RU2522953C1

RU2522953C1 - Agent against myocardial hypoxia

Info

Publication number: RU2522953C1
Application number: RU2013127124/15A
Authority: RU
Inventors: Владимир Павлович Ширинский; Валерий Игнатьевич Капелько; Анатолий Фёдорович Ванин
Priority date: 2013-06-14
Filing date: 2013-06-14
Publication date: 2014-07-20

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to binuclear form of dinitrosyl iron complex with ethyl ether of glutathione (DNIC-EEG) of the formula [(EEGS)₂Fe₂(NO)₄] with the structural formula:

, where R-S represents ethyl ether of glutathione containing a thiol group. The invention also relates to a composition for reducing functional disorders of myocardium subjected to hypoxia-reoxygenation which contains binuclear form of dinitrosyl iron complex with ethyl ether of glutathione (DNIC EEG) as defined above and a pharmaceutically acceptable carrier. Also the use of DNIC-EEG is disclosed as antihypoxic agent.

EFFECT: reduction of hypoxic contracture, arrhythmias intensity and improvement of recovery of contractile function of the heart after reoxygenation.

3 cl, 1 tbl, 16 dwg, 4 ex

Description

Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION

Изобретение относится к области кардиологии и может быть использовано при окислительном стрессе, возникающем при гипоксии и реоксигенации, а также при ишемии и реперфузии сердца.The invention relates to the field of cardiology and can be used for oxidative stress arising from hypoxia and reoxygenation, as well as ischemia and reperfusion of the heart.

Уровень техникиState of the art

Известно использование различных веществ в качестве антигипоксических препаратов.The use of various substances as antihypoxic drugs is known.

Так, из литературы известны попытки поддержать синтез АТФ в митохондриях благодаря стимуляции субстратного фосфорилирования посредством добавления к гипоксическому перфузату глутамата и/или аспартата - субстратов цикла Кребса. В серии работ на изолированном сердце было показано, что ферменты цикла Кребса могут продуцировать некоторое количество АТФ даже в полностью аноксических условиях [Penney DG, Cascarano J. Anaerobic rat heart. Effects of glucose and tricarboxylic acid-cycle metabolites on metabolism and physiological performance. Biochem J. 1970; 118(2):221-7]. Добавление глутамата и/или аспартата позволяло поддерживать синтез АТФ, хотя и на значительно сниженном уровне - порядка 7% от нормального, что улучшало восстановление сократительной функции сердца при реоксигенации [Писаренко О.И, Соломатина Е.С, Студнева И.М, Иванов В.Э, Капелько В.И. Эффект экзогенных аминокислот на сократительную функцию и обмен азотистых соединений в аноксическом сердце. Кардиология 1982, 11, 63-67; Писаренко О.И., Соломатина Е.С., Студнева И.М., Иванов В.Э., Капелько В.И. Влияние экзогенной глутаминовой кислоты на анаэробное образование АТФ в мышце сердца. Биохимия 1984, 49, 2019-2025; Pisarenko O.I., Solomatina E.S., Studneva I.M., Ivanov V.E., Kapelko V.I., Smirmov V.N. On the mechanism of the enhanced ATP formation in hypoxic myocardium caused by glutamic acid. Basic Res. Cardiol. 1985, 80, 126-134].Thus, attempts to support ATP synthesis in mitochondria are known from the literature due to the stimulation of substrate phosphorylation by adding glutamate and / or aspartate, substrates of the Krebs cycle, to hypoxic perfusate. In a series of studies on an isolated heart, it was shown that Krebs cycle enzymes can produce some ATP even under completely anoxic conditions [Penney DG, Cascarano J. Anaerobic rat heart. Effects of glucose and tricarboxylic acid-cycle metabolites on metabolism and physiological performance. Biochem J. 1970; 118 (2): 221-7]. The addition of glutamate and / or aspartate made it possible to maintain ATP synthesis, albeit at a significantly reduced level - about 7% of normal, which improved the recovery of the contractile function of the heart during reoxygenation [Pisarenko O.I., Solomatina E.S., Studneva I.M., Ivanov V .E, Kapelko V.I. The effect of exogenous amino acids on the contractile function and metabolism of nitrogenous compounds in an anoxic heart. Cardiology 1982, 11, 63-67; Pisarenko O.I., Solomatina E.S., Studneva I.M., Ivanov V.E., Kapelko V.I. The effect of exogenous glutamic acid on the anaerobic formation of ATP in the heart muscle. Biochemistry 1984, 49, 2019-2025; Pisarenko O.I., Solomatina E.S., Studneva I.M., Ivanov V.E., Kapelko V.I., Smirmov V.N. On the mechanism of the enhanced ATP formation in hypoxic myocardium caused by glutamic acid. Basic Res. Cardiol. 1985, 80, 126-134].

Из литературы известно положительное действие различных антиоксидантов. Возникновение окислительного стресса при реоксигенации обусловлено взрывоподобным образованием активных форм кислорода в митохондриях. Образование активных форм кислорода уменьшалось под влиянием ловушки радикалов - тайрона или ингибиторов ксантиноксидазы или NADPH, что указывает на множественность путей образования свободных радикалов. Также и другой перехватчик свободных радикалов, N-ацилцистеин, существенно уменьшал нарушения сократительной функции после ишемии-реперфузии [Saini-Chohan HK, Dhalla NS. Attenuation of ischemia-reperfusion-induced alterations in intracellular Ca2+in cardiomyocytes from hearts treated with N-acetylcysteine and N-mercaptopropionyl-glycine. Can J Physiol Pharmacol. 2009; 87(12):1110-9.]. Однако тайрон является синтетическим токсичным продуктом и по этой причине не может быть использован в качестве лекарственного препарата, а N-ацилцистеин применяется в высоких дозировках (10-15 мМ), что нерентабельно. Другими, более естественными антиоксидантами являются витамины Е и С, бета-каротин, полифенолы, но попытки их применения в клинической практике не принесли ожидаемых результатов.From the literature, the positive effects of various antioxidants are known. The occurrence of oxidative stress during reoxygenation is due to the explosive formation of reactive oxygen species in mitochondria. The formation of reactive oxygen species decreased under the influence of a radical trap - tyrone or xanthine oxidase inhibitors or NADPH, which indicates the multiplicity of free radical formation pathways. Also, another free radical scavenger, N-acylcysteine, significantly reduced contractile dysfunction after ischemia-reperfusion [Saini-Chohan HK, Dhalla NS. Attenuation of ischemia-reperfusion-induced alterations in intracellular Ca2 + in cardiomyocytes from hearts treated with N-acetylcysteine and N-mercaptopropionyl-glycine. Can J Physiol Pharmacol. 2009; 87 (12): 1110-9.]. However, tyrone is a synthetic toxic product and for this reason cannot be used as a medicine, and N-acylcysteine is used in high doses (10-15 mmol), which is unprofitable. Other, more natural antioxidants are vitamins E and C, beta-carotene, polyphenols, but attempts to use them in clinical practice have not brought the expected results.

Из литературы известен антигипоксический эффект предшественника образования NO-L-аргинина. Добавление его к перфузату изолированного сердца в концентрации 3 мМ улучшало восстановление сократительной функции сердца после реоксигенации с 2 до 12% от исходного уровня (Angelos M.G., Kutala V.K., Torres C.A., He G., Stoner J.D., Mohammad M., Kuppusamy P. Hypoxic reperfusion of the ischemic heart and oxygen radical generation. Am J Physiol Heart Circ Physiol 290: H341-H347, 2006). При этом выяснилось, что эффект достигается только при добавлении аргинина к исходному перфузату, т.е. до гипоксии. Добавление же его в период гипоксии или реоксигенации оказалось неэффективным. В другой работе [Вассаrо С., Bennardini F., Dini G., Franconi F., Giotti A. Cardiac hypoxia and subsequent reoxygenation: sensitivity to L-arginine methylester. Br. J. Pharmac. 1986, 87, 649-656] было показано антиаритмическое действие L-метиларгинина (7,5 мМ), лучше проникающего через мембраны, во время гипоксии и реоксигенации. Эти работы показали определенную значимость оксида азота для уменьшения гипоксического повреждения миокарда, но применение их в миллимолярной концентрации ограничивает их возможное использование в качестве лекарственного препарата.The antihypoxic effect of the precursor of the formation of NO-L-arginine is known from the literature. Adding it to an isolated heart perfusate at a concentration of 3 mM improved the restoration of cardiac contractile function after reoxygenation from 2 to 12% of the initial level (Angelos MG, Kutala VK, Torres CA, He G., Stoner JD, Mohammad M., Kuppusamy P. Hypoxic reperfusion of the ischemic heart and oxygen radical generation. Am J Physiol Heart Circ Physiol 290: H341-H347, 2006). It was found out that the effect is achieved only by adding arginine to the initial perfusate, i.e. before hypoxia. Adding it during hypoxia or reoxygenation was ineffective. In another work [Vassaro S., Bennardini F., Dini G., Franconi F., Giotti A. Cardiac hypoxia and subsequent reoxygenation: sensitivity to L-arginine methylester. Br. J. Pharmac. 1986, 87, 649-656] the antiarrhythmic effect of L-methylarginine (7.5 mM), which penetrates better through membranes during hypoxia and reoxygenation, was shown. These works showed a certain significance of nitric oxide to reduce hypoxic damage to the myocardium, but their use in millimolar concentration limits their possible use as a medicine.

По результатам анализа патентных документов, к основным тенденциям защиты миокарда от повреждения при гипоксии относятся: применение антиоксидантов общего действия для снижения последствий окислительного стресса; применение блокаторов адренорецепторов для снижения потребности миокарда в кислороде; применение доноров оксида азота, который в умеренных количествах выступает как конкурент супероксида, препятствуя избыточному окислению внутриклеточных и мембранных белков; применение глутатиона и этилглутатиона для повышения уровня глутатионилирования внутриклеточных белков.According to the results of the analysis of patent documents, the main trends in protecting the myocardium from damage during hypoxia include: the use of general antioxidants to reduce the effects of oxidative stress; the use of adrenoreceptor blockers to reduce myocardial oxygen demand; the use of nitric oxide donors, which in moderation acts as a competitor to superoxide, preventing the excessive oxidation of intracellular and membrane proteins; the use of glutathione and ethyl glutathione to increase the level of glutathionylation of intracellular proteins.

В патенте RU 2325915 описан способ предупреждения ишемических и реперфузионных повреждений изолированного сердца с помощью липосом, вводимых в перфузат. Липосомы включают токоферол и содержат антиоксидантные ферменты (супероксиддисмутазу, каталазу) и восстановленный глутатион во внутренней фазе липосом. При этом перфузию проводят ретроградно через аортальную канюлю сначала оксигенированным раствором в течение 15 мин, а затем в течение 1-5 мин перфузируют неоксигенированным раствором с добавкой липосом, причем указанные процедуры проводят 2-5 раз с продолжительностью последующих периодов перфузии оксигенированным раствором 2-10 мин. Применение способа позволяет значительно улучшить восстановление сократительной функции и ритма сердца после длительной тотальной ишемии и реперфузии. Однако действие глутатиона не доказано, так как эффект антиоксидантных ферментов должен заведомо быть сильнее. Кроме того, модель постишемической реперфузии более сложна по сравнению с постгипоксической реоксигенацией (конечные продукты клеточного метаболизма остаются в клетках и еще более нарушают метаболизм).RU 2325915 describes a method for preventing ischemic and reperfusion injuries of an isolated heart using liposomes introduced into the perfusate. Liposomes include tocopherol and contain antioxidant enzymes (superoxide dismutase, catalase) and reduced glutathione in the internal phase of liposomes. In this case, perfusion is carried out retrograde through the aortic cannula, first with an oxygenated solution for 15 minutes, and then for 1-5 minutes is perfused with a non-oxygenated solution with the addition of liposomes, and these procedures are carried out 2-5 times with a duration of subsequent periods of perfusion with an oxygenated solution of 2-10 minutes . The application of the method can significantly improve the restoration of contractile function and heart rate after prolonged total ischemia and reperfusion. However, the effect of glutathione has not been proven, since the effect of antioxidant enzymes must obviously be stronger. In addition, the model of postischemic reperfusion is more complex than posthypoxic reoxygenation (the end products of cellular metabolism remain in the cells and further disrupt the metabolism).

Патент RU 2096034 раскрывает новый лекарственный препарат - фармацевтическую композицию, индуцирующую биосинтез глутатиона, активность глутатионтрансферазы и оказывающую антитоксическое, радиопротекторное и антигипоксическое действие, а также способы лечения и профилактики гипоксических состояний с ее использованием. Данный препарат предлагается использовать в медицине для повышения резистентности организма посредством избирательной индукции биосинтеза глутатиона и активности глутатионтрансфезы. В качестве действующего вещества композиция содержит эффективное количество смеси L-глутаминовой кислоты, глицина и серосодержащей аминокислоты, выбранной из группы, включающей цистеин, цистин и метионин, при массовом соотношении компонентов 1:1:1. В данном патенте используются три аминокислоты, из которых в клетках синтезируется глутатион. При этом сам глутатион был использован в качестве препарата сравнения, который по результатам исследований не оказывал должного эффекта. В числе примеров в патенте фигурирует и модель создания гипоксии изолированного сердца. Однако при этом авторами представлена информация о повышении содержания глутатиона в печени, но не в миокарде. Кроме того, по мнению авторов, повышенный уровень функции сердца в период гипоксии является положительным аргументом, но это весьма сомнительно, так как при этом расходуются запасы АТФ, что ухудшает восстановление деятельности сердца при реоксигенации. Кроме того, работа проведена на сердцах беременных самок с измененным метаболизмом; такой объект не может считаться адекватным для использования в качестве эталона миокарда.Patent RU 2096034 discloses a new drug - a pharmaceutical composition that induces the biosynthesis of glutathione, the activity of glutathione transferase and has an antitoxic, radioprotective and antihypoxic effect, as well as methods of treating and preventing hypoxic conditions using it. This drug is proposed to be used in medicine to increase the body's resistance through the selective induction of glutathione biosynthesis and the activity of glutathione transfeza. As an active substance, the composition contains an effective amount of a mixture of L-glutamic acid, glycine and a sulfur-containing amino acid selected from the group comprising cysteine, cystine and methionine, with a mass ratio of components 1: 1: 1. This patent uses three amino acids from which glutathione is synthesized in cells. At the same time, glutathione itself was used as a comparison drug, which, according to the results of studies, did not have the desired effect. Among the examples in the patent, there is also a model for creating hypoxia of an isolated heart. However, the authors provided information on the increase in the content of glutathione in the liver, but not in the myocardium. In addition, according to the authors, an elevated level of cardiac function during hypoxia is a positive argument, but this is very doubtful, since it consumes ATP reserves, which worsens the restoration of cardiac activity during reoxygenation. In addition, the work was carried out on the hearts of pregnant females with altered metabolism; such an object cannot be considered adequate for use as a myocardial standard.

Патент RU 2255756 раскрывает тетрапептид аланил-глутамил-аспартил-аргинин общей формулы Ala-Glu-Asp-Arg, обладающий биологической активностью, проявляющейся в восстановлении функции миокарда после ишемии (опубликован также как US 2008269141 (A1), WO 2006001728 (A1), ES 2302067 (Т3), ЕР 1758923 (A1), EP 1758923 (В1), EP 1758923 (В8), DE 602004011843 (Т2), АТ 386047 (Т), что свидетельствует о значимости данного технического решения). Изобретение относится к лекарственным средствам для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы и может быть использовано как средство, восстанавливающее функцию миокарда, при лечении различных форм данной патологии. Однако эффективность глутамата и аспартата была показана уже давно в лаборатории РКНПК (1983-1985 гг.), аргинин полезен как предшественник оксида азота.Patent RU 2255756 discloses an alanyl-glutamyl-aspartyl-arginine tetrapeptide of the general formula Ala-Glu-Asp-Arg having biological activity, which is manifested in the restoration of myocardial function after ischemia (also published as US 2008269141 (A1), WO 2006001728 (A1), ES 2302067 (T3), EP 1758923 (A1), EP 1758923 (B1), EP 1758923 (B8), DE 602004011843 (T2), AT 386047 (T), which indicates the significance of this technical solution). The invention relates to medicines for the treatment of diseases of the cardiovascular system and can be used as a means of restoring myocardial function in the treatment of various forms of this pathology. However, the effectiveness of glutamate and aspartate has been shown for a long time in the laboratory of RKNPK (1983-1985), arginine is useful as a precursor of nitric oxide.

В патентах RU 2011142254 и RU 2441873 использованы биядерные катионные нитрозильные комплексы железа, к которым в качестве действующего вещества присоединены антиметаболиты пуриновых оснований ДНК для подавления синтеза ДНК, или природные алифатические тиолилы, действие которых реализуется через апоптоз и цитотоксичность. В связи с чем, данные комплексы предлагается использовать в качестве противоопухолевых средств. Однако такое применение стоит далеко от задачи данного изобретения.In patents RU 2011142254 and RU 2441873, binuclear cationic nitrosyl iron complexes are used, to which antimetabolites of purine DNA bases are added as an active substance to suppress DNA synthesis, or natural aliphatic thiolyls, the effect of which is realized through apoptosis and cytotoxicity. In this connection, these complexes are proposed to be used as antitumor agents. However, such an application is far from the object of the present invention.

Наиболее близким по сути аналогом (прототипом) является патент RU 2438698 (МПК: А61К 38/28, А61К 33/14, А61К 31/7004, А61К 31/194, А61К 31/295, А61Р 9/00, Статус: по данным на 06.07.2012 - действует, приоритет 12.05.2010, Заявитель - Федеральное государственное учреждение "Российский кардиологический научно-производственный комплекс" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ФГУ "РКНПК" Минздравсоцразвития России) (RU), Российская Федерация в лице Министерства образования и науки Российской Федерации (Минобрнауки России). В патенте раскрыта ВОДОРАСТВОРИМАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ОБЛАДАЮЩАЯ СВОЙСТВАМИ КАРДИОПРОТЕКТОРА, которая может быть использована в качестве лекарственного средства при инфаркте миокарда и операциях на сердце в условиях искусственного кровообращения. Водорастворимая композиция для внутривенного введения содержит ингредиенты при следующем соотношении, мас.%: D-глюкоза 23,40-28,60, калия хлорид 0,14-0,16, калиевая соль L-аспарагиновой кислоты 0,81-0,99, полумагниевая соль L-аспарагиновой кислоты (магния L-аспарагинат) 0,72-0,88, инсулин человеческий генно-инженерный (в МЕ/л) 54,00-66,00, динитрозильный комплекс железа (II) (ДНЖК) с глутатионом 0,19-0,23, вода для инъекций остальное, при этом pH раствора 7,4±0,1 при 22°С. Применение композиции обеспечивает ограничение размеров инфаркта миокарда, восстановление метаболического состояния сердца при реперфузии, снижает повреждения мембран постишемических кардиомиоцитов при меньших нарушениях гемодинамики по сравнению с традиционно использующимися препаратами.The closest analogue (prototype) is the patent RU 2438698 (IPC: A61K 38/28, A61K 33/14, A61K 31/7004, A61K 31/194, A61K 31/295, A61P 9/00, Status: according to 07/06/2012 - valid, priority 05/12/2010, Applicant - Federal State Institution "Russian Cardiology Research and Production Complex" of the Ministry of Health and Social Development of the Russian Federation (FGU "RKNPK" Ministry of Health and Social Development of Russia) (RU), the Russian Federation represented by the Ministry of Education and Science of the Russian Federation (Ministry of Education and Science of Russia). The patent discloses WODORAS A CREATIVE COMPOSITION HAVING PROPERTIES OF A CARDIOPROTECTOR, which can be used as a medicine for myocardial infarction and cardiac operations under cardiopulmonary bypass. The water-soluble composition for intravenous administration contains ingredients in the following ratio, wt.%: D-glucose 23,40-28 , 60, potassium chloride 0.14-0.16, potassium salt of L-aspartic acid 0.81-0.99, semi-magnesium salt of L-aspartic acid (magnesium L-aspartate) 0.72-0.88, human insulin engineering (in IU / l) 54.00-66.00, dinitrozil ny complex iron (II) (DNZHK) 0,19-0,23 with glutathione, water for injections rest, the solution pH 7.4 ± 0.1 at 22 ° C. The use of the composition provides a limitation of the size of myocardial infarction, restoration of the metabolic state of the heart during reperfusion, reduces damage to the membranes of postischemic cardiomyocytes with less hemodynamic impairment compared to traditionally used drugs.

Однако известная из RU 2438698 композиция представляет собой сложную смесь, в которой помимо ДНКЖ присутствуют калиевые и магниевые соли аспарагиновой кислоты, а также инсулин; эти компоненты, как показано ранее (например, смесь ГИК - глюкоза, инсулин, калий, а также соли аспарагиновой кислоты), обладают самостоятельным защитным действием на ишемический миокард, поэтому вклад собственно ДНКЖ трудно идентифицировать. В данной работе показано, что под действием этой композиции происходит ограничение размера инфаркта, но совершенно не исследовано функциональное состояние миокарда в данной зоне. Поэтому остается неизвестным, изменяется ли состояние кальций-транспортирующих белков. При этом авторы использовали модель ишемии-реперфузии in vivo, которая помимо гипоксии включает в себя и собственно ишемические последствия - прекращение оттока продуктов метаболизма клеток, что ведет к сильному закислению цитоплазмы, которое само по себе прекращает сократительную активность. However, the composition known from RU 2438698 is a complex mixture in which, in addition to DNIC, potassium and magnesium salts of aspartic acid are present, as well as insulin; these components, as shown earlier (for example, a mixture of GIC - glucose, insulin, potassium, as well as salts of aspartic acid), have an independent protective effect on the ischemic myocardium, therefore, the contribution of DNIC itself is difficult to identify. In this paper, it is shown that under the influence of this composition, the size of the heart attack occurs, but the functional state of the myocardium in this zone has not been completely studied. Therefore, it remains unknown whether the state of calcium-transporting proteins changes. At the same time, the authors used an in vivo model of ischemia-reperfusion, which, in addition to hypoxia, also includes the ischemic consequences proper - the cessation of the outflow of cell metabolism products, which leads to a strong acidification of the cytoplasm, which itself terminates contractile activity.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Задачей изобретения является создание средства для предупреждения и лечения гипоксического повреждения миокарда, которое было бы более эффективно, чем известные средства для этих целей.The objective of the invention is to provide means for the prevention and treatment of hypoxic damage to the myocardium, which would be more effective than known means for these purposes.

Техническим результатом, на достижение которого направлено заявленное изобретение, является уменьшение гипоксической контрактуры, интенсивности аритмий и улучшение восстановления сократительной функции сердца после реоксигенации.The technical result, the achievement of which the claimed invention is directed, is to reduce hypoxic contracture, the intensity of arrhythmias and improve the recovery of contractile function of the heart after reoxygenation.

Данный технический результат обеспечивается созданием биядерной формы динитрозильного комплекса железа с этиловым эфиром глутатиона (ДНКЖ-ЭЭГ) [(EEGS)₂Fe₂(NO)₄] и композиции для уменьшения функциональных нарушений миокарда, подвергнутого гипоксии-реоксигенации, на его основе.This technical result is ensured by the creation of a binuclear form of a dinitrosyl complex of iron with glutathione ethyl ester (DNIC-EEG) [(EEGS) ₂ Fe ₂ (NO) ₄ ] and a composition for reducing functional disorders of the myocardium subjected to hypoxia-reoxygenation based on it.

Биядерная форма динитрозильного комплекса железа с этиловым эфиром глутатиона (ДНКЖ-ЭЭГ) формулы [(EEGS)₂Fe₂(NO)₄] имеет структурную формулу:The binuclear form of the dinitrosyl complex of iron with glutathione ethyl ester (DNIC-EEG) of the formula [(EEGS) ₂ Fe ₂ (NO) ₄ ] has the structural formula:

где R-S обозначает этиловый эфир глутатиона, содержащий тиоловую группу.where R-S is glutathione ethyl ester containing a thiol group.

Анализ научно-технической литературы и патентных документов показывает, что заявляемое нами соединение - динитрозильные комплексы железа с этилглутатионом в качестве лиганда - является оригинальным.An analysis of the scientific and technical literature and patent documents shows that the claimed compound — dinitrosyl iron complexes with ethyl glutathione as a ligand — is original.

Для исследования свойств композиции и осуществления способа уменьшения функциональных нарушений миокарда, подвергнутого гипоксии-реоксигенации, композиция вносится в гипоксический раствор, который перфузирует изолированное сердце крысы и находится в нем в постоянной концентрации в течение всего периода гипоксии, длящегося 30 минут. В этом периоде наблюдают за ростом диастолического давления в изоволюмическом баллончике, находящемся в полости левого желудочка. Рост давления в нем сигнализирует о развитии гипоксической контрактуры миокарда. Одновременно определяют интенсивность аритмий по ЭКГ - подсчитывают количество экстрасистол, в том числе - приступов желудочковой тахикардии или фибрилляции. Такая же работа проводится и в периоде реоксигенации. В конце реоксигенации измеряют все регистрируемые показатели и определяют степень восстановления сократительной функции по индексу работы сердца, представляющему произведение развиваемого давления и частоты сокращений, по отношению к исходному периоду перед гипоксией. Все полученные данные в группе опытов подвергают статистической обработке и сравнивают с аналогичными результатами, полученными в контрольной группе, т.е. без добавления заявляемой композиции.To study the properties of the composition and to implement a method of reducing functional myocardial disorders subjected to hypoxia-reoxygenation, the composition is introduced into a hypoxic solution that perfuses an isolated rat heart and remains in constant concentration throughout the entire hypoxia period lasting 30 minutes. In this period, an increase in diastolic pressure is observed in the isovolumic balloon located in the cavity of the left ventricle. An increase in pressure in it signals the development of hypoxic myocardial contracture. At the same time, the intensity of arrhythmias is determined by ECG - the number of extrasystoles is calculated, including attacks of ventricular tachycardia or fibrillation. The same work is carried out in the period of reoxygenation. At the end of reoxygenation, all recorded parameters are measured and the degree of restoration of contractile function is determined by the index of cardiac performance, which is the product of the developed pressure and frequency of contractions, in relation to the initial period before hypoxia. All obtained data in the experimental group are subjected to statistical processing and compared with similar results obtained in the control group, i.e. without adding the claimed composition.

Изобретение поясняется рисунками, где на рис.1 представлена запись сигналов развиваемого давления (А) и ЭКГ (Б), а на рис.2 - общая картина изменения частоты сокращений (ЧС), развиваемого давления (РД) и диастолического давления (ДД) в левом желудочке во время гипоксии и реоксигенации сердца. Величина диастолического давления во время гипоксии характеризует степень гипоксической контрактуры.The invention is illustrated by figures, where Fig. 1 shows a record of the developed pressure signals (A) and ECG (B), and Fig. 2 shows the general picture of changes in the frequency of contractions (ES), developed pressure (RD) and diastolic pressure (DD) in left ventricle during hypoxia and reoxygenation of the heart. The value of diastolic pressure during hypoxia characterizes the degree of hypoxic contracture.

На рис.3 и 4 показаны иллюстрации одиночных экстрасистол (А) и возникновение приступа желудочковой тахикардии (Б).Figures 3 and 4 show illustrations of single extrasystoles (A) and the occurrence of an attack of ventricular tachycardia (B).

На рис.5: Верхняя панель - спектры поглощения 0,25 мМ раствора Б-ДНКЖ с EEGS при pH 7.2 (спектр 1), 0.4 мМ раствора М-ДНКЖ с EEGS при pH 11,0 (спектр 2) и 1.5 мM раствора EEGS-NO (спектр 3). Нижняя панель - Сигналы ЭПР растворов М-ДНКЖ с EEGS, зарегистрированные при 77К (а) или комнатной температуре (b). Б-ДНКЖ с EEGS синтезирован в соответствии с указанным протоколом B-DNIC и разбавлен в 10 раз дистиллированной водой.In Fig. 5: The upper panel shows the absorption spectra of a 0.25 mM B-DNIC solution with EEGS at pH 7.2 (spectrum 1), a 0.4 mM M-DNIC solution with EEGS at pH 11.0 (spectrum 2), and 1.5 mM EEGS solution -NO (spectrum 3). Bottom panel - EPR signals of M-DNIC solutions with EEGS recorded at 77K (a) or room temperature (b). B-DNIC with EEGS was synthesized according to the specified B-DNIC protocol and diluted 10 times with distilled water.

Рис.6: Показатели сократительной функции изолированного сердца после реоксигенации (КДД - максимальная величина диастолического давления при гипоксии, РД - развиваемое давление, ИРС - индекс работы сердца, произведение частоты сокращений на развиваемое давление, оба - в процентах к исходным величинам перед гипоксией). Серии опытов: контроль, ЭЭГ - этиловый эфир глутатиона, ДНКЖ самостоятельно и с этиловым эфиром глутатиона. Звездочками обозначены статистически достоверные различия по сравнению с соответствующим контролем (p<0.05 и p<0.01).Fig. 6: Indicators of contractile function of an isolated heart after reoxygenation (CDD - maximum diastolic pressure during hypoxia, RD - developed pressure, IRS - index of heart function, product of the frequency of contractions and pressure developed, both as a percentage of the initial values before hypoxia). Series of experiments: control, EEG - ethyl ester of glutathione, DNA alone and with ethyl ester of glutathione. Asterisks indicate statistically significant differences compared with the corresponding control (p <0.05 and p <0.01).

Рис.7: Средняя длительность аритмий изолированного сердца (мин) во время гипоксии (АР, гип) и реоксигенации (АР, реок). Серии опытов: Контроль общий, ЭЭГ - этиловый эфир глутатиона, ДНКЖ самостоятельно и с этиловым эфиром глутатиона. В последней серии аритмий не было вообще.Fig. 7: Average duration of isolated heart arrhythmias (min) during hypoxia (AR, hyp) and reoxygenation (AR, reok). Series of experiments: General control, EEG - glutathione ethyl ester, DNA alone and with glutathione ethyl ester. In the last series of arrhythmias were not at all.

Рис.8: Сравнение динамики содержания свободного внутриклеточного Са2+ в кардиомиоцитах при нормоксии (А), гипоксии (Б) и реоксигенации (В). Показана запись типичного кардиомиоцита. По ординате - изменение интенсивности флуоресценции Са2+ - индикатора Fluo-4 в саркоплазме кардиомиоцита (отн. ед). По абсциссе - время (с). Клетки стимулировали прямоугольными электрическими импульсами с частотой 1 Гц.Fig. 8: Comparison of the dynamics of the content of free intracellular Ca2 + in cardiomyocytes during normoxia (A), hypoxia (B) and reoxygenation (C). A typical cardiomyocyte recording is shown. In ordinate, the change in the fluorescence intensity of Ca2 +, an indicator of Fluo-4 in the sarcoplasm of cardiomyocyte (rel. Units). On the abscissa, time (s). Cells were stimulated with rectangular electrical pulses with a frequency of 1 Hz.

Рис.9: Сравнение динамики содержания свободного внутриклеточного Са2+ в кардиомиоцитах при нормоксии (А), гипоксии 2 мин (Б) и реоксигенации (В) в присутствии этилглутатиона. По ординате - изменение интенсивности флуоресценции Са2+ - индикатора Fluo-4 в саркоплазме кардиомиоцита (отн. ед). По абсциссе - время (сек). Клетки стимулировали прямоугольными электрическими импульсами с частотой 1 Гц. Показана запись типичного кардиомиоцита.Fig. 9: Comparison of the dynamics of the content of free intracellular Ca2 + in cardiomyocytes during normoxia (A), hypoxia 2 min (B) and reoxygenation (C) in the presence of ethyl glutathione. In ordinate, the change in the fluorescence intensity of Ca2 +, an indicator of Fluo-4 in the sarcoplasm of cardiomyocyte (rel. Units). On the abscissa, time (sec). Cells were stimulated with rectangular electrical pulses with a frequency of 1 Hz. A typical cardiomyocyte recording is shown.

Рис.10: Сравнение динамики колебаний свободного внутриклеточного Са2+ в типичном кардиомиоците при нормоксии (А), гипоксии 2 мин (Б) и реоксигенации 10 мин (В) в присутствии 30 нМ ДНКЖ. По ординате - изменение интенсивности флуоресценции Са2+-индикатора Fluo-4 в саркоплазме кардиомиоцита (отн. ед). По абсциссе - время (сек). Клетки стимулировали прямоугольными электрическими импульсами с частотой 1 Гц.Fig. 10: Comparison of the dynamics of free intracellular Ca2 + in a typical cardiomyocyte with normoxia (A), hypoxia 2 min (B) and reoxygenation 10 min (C) in the presence of 30 nM DNIC. In ordinate, the change in the fluorescence intensity of the Ca2 + indicator Fluo-4 in the sarcoplasm of the cardiomyocyte (rel. Units). On the abscissa, time (sec). Cells were stimulated with rectangular electrical pulses with a frequency of 1 Hz.

Рис.11. Динамика колебаний свободного внутриклеточного Са2+ в типичном кардиомиоците при нормоксии (А), гипоксии 2 мин (Б) в присутствии 30 нМ ДНКЖ с ЭЭГ.Fig. 11. Oscillation dynamics of free intracellular Ca2 + in a typical cardiomyocyte with normoxia (A), hypoxia 2 min (B) in the presence of 30 nM DNIC with EEG.

Рис.12. Фазово-контрастная микроскопия свежевыделенных кардиомиоцитов взрослой крысы, подвергнутых гипоксии-реоксигенации в присутствии 1 мМ этиловым эфиром глутатиона (ЭЭГ). А - нормоксия; Б - гипоксия, 2 мин; В - гипоксия 10 мин, в присутствии 1 мМ ЭЭГ; Г - реоксигенация 10 мин в присутствии 1 мМ ЭЭГ. Увеличение ×20.Fig. 12. Phase contrast microscopy of freshly isolated adult rat cardiomyocytes subjected to hypoxia-reoxygenation in the presence of 1 mM glutathione ethyl ester (EEG). A - normoxia; B - hypoxia, 2 min; B - hypoxia 10 min, in the presence of 1 mm EEG; G - reoxygenation 10 min in the presence of 1 mm EEG. Magnification × 20.

Рис.13. Фазово-контрастная микроскопия свежевыделенных кардиомиоцитов взрослой крысы, подвергнутых гипоксии-реоксигенации в присутствии 30 нМ ДНКЖ. А - нормоксия; Б - гипоксия, 2 мин; В - реоксигенация 10 мин в присутствии 30 нМ ДНКЖ. Увеличение ×20.Fig. 13. Phase contrast microscopy of freshly isolated adult rat cardiomyocytes subjected to hypoxia-reoxygenation in the presence of 30 nM DNIC. A - normoxia; B - hypoxia, 2 min; B - reoxygenation 10 min in the presence of 30 nM DNIC. Magnification × 20.

Рис.14. Динамика накопления свободных радикалов в кардиомиоцитах при гипоксии и реоксигенации (А) и электростимуляции оксигенируемых клеток (Б). По ординате - изменение интенсивности флуоресценции DHR в кардиомиоците (отн. ед), по абсциссе - время (сек). Синие маркеры по абсциссе указывают на периоды записи флуоресцентного сигнала, которые также совпадали с периодами электростимуляции, в остальные периоды времени клетки не освещали для избегания чрезмерного выгорания индикатора.Fig. 14. Dynamics of accumulation of free radicals in cardiomyocytes during hypoxia and reoxygenation (A) and electrostimulation of oxygenated cells (B). In ordinate, the change in DHR fluorescence intensity in the cardiomyocyte (rel. Units), in abscissa, in time (sec). Blue abscissa markers indicate periods of recording a fluorescent signal, which also coincided with periods of electrical stimulation, in the remaining periods of time the cells were not illuminated to avoid excessive burnout of the indicator.

Рис.15. Влияние этилового эфира глутатиона (ЭЭГ, А) и ДНКЖ (Оксаком, Б) на генерацию свободных радикалов в кардиомиоцитах при гипоксии-реоксигенации. По ординате - изменение интенсивности флуоресценции DHR в кардиомиоците (отн. ед), по абсциссе -время (сек). Синие маркеры по абсциссе указывают на периоды записи флуоресцентного сигнала, которые также совпадали с периодами 10-секундной электростимуляции клеток.Fig. 15. The effect of glutathione ethyl ester (EEG, A) and DNIC (Oxacom, B) on the generation of free radicals in cardiomyocytes during hypoxia-reoxygenation. In ordinate, the change in the intensity of DHR fluorescence in the cardiomyocyte (rel. Units), in abscissa, in time (sec). Blue abscissa markers indicate periods of fluorescence recording, which also coincided with periods of 10-second electrical stimulation of the cells.

Рис.16. Иммунодетекция степени глутатионилирования Са2+-АТФазы саркоплазматического ретикулума (SERCA2) кардиомиоцитов в контрольных нормоксических условиях (К), при гипоксии (Г), при гипоксии-реоксигенации (Г/О) и при тех же условиях в присутствии 1 мМ этилового эфира глутатиона (ЭЭГ).Fig.16. Immunodetection of the degree of glutathionylation of Ca2 + -ATPase of the sarcoplasmic reticulum (SERCA2) of cardiomyocytes under control normoxic conditions (K), with hypoxia (G), with hypoxia-reoxygenation (G / O) and under the same conditions in the presence of 1 mM glutathione ethyl ester (EE) .

Осуществление изобретенияThe implementation of the invention

Синтез биядерной формы динитрозильного комплекса железа с этиловым эфиром глутатиона (Б-ДНКЖ-ЭЭГ) (формула [(EEGS)₂Fe₂(NO)₄]) сводился к последовательному добавлению в определенный объем дистиллированной воды этилглутатиона (EEGS), соли сернокислого железа, а затем нитрита натрия при молярном соотношении этих соединений соответственно 2:1:1 с последующим (через определенное время) повышением pH раствора до нейтральных значений. Синтез проводился на воздухе при комнатной температуре.The synthesis of the binuclear form of the dinitrosyl complex of iron with glutathione ethyl ester (B-DNIC-EEG) (formula [(EEGS) ₂ Fe ₂ (NO) ₄ ]) was reduced to the sequential addition of ethyl glutathione (EEGS), a salt of iron sulfate, to a certain volume of distilled water and then sodium nitrite at a molar ratio of these compounds, respectively, 2: 1: 1, followed by (after a certain time) increasing the pH of the solution to neutral values. The synthesis was carried out in air at room temperature.

Синтез использовавшегося в наших опытах 2,5 мМ раствора Б-ДНКЖ-ЭЭГ в 10 мл дистиллированной воды осуществлялся согласно следующему протоколу, включающему три стадии.The synthesis of a 2.5 mM B-DNIC-EEG solution used in our experiments in 10 ml of distilled water was carried out according to the following protocol, which included three stages.

Стадия 1 сводилась к получению в растворе S-нитрозотиола EEGS (EEGS-NO). Для достижения этого 66 мг этилового эфира глутатиона EEGS (20 мМ EEGS) добавляли на воздухе к 10 мл дистиллированной воды, помещенной в стеклянную пробирку высотой 15 см с диаметром 1,5 см, в результате чего pH раствора снижался до 4,0. Последующее введение 28 мг FeSO₄×7H₂O (10 мM) приводило к дальнейшему снижению pH до 3,8. Далее в раствор добавляли при 1 минутном встряхивании пробирки 6,9 мг NaNO₂ (10 мМ). При пониженном pH раствора (pH=3,8) добавленный нитрит протонировался с образованием азотистой кислоты, способной S-нитрозировать тиолы, что и приводило к образованию EEGS-NO (10 мМ) по реакции [D.L.H. Williams, Nitrosation Reactions and the Chemistry of Nitric Oxide, (Elsevier, Amsterdam 2004).]:Stage 1 was reduced to obtaining in a solution of S-nitrosothiol EEGS (EEGS-NO). To achieve this, 66 mg of glutathione ethyl ester EEGS (20 mM EEGS) was added in air to 10 ml of distilled water, placed in a 15 cm tall glass tube with a diameter of 1.5 cm, resulting in a pH of the solution dropping to 4.0. Subsequent administration of 28 mg of FeSO ₄ × 7H ₂ O (10 mM) led to a further decrease in pH to 3.8. Then, 6.9 mg NaNO ₂ (10 mM) tubes were added to the solution with 1 minute shaking. At a reduced pH of the solution (pH = 3.8), the added nitrite was protonated with the formation of nitrous acid capable of S-nitrosation of thiols, which led to the formation of EEGS-NO (10 mM) according to the reaction [DLH Williams, Nitrosation Reactions and the Chemistry of Nitric Oxide, (Elsevier, Amsterdam 2004).]:

HNO₂+EEGSH=EEGS-NO+H₂O.HNO ₂ + EEGSH = EEGS-NO + H ₂ O.

Образование EEGS-NO сопровождалось появлением розовой окраски раствора. Синтез заканчивался через 1,5-2 часа, о чем можно было судить по увеличению интенсивности полосы оптического поглощения EEGS-NO на 334 нм с коэффициентом экстинкции ε=908 М^-1см^-1 (Рис.5, верхняя панель, спектр 3). За это время весь нитрит (10 мМ) и 10 мМ EEGS уходили на синтез EEGS-NO. В растворе оставалось 10 мМ свободного EEGS, часть которого (5 мМ) включалась далее в синтез Б-ДНКЖ-ЭЭГ.The formation of EEGS-NO was accompanied by the appearance of a pink color in the solution. The synthesis ended after 1.5-2 hours, which could be judged by the increase in the intensity of the optical absorption band of EEGS-NO by 334 nm with an extinction coefficient ε = 908 M ^-1 cm ^-1 (Fig. 5, top panel, spectrum 3) . During this time, all nitrite (10 mM) and 10 mM EEGS went into the synthesis of EEGS-NO. 10 mM free EEGS remained in the solution, part of which (5 mM) was further included in the synthesis of B-DNAJ-EEG.

На Стадии 2 осуществлялся синтез Б-ДНКЖ-ЭЭГ. Для этого pH раствора повышали до 7,2 добавлением капель 10 мМ раствора NaOH. Повышение pH раствора контролировали, используя стандартный pH-метр (например, UP-5 pH meter (Denver Instrument, Denver, USA). Раствор приобретал оранжево-коричневую окраску, характерную для Б-ДНКЖ-ЭЭГ. Полный синтез этого комплекса заканчивался за 10 и более часов (в течение, например, ночи). Медленное повышение pH при титровании раствора щелочью обеспечивалось буферной емкостью имеющегося в растворе.At Stage 2, B-DNIC-EEG synthesis was performed. For this, the pH of the solution was increased to 7.2 by adding drops of a 10 mM NaOH solution. The increase in pH of the solution was monitored using a standard pH meter (for example, an UP-5 pH meter (Denver Instrument, Denver, USA). The solution acquired an orange-brown color characteristic of B-DNIC-EEG. Complete synthesis of this complex ended in 10 and more than hours (during, for example, night) A slow increase in pH during titration of the solution with alkali was provided by the buffer capacity of the solution.

На первом этапе синтеза Б-ДНКЖ-ЭЭГ возникала по механизму, показанному на Схеме 1, моноядерная форма ДНКЖ-ЭЭГ (М-ДНКЖ-ЭЭГ - формула [(EEGS)₂Fe(NO)₂])At the first stage of the synthesis of B-DNIC-EEG, the mononuclear form of DNIC-EEG (M-DNIC-EEG - formula [(EEGS) ₂ Fe (NO) ₂ ]) arose according to the mechanism shown in Scheme 1)

На схемах 1 и 2 литерой RS обозначен этиловый эфир глутатиона, содержащий тиоловую группу.In Schemes 1 and 2, RS denotes glutathione ethyl ester containing a thiol group.

Далее образующиеся М-ДНКЖ-ЭЭГ превращались в соответствии со схемой 2 в Б-ДНКЖ-ЭЭГNext, the resulting M-DNIC-EEG was converted in accordance with scheme 2 into B-DNIC-EEG

Стадия 3 сводилась к удалению из раствора образовавшегося Б-ДНКЖ ЭЭГ появившихся гидроокисных водонерастворимых комплексов железа (5 мМ), не включившегося в Б-ДНКЖ-ЭЭГ. Для удаления этих комплексов раствор пропускали на воронке через бумажный фильтр.Stage 3 was reduced to the removal of the resulting hydroxide water-insoluble iron complexes (5 mM) from the formed B-DNIC EEG, which was not included in the B-DNIC-EEG. To remove these complexes, the solution was passed on a funnel through a paper filter.

Концентрацию образующихся Б-ДНКЖ-ЭЭГ определяли оптическим методом по интенсивности полос на 310 или 360 нм с коэффициентами экстинкции соответственно равными ε=9200 и 7400 M^-1см^-1 [A.F.Vanin, A.P.Poltorakov, V.D.Mikoyan, L.N.Kubrina, D.Sh.Burbaev, Nitric Oxide, Biol. & Chem. 23, 1236-1249 (2010)] в спектре поглощения этих комплексов, приведенных на Рис.5, верхняя панель, спектр 1). В соответствии с этими расчетами, концентрация Б-ДНКЖ-ЭЭГ, полученного в соответствии с описанным протоколом, составляла 2,5 мМ в перечете на Б-ДНКЖ или 5 мМ в пересчете на один атом железа в комплексе. Таким образом, после завершения синтеза этого комплекса из 20 мМ добавленного EEGS в растворе оставалось 5 мМ последнего в свободном состоянии. Из 10 мМ железа 5 мМ включалось в Б-ДНКЖ, остальные 5 мМ удалялись из раствора в виде гидроокисных комплексов.The concentration of the resulting B-DNIC-EEG was determined optically by the intensity of the bands at 310 or 360 nm with extinction coefficients respectively ε = 9200 and 7400 M ^-1 cm ^-1 [AFVanin, APPoltorakov, VDMikoyan, LNKubrina, D.Sh.Burbaev, Nitric Oxide, Biol. & Chem. 23, 1236-1249 (2010)] in the absorption spectrum of these complexes shown in Fig. 5, upper panel, spectrum 1). In accordance with these calculations, the concentration of B-DNIC-EEG obtained in accordance with the described protocol was 2.5 mM, calculated as B-DNIC or 5 mM, calculated on one iron atom in the complex. Thus, after completion of the synthesis of this complex from 20 mM of added EEGS, 5 mM of the latter remained in solution in the free state. Of 10 mM iron, 5 mM was incorporated into B-DNIC, the remaining 5 mM were removed from the solution in the form of hydroxide complexes.

Полученный Б-ДНКЖ-ЭЭГ представляет собой диамагнитный тиоэфир EEGS и красной соли Руссена. Диамагнетизм этого комплекса определяется спариванием спинов двух Fe(NO)₂ групп в Б-ДНКЖ («антиферромагнитным взаимодействием») по двум серным мостикам (по сохранившимся в EEGS тиоловым группам). В полученном препарате Б-ДНКЖ-ЭЭГ имеется небольшая примесь (~5%) М-ДНКЖ-ЭЭГ. Она становится доминирующей при повышении pH раствора до 10-11. При этом исчезает спектр поглощения Б-ДНКЖ и вместо него регистрируется спектр поглощения М-ДНКЖ с полосой на 390 нм (Рис.5, верхняя панель, спектр 2). Этот парамагнитный комплекс характеризуется также сигналом электронного парамагнитного резонанса, имеющим анизотропную форму при его регистрации при 77 К с g_⊥=2.04, g_||=2.014, g_aver.=2.03. При комнатной температуре регистрации он имеет форму симметричного синглета с центром при g=2.03 (Рис.5, нижняя панель, сигналы а, b).The obtained B-DNIC-EEG is a diamagnetic thioether of EEGS and the red Russen salt. The diamagnetism of this complex is determined by pairing the spins of two Fe (NO) ₂ groups in B-DNIC (“antiferromagnetic interaction”) over two sulfur bridges (according to the thiol groups preserved in EEGS). The resulting preparation B-DNIC-EEG has a small admixture (~ 5%) of M-DNIC-EEG. It becomes dominant with increasing pH of the solution to 10-11. In this case, the absorption spectrum of B-DNIC disappears and instead the absorption spectrum of M-DNIC with a band at 390 nm is recorded (Fig. 5, upper panel, spectrum 2). This paramagnetic complex is also characterized by an electron paramagnetic resonance signal, which has an anisotropic shape when it is detected at 77 K with g _⊥ = 2.04, g _|| = 2.014, g _aver. = 2.03. At room temperature, it has the form of a symmetrical singlet with a center at g = 2.03 (Fig. 5, bottom panel, signals a, b).

Пример 1. Результаты применения композиции ДНКЖ с этилглутатионом при гипоксии-реоксигенации сердцаExample 1. The results of the use of the composition DNIC with ethyl glutathione in hypoxia-reoxygenation of the heart

Создание пробной партии нового вещества ДНКЖ+ЭЭГ, изложенное в предыдущем разделе, позволило нам выполнить тестовую серию опытов на изолированном сердце и на кардиомиоцитах. При этом новый комплекс применяли в той же концентрации, что и ДНКЖ - 30 нМ. На рис.6 представлены результаты всех трех серий опытов в сравнении с общим контролем.The creation of a test batch of a new substance, DNIC + EEG, described in the previous section, allowed us to perform a test series of experiments on an isolated heart and on cardiomyocytes. In this case, the new complex was used in the same concentration as DNIC - 30 nM. Figure 6 shows the results of all three series of experiments in comparison with the general control.

Результаты свидетельствуют, что как ДНКЖ, так и его комплекс с этилглутатионом достоверно снижали уровень диастолического давления во время гипоксии (гипоксическую контрактуру) на 14-24%, в то время как этилглутатион был неэффективен. Восстановление индекса работы сердца улучшалось в группах этилглутатиона и ДНКЖ по сравнению с контролем только при парном сравнении, в то время как ДНКЖ в комплексе с этилглутатионом достоверно повышал степень восстановления по сравнению с контролем при сравнении всего массива данных более чем в 1,5 раза - с 32±6 в контроле до 56±5%.The results indicate that both DNIC and its complex with ethyl glutathione significantly reduced the level of diastolic pressure during hypoxia (hypoxic contracture) by 14-24%, while ethyl glutathione was ineffective. The recovery of the cardiac index improved in the ethylglutathione and DNIC groups compared with the control only by paired comparison, while DNLC in combination with ethyl glutathione significantly increased the recovery compared to the control when comparing the entire data array by more than 1.5 times - with 32 ± 6 in the control up to 56 ± 5%.

На рис.7 приведены результаты аналогичных опытов, в которых анализировали возникновение аритмий в гипоксическом и реоксигенационном периодах. Во время гипоксии средняя длительность аритмий во всех сериях была примерно одинаковой - от 1,5 до 2,5 мин. Но ситуация коренным образом изменилась во время реоксигенации. В контрольных опытах средняя длительность аритмий в опыте составила около 6 мин. Все примененные вещества снижали этот индекс в 6-10 раз, а в опытах с применением ДНКЖ с этилглутатионом аритмии не было ни в одном опыте из 8. Этот результат хорошо согласуется с нашими данными, показавшими, что оба компонента нового комплекса успешно предупреждают рост свободных радикалов кислорода во время реоксигенации.Figure 7 shows the results of similar experiments in which the occurrence of arrhythmias in the hypoxic and reoxygenation periods was analyzed. During hypoxia, the average duration of arrhythmias in all series was approximately the same - from 1.5 to 2.5 minutes. But the situation radically changed during reoxygenation. In control experiments, the average duration of arrhythmias in the experiment was about 6 minutes. All the substances used reduced this index by 6–10 times, and in experiments using DNA with ethylglutathione there were no arrhythmias in any of 8. This result is in good agreement with our data, which showed that both components of the new complex successfully prevent the growth of free radicals oxygen during reoxygenation.

Таким образом, результаты выполненных опытов на изолированном сердце позволяют считать, что комплекс ДНКЖ с этилглутатионом является более эффективным, чем любой из его компонентов в отдельности. Данный комплекс оказывает защитное действие также в диапазоне 10-100 нМ.Thus, the results of experiments performed on an isolated heart suggest that the complex of DNA with ethyl glutathione is more effective than any of its components separately. This complex also has a protective effect in the range of 10-100 nM.

Пример 2. Действие этилглутатиона и ДНКЖ на кальциевый транспорт кардиомиоцитов при гипоксииExample 2. The effect of ethyl glutathione and DNIC on calcium transport of cardiomyocytes during hypoxia

Полученные результаты дополнены изучением действия этилглутатиона и ДНКЖ, а также ДНКЖ с ЭЭГ на изолированных кардиомиоцитах. При этом с помощью флуоресцентного индикатора Fluo-4 регистрировали колебания миоплазматического Са⁺⁺ при электростимуляции. При гипоксии изменяется вид кривой, характеризующей изменение содержания свободного Са2+ в цитоплазме кардиомиоцитов во времени. В нормоксических условиях на каждый электрический стимул приходится один пик подъема концентрации Са²⁺ (рис.8А). Все пики имеют одинаковую амплитуду и практически симметричную форму. Пики хорошо разрешены, т.е. между стимуляциями клеток уровень Са²⁺ в них опускается до базального. После 2-минутной гипоксии кардиомиоцитов (Б) наблюдается возникновение «купола» на половине высоты нисходящего плеча, отражающего замедление выведения Са²⁺ из саркоплазмы в саркоплазматический ретикулум. При этом восходящее плечо (возрастание Са²⁺ в саркоплазме, отражающее работу Са²⁺ каналов) изменяется меньше, но амлитуда пиков падает примерно в 1.4 раза.The results are supplemented by a study of the effects of ethyl glutathione and DNIC, as well as DNA with EEG on isolated cardiomyocytes. In this case, using the fluorescent indicator Fluo-4, fluctuations of myoplasmic Ca ^{++ were} recorded during electrical stimulation. With hypoxia, the shape of the curve characterizes the change in the content of free Ca2 + in the cytoplasm of cardiomyocytes over time. Under normoxic conditions, for each electric stimulus, there is one peak in the increase in Ca ²⁺ concentration (Fig. 8A). All peaks have the same amplitude and almost symmetrical shape. Peaks are well resolved, i.e. between cell stimulations, the level of Ca ²⁺ in them drops to basal. After 2 minutes of hypoxia cardiomyocytes (B) observed the emergence of "dome" at half the height of the shoulder downward, reflecting the slowdown in removing Ca ²⁺ from the sarcoplasmic reticulum in the sarcoplasmic. In this case, the ascending arm (an increase in Ca ²⁺ in the sarcoplasm, reflecting the work of Ca ²⁺ channels) changes less, but the peak amplitude decreases by about 1.4 times.

Также обращает на себя внимание то, что ритм высвобождения Са²⁺ не воспроизводит ритм электрической стимуляции клеток. Так, на 10 электрических импульсов, стандартно подаваемых в камеру с клетками, происходит только 7 кальциевых ответов. Промежутки между Са²⁺ пиками также неравномерные, но практически всегда между пиками достигается базальный уровень Са²⁺. При этом отмечаются флуктуации базального уровня Са²⁺, достигающие в отдельных случаях половины амплитуды Са²⁺ пика. Таким образом, в состоянии гипоксии при функциональной нагрузке в кардиомиоцитах нарушается транспорт Са²⁺,обеспечивающий сократительную активность. Судя по характеру кривых изменения концентрации Са2+, главным образом страдает процесс удаления Са2+ из цитоплазмы, в то время как процесс его поступления в цитоплазму нарушен меньше. Это хорошо согласуется с тем фактом, что удаление Са2+ из цитоплазмы, осуществляемое Са2+-АТФазами сарколеммы и саркоплазматического ретикулума (SERCA), - энергозависимый процесс, который замедляется по причине падения содержания маркоэргов (АТФ и креатинфосфат) в клетке при недостатке кислорода. Реоксигенация (В) не восстанавливает нормальный ритм, несколько пиков остаются затянутыми, удаление Са++ из миоплазмы неполное.It is also noteworthy that the rhythm of Ca ²⁺ release does not reproduce the rhythm of electrical cell stimulation. So, for 10 electrical impulses, standardly supplied to the cell chamber, only 7 calcium responses occur. The gaps between the Ca ²⁺ peaks are also uneven, but the basal level of Ca ^{2+ is} almost always reached between the peaks. In this case, fluctuations in the basal level of Ca ²⁺ are observed, which in some cases reach half the amplitude of the Ca ²⁺ peak. Thus, in a state of hypoxia with a functional load in cardiomyocytes, Ca ²⁺ transport is disrupted, providing contractile activity. Judging by the nature of the curves of changes in the concentration of Ca2 +, the process of removal of Ca2 + from the cytoplasm mainly suffers, while the process of its entry into the cytoplasm is less disturbed. This is in good agreement with the fact that the removal of Ca2 + from the cytoplasm by Ca2 + -ATPases of the sarcolemma and sarcoplasmic reticulum (SERCA) is an energy-dependent process that slows down due to a decrease in the content of marcoergs (ATP and creatine phosphate) in the cell with a lack of oxygen. Reoxygenation (B) does not restore normal rhythm, several peaks remain protracted, Ca ++ removal from myoplasma is incomplete.

Преинкубация кардиомиоцитов с этилглутатионом в концентрации 1 мМ в условиях нормоксии не сказывается на характере Са2+ пиков при электрической стимуляции (рис.9А). Они возникают в ответ на каждый электрический импульс и остаются симметричными. Длительность пиков составляет около 200 мс. При переводе кардиомиоцитов в гипоксический буфер и инкубации в нем в течение 2 мин в присутствии ЭГ амплитуда, частота и продолжительность Са2+ пиков не изменяются (рис.9Б). Реоксигенация сопровождается восстановлением нормального ритма, хотя амплитуда кальциевых спайков снижена (рис.9В).The preincubation of cardiomyocytes with ethyl glutathione at a concentration of 1 mM under normoxic conditions does not affect the nature of Ca2 + peaks during electrical stimulation (Fig. 9A). They arise in response to every electrical impulse and remain symmetrical. The duration of the peaks is about 200 ms. When cardiomyocytes are transferred to a hypoxic buffer and incubated for 2 min in the presence of EG, the amplitude, frequency, and duration of Ca2 + peaks do not change (Fig. 9B). Reoxygenation is accompanied by restoration of the normal rhythm, although the amplitude of calcium spikes is reduced (Fig. 9B).

Таким образом, присутствие 1 мМ ЭГ не сказывается на динамике свободного внутриклеточного Са2+ в кардиомиоцитах, стимулированных импульсами электрического тока в условиях нормоксии. При этом в гипоксических условиях ЭГ предотвращает/обращает нарушения Са2+ транспорта, воздействуя, вероятно, и на процесс поступления Са2+ в саркоплазму, и на процесс его удаления из нее. Поскольку второй процесс является энергозависимым, его коррекция ЭГ в условиях энергодефицита при гипоксии может определяться повышением эффективности работы Са2+-насосов кардиомиоцитов, в частности, путем поддержания восстановленного состояния их тиоловых групп и/или обратимой их защиты S-глутатионилированием.Thus, the presence of 1 mM EG does not affect the dynamics of free intracellular Ca2 + in cardiomyocytes stimulated by electric current pulses under normoxia conditions. Moreover, under hypoxic conditions, EG prevents / reverses Ca2 + transport disorders, probably affecting both the process of Ca2 + entry into the sarcoplasm and its removal from it. Since the second process is energy-dependent, its correction of EG under conditions of energy deficiency during hypoxia can be determined by increasing the efficiency of Ca2 + pumps of cardiomyocytes, in particular, by maintaining the restored state of their thiol groups and / or their reversible protection by S-glutathionylation.

Сократительная активность кардиомиоцитов полностью соответствовала параметрам Са2+-транспорта. За каждым пиком подъема Са2+ следовало одиночное сокращение тела клетки. Амплитуда Са2+ пиков была прямо пропорциональна степени укорочения кардиомиоцитов. Растянутые Са2+ - пики в условиях гипоксии сопровождались таким же длительным сокращением клеток. Таким образом, влияние ЭГ на сократительную активность кардиомиоцитов в нашей модели в основном определялось влиянием этого вещества на Са2+-транспорт.The contractile activity of cardiomyocytes is fully consistent with the parameters of Ca2 + transport. Each peak of Ca2 + rise was followed by a single contraction of the cell body. The amplitude of the Ca2 + peaks was directly proportional to the degree of shortening of cardiomyocytes. Stretched Ca2 + peaks under conditions of hypoxia were accompanied by the same prolonged cell contraction. Thus, the effect of EG on the contractile activity of cardiomyocytes in our model was mainly determined by the effect of this substance on Ca2 + transport.

Полученные данные свидетельствуют о том, что этиловый эфир глутатиона оказывает выраженное корректирующее действие на динамику выведения Са⁺⁺ из саркоплазмы кардиомиоцитов, которая значительно замедляется при гипоксии. В условиях преинкубации кардиомиоцитов с 1 мМ ЭЭГ нарушений в работе Са⁺⁺-насосов кардиомиоцитов через 2 мин гипоксии не наблюдалось. Введение ЭЭГ в раствор после начала гипоксического воздействия также обращало нарушения Са⁺⁺-транспорта в кардиомиоцитах. Важно отметить, что после реоксигенации в присутствии ЭЭГ нормальный ритм ответов на электростимулы полностью сохранялся.The data obtained indicate that glutathione ethyl ester has a pronounced corrective effect on the dynamics of Ca ⁺⁺ excretion from the sarcoplasm of cardiomyocytes, which significantly slows down during hypoxia. Under conditions of preincubation of cardiomyocytes with 1 mM EEG, there were no disturbances in the operation of Ca ⁺⁺ pump pumps of cardiomyocytes after 2 min of hypoxia. The introduction of EEG into the solution after the onset of hypoxic exposure also reversed the disruption of Ca ⁺⁺ transport in cardiomyocytes. It is important to note that after reoxygenation in the presence of EEG, the normal rhythm of responses to electrical stimuli was completely preserved.

В опытах с применением ДНКЖ гипоксические изменения кальциевых спайков были такими же, как и в предыдущей серии. Присутствие 30 нМ ДНКЖ не сказалось на динамике свободного внутриклеточного Са2+ в кардиомиоцитах, стимулированных импульсами электрического тока в условиях нормоксии (рис.10А). При этом в гипоксических условиях ДНКЖ предотвращает нарушения Са2+-транспорта, хотя базальный уровень Са++ несколько повышается (рис.10Б). Однако после реоксигенации в присутствии ДНКЖ восстанавливался не только нормальный ритм ответов, но и амплитуда кальциевых спайков, что свидетельствует о практически полном восстановлении кальциевого транспорта в миоцитах (рис.10В). Как видно из записей, при гипоксии больше страдает процесс обратного поглощения Са2+ в саркоплазматический ретикулум, за который ответственна SERCA2. Поскольку этот процесс является энергозависимым, его коррекция ДНКЖ в условиях энергодефицита при гипоксии может определяться повышением эффективности работы Са2+-насосов кардиомиоцитов, в частности, путем поддержания восстановленного состояния их тиоловых групп и/или обратимой их защиты S-нитрозилированием. Таким образом, влияние ДНКЖ на сократительную активность кардиомиоцитов в нашей модели в основном определялось его воздействием на процесс поглощения Са2+ в саркоплазматический ретикулум.In experiments using DNIC, the hypoxic changes in calcium spikes were the same as in the previous series. The presence of 30 nM DNIC did not affect the dynamics of free intracellular Ca2 + in cardiomyocytes stimulated by electric current pulses under normoxia conditions (Fig. 10A). Moreover, under hypoxic conditions, DNIC prevents Ca2 + -transport disturbances, although the basal level of Ca ++ is slightly increased (Fig. 10B). However, after reoxygenation in the presence of DNIC, not only the normal rhythm of responses was restored, but also the amplitude of calcium spikes, which indicates an almost complete restoration of calcium transport in myocytes (Fig. 10B). As can be seen from the records, during hypoxia, the process of reverse absorption of Ca2 + into the sarcoplasmic reticulum, for which SERCA2 is responsible, suffers more. Since this process is energy-dependent, its correction of DNIC under conditions of energy deficiency during hypoxia can be determined by increasing the efficiency of Ca2 + pumps of cardiomyocytes, in particular, by maintaining the restored state of their thiol groups and / or their reversible protection by S-nitrosylation. Thus, the effect of DNIC on the contractile activity of cardiomyocytes in our model was mainly determined by its effect on the absorption of Ca2 + into the sarcoplasmic reticulum.

Динамика кальциевых ответов в присутствии ДНКЖ с этилглутатионом близко соответствовала аналогичной динамике при применении одного ДНКЖ (рис.11А). Более того, примененная композиция полностью нормализовала несколько затухающие ответы кальциевых спайков в исходном состоянии (рис.11Б). Обращает на себя внимание высокая амплитуда спайков, свидетельствующая об отсутствии нарушений в системе кальциевого транспорта.The dynamics of calcium responses in the presence of DNA with ethyl glutathione closely corresponded to the same dynamics with the use of DNA alone (Fig. 11A). Moreover, the applied composition completely normalized several decaying responses of calcium spikes in the initial state (Fig. 11B). Noteworthy is the high amplitude of the spikes, indicating the absence of disturbances in the calcium transport system.

Пример 3. Действие этилглутатиона и ДНКЖ на структурные изменения кардиомиоцитов при гипоксииExample 3. The effect of ethyl glutathione and DNIC on structural changes in cardiomyocytes during hypoxia

Защитное действие этилглутатиона или ДНКЖ на функциональную активность кардиомиоцитов сочеталось с лучшей сохранностью их структуры в гипоксических условиях. В норме свежевыделенные кардиомиоциты из сердца взрослой крысы представляют собой хорошо преломляющие свет длинные крупные палочковидные клетки с четкими краями (рис.12А). При фазово-контрастной микроскопии видна поперечная исчерченность клеток, отражающая распределение в клетке сократительного аппарата саркомерного типа. Среди вытянутых кардиомиоцитов встречаются округлые суперсокращенные клетки, но их количество невелико (10-15%). По всей видимости, эти клетки представляют собой кардиомиоциты, погибшие при выделении. У них была нарушена целостность сарколеммы и/или не были закрыты щелевые контакты при диссоциации клеток друг от друга. В результате произошло неконтролируемое повышение концентрации Са2+ внутри клеток и их необратимое сокращение и апоптоз. После содержания кардиомиоцитов в условиях гипоксии в течение 2 мин распределение длинных и круглых клеток существенно изменяется (рис.12Б). Начинают преобладать суперсокращенные клетки, в то время как нативные кардиомиоциты составляют не более 10% от общего числа клеток. Пролонгированная гипоксия до 10 мин приводит к полному исчезновению вытянутых кардиомиоцитов.The protective effect of ethyl glutathione or DNIC on the functional activity of cardiomyocytes was combined with the best preservation of their structure under hypoxic conditions. Normally, freshly isolated cardiomyocytes from the heart of an adult rat are long, large, rod-shaped cells that have good light-refracting lines with distinct edges (Fig. 12A). Phase contrast microscopy shows the transverse striation of the cells, reflecting the distribution in the cell of the contractile apparatus of the sarcomere type. Among elongated cardiomyocytes, rounded super-contracted cells are found, but their number is small (10-15%). Apparently, these cells are cardiomyocytes that died during isolation. Their integrity of the sarcolemma was impaired and / or gap junctions were not closed during the dissociation of cells from each other. As a result, there was an uncontrolled increase in the concentration of Ca2 + inside the cells and their irreversible reduction and apoptosis. After the content of cardiomyocytes under hypoxia for 2 min, the distribution of long and round cells changes significantly (Fig. 12B). Super-abbreviated cells begin to prevail, while native cardiomyocytes make up no more than 10% of the total number of cells. Prolonged hypoxia up to 10 min leads to the complete disappearance of elongated cardiomyocytes.

Преинкубация кардиомиоцитов с 1 мМ этилглутатиона в условиях нормоксии не приводит к видимым структурным изменениям клеток. В клеточной популяции продолжают преобладать длинные клетки. Присутствие этилглутатиона защищает кардиомиоциты от гипоксии. Через 10 мин после начала гипоксической инкубации в присутствии 1 мМ этилглутатиона в изоляте остается около 30-40% вытянутых кардиомиоцитов (рис.12В). При последующей реоксигенации в течение 10 мин не менее 30% кардиомиоцитов продолжает оставаться вытянутыми с четкими краями, в то время как реоксигенация контрольных кардиомиоцитов, подвергнутых гипоксии в течение 10 мин, не приводит к смене их округлой формы на вытянутую, т.е. эти клетки при гипоксии перешли в стадию необратимых изменений (рис.12Г).The preincubation of cardiomyocytes with 1 mM ethylglutathione under normoxia does not lead to visible structural changes in the cells. Long cells continue to predominate in the cell population. The presence of ethyl glutathione protects cardiomyocytes from hypoxia. About 10–40% of elongated cardiomyocytes remain in the isolate 10 min after the onset of hypoxic incubation in the presence of 1 mM ethylglutathione (Fig. 12B). With subsequent reoxygenation for 10 minutes, at least 30% of cardiomyocytes remains elongated with clear edges, while reoxygenation of control cardiomyocytes subjected to hypoxia for 10 min does not change their round shape to elongated, i.e. these cells during hypoxia went into the stage of irreversible changes (Fig. 12G).

Преинкубация кардиомиоцитов с 30 нМ ДНКЖ в условиях нормоксии не приводит к видимым структурным изменениям клеток (рис.13А). В клеточной популяции продолжают преобладать длинные клетки (53%). Присутствие ДНКЖ защищает кардиомиоциты от гипоксии. Через 2 мин после начала гипоксической инкубации в присутствии 30 нМ ДНКЖ в изоляте остается около 52% вытянутых кардиомиоцитов, т.е. столько же, сколько их было в первичном изоляте (рис.13Б). При последующей реоксигенации в течение 10 мин более 40% кардиомиоцитов продолжает оставаться вытянутыми с четкими краями (рис.13В). Таким образом, ДНКЖ в низких дозах эффективно защищает кардиомиоциты от повреждения и гибели, что выражается в очень небольшом накоплении структурно измененных округлых клеток.The preincubation of cardiomyocytes with 30 nM DNIC under normoxic conditions does not lead to visible structural changes in the cells (Fig. 13A). Long cells continue to dominate in the cell population (53%). The presence of DNIC protects cardiomyocytes from hypoxia. 2 minutes after the start of hypoxic incubation in the presence of 30 nM DNIC, about 52% of elongated cardiomyocytes remain in the isolate, i.e. as many as there were in the primary isolate (Fig.13B). With subsequent reoxygenation for 10 min, more than 40% of cardiomyocytes continues to be elongated with clear edges (Fig. 13B). Thus, DNIC in low doses effectively protects cardiomyocytes from damage and death, which is expressed in a very small accumulation of structurally changed round cells.

Пример 4. Действие этилглутатиона и ДНКЖ на метаболизм кардиомиоцитов при гипоксииExample 4. The effect of ethyl glutathione and DNIC on the metabolism of cardiomyocytes in hypoxia

Определение содержания глутатиона в кардиомиоцитах проводили на основе специально разработанной методики. Результаты показали, что содержание глутатиона в кардиомиоцитах снижается при гипоксии-реоксигенации как в контрольных условиях, так и при добавлении этилглутатиона (табл.1).The determination of glutathione content in cardiomyocytes was carried out on the basis of a specially developed technique. The results showed that the content of glutathione in cardiomyocytes decreases with hypoxia-reoxygenation both under control conditions and with the addition of ethyl glutathione (Table 1).

Таблица 1 Table 1 Уровень глутатиона в кардиомиоцитах крысыGlutathione level in rat cardiomyocytes ОбразецSample Уровень глутатиона,Glutathione level

нмоль/100000 клетокnmol / 100000 cells КонтрольThe control 3,063.06 ГипоксияHypoxia 1,801.80 РеоксигенацияReoxygenation 1,801.80 Контроль + этилглутатионControl + ethylglutathione 2,222.22 Гипоксия + этилглутатионHypoxia + Ethyl Glutathione 2,082.08 Реоксигенация + этилглутатионReoxygenation + Ethyl Glutathione 1,941.94

Как видно из представленной таблицы, при гипоксии, а также при последующей реоксигенации уровень глутатиона в контрольных опытах снижался в 1,7 раза. Это снижение может быть следствием как трансформации глутатиона в измененных клетках, так отражать гибель клеток при гипоксии, сопровождающуюся разрушением плазматической мембраны и выходом содержащегося в клетках глутатиона в раствор. В то же время следует отметить, что при инкубации кардиомиоцитов в присутствии 1 мМ этилглутатиона снижение уровня глутатиона на фоне гипоксии-реоксигенации выражено значительно слабее и составляет только порядка 10%, в то время как в контрольных опытах оно составляло 41%. Этот результат свидетельствует о защитном действии глутатиона при гипоксии-реоксигенации.As can be seen from the table, with hypoxia, as well as with subsequent reoxygenation, the level of glutathione in control experiments decreased 1.7 times. This decrease can be a consequence of both the transformation of glutathione in altered cells, so reflect the death of cells during hypoxia, accompanied by the destruction of the plasma membrane and the release of glutathione in the cells into the solution. At the same time, it should be noted that during the incubation of cardiomyocytes in the presence of 1 mM ethylglutathione, the decrease in glutathione level against the background of hypoxia-reoxygenation was much weaker and amounted to only about 10%, while in the control experiments it was 41%. This result indicates the protective effect of glutathione in hypoxia-reoxygenation.

Измерение уровня свободных радикалов кислорода в кардиомиоцитах было выполнено с использованием флуоресцентного индикатора дигидрородамина (DHR) фирмы In-vitrogen. Эта незаряженная молекула проникает в клетки и далее в митохондрии, которые являются основным источником свободных радикалов в кардиомиоцитах. В клетках DHR превращается в т.н. дигидрородамин 123 и является сенсором свободных радикалов как в митохондриях, так и в саркоплазме.Measurement of the level of oxygen free radicals in cardiomyocytes was carried out using an In-vitrogen fluorescent indicator dihydrodamine (DHR). This uncharged molecule penetrates into cells and further into mitochondria, which are the main source of free radicals in cardiomyocytes. In cells, DHR is converted into the so-called dihydrorodaminamine 123 and is a sensor of free radicals both in mitochondria and in sarcoplasm.

Как видно на рис.14А, при гипоксии накопление свободных радикалов возрастает, При реоксигенации концентрация свободных радикалов также возрастает, однако при последующих стимуляциях клеток значительного увеличения концентрации свободных радикалов не наблюдалось. По-видимому, это объясняется с тем, что системы антиоксидантной защиты вернулись в исходное состояние после эпизода гипоксии и ранней реоксигенации. В то же время сократительная активность кардиомиоцитов в условиях оксигенации в течение того же периода не сопряжена с увеличенной генерацией свободных радикалов (рис.14Б).As can be seen in Fig.14A, during hypoxia, the accumulation of free radicals increases. During reoxygenation, the concentration of free radicals also increases, however, with subsequent stimulation of cells, a significant increase in the concentration of free radicals was not observed. Apparently, this is due to the fact that the antioxidant defense systems returned to their original state after an episode of hypoxia and early reoxygenation. At the same time, the contractile activity of cardiomyocytes under oxygenation during the same period is not associated with increased generation of free radicals (Fig. 14B).

В присутствии 1 мМ этилглутатиона (Рис.15, А) заметных колебаний содержания свободных радикалов в кардиомиоцитах во время гипоксии и реоксигенации не происходило, но при этом добавление 100 мкМ перекиси водорода резко изменяло ход кривой. Аналогично, в присутствии 30 нМ ДНКЖ не наблюдалось существенных изменений уровня свободных радикалов (Рис.15, Б), но контрольное добавление перекиси вызывало драматический эффект, показывая, что метод адекватно регистрирует свободные радикалы в том случае, если их количество превышает нейтрализующую емкость этилглутатиона и ДНКЖ.In the presence of 1 mM ethyl glutathione (Fig. 15, A), there were no noticeable fluctuations in the content of free radicals in cardiomyocytes during hypoxia and reoxygenation, but the addition of 100 μM hydrogen peroxide sharply changed the course of the curve. Similarly, in the presence of 30 nM DNIC, no significant changes in the level of free radicals were observed (Fig. 15, B), but the control addition of peroxide caused a dramatic effect, showing that the method adequately registers free radicals if their amount exceeds the neutralizing capacity of ethyl glutathione and DNIC.

Таким образом, гипоксия и последующая реоксигенация, в особенности ранняя ее фаза после гипоксии, сопровождаются генерацией свободных радикалов в изолированных кардиомиоцитах крыс. Сократительная активность клеток также сочеталась с повышением содержания свободных радикалов. В то же время в присутствии 1 мМ этилглутатиона или 30 нМ ДНКЖ происходит подавление генерации свободных радикалов. Если механизм антиоксидантного эффекта этилглутатиона понятен и, по-видимому, связан с нейтрализацией самих свободных радикалов, то механизм антирадикального действия ДНКЖ требует дальнейшего изучения.Thus, hypoxia and subsequent reoxygenation, especially its early phase after hypoxia, are accompanied by the generation of free radicals in isolated rat cardiomyocytes. The contractile activity of the cells was also combined with an increase in the content of free radicals. At the same time, in the presence of 1 mM ethyl glutathione or 30 nM DNIC, the generation of free radicals is suppressed. If the mechanism of the antioxidant effect of ethyl glutathione is understandable and, apparently, is associated with the neutralization of the free radicals themselves, then the mechanism of the antiradical effect of DNIC requires further study.

Окисление тиоловых групп SERCA2 и других белков кальциевого транспорта, происходящее при окислительном стрессе, снижает скорость транслокации ионов Са2+ и препятствует расслаблению сократительного аппарата кардиомиоцита. Одним из физиологических механизмов повышения активности SERCA2 служит глутатионилирование этого белка по остатку Cys674. Глутатионилирование выполняет также защитную функцию, поскольку глутатион связывается с окисленными тиоловыми группами в составе белка, а последующее действие глутатионредуктазы приводит к восстановлению SH-групп и повышению активности транслокации Са2+ в саркоплазматический ретикулум.Oxidation of the thiol groups of SERCA2 and other calcium transport proteins during oxidative stress reduces the translocation rate of Ca2 + ions and interferes with the relaxation of the contractile apparatus of cardiomyocytes. One of the physiological mechanisms for increasing SERCA2 activity is glutathionylation of this protein at the Cys674 residue. Glutathionylation also performs a protective function, since glutathione binds to oxidized thiol groups in the protein, and the subsequent action of glutathione reductase leads to the restoration of SH groups and an increase in the activity of Ca2 + translocation into the sarcoplasmic reticulum.

Для изучения механизма защитного действия этилглутатиона была разработана методика измерения уровня глутатионилирования кальций-транспортирующих белков кардиомиоцитов при помощи антител к SERCA2 и глутатиону. Оптимизация условий детекции глутатионилирования SERCA2 показала, что в присутствии 1 мМ этилглутатиона при 2-минутной гипоксии достигалось повышение уровня глутатионилирования SERCA2 по сравнению с условиями нормоксии или гипоксии в отсутствие этилглутатиона в среде инкубации кардиомиоцитов (рис.16).To study the protective mechanism of ethyl glutathione, a method was developed for measuring the level of glutathionylation of calcium-transporting proteins of cardiomyocytes using antibodies to SERCA2 and glutathione. Optimization of the SERCA2 glutathionylation detection conditions showed that in the presence of 1 mM ethylglutathione with 2-minute hypoxia, an increase in SERCA2 glutathionylation levels was achieved compared to normoxia or hypoxia conditions in the absence of ethyl glutathione in the incubation medium of cardiomyocytes (Fig. 16).

В присутствии 1 мМ глутатиона гипоксия-реоксигенация кардиомиоцитов приводила к значительному повышению количества глутатиона, обнаруживаемого в составе SERCA2. Результаты этих исследований показывают, что присутствие этилглутатиона приводит к повышению уровня глутатионилирования SERCA2 в условиях гипоксии и гипоксии-реоксигенации и коррелирует с наблюдаемым защитным эффектом этилглутатиона, препятствуя нарушению сократительной активности кардиомиоцитов при гипоксии.In the presence of 1 mM glutathione, hypoxia-reoxygenation of cardiomyocytes led to a significant increase in the amount of glutathione found in SERCA2. The results of these studies show that the presence of ethyl glutathione leads to an increase in the level of glutathionylation of SERCA2 under conditions of hypoxia and hypoxia-reoxygenation and correlates with the observed protective effect of ethyl glutathione, preventing the disturbance of the contractile activity of cardiomyocytes during hypoxia.

Таким образом, разработанный метод защиты кардиомиоцитов от повреждения в условиях гипоксии посредством введения в среду инкубации 1 мМ этилглутатиона позволяет эффективно предотвратить снижение и/или восстановить сократительную активность изолированных кардиомиоцитов в ответ на электрическую стимуляцию. В присутствии 1 мМ ЭГ при гипоксии происходит глутатионилирование Са2+-АТФазы саркоплазматического ретикулума кардиомиоцитов, коррелирующее с восстановлением активности сократительного аппарата кардиомиоцитов и динамики флуоресценции Fluo-4 - индикатора концентрации свободного Са2+ в цитоплазме кардиомиоцитов.Thus, the developed method for protecting cardiomyocytes from damage under hypoxia by introducing 1 mM ethylglutathione into the incubation medium can effectively prevent the decrease and / or restore contractile activity of isolated cardiomyocytes in response to electrical stimulation. In the presence of 1 mM EG during hypoxia, glutathionylation of Ca2 + -ATPase of the sarcoplasmic reticulum of cardiomyocytes occurs, which correlates with the restoration of the activity of the contractile apparatus of cardiomyocytes and the fluorescence dynamics of Fluo-4, an indicator of the concentration of free Ca2 + in the cytoplasm of cardiomyocytes.

Таким образом, создание биядерной формы динитрозильного комплекса железа с этиловым эфиром глутатиона (ДНКЖ-ЭЭГ) [(EEGS)₂Fe₂(NO)₄] осуществлено на базе полученных сведений о наличии защитного действия каждого соединения с учетом того, что этилглутатион обладал более сильным антиаритмическим действием, чем ДНКЖ. Кроме того, перспективность нового соединения определяется вероятным ускорением прохождения ДНКЖ через клеточные мембраны благодаря наличию этилового радикала.Thus, the binuclear form of the dinitrosyl complex of iron with glutathione ethyl ester (DNIC-EEG) [(EEGS) ₂ Fe ₂ (NO) ₄ ] was created on the basis of the information obtained on the presence of the protective effect of each compound, taking into account the fact that ethyl glutathione had a stronger antiarrhythmic action than DNIC. In addition, the promise of the new compound is determined by the likely acceleration of the passage of DNIC through cell membranes due to the presence of an ethyl radical.

Новая композиция, включающая динитрозильные комплексы железа (ДНКЖ) с этиловым эфиром глутатиона (ДНКЖ-ЭЭГ) [(EEGS)₂Fe₂(NO)₄], создана для применения в кардиологии, а именно - для уменьшения гипоксических и реоксигенационных нарушений функции миокарда посредством воздействия на белки кальциевого транспорта кардиомиоцитов. Раскрытие механизма защитного действия этилглутатиона и ДНКЖ при гипоксии-реоксигенации миокарда и усиление защитного действия при совместном использовании компонентов заявляемой композиции позволяет рекомендовать ее как перспективную основу для создания кардиотропного препарата в ситуациях гипоксического или ишемического повреждения миокарда.The new composition, including dinitrosyl iron complexes (DNIC) with glutathione ethyl ester (DNIC-EEG) [(EEGS) ₂ Fe ₂ (NO) ₄ ], was created for use in cardiology, namely, to reduce hypoxic and reoxygenation disorders of the myocardium by effects on calcium transport proteins of cardiomyocytes. The disclosure of the mechanism of the protective effect of ethyl glutathione and DNIC during hypoxia-reoxygenation of the myocardium and the enhancement of the protective effect when the components of the claimed composition are used together can be recommended as a promising basis for creating a cardiotropic drug in situations of hypoxic or ischemic myocardial damage.

Claims

1. The binuclear form of the dinitrosyl complex of iron with glutathione ethyl ester (DNIC-EEG) of the formula [(EEGS) ₂ Fe ₂ (NO) ₄ ] with the structural formula:

where RS is a glutathione ethyl ester containing a thiol group.

2. A composition for reducing functional disorders of the myocardium subjected to hypoxia-reoxygenation, containing the binuclear form of the dinitrosyl complex of iron with glutathione ethyl ester (DNA-EEG) according to claim 1 and a pharmaceutically acceptable carrier.

3. The use of the binuclear form of a dinitrosyl complex of iron with glutathione ethyl ester (DNIC-EEG) according to claim 1 as an antihypoxic agent.