соотношениях фермента и блок-сополимера, эффективное взаимодействие которых осуществляется при рН 7,5-10,5 и температуре +8-30°С, ранее известно не было и позволяет характеризовать предлагаемое техническое решение как новое.
Ниже приводятся конкретные примеры реализации заявляемого технического решения.
Пример 1. Ферментный биокатализатор в виде наноразмерных частиц на основе His6-OPH и ПЭГ-ПГК50 в зарядовом соотношении 2:1.
К очищенному ферменту His6-OPH, находящемуся в 100 мМ карбонатном буфере (рН 10,5) в концентрации 1 г/л, добавляют 20 г/л водный раствор ПЭГ119-ПГК50 (MW=13 кг/моль) так, чтобы концентрация блок-сополимера составила 0,09 г/л. Приготовленную смесь оставляют при комнатной температуре на 30 мин для формирования ферментного биокатализатора в виде нековалентного полиэлектролитного комплекса с зарядовым соотношением фермента и блок-сополимера 2:1.
Полученный ферментный биокатализатор имеет размер частиц 29±4 нм, обладает каталитической константой действия по фосфорорганическому пестициду Параоксону 5010±60 с-1, константой Михаэлиса 16,7±0,9 мкМ и константой эффективности действия (3,0±0,2)×108 М-1с-1, функционирует в диапазоне рН 7,0-12,0 и температур 15-60°С. Каталитическая константа действия по фосфорорганическому пестициду Хлорпирифосу составляет 482±25 с-1, константа Михаэлиса - 150±10 мкМ и константа эффективности действия - (3,2±0,4)×106 М-1с-1. Снижение активности данного биокатализатора, выдержанного при 55°С в течение 15 мин, составляет менее 5%. Расчетный период полуинактивации биокатализатора при 37°С составляет как минимум 500 ч. При внутривенном введении ферментного биокатализатора в дозе 1 мг/кг клиренс у белых крыс (скорость выведения, CL) составляет 27,6 мл/ч. Специфические антитела к ферментному биокатализатору этого состава при его введении в указанной дозе в плазме крови исследованных животных отсутствуют.
Пример 2. Ферментный биокатализатор в виде наноразмерных частиц на основе His6-OPH и ПЭГ-ПГК10 в зарядовом соотношении 1:1.
К очищенному ферменту His6-OPH, находящемуся в 50 мМ фосфатно-солевом буфере (рН 7,5) в концентрации 1 г/л, добавляют 20 г/л водный раствор ПЭГ119-ПГК10 (MW=6.5 кг/моль) так, чтобы концентрация блок-сополимера составила 0,45 г/л. Приготовленную смесь оставляют при температуре +8°С на 40 мин для формирования ферментного биокатализатора в виде нековалентного полиэлектролитного комплекса с зарядовым соотношением фермента и блок-сополимера 1:1.
Полученный ферментный биокатализатор имеет размер частиц 30±5 нм, обладает каталитической константой действия по фосфорорганическому пестициду Паратиону 1040±80 с-1, константой Михаэлиса 20,1±1,7 мкМ и константой эффективности действия (5,2±0,8)×107 M-1c-1, функционирует в диапазоне рН 7,0-12,0 и температур 15-60°С. Каталитическая константа действия по фосфорорганическому пестициду Диазинону составляет 85,6±5,1 с-1, константа Михаэлиса - 202±13 мкМ и константа эффективности действия - (4,2±0,5)×105 М-1с-1. Снижение активности данного биокатализатора, выдержанного при 55°С в течение 15 мин, составляет менее 3%. При внутривенном введении ферментного биокатализатора в дозе 1 мг/кг клиренс у белых крыс (скорость выведения, CL) составляет 28,2 мл/ч. Специфические антитела к ферментному биокатализатору этого состава при его введении в указанной дозе в плазме крови исследованных животных отсутствуют.
Пример 3. Ферментный биокатализатор в виде наноразмерных частиц на основе His6-OPH и ПЭГ-ПГК50 в зарядовом соотношении 1:2.
К очищенному ферменту His6-OPH, находящемуся в 100 мМ карбонатном буфере (рН 9,5) в концентрации 1 г/л, добавляют 20 г/л водный раствор ПЭГ119-ПГК50 (MW=13 кг/моль) так, чтобы концентрация блок-сополимера составила 0,36 г/л. Приготовленную смесь оставляют при температуре 30°С на 20 мин для формирования ферментного биокатализатора в виде нековалентного полиэлектролитного комплекса с зарядовым соотношением фермента и блок-сополимера 1:2.
Полученный ферментный биокатализатор имеет размер частиц 28±3 нм, обладает каталитической константой действия по фосфорорганическому пестициду Метилпаратиону 309±15 с-1, константой Михаэлиса 34,5±1,9 мкМ и константой эффективности действия (9,0±0,9)×106 M-c-1, функционирует в диапазоне рН 7,0-12,0 и температур 15-60°С. Снижение активности данного биокатализатора, выдержанного при 55°С в течение 15 мин, составляет менее 4%. При внутривенном введении ферментного биокатализатора в дозе 1 мг/кг клиренс у белых крыс (скорость выведения, CL) составляет 32,2 мл/ч. Специфические антитела к ферментному биокатализатору этого состава при его введении в указанной дозе в плазме крови исследованных животных отсутствуют.
Пример 4. Ферментный биокатализатор в виде наноразмерных частиц на основе His6-OPH и ПЭГ-ПГК50 в зарядовом соотношении 1:5.
К очищенному ферменту His6-OPH, находящемуся в 50 мМ карбонатном буфере (рН 10,5) в концентрации 1 г/л, добавляют 20 г/л водный раствор ПЭГ119-ПГК50 (MW=13 кг/моль) так, чтобы концентрация блок-сополимера составила 0,9 г/л. Приготовленную смесь оставляют при температуре 20°С на 30 мин для формирования ферментного биокатализатора в виде нековалентного полиэлектролитного комплекса с зарядовым соотношением фермента и блок-сополимера 1:5.
Полученный ферментный биокатализатор имеет размер частиц 27±4 нм, обладает каталитической константой действия по фосфорорганическому пестициду Параоксону 4190±100 с-1, константой Михаэлиса 38,0±1,7 мкМ и константой эффективности действия (1,1±0,1)×10 М-1с-1, функционирует в диапазоне рН 7,0-12,0 и температур 15-60°С. Каталитическая константа действия по фосфорорганическому пестициду Кумафосу составляет 335±15 с-1, константа Михаэлиса - 350±20 мкМ и константа эффективности действия - (9,6±1,0)×10 М-1с-1. Снижение активности данного биокатализатора, выдержанного при 55°С в течение 15 мин, составляет менее 5%. При внутривенном введении ферментного биокатализатора в дозе 1 мг/кг клиренс у белых крыс (скорость выведения, CL) составляет 41,5 мл/ч. Специфические антитела к ферментному биокатализатору этого состава при его введении в указанной дозе в плазме крови исследованных животных отсутствуют.
Пример 5. Ферментный биокатализатор в виде наноразмерных частиц на основе His12-OPH и ПЭГ-ПГК50 в зарядовом соотношении 1:4.
К очищенному ферменту His12-OPH, находящемуся в 50 мМ фосфатном буфере (рН 8,0) в концентрации 1 г/л, добавляют 20 г/л водный раствор ПЭГ119-ПГК50 (MW=13 кг/моль) так, чтобы концентрация блок-сополимера составила 0,72 г/л. Приготовленную смесь оставляют при комнатной температуре на 30 мин для формирования ферментного биокатализатора в виде нековалентного полиэлектролитного комплекса с зарядовым соотношением фермента и блок-сополимера 1:4.
Полученный ферментный биокатализатор имеет размер частиц 30±5 нм, обладает каталитической константой действия по фосфорорганическому пестициду Параоксону 4008±235 с-1, константой Михаэлиса 253±40 мкМ и константой эффективности действия (1,6±0,3)×107 М-1с-1, функционирует в диапазоне рН 7,0-12,0 и температур 15-60°С. Снижение активности данного биокатализатора, выдержанного при 55°С в течение 15 мин, составляет менее 2%. При внутривенном введении ферментного биокатализатора в дозе 1 мг/кг клиренс у белых крыс (скорость выведения, CL) составляет 37,6 мл/ч. Специфические антитела к ферментному биокатализатору этого состава при его введении в указанной дозе в плазме крови исследованных животных отсутствуют.
Пример 6. Свойства заявляемого ферментного биокатализатора как антидота in vivo при детоксификации отравляющего вещества Vx.
Ферментный биокатализатор в виде нековалентного полиэлектролитного комплекса с зарядовым соотношением фермента и блок-сополимера 1:5, полученный как описано в Примере 1, вводят внутривенно белым крысам марки Sprague Dawley в дозе 1 мг/кг. Через 1 ч крысам внутривенно вводят вещество Vx в дозе LD50, фиксируют гибель 25,0% животных и наблюдают уменьшение количества погибших животных в 2 раза по сравнению с контрольной группой.
Ферментный биокатализатор в виде нековалентного полиэлектролитного комплекса с зарядовым соотношением фермента и блок-сополимера 1:5, полученный как описано в Примере 4, вводят внутривенно белым крысам марки Sprague Dawley в дозе 1 мг/кг. Через 1 ч крысам внутривенно вводят вещество Vx в дозе LD50, фиксируют гибель 16,7% животных и наблюдают уменьшение количества погибших животных в 3 раза по сравнению с контрольной группой.
Таким образом, заявляемое изобретение в сравнении с известными аналогами и прототипом характеризуется:
- существенным упрощением технологии получения, не требующей применения сшивающих химических агентов, формирующих ковалентные связи между функциональными группами фермента и полимера, модифицирующего белковую поверхность;
- получение нековалентных комплексов вместо ковалентных, как основы формирования заявляемого ферментного биокатализатора, а также применение более каталитически активного, чем ОРН, полигистидин-содержащего полипептида позволяет значительно увеличить каталитическую эффективность действия получаемых наночастиц;
- высокая активность заявляемого ферментного биокатализатора позволяет значительно снизить вводимую дозу, существенным образом улучшив экономическую сторону применения подобных антидотов и уменьшив возможность их иммунотоксичного эффекта;
- заявляемый ферментный биокатализатор характеризуется существенным снижением количества полимера, используемого для получения наноразмерных стабильных частиц (снижение соотношения фермент:полимер от 1:400-800, характерной для аналогов и прототипа до 1:5 в максимуме для предлагаемого решения), что также улучшает экономическую характеристику заявляемого ферментного биокатализатора;
- заявляемый ферментный биокатализатор обладает широким субстратным спектром действия в отношении ФОС и проявляет высокую активность в реакциях гидролиза пестицидов и отравляющих веществ (на примере вещества Vx) in vivo.
Claims (4)
1. Ферментный биокатализатор в виде наноразмерных частиц для детоксификации фосфорорганических соединений in vivo, отличающийся тем, что представляет собой нековалентные полиэлектролитные комплексы, состоящие из полигистидин-содержащего полипептида со свойствами органофосфатгидролазы и блок-сополимера полиэтиленгликоля и полиглутаминовой кислоты, взятых в зарядовом соотношении фермент:блок-сополимер в диапазоне от 2:1 до 1:5.
2. Ферментный биокатализатор по п.1, отличающийся тем, что полиэлектролитные комплексы представляют собой наночастицы размером 29±4 нм, сформированные при рН 7,5-10,5 и температуре +8-(+30)°С.
3. Ферментный биокатализатор по п.1, отличающийся тем, что молекулярная масса блок-сополимера находится в диапазоне 6,5-13 кг/моль.
4. Ферментный биокатализатор по п.1, отличающийся тем, что полиглутаминовая кислота имеет степень полимеризации 50-100, полиэтиленгликоль - 119.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012139201/10A RU2525658C2 (ru) | 2012-09-13 | 2012-09-13 | НАНОРАЗМЕРНЫЙ ФЕРМЕНТНЫЙ БИОКАТАЛИЗАТОР ДЛЯ ДЕТОКСИФИКАЦИИ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ in vivo |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012139201/10A RU2525658C2 (ru) | 2012-09-13 | 2012-09-13 | НАНОРАЗМЕРНЫЙ ФЕРМЕНТНЫЙ БИОКАТАЛИЗАТОР ДЛЯ ДЕТОКСИФИКАЦИИ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ in vivo |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2012139201A RU2012139201A (ru) | 2014-03-27 |
| RU2525658C2 true RU2525658C2 (ru) | 2014-08-20 |
Family
ID=50342590
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012139201/10A RU2525658C2 (ru) | 2012-09-13 | 2012-09-13 | НАНОРАЗМЕРНЫЙ ФЕРМЕНТНЫЙ БИОКАТАЛИЗАТОР ДЛЯ ДЕТОКСИФИКАЦИИ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ in vivo |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2525658C2 (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2575627C1 (ru) * | 2014-12-18 | 2016-02-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | ФЕРМЕНТНЫЙ БИОКАТАЛИЗАТОР ДЛЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ in vivo |
| RU2615176C1 (ru) * | 2015-12-24 | 2017-04-04 | Елена Николаевна Ефременко | Криосформированный ферментный биокатализатор для детоксификации фосфорорганических соединений |
| RU2648169C1 (ru) * | 2017-01-16 | 2018-03-22 | Елена Николаевна Ефременко | Ферментный биокатализатор с антиоксидантной активностью для детоксификации фосфорорганических соединений |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2261911C1 (ru) * | 2004-03-18 | 2005-10-10 | Ефременко Елена Николаевна | Способ получения биокатализатора и биокатализатор для детоксикации фосфорорганических соединений |
| RU2451077C1 (ru) * | 2011-01-12 | 2012-05-20 | Химический Факультет Московского Государственного Университета Имени М.В. Ломоносова | Способ ферментативного гидролиза фосфорорганических соединений в почвогрунте |
-
2012
- 2012-09-13 RU RU2012139201/10A patent/RU2525658C2/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2261911C1 (ru) * | 2004-03-18 | 2005-10-10 | Ефременко Елена Николаевна | Способ получения биокатализатора и биокатализатор для детоксикации фосфорорганических соединений |
| RU2451077C1 (ru) * | 2011-01-12 | 2012-05-20 | Химический Факультет Московского Государственного Университета Имени М.В. Ломоносова | Способ ферментативного гидролиза фосфорорганических соединений в почвогрунте |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| PETRIKOVICS I., et al., Enzyme-based intravascular defense against organophosphoms neurotoxins: Synergism of dendritic-enzyme complexes with 2-PAM and atropine. // Nanotoxicology, 2005, V.1(2), p.85-92. * |
| ЕФРЕМЕНКО Е.Н., Гетерогенные биокатализаторы на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов: фундаментальные и прикладные аспекты, Автореферат, 2009, Москва, стр.28-33. ЛЯГИН И.В., Иммобилизованные биокатализаторы на основе полигистидинсодержащих производных органофосфатгидролазы: получение и свойства, Автореферат, 2009, Москва, стр.5-20 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2575627C1 (ru) * | 2014-12-18 | 2016-02-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | ФЕРМЕНТНЫЙ БИОКАТАЛИЗАТОР ДЛЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ in vivo |
| RU2615176C1 (ru) * | 2015-12-24 | 2017-04-04 | Елена Николаевна Ефременко | Криосформированный ферментный биокатализатор для детоксификации фосфорорганических соединений |
| RU2648169C1 (ru) * | 2017-01-16 | 2018-03-22 | Елена Николаевна Ефременко | Ферментный биокатализатор с антиоксидантной активностью для детоксификации фосфорорганических соединений |
| RU2780376C2 (ru) * | 2022-02-25 | 2022-09-22 | Елена Николаевна Ефременко | Самоочищающийся материал со свойствами химико-биологической защиты |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2012139201A (ru) | 2014-03-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Efremenko et al. | A simple and highly effective catalytic nanozyme scavenger for organophosphorus neurotoxins | |
| Lenz et al. | Stoichiometric and catalytic scavengers as protection against nerve agent toxicity: a mini review | |
| Çokuğraş | Butyrylcholinesterase: structure and physiological importance | |
| Nachon et al. | Progress in the development of enzyme-based nerve agent bioscavengers | |
| Zhang et al. | Butyrylcholinesterase nanocapsule as a long circulating bioscavenger with reduced immune response | |
| CN107530285B (zh) | 使用纳米粒子解毒 | |
| Wales et al. | Organophosphorus hydrolase as an in vivo catalytic nerve agent bioscavenger | |
| Iyengar et al. | Organophosphate-hydrolyzing enzymes as first-line of defence against nerve agent-poisoning: perspectives and the road ahead | |
| Katyal et al. | Enhancing organophosphate hydrolase efficacy via protein engineering and immobilization strategies | |
| Wong et al. | Shielded α-nucleophile nanoreactor for topical decontamination of reactive organophosphate | |
| Bajaj et al. | Refolded recombinant human paraoxonase 1 variant exhibits prophylactic activity against organophosphate poisoning | |
| Zou et al. | Dual-modal nanoscavenger for detoxification of organophosphorus compounds | |
| AU2007281998B2 (en) | Long half-life recombinant butyrylcholinesterase | |
| RU2525658C2 (ru) | НАНОРАЗМЕРНЫЙ ФЕРМЕНТНЫЙ БИОКАТАЛИЗАТОР ДЛЯ ДЕТОКСИФИКАЦИИ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ in vivo | |
| Atsmon et al. | Preclinical and first-in-human evaluation of PRX-105, a PEGylated, plant-derived, recombinant human acetylcholinesterase-R | |
| Petrikovics et al. | Nano-intercalated organophosphorus-hydrolyzing enzymes in organophosphorus antagonism | |
| Bird et al. | Enzymes and bioscavengers for prophylaxis and treatment of organophosphate poisoning | |
| Qin et al. | Enzyme-armed nanocleaner provides superior detoxification against organophosphorus compounds via a dual-action mechanism | |
| US20110064716A1 (en) | Materials and methods for treating or preventing organophosphate exposure associated damage | |
| Thakur et al. | Packaging of diisopropyl fluorophosphatase (DFPase) in bacterial outer membrane vesicles protects its activity at extreme temperature | |
| Lenz et al. | Nerve agent bioscavengers: protection against high-and low-dose organophosphorus exposure | |
| Mohamed et al. | Transitioning from oxime to the next potential organophosphorus poisoning therapy using enzymes | |
| Saxena et al. | Novel approaches to medical protection against chemical warfare nerve agents | |
| Mazor et al. | Aging-resistant organophosphate bioscavenger based on polyethylene glycol-conjugated F338A human acetylcholinesterase | |
| Ma et al. | N-terminal PEGylation enhances organophosphorus hydrolase catalysis for a promising fast and long-acting prophylactic candidate |