RU2522863C2 - Способ определения модифицированных нуклеотидов рнк - Google Patents
Способ определения модифицированных нуклеотидов рнк Download PDFInfo
- Publication number
- RU2522863C2 RU2522863C2 RU2012143256/15A RU2012143256A RU2522863C2 RU 2522863 C2 RU2522863 C2 RU 2522863C2 RU 2012143256/15 A RU2012143256/15 A RU 2012143256/15A RU 2012143256 A RU2012143256 A RU 2012143256A RU 2522863 C2 RU2522863 C2 RU 2522863C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- rna
- probes
- fluorescence
- melting
- temperature
- Prior art date
Links
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 title claims abstract description 91
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 79
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 85
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 64
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims abstract description 59
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims abstract description 59
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims abstract description 50
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims abstract description 50
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 30
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 17
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims abstract description 17
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000010583 slow cooling Methods 0.000 claims abstract description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 124
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 24
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 16
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 6
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 5
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 5
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 5
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 claims description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 4
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 4
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 claims description 3
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 claims description 3
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 claims description 3
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 14
- 230000026279 RNA modification Effects 0.000 abstract description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 7
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 22
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 21
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 21
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 8
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical class O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 7
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 7
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 7
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical group O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 6
- -1 other polymers Chemical class 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 6
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 6
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 229930185560 Pseudouridine Natural products 0.000 description 5
- PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N Pseudouridine C Natural products OC1C(O)C(CO)OC1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N beta-Pseudouridine Natural products OC1OC(CN2C=CC(=O)NC2=O)C(O)C1O WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 5
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 5
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 5
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N pseudouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N 0.000 description 5
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 4
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 4
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 4
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 4
- 108020005097 23S Ribosomal RNA Proteins 0.000 description 3
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 3
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VQAYFKKCNSOZKM-IOSLPCCCSA-N N(6)-methyladenosine Chemical compound C1=NC=2C(NC)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O VQAYFKKCNSOZKM-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 3
- VQAYFKKCNSOZKM-UHFFFAOYSA-N NSC 29409 Natural products C1=NC=2C(NC)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(O)C1O VQAYFKKCNSOZKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 3
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 3
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 3
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 3
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 3
- OGHAROSJZRTIOK-KQYNXXCUSA-O 7-methylguanosine Chemical compound C1=2N=C(N)NC(=O)C=2[N+](C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OGHAROSJZRTIOK-KQYNXXCUSA-O 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 2
- BVIAOQMSVZHOJM-UHFFFAOYSA-N N(6),N(6)-dimethyladenine Chemical compound CN(C)C1=NC=NC2=C1N=CN2 BVIAOQMSVZHOJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016812 Radical SAM Human genes 0.000 description 2
- 108050006523 Radical SAM Proteins 0.000 description 2
- 125000000278 alkyl amino alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000001360 collision-induced dissociation Methods 0.000 description 2
- ZPTBLXKRQACLCR-XVFCMESISA-N dihydrouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)CC1 ZPTBLXKRQACLCR-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 2
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 2
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 2
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 2
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N spermine Chemical compound NCCCNCCCCNCCCN PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 2
- LKUDPHPHKOZXCD-UHFFFAOYSA-N 1,3,5-trimethoxybenzene Chemical compound COC1=CC(OC)=CC(OC)=C1 LKUDPHPHKOZXCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTQUILVPBZEHTK-ZOQUXTDFSA-N 1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-3-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1N(C)C(=O)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UTQUILVPBZEHTK-ZOQUXTDFSA-N 0.000 description 1
- NEOJKYRRLHDYII-TURQNECASA-N 1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-(2-oxopropyl)pyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(CC(=O)C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 NEOJKYRRLHDYII-TURQNECASA-N 0.000 description 1
- WZIZREBAUZZJOS-TURQNECASA-N 1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-[2-(methylamino)ethyl]pyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(CCNC)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 WZIZREBAUZZJOS-TURQNECASA-N 0.000 description 1
- QLOCVMVCRJOTTM-TURQNECASA-N 1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-prop-1-ynylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C#CC)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 QLOCVMVCRJOTTM-TURQNECASA-N 0.000 description 1
- SGKGZYGMLGVQHP-ZOQUXTDFSA-N 1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-6-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound CC1=CC(=O)NC(=O)N1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SGKGZYGMLGVQHP-ZOQUXTDFSA-N 0.000 description 1
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1H-imidazole Chemical compound CN1C=CN=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GFYLSDSUCHVORB-IOSLPCCCSA-N 1-methyladenosine Chemical compound C1=NC=2C(=N)N(C)C=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O GFYLSDSUCHVORB-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 1
- WJNGQIYEQLPJMN-IOSLPCCCSA-N 1-methylinosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)N(C)C=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O WJNGQIYEQLPJMN-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 1
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 101800001779 2'-O-methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- IQZWKGWOBPJWMX-UHFFFAOYSA-N 2-Methyladenosine Natural products C12=NC(C)=NC(N)=C2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O IQZWKGWOBPJWMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HTOVHZGIBCAAJU-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-propyl-1h-purin-6-one Chemical compound CCCC1(N)NC(=O)C2=NC=NC2=N1 HTOVHZGIBCAAJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CDAWCLOXVUBKRW-UHFFFAOYSA-N 2-aminophenol Chemical compound NC1=CC=CC=C1O CDAWCLOXVUBKRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- IQZWKGWOBPJWMX-IOSLPCCCSA-N 2-methyladenosine Chemical compound C12=NC(C)=NC(N)=C2N=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O IQZWKGWOBPJWMX-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 1
- USCCECGPGBGFOM-UHFFFAOYSA-N 2-propyl-7h-purin-6-amine Chemical compound CCCC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 USCCECGPGBGFOM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RHFUOMFWUGWKKO-XVFCMESISA-N 2-thiocytidine Chemical compound S=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 RHFUOMFWUGWKKO-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- GJTBSTBJLVYKAU-XVFCMESISA-N 2-thiouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=S)NC(=O)C=C1 GJTBSTBJLVYKAU-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- RDPUKVRQKWBSPK-UHFFFAOYSA-N 3-Methylcytidine Natural products O=C1N(C)C(=N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 RDPUKVRQKWBSPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTQUILVPBZEHTK-UHFFFAOYSA-N 3-Methyluridine Natural products O=C1N(C)C(=O)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UTQUILVPBZEHTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RDPUKVRQKWBSPK-ZOQUXTDFSA-N 3-methylcytidine Chemical compound O=C1N(C)C(=N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 RDPUKVRQKWBSPK-ZOQUXTDFSA-N 0.000 description 1
- LOJNBPNACKZWAI-UHFFFAOYSA-N 3-nitro-1h-pyrrole Chemical compound [O-][N+](=O)C=1C=CNC=1 LOJNBPNACKZWAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLOIGESWDJYCTF-UHFFFAOYSA-N 4-Thiouridine Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=S)C=C1 ZLOIGESWDJYCTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BCZUPRDAAVVBSO-MJXNYTJMSA-N 4-acetylcytidine Chemical compound C1=CC(C(=O)C)(N)NC(=O)N1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 BCZUPRDAAVVBSO-MJXNYTJMSA-N 0.000 description 1
- MPPUDRFYDKDPBN-UAKXSSHOSA-N 4-amino-1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-hydroxypyrimidin-2-one Chemical group C1=C(O)C(N)=NC(=O)N1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 MPPUDRFYDKDPBN-UAKXSSHOSA-N 0.000 description 1
- XXSIICQLPUAUDF-TURQNECASA-N 4-amino-1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-prop-1-ynylpyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(N)C(C#CC)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 XXSIICQLPUAUDF-TURQNECASA-N 0.000 description 1
- GCNTZFIIOFTKIY-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxypyridine Chemical compound OC1=CC=NC=C1 GCNTZFIIOFTKIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLOIGESWDJYCTF-XVFCMESISA-N 4-thiouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=S)C=C1 ZLOIGESWDJYCTF-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 5-Methylcytidine Natural products O=C1N=C(N)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZXIATBNUWJBBGT-JXOAFFINSA-N 5-methoxyuridine Chemical compound O=C1NC(=O)C(OC)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 ZXIATBNUWJBBGT-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- SNNBPMAXGYBMHM-JXOAFFINSA-N 5-methyl-2-thiouridine Chemical compound S=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SNNBPMAXGYBMHM-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 5-methylcytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- OZFPSOBLQZPIAV-UHFFFAOYSA-N 5-nitro-1h-indole Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C2NC=CC2=C1 OZFPSOBLQZPIAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical group C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKOMXBHMKXXTNW-UHFFFAOYSA-N 6-methyladenine Chemical compound CNC1=NC=NC2=C1N=CN2 CKOMXBHMKXXTNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RTGYRFMTJZYXPD-IOSLPCCCSA-N 8-Methyladenosine Chemical compound CC1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O RTGYRFMTJZYXPD-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 1
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical class [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 125000000824 D-ribofuranosyl group Chemical group [H]OC([H])([H])[C@@]1([H])OC([H])(*)[C@]([H])(O[H])[C@]1([H])O[H] 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 101710159129 DNA adenine methylase Proteins 0.000 description 1
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 1
- 230000030933 DNA methylation on cytosine Effects 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241001674329 Helicobacter pylori 26695 Species 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150057246 IME4 gene Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- RSPURTUNRHNVGF-IOSLPCCCSA-N N(2),N(2)-dimethylguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N(C)C)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O RSPURTUNRHNVGF-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 1
- SLEHROROQDYRAW-KQYNXXCUSA-N N(2)-methylguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(NC)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O SLEHROROQDYRAW-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- JSJWCHRYRHKBBW-UHFFFAOYSA-N N-carbamoyl-beta-alanine Chemical compound NC(=O)NCCC(O)=O JSJWCHRYRHKBBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N N-formyl-L-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC=O PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 101100342977 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical group OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 101900065090 Saccharomyces cerevisiae tRNA(His) guanylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 229910004298 SiO 2 Inorganic materials 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000005600 alkyl phosphonate group Chemical group 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000001369 bisulfite sequencing Methods 0.000 description 1
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 1
- WTEOIRVLGSZEPR-UHFFFAOYSA-N boron trifluoride Chemical class FB(F)F WTEOIRVLGSZEPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004657 carbamic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012668 chain scission Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000007073 chemical hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-N dithiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 229960003082 galactose Drugs 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 229960004275 glycolic acid Drugs 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002443 hydroxylamines Chemical class 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- WDWDWGRYHDPSDS-UHFFFAOYSA-N methanimine Chemical class N=C WDWDWGRYHDPSDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OLOIFBKXGHJOIV-UHFFFAOYSA-N methyl(methylidene)silane Chemical class C[SiH]=C OLOIFBKXGHJOIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical class CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037230 mobility Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 150000002923 oximes Chemical class 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 150000008298 phosphoramidates Chemical class 0.000 description 1
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000006303 photolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000307 polymer substrate Polymers 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- UBQKCCHYAOITMY-UHFFFAOYSA-N pyridin-2-ol Chemical compound OC1=CC=CC=N1 UBQKCCHYAOITMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000003303 reheating Methods 0.000 description 1
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 description 1
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-JXOAFFINSA-N ribothymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- RHFUOMFWUGWKKO-UHFFFAOYSA-N s2C Natural products S=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 RHFUOMFWUGWKKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JRPHGDYSKGJTKZ-UHFFFAOYSA-K selenophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=[Se] JRPHGDYSKGJTKZ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000006884 silylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 229940063675 spermine Drugs 0.000 description 1
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 1
- 150000003457 sulfones Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical class [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицины и предназначено для обнаружения модифицированных нуклеотидов в составе РНК. Осуществляют подбор подходящей для исследуемой области РНК пары олигонуклеотидных зондов, подбор пары донора и тушителя флуоресценции с подходящими оптическими свойствами. Проводят прямой химический синтез модифицированных зондов, оценивают их эффективность в ходе плавления с РНК, содержащей известные модификации. Оценивают полученные параметры плавления для каждой конкретной системы. Анализируют контрольную и исследуемую РНК, подвергая смесь зондов и РНК сильному нагреванию, медленному охлаждению, а затем контролируемому нагреванию с одновременной детекцией интенсивности флуоресценции, причем параметры исследования выбирают с учетом конкретной системы. Результаты плавления анализируют, оценивая характер кривых плавления, и делают вывод о наличии или отсутствии модификации в исследуемой РНК при наличии или отсутствии модификаций в контрольной РНК. Предлагаемый способ эффективен для обнаружения различных типов модификаций РНК и позволяет детектировать наличие модификаций, которые не препятствуют образованию Уотсон-Криковских пар между нуклеотидами. 16 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 пр.
Description
Изобретение относится к области органической и медицинской химии, молекулярной биологии и касается способа обнаружения модифицированных оснований в составе РНК, который может быть использован для быстрой идентификации РНК-модифицирующих ферментов в клетке.
Нуклеотиды природных РНК часто претерпевают различные химические превращения, и на сегодняшний день известно более сотни типов модифицированных нуклеотидов (Rozenski J., Grain P.F., McCloskey J.A. The RNA Modification Database: 1999 update. Nucleic Acids Res. 1999. 27(1): 196-7). Среди всех типов РНК наиболее распространенными модификациями являются метилирование, псевдоуридинилирование и дигидроуридинилирование. Известно, что некоторые такие модификации обеспечивают химическое и функциональное разнообразие РНК, улучшают их структурную стабильность или функциональную активность (Bjork, G.R., et al. Transfer RNA modification. Anna Rev Biochem. 1987. 56:263-87; Dunin-Horkawicz, S., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. Nucleic Acids Res. 2006. 34 (Database issue): D145-9) и даже участвуют в регуляции экспрессии генов (Clancy MJ, Shambaugh ME, Timpte CS, Bokar J A. Induction of sporulation in Saccharomyces cerevisiae leads to the formation of N6-methyladenosine in mRNA: a potential mechanism for the activity of the IME4 gene. Nucleic Acids Res. 2002. 30(20): 4509-18).
Несмотря на эти данные, остается обширный круг модифицированных нуклеотидов РНК, функция и причина возникновения которых до сих пор непонятны. Кроме того, реализация данного изобретения поможет выяснить и особенности регуляции процесса модифицирования нуклеотидов РНК. В течение более чем 50 лет в научном мире появляются все новые методы, которые позволяют более или менее успешно устанавливать наличие, количество и даже положение той или иной модификации в молекуле РНК. Одним из первых методов обнаружения метилированных нуклеотидов стал анализ продуктов гидролиза радиоактивно меченной РНК методом двумерного электрофореза (Sanger, F., G.G.Brownlee, and B.G.Barrell. A two-dimensional fractionation procedure for radioactive nucleotides. J Mol Biol. 1965. 13(2): 373-98). Однако метод оказался крайне трудоемким, а его результаты часто были неоднозначными. Сразу после того как Максам и Гилберт предложили анализировать последовательность ДНК путем химического и ферментативного гидролиза (Махат, A.M. and W.Gilbert. A new method for sequencing DNA. Proc Natl Acad Sci USA. 1977. 74(2): 560-4), появились методы, позволяющие выявить некоторые модифицированные нуклеотиды РНК (Peattie, D.A. Direct chemical method for sequencing RNA. Proc Natl Acad Sci USA 1979. 76(4): 1760-4; Donis-Keller, H., A.M.Maxam, and W.Gilbert. Mapping adenines, guanines, and pyrimidines in RNA. Nucleic Acids Res. 1977. 4(8): 2527-38). Эти методы требовали работы с радиоактивными изотопами, а анализируемая молекула РНК не должна была иметь большую длину. В начале 80-х годов данный метод адаптировали к длинным молекулам РНК, предложив использовать олигодезоксирибонуклеотиды, комплементарные исследуемым последовательностям РНК, с последующим гидролизом РНказойН (Connaughton, J.F., et al. Primary structure of rabbit 18S ribosomal RNA determined by direct RNA sequence analysis. Nucleic Acids Res. 1984. 12(11): 4731-45). Это позволило идентифицировать метилированные по 2'-гидроксильным группам рибозы нуклеотиды Cm, Am, Um, а также нуклеотиды m7G. К сожалению, усовершенствованный метод гидролиза с последующим секвенированием РНК, был не менее трудоемок и не был универсальным для нахождения любых модификаций РНК. В 1993 году группа Офенганда разработала новый, до сих пор не утерявший своей актуальности метод обнаружения модифицированных нуклеотидов с помощью реакции обратной транскрипции (Bakin, A. and J.Ofengand. Four newly located pseudouridylate residues in Escherichia coli 23S ribosomal RNA are all at the peptidyltransferase center: analysis by the application of a new sequencing technique. Biochemistry. 1993. 32(37): 9754-62). Он применим преимущественно к нахождению модификаций нуклеотидов, которые препятствуют образованию Уотсон-Криковских пар (m2 6А, m3U, m1G), а при особых условиях остановку реакции обратной транскрипции вызывает и наличие метальной группы на 2'-гидроксиле рибозы (Maden, В.Е., et al. Classical and novel approaches to the detection and localization of the numerous modified nucleotides in eukaryotic ribosomal RNA. Biochimie. 1995. 77(1-2): 22-9). При использовании уникальных химических свойств некоторых других нуклеотидов в сочетании с реакцией обратной транскрипции также можно обнаружить псевдоуридин Ψ (Bakin, A. and J.Ofengand. Four newly located pseudouridylate residues in Escherichia coli 23S ribosomal RNA are all at the peptidyltransferase center: analysis by the application of a new sequencing technique. Biochemistry. 1993. 32(37): 9754-62), m7G (Wintermeyer, W. and H.G.Zachau. A specific chemical chain scission of tRNA at 7-methylguanosine. FEBS Lett. 1970. 11(3): 160-164), m3C, m2G (Mortimer, SA., J.S.Johnson, and K.M.Weeks. Quantitative analysis of RNA solvent accessibility by N-silylation of guanosine. Biochemistry. 2009. 48(10): 2109-14.), m5C (Rhodes, D. Accessible and inaccessible bases in yeast phenylalanine transfer RNA as studied by chemical modification. J Mol Biol. 1975. 94(3): 449-60; Negishi, K., et al A rapid cytosine-specific modification of E. coli tRNA Leu 1 by semicarbazide-bisulfite, a probe for polynucleotide conformations. Nucleic Acids Res. 1977. 4(7): 2283-92. Munzel, M., et al. Chemical discrimination between dC and 5MedC via their hydroxylamine adducts. Nucleic Acids Res. 2010. 38(21): e192; Clark, S.J., et al. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 1994. 22(15): 2990-7; Gu, W., et al. Depletion of Saccharomyces cerevisiae tRNA(His) guanylyltransferase Thg1p leads to uncharged tRNAHis with additional m(5)C. Mol Cell Biol. 2005. 25(18): 8191-201; Schaefer, M., et al. RNA cytosine methylation analysis by bisulfite sequencing. Nucleic Acids Res. 2009. 37(2): e12.). Стоит отметить также, что 2'-O-метилированный нуклеотид более устойчив в условиях щелочного гидролиза, нежели неметилированный. Это свойство используют в сочетании с реакцией обратной транскрипции для обнаружения нуклеотидов РНК, содержащих метальную группу в рибозе (Maden, В.Е. Mapping 2'-O-methyl groups in ribosomal RNA. Methods. 2001. 25(3): 374-82). Дигидроуридин также не вызывает остановку реакции обратной транскрипции, поэтому перед дальнейшим анализом используют его уникальную способность превращаться в остаток β-уреидопропионовой кислоты в щелочной среде (Xing F, Hiley SL, Hughes TR, Phizicky EM. The specificities of four yeast dihydrouridine synthases for cytoplasmic tRNAs. J Biol Chem. 2004. 279:17850-60).
С появлением новых инструментов подходы к поиску модифицированных нуклеотидов РНК изменились. Так, метод масс-спектрометрии с электроспрей-ионизацией (ESI-MS) обеспечивает достаточно мягкие условия для анализа РНК (Kowalak, J.A., et al. А novel method for the determination of post-transcriptional modification in RNA by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 1993. 21(19): 4577-85), которые в результате образуют многозарядные ионы, и, следовательно, допустимый предел массы анализируемой РНК значительно увеличивается (Polo, L.M. and P.A.Limbach. Analysis of oligonucleotides by electrospray ionization mass spectrometry. Curr Protoc Nucleic Acid Chem. 2001. Chapter 10, Unit 10 2). При всех достоинствах метода ESI-MS, с его помощью зачастую нельзя установить положение модифицированного нуклеотида в молекуле РНК, и практически невозможно установить положение модификации внутри нуклеотида. В связи с этим метод масс-спектрометрии используют в качестве надежного дополняющего метода, позволяющего обнаружить различия в массах фрагментов РНК, не достигающих даже 1 дальтона.
На сегодняшний день широко применяют высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) для подтверждения присутствия модифицированного нуклеотида в составе РНК. Разделению подвергают продукты полностью гидролизованных РНК и по малейшим изменениям в подвижности различают всевозможные типы модифицированных нуклеотидов. Кроме того, в сочетании с методом масс-спектрометрии в точности устанавливают тип и молекулярную массу исследуемого фрагмента (Kowalak, J.A., et al. A novel method for the determination of post-transcriptional modification in RNA by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 1993. 21(19): 4577-85; Andersen, Т.Е., B.T.Porse, and F.Kirpekar. A novel partial modification at C2501 in Escherichia coli 23S ribosomal RNA. RNA. 2004.10(6): 907-13; Giessing, A.M., et al. Identification of 8-methyladenosine as the modification catalyzed by the radical SAM methyltransferase Cfr that confers antibiotic resistance in bacteria. RNA. 2009. 15(2): 327-36; Yan, F., et al. RlmN and Cfr are radical SAM enzymes involved in methylation of ribosomal RNA. J Am Chem Soc. 2010. 132(11): 3953-64; Benitez-Paez, A., et al. YibK is the 2'-O-methyltransferase TrmL that modifies the wobble nucleotide in Escherichia coli tRNA(Leu) isoacceptors. RNA. 2010.16(11): 2131-43; Havelund, JF, Giessing, A.M., Hansen, Т., Rasmussen, A., Scott, L.G., Kirpekar, F. Identification of 5-hydroxycytidine at position 2501 concludes characterization of modified nucleotides in E.coli 23S rRNA. J Mol Biol. 2011. 411(3):529-36). Однако установить точное положение модифицированного нуклеотида с использованием комбинации ВЭЖХ и ESI-MS не представляется возможным. Нельзя не упомянуть изящный и сложный метод обнаружения 2'-O-метилированных нуклеотидов, который представляет собой совмещение масс-спектрометрического анализа, метода переноса электронов (ЕТ) и метода диссоциации, активированной соударениями (CAD), инфракрасной мультифотонной диссоциации (IRMPD) или ультрафиолетовой фотодиссоциации (UVPD) (Smith, S.I. and J.S. Brodbelt. Hybrid activation methods for elucidating nucleic acid modifications. Anal Chem. 2011. 83(1): 303-10). С помощью данного метода получают различные типы ионов, образованных разрушением некоторых предпочтительных связей в нуклеиновых кислотах, причем продукты разрыва в результате применения IRMPD и UVPD различаются и дополняют друг друга. Наличие 2'-O-метильной группы предотвращает образование характерных для рибозы типов ионов, и в результате сравнительного анализа методом масс-спектрометрии полученного фрагмента РНК устанавливают искомое положение метилированного нуклеотида в нем.
Среди всех модифицированных нуклеозидов наибольшее затруднение в идентификации вызывают дигидроуридин (D), монометилированный по экзоциклическому атому азота аденозин (m6A) и в меньшей степени псевдоуридин (Ψ). Это связано с тем, что при формировании дуплексов между исследуемой РНК и комплементарными ей олигонуклеотидами они ведут себя в точности так же, как немодифицированные нуклеозиды. В то время как D и Ψ имеют уникальные химические свойства и могут быть обнаружены после химических превращений путем обратной транскрипции, то m6A до недавних пор могли детектировать только исчерпывающим гидролизом с дальнейшим анализом методами ВЭЖХ и MS (Kawamura, Y. and Mizuno, Y. Studies on transfer RNAs. II. Modification of Escherichia coli formylmethionine transfer RNA. Biochim. Biophys. Acta. 1972. 277: 323-334; Limbach, PA., Grain, P.F. and McCloskey, J.A. Characterization of oligonucleotides and nucleic acids by mass spectrometry. Curr. Opin. Biotechnol. 1995. 6: 96-102). Проблема обостряется еще и потому, что именно эти три модифицированных нуклеозида чаще всего встречаются в РНК клеток всех живых организмов. Был предложен довольно интересный метод обнаружения двух модифицированных нуклеозидов - Ψ и m6A (Dai, Q., Fong, R., Saikia, M., Stephenson, D., Yu, Y., Pan, T. and Piccirilli, J A. Identification of recognition residues for ligation-based detection and quantitation of pseudouridine and N6-methyladenosine. Nucleic Acids Research. 2007. 35(18): 6322-9). Принцип метода заключается в подборе пары комплементарных исследуемой РНК олигонуклеотидов, один из которых содержит на 5'-конце так называемый «узнающий остаток», а также несет радиоактивно меченный атом фосфора в α-положении. Второй олигонуклеотид гибридизуется в непосредственной близости с «узнающим». «Узнающий остаток» находится прямо напротив исследуемого нуклеотида и принимает разную геометрию, в зависимости от наличия или отсутствия модификации. Это сказывается на эффективности лигирования двух олигонуклеотидов, располагающихся напротив искомого нуклеотида, и, таким образом, указывает на наличие или отсутствие модификации в РНК. Авторы данного метода впервые показали, как без дополнительных химических превращений можно обнаружить модифицированные нуклеотиды Ψ и m6A. Недостатками метода является применение радиоактивных изотопов, а также неколичественный выход реакции, который заметно отличается для разных последовательностей изучаемых РНК.
Один из методов обнаружения модифицированного нуклеозида m6А использовала группа Рао, применив антитела, специфичные к участку ДНК, содержащему монометилированный по экзоциклическому атому азота аденозин (Banerjee, A., Rao, D.N. Functional analysis of an acid adaptive DNA adenine methyltransferase from Helicobacter pylori 26695. PLoS One. 2011. 6(2):e16810). Вскоре после этого был представлен усовершенствованный метод, адаптированный для анализа метилированных РНК и получивший название m6A-seq (Dominissini, D., Moshitch-Moshkovitz, S., Schwartz, S., Salmon-Divon, M., Ungar, L., Osenberg, S., Cesarkas, K., Jacob-Hirsch, J., Amariglio, N, Kupiec, M., Sorek, R., Rechavi, G. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature. 2012. 485(7397): 201-6). Авторы демонстрируют, что при помощи антител, специфичных по отношению к модифицированному нуклеозиду m6A в мРНК, с последующим исчерпывающим секвенированием ее фрагментов, появилась возможность определять весь набор искомых модификаций во всех клеточных РНК одновременно. Этот метод можно назвать прорывным благодаря его универсальности: с его помощью стало возможным обнаруживать модифицированные нуклеотиды вне зависимости от последовательности РНК, при этом не требуется дополнительной обработки РНК и работы с радиоактивными изотопами. Единственным существенным недостатком предложенного метода является необходимость в дорогостоящем оборудовании, приобретение которого могут позволить себе лишь единичные лаборатории мира.
Наиболее близким к заявляемому решению является способ определения метилирования в последовательностях нуклеиновых кислот (Заявка на изобретение США US 2010/0291565 Al). Данное изобретение относится к методу детекции метилирования ДНК предпочтительно природного происхождения путем контакта исследуемой нуклеиновой кислоты с каким-либо химическим агентом с образованием детектируемого сигнала при их контакте. Метод включает в себя стадию денатурации исследуемой ДНК и детекцию полученного от химического агента сигнала при их контакте. Уровень метилирования оценивают путем сравнения профилей кривых плавления, в частности, по их наклону. Кроме того, метод также допускает использование дополнительно химического агента, контактирующего с ДНК и способного тушить флуоресценцию, возникающую при применении метода.
Заявляемое изобретение имеет существенные отличия от известного технического решения. А именно, в основе настоящего изобретения лежит гибридизация двух олигонуклеотидов, один из которых содержит донор флуоресценции, а другой - тушитель флуоресценции, причем имеет большое значение соотношение длин применяемых олигонуклеотидов. Предложенный метод используется для точечных модификаций в определенных нуклеотидах, в отличие от прототипа. Метод нацелен на обнаружение различных типов модификаций, включая различные типы метилирования, дигидроуридинилирование и прочее. Стадии денатурации в настоящем исследовании предшествует стадия гибридизации олигонуклеотидов, что увеличивает специфичность метода детекции. Характер кривых в настоящем изобретении может указывать на различные типы модификаций и, таким образом, возможна детерминация различных типов модификаций на одном и том же нуклеотиде. Кроме того, объектом исследования является РНК, а не ДНК.
Все вышеперечисленные отличия выгодно характеризуют предложенное изобретение, при применении которого появляется возможность детектировать большой спектр модификаций на конкретных нуклеотидах в молекулах РНК.
Таким образом, в данной области остается необходимость в разработке универсального метода, который позволил бы однозначно, быстро и с минимальными материальными затратами детектировать различные модификации нуклеотидов в составе РНК.
Задачей настоящего изобретения является разработка нового простого и универсального способа обнаружения модифицированных нуклеотидов в составе РНК.
Технический результат заявляемой группы изобретений состоит в возможности выявить минимальные различия в структуре РНК, даже для модификаций, не препятствующих образованию Уотсон-Криковских пар. Кроме того, технический результат состоит в расширении спектра модификаций, которые могут быть обнаружены с помощью заявляемого метода.
Поставленная задача решается тем, что способ обнаружения модифицированного нуклеотида в составе исследуемой РНК включает получение контрольной РНК; дизайн двух олигонуклеотидных зондов разной длины, комплементарных исследуемой РНК, при этом один из зондов, имеющих меньшую длину, комплементарен РНК в области, содержащей исследуемый нуклеотид, и имеет температуру плавления меньшую, чем температура плавления второго зонда, один из зондов содержит молекулу донора флуоресценции, а другой - тушитель флуоресценции, при этом донор флуоресценции и тушитель подобраны с обеспечением перекрывания диапазона длин волн испускаемого донором флуоресценции излучения с диапазоном длин волн излучения, поглощаемого тушителем флуоресценции; смешение зондов с исследуемой и контрольной РНК, после чего полученные смеси подвергают нагреву до температуры, обеспечивающей полную денатурацию исследуемой РНК и зондов, медленному охлаждению до температуры, обеспечивающей образование стабильных дуплексов между РНК и зондами, и повторному медленному контролируемому нагреву с одновременным облучением и измерением интенсивности флуоресценции и получением кривых плавления для исследуемой и контрольной РНК, при этом выводы о наличии или отсутствии модификации в исследуемом нуклеотиде РНК делают по итогам сравнения кривых, и при совпадении характера кривых и/или температуры плавления делают вывод о наличии / отсутствии модификации в исследуемой РНК при наличии / отсутствии модификации в контрольной РНК в зоне гибридизации более короткого зонда. В качестве контрольной РНК используют РНК с известной структурой в исследуемой области, а исследуемая РНК аналогична контрольной или отличается от контрольной наличием или отсутствием модификации в исследуемом нуклеотиде. Исследуемая и контрольная РНК являются рибосомными или матричными или транспортными. Зонды подбирают из условия гибридизации их на РНК в непосредственной близости без перекрывания. Более длинный зонд подбирают с температурой плавления, превышающей температуру плавления второго зонда более чем на 5°С. Первый и второй зонды подбирают из условия гибридизации их на РНК на расстоянии друг от друга не далее чем на 10 нуклеотидов между их ближайшими концами. Первый и второй зонды подбирают из условия расположения молекул донора флуоресценции и тушителя флуоресценции на расстоянии не более чем на 10 нуклеотидов друг от друга при гибридизации зондов на РНК. Молекулы донора флуоресценции и тушителя флуоресценции к зондам присоединяют ковалентно. Зонды состоят из рибонуклеотидов, и/или дезоксирибонуклеотидов, и/или из их аналогов и могут содержать любые модификации, не препятствующие проведению исследования. Смешение зондов с РНК осуществляют с использованием буферного раствора. В качестве буферного раствора может быть использован любой состав, включающий вещество, поддерживающее рН раствора в диапазоне 6-8.5, и соль одновалентного или мультивалентного катиона. В одном из вариантов исполнения для смешения зондов с РНК может быть использовано 2-10 пмоль РНК, 2-10 пмоль олигонуклеотида зонда, содержащего донор флуоресценции, 2-10 пмоль зонда, содержащего тушитель флуоресценции, 2-10 мкл 5-кратного буфера для гибридизации, содержащего 200-300 мМ Tris-HCl рН 8.3, 150-250 мМ КСl и деионизированную воду для доведения объема образца до 10-50 мкл. Смесь может дополнительно содержать минеральное масло в количестве 3-10 мкл. Нагрев и охлаждение смесей осуществляют с контролируемой скоростью, при этом измерение интенсивности флуоресценции осуществляют в процессе нагревания. Возможен вариант использования, при котором первоначальный нагрев осуществляют до температуры смесей 70-95°С, медленное охлаждение происходит со скоростью 0.5-4°/ мин до достижения температуры смеси 30-10°С, повторный нагрев смесей производят со скоростью 0.5°/30 сек до достижения смесями 55-95°С. При этом охлаждение проводят до температуры, значение которой ниже температуры плавления короткого зонда не менее чем на 5°С. Повторный нагрев смесей осуществляют до температуры, значение которой превышает температуру плавления более короткого зонда, не менее чем на 5°С. Полученные для анализа кривые плавления преобразуют в кривые зависимости производных интенсивности флуоресценции по температуре от температуры (дифференциальные кривые).
Таким образом, техническая задача решается путем подбора подходящей для исследуемой области РНК пары олигонуклеотидных зондов, подбором пары донора и тушителя флуоресценции с подходящими оптическими свойствами. Длину зондов подбирают экспериментально, отдавая предпочтение тем, которые обеспечивают результаты плавления, интерпретируемые наилучшим образом. Проводится прямой химический синтез модифицированных зондов, оценивается их эффективность в ходе плавления с РНК, содержащей известные модификации. Оцениваются полученные параметры плавления для каждой конкретной системы.
Изобретение поясняется чертежами, где на Фиг.1 представлена схема расположения олигонуклеотидов, содержащих флуорофор и тушитель флуоресценции, гибридизованных с местом модификации РНК; на Фиг.2 изображены кривые плавления РНК-ДНК дуплексов; на Фиг.3 представлены дифференциальные кривые плавления РНК-ДНК дуплексов.
Авторы настоящего изобретения установили, что после гибридизации в непосредственной близости друг от друга двух комплементарных исследуемой РНК олигонуклеотидных зондов, один из которых содержит флуоресцентную метку, а другой - тушитель флуоресценции (Фиг.1), по термодинамическим параметрам такой системы можно определить наличие или отсутствие модифицированного основания в том участке РНК, на котором гибридизован более короткий зонд. Термодинамические параметры оценивали качественно при медленном нагревании всей системы и постоянной детекции уровня флуоресценции. В тот момент, когда один из олигонуклеотидных зондов начинает первым диссоциировать, происходит увеличение расстояния между донором флуоресценции и тушителем, что приводит к скачкообразному росту интенсивности флуоресценции в системе. Такой скачок происходит для каждой пары зондов и РНК при конкретной температуре, которую считают температурой плавления дуплекса. В результате эксперимента получали графики зависимости уровня флуоресценции от температуры (кривые плавления), которые преобразовывали в кривые зависимости производных интенсивности флуоресценции по температуре от температуры (дифференциальные кривые). Те области кривых плавления, в которых рост флуоресценции происходит скачкообразно (т.е. наблюдается точка перегиба кривой), соответствуют пикам в дифференциальных кривых.
Согласно заявляемому изобретению олигонуклеотидный зонд, комплементарный исследуемой РНК в непосредственной области, содержащей анализируемый нуклеотид, должен иметь температуру плавления ниже температуры плавления второго зонда. При этом не имеет значения, какой из зондов модифицирован донором, а какой - тушителем флуоресценции. При сравнении параметров системы, содержащей модифицированную и немодифицированную РНК, в большинстве случаев наблюдается различие как в температуре плавления, так и в характере кривых плавления. Причем различия в температурах плавления могут быть и менее 1 градуса. Это обусловлено особенностями каждой отдельной системы, которая, в зависимости от наличия или отсутствия модификации, может стабилизироваться или дестабилизироваться за счет изменения в геометрии дуплекса и в характере связей между зондами и РНК в области исследуемого нуклеотида. Зонды могут представлять собой модифицированные олигорибонуклеотиды, олигодезоксирибонуклеотиды, могут также содержать в своем составе любые модификации, не влияющие на способность зондов к гибридизации.
Авторами были получены кривые плавления для систем с рибосомной РНК, которые содержали следующие модифицированные нуклеозиды: псевдоуридин Ψ, дигидроуридин D, метилированный по 6 положению аденозин m6А, метилированный по 7 положению гуанозин m7G, метилированные по 2'-O-гидроксилу рибозы нуклеозиды Bm. Из перечисленных модифицированных нуклеозидов с помощью предложенного метода были детектированы D, m6А и m7G, разница в температурах плавления с немодифицированными РНК составляла до 4 градусов, при этом характер кривых плавления при детекции m6А заметно изменялся, что упрощало анализ. Стоит отметить, что модифицированные нуклеозиды Ψ и Bm не вызывали заметного сдвига кривых плавления. По всей вероятности, псевдоуридин незначительно изменяет свое окружение по сравнению с уридином, и термодинамические параметры образуемых ими дуплексов в точности совпадают. Метилированные по рибозе нуклеозиды Вт, хоть и содержат дополнительную гидрофобную группу, что, несомненно, сказывается на структуре ДНК-РНК дуплекса, однако же не проявляют какие-либо особенности в ходе плавления предложенным методом.
Кроме того, оригинальным является и принцип подбора олигонуклеотидных зондов для реализации способа, которые комплементарны РНК в области предполагаемого модифицированного нуклеотида, и один из них содержит тушитель флуоресценции, а другой - донор флуоресценции.
Наилучший результат достигается при соблюдении совокупности следующих условий:
- для детекции модифицированного нуклеотида необходимо ровно два олигонуклеотидных зонда;
- один из используемых зондов должен быть комплементарен области исследуемой РНК так, чтобы в данной области находился изучаемый нуклеотид;
- зонд, комплементарный области РНК, содержащей изучаемый нуклеотид, должен иметь температуру плавления, заметно меньшую, чем температура плавления второго зонда (как минимум, на 5°С);
- второй из используемых зондов должен быть комплементарен исследуемой РНК в непосредственной близости к первому зонду так, чтобы не было перекрывания зондов, а также их ближайшие концы располагались на РНК не далее чем на 10 нуклеотидов;
- один из зондов должен быть модифицирован молекулой донора флуоресценции, а другой зонд должен быть модифицирован молекулой тушителя флуоресценции, причем при гибридизации зондов на РНК молекулы донора и тушителя флуоресценции должны располагаться на расстоянии не более чем на 10 нуклеотидов;
- пара донора и тушителя флуоресценции, используемая в настоящем изобретении, должна быть совместима, то есть диапазон волн испускаемого донором излучения должен как минимум частично перекрываться с диапазоном длин волн, поглощаемых тушителем;
- зонды могут состоять из рибонуклеотидов или дезоксирибонуклеотидов;
- зонды могут содержать любые модификации, не препятствующие проведению детекции.
Ниже представлено более подробное описание заявляемого способа.
Зонды по изобретению могут иметь длину от 8 до 35 нуклеотидов, причем зонд, комплементарный РНК в области исследуемого нуклеотида, должен иметь температуру плавления как минимум на 5°С ниже температуры плавления второго зонда. Один из зондов должен содержать ковалентно связанную с ним молекулу донора флуоресценции, а другой зонд из пары должен содержать ковалентно связанную с ним молекулу тушителя флуоресценции. В некоторых вариантах осуществления зонды могут содержать дополнительные, некомплементарные к последовательности РНК, нуклеотиды или их производные, а также могут содержать модифицированные межнуклеотидные связи.
Ниже представлена используемая в изобретении терминология.
Под термином «РНК» понимают рибонуклеиновую кислоту. В рамках настоящего изобретения объектом исследования является любая РНК природного происхождения.
Под термином «ДНК» понимают дезоксирибонуклеиновую кислоту. Олигонуклеотидные зонды чаще всего представляют собой именно ДНК.
Под термином «модифицированный нуклеотид» подразумевают нуклеотид, производный от одного из нуклеотидов, азотистое основание которых является урацилом, тимином, аденином, цитозином или гуанином, отличающийся от них наличием или отсутствием заместителей или характером образованных связей.
Под термином «штамм дикого типа» подразумевают фенотип присущий большинству особей природных популяций данного вида.
Под термином «РНК дикого типа» подразумевают РНК, выделенную из штамма дикого типа.
Под термином «мутантная РНК» подразумевают РНК, отличную от РНК дикого
типа.
Под термином «суммарная РНК» подразумевают набор из различных РНК, выделенных из клетки одновременно.
Под термином «рибосомная РНК» подразумевают рибонуклеиновую кислоту природного происхождения, которая входит в состав рибосом.
Под термином «матричная РНК» подразумевают рибонуклеиновую кислоту природного происхождения, содержащую информацию о первичной структуре (аминокислотной последовательности) белков.
Под термином «транспортная РНК» подразумевают рибонуклеиновую кислоту природного происхождения, функцией которой является транспортировка аминокислот к месту синтеза белка.
Под термином «олигонуклеотидные зонды» подразумевают олигорибонуклеотиды или олигодезоксирибонуклеотиды, которые специфически связываются с определенной последовательностью целевой РНК или ДНК. Олигонуклеотидные зонды часто содержат различные модификации, к примеру, молекулы донора флуоресценции, остаток фосфорной кислоты с изотопом 32Р, биотин и другие, в зависимости от дальнейших целей эксперимента. Соответствующие олигодезоксирибонуклеотиды были получены методом стандартного твердофазного синтеза.
Под термином «дуплекс» понимают структуру из двух цепей нуклеиновых кислот, образующую двухцепочечную спираль, удерживаемую, в основном, каноническими Уотсон-Криковскими взаимодействиями.
Под термином «гибридизация» понимают процесс избирательного связывания РНК и олигонуклеотидного зонда по принципу комплементарности. В экспериментальных условиях гибридизация происходит наиболее эффективно при сильном нагревании до 80°С с последующим медленным охлаждением до комнатной температуры.
В рамках настоящего изобретения под термином «плавление» подразумевают процесс нагревания гибридизованных нуклеиновых кислот до полной диссоциации с образованием индивидуальных молекул в растворе. Плавление нуклеиновых кислот, как и других полимеров, может происходить ступенчато, с образованием промежуточных устойчивых комплексов за счет перегруппировки нуклеотидных остатков и образования новых стабилизирующих связей, например водородных.
Под термином «температура плавления» подразумевают температуру, при которой структура кооперативно переходит в расплавленное состояние. У дуплексов, образованных нуклеиновыми кислотами, может наблюдаться несколько таких точек кооперативного перехода. В рамках настоящего изобретения при плавлении структуры наблюдается резкое разгорание флуоресценции, которое указывает на единовременный переход дуплекса, образованного более коротким олигонуклеотидом, в расплавленное состояние.
Под «последовательностью РНК» в настоящем описании понимают полимерную последовательность рибонуклеотидов и их производных. Нуклеотид - это сахар, к 5'-атому углерода которого присоединена фосфатная группа, а к 1' атому углерода присоединено азотистое основание. Сахаром является рибоза или дезоксирибоза (в РНК и ДНК соответственно). Основаниями могут быть аденин, гуанин, тимин, урацил и цитозин, а также их производные. В последовательность зондов могут быть включены ароматические группы, не являющиеся указанными основаниями.
Под термином «нуклеотид» в настоящем описании понимают нуклеотиды, которые могут быть природными нуклеотидами (например, АТР, ТТР, GTP, СТР, UTP) или модифицированными нуклеотидами. Модифицированные нуклеотиды относятся к нуклеотидам, содержащим основания, такие как, например, аденин, гуанин, цитозин, тимин и урацил, ксантин, инозин, и квеуозин, которые были модифицированы заменой или добавлением одного или нескольких атомов или групп. Некоторые примеры вариантов модификаций, которые могут содержать нуклеотиды, основные группы которых модифицированы, включают, но ими не ограничиваются, алкилированные, галогенированные, тиолированные, аминированные, амидированные или ацетилированные основания, в различных сочетаниях. Более конкретные примеры включают 5-пропинилуридин, 5-пропинилцитидин, 6-метиладенин, 6-метилгуанин, N6,N6-диметиладенин, 2-пропиладенин, 2-пропилгуанин, 2-аминоаденин, 1-метилинозин, 3-метилуридин, 5-метилцитидин, 5-метилуридин и другие нуклеотиды, имеющие модифицикации в 5 положении, 5-(2-амино)пропилуридин, 5-галогенцитидин, 5-галогенуридин, 4-ацетилцитидин, 1-метиладенозин, 2-метиладенозин, 3-метилцитидин, 6-метилуридин, 2-метилгуанозин, 7-метилгуанозин, 2,2-диметилгуанозин, 5-метиламиноэтилуридин, 5-метилоксиуридин, деазануклеотиды, такие как 7-деаза-аденозин, 6-азоуридин, 6-азоцитидин, 6-азотимидин, 5-метил-2-тиоуридин, другие тио-основания, такие как 2-тиоуридин и 4-тиоуридин и 2-тиоцитидин, а также дигидроуридин, псевдоуридин, квьюозин, нафтил и замещенные нафтиловые группы, любые О- и N-алкилирующие пурины и пиримидины, такие как N6-метиладенозин, 5-метилкарбонилметилуридин, уридин 5-оксиуксусная кислота, пиридин-4-он, пиридин-2-он, фенил и модифицированные фенильные группы, такие как аминофенол или 2, 4, 6-триметоксибензол, 8-замещенные аденины и гуанины, 5-замещенные урацилы и тимины, азапиримидины, карбоксигидроксиалкильные нуклеотиды, карбоксиалкиламиноалкильные нуклеотиды и алкилкарбонилалкилированные нуклеотиды. Модифицированные нуклеотиды также включают нуклеотиды, которые модифицированы по сахарной группе (например, 2'-фтор или 2'-O-метил нуклеотиды), а также нуклеотиды, имеющие сахара или их аналоги, которые не являются рибозилом. Например, сахарные группы могут быть, или могут быть основаны на маннозе, арабинозе, глюкопиранозе, галактопиранозе, 4'-тиорибозе и других сахарах, гетероциклах или карбоциклах. Термин «нуклеотид» также обозначает универсальное основание. В качестве примера, универсальные основания включают, но ими не ограничиваются, 3-нитропиррол, 5-нитроиндол или небуларин. Модифицированные нуклеотиды включают меченные нуклеотиды, такие как нуклеотиды, меченные радиоактивной меткой, флуоресцентной меткой, молекулой тушителя флуоресценции, ферментом или пигментом.
Под «модифицированными межнуклеотидными связями» понимают все модифицированные межнуклеотидные связи, известные в данной области и которые специалист в данной области сочтет возможными для использования в контексте настоящего изобретения. Модификации межнуклеотидных связей включают, но ими не ограничиваются, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты, метилфосфонаты, 5'-алкиленфосфонаты, 5'-метилфосфонат, 3'-алкиленфосфонаты, эфираты трехфтористого бора, сложные эфиры бора и фосфорной кислоты и селенофосфаты 3'-5' связи или 2'-5' связи, фосфотриэфиры, тионоалкилалкилфосфотриэфиры, гидрофосфорные связи, алкилфосфонаты, алкилфосфонотиоаты, арилфосфонотиоаты, фосфороселеноата, фосфородиселеноаты, фосфинаты, фосфорамидаты, 3'-алкилфосфорамидаты, аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты, фосфоропиперазидаты, фосфороанилотиоаты, фосфороанилидаты, кетоны, сульфоны, сульфонамиды, карбонаты, карбаматы, метиленгидразо, метилендиметилгидразо, формацетали, тиоформацетали, оксимы, метиленимины, метиленметилимины, тиоамидаты, связи с рибоацетиловыми группами, аминоэфир глицина, силиловые или силоксановые связи, алкил или циклоалкильные связи с или без гетероатомов, например, от 1 до 10 углеродов, которые могут быть замещенными или незамещенными и/или замещенными и/или содержать гетероатомы, связи с морфолиноструктурами, амиды, полиамиды, где основания могут быть присоединены к аза-азоту основной цепи напрямую или не напрямую, и сочетания таких модифицированных межнуклеотидных связей.
В изобретении, согласно заявляемому решению, зонды могут быть связаны с конъюагатами, придающими им дополнительные свойства. Конъюгаты могут включать, но ими не ограничиваться, например, аминокислоты, пептиды, полипептиды, белки, антитела, антигены, токсины, гормоны, липиды, нуклеотиды, нуклеозиды, сахара, углеводороды, полимеры, такие как полиэтиленгликоль и полипропиленгликоль, а также аналоги или производные всех этих классов веществ, холестерин, фосфолипиды, ди- и триацилгицеролы, жирные кислоты, углеводороды, которые необязательно содержат заместители, ферменты, биотин, дигоксигенин и полисахариды.
Зонды должны содержать ковалентно присоединенную молекулу флуорофора или тушителя. Используемые флуорофоры могут включать, но ими не ограничиваться: FAM, ROX, Alexa Fluor, TAMRA, BODIPY, производные цианина, такие как Су3 или Су5 Dabsyl, или другие подходящие флуорофоры, известные из уровня техники. Используемые тушители могут включать, но ими не ограничиваться: все производные BHQ, Qxl, Iowa black FQ, Iowa black RQ, IRDye QC-1. Такие конъюгаты могут быть присоединены к любому концу олигонуклеотида, а также к любому промежуточному нуклеотиду, если расстояние между двумя конъюгатами гибиридизованных зондов не превышает 10 нуклеотидов.
Для выполнения настоящего метода зонды могут быть синтезированы любым способом, известным в данной области. В одном из вариантов осуществления, зонды могут быть получены химическим синтезом олигонуклеотидов и/или лигированием коротких олигонуклеотидов.
Изобретение может быть использовано для обнаружения РНК, принадлежащей некоторым патогенам, устойчивым, например, к макролидным антибиотикам. Такие способы возможно применять в клинических условиях для выявления в РНК патогенов модификаций, обеспечивающих устойчивость к антибиотикам, в частности, для обнаружения диметилирования нуклеотида А2058 23S рибосомной РНК бактерий, приводящего к их устойчивости к антибиотикам макролидного ряда, например эритромицин.
Изобретение поясняется конкретными вариантами осуществления, которые не предназначены для ограничения заявленного технического решения.
Этап 1. Синтез олигодезоксирибонуклеиновых зондов.
Синтез олигодезоксирибонуклеиновых зондов по изобретению осуществляли по стандартной методике на твердофазном носителе (Oligonucleotide Synthesis, M.J.Gait ed., 1984; Sambrook, Fntsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989).
Зонды, содержащие на 5'-конце флуорофор FAM, были получены методом автоматического твердофазного синтеза на синтезаторе MerMade 48 с использованием в качестве реагентов амидофосфитов нуклеозидов. В качестве носителя был использован полимер на основе SiO2 с контролируемым размером пор (CPG - Controlled Pore Glass, GlenResearch). Колонки с носителем содержали первый нуклеотид зонда, присоединенный к аминопропиловой группе на поверхности носителя с помощью сукцинильного линкера, связывающего аминогруппу и 3'-гидроксильную группу нуклеотида. На каждом цикле реакции детритилировали продукт, затем проводили наращивание цепи активированным амидофосфитом. Не вступившие в реакцию 5'-гидроксильные группы растущей цепи блокировали смесью уксусного ангидрида и 1-метилимидазола, а связанный на подложке продукт обрабатывали водным раствором йода и пиридина. На завершающей стадии с полученного олигонуклеотида снимали защитную группировку DMT 2% трихлоруксусной кислотой в дихлорметане и модифицировали полученный олигонуклеотид амидитом 6-FAM. Олигонуклеотиды снимали с полимерной подложки насыщенным раствором аммиака при 55°С в течение 3 часов, а также удаляли защитные группировки.
Для твердофазного синтеза зондов с молекулой тушителя на 3'-конце использовали стандартный полимер 3'-BHQ-1 CPG (стекло с контролируемым размером пор и с модификацией BHQ1, GlenResearch). Таким образом, на первом же цикле синтеза продукт уже содержал молекулу тушителя BHQ1. Синтез олигонуклеотидов, содержащих тушитель, производили стандартным описанным выше методом.
Полученные олигонуклеотиды очищали путем электрофоретического разделения продуктов реакции в полиакриламидном геле.
Этап 2. Выделение и очистка РНК
Для получения суммарной РНК по изобретению, пригодной для анализа методом плавления, проводили следующие процедуры:
Клетки исследуемых штаммов высевали со стоков штрихом до образования отдельных колоний на агаризованную среду, инкубировали ночь при 37°С, затем отдельные колонии переносили в 1 мл LB ночной культуры и снова инкубировали при интенсивном встряхивании в течение ночи при 37°С.
30 мкл ночной культуры инокулировали в 30 мл LB. Клеткам давали вырасти до достижения оптической плотности А600=0.6 и остужали во льду при 4°С в течение 20 мин. Клетки собирали центрифугированием при 6000 об/мин в роторе JA10 в течение 10 мин, промывали буфером А (20 мМ Hepes-KOH рН 7.5, 6 мМ Mg(OAc)2, 150 мМ NH4Cl, 4 мМ β-меркаптоэтанол, 0,05 мМ спермин, 2 мМ спермидин) и снова центрифугировали при 6000 об/мин.
Полученные влажные клетки можно замораживать в жидком азоте и хранить при Т=-80°С.
Осажденные клетки ресуспендировали в 1 мл холодного буфера А и разрушали ультразвуком (6 раз по 30 сек). Дебрис отделяли центрифугированием при 15000 об/мин в течение 40 мин в роторе JA-20. Супернатант декантировали, и к нему добавляли равный объем буфера для экстракции В (300 mM NaOAc, 25 mМ H3BO3 рН 7.0, 0.5 mM SDS, 5 мМ EDTA). К раствору добавляли 1 объем фенола, интенсивно взбалтывали в течение минимум 30 сек, центрифугировали в настольной центрифуге при 13000 об/мин в течение 10 минут. Верхнюю, водную, фазу отбирали и снова экстрагировали 1 объемом фенола, а затем - 1 объемом смеси фенола и хлороформа в соотношении 1:1. К водной фазе добавляли 3 объема этанола и осаждали при -20°С в течение часа. Осадки центрифугировали в настольной центрифуге при 13000 об/мин в течение 10 минут, а затем сушили в вакуумном испарителе или на воздухе. Полученные осадки суммарных РНК растворяли в смеси из 50 мкл деионизированной воды и 50 мкл буфера В, а затем экстрагировали смесь фенолом и снова осаждали РНК тремя объемами этанола при -20°С в течение 1 часа. Осадки растворяли в 50 мкл деионизированной воды и оценивали концентрацию рРНК спектрофотометрически при длине волны 260 нм.
Концентрацию суммарной рРНК рассчитывали, исходя из ее доли в смеси суммарной клеточной РНК (которая составляет 0,8), по формуле:
OD260[о.е./мл]∗0,0258[нмоль/ое]∗0,8=с(рРНК)[пмоль/мкл]
Полученные растворы суммарной рРНК в аликвотах по 10 мкл замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -80°С.
Этап 3. Получение и анализ кривых плавления
Для проведения детекции модифицированных нуклеотидов путем плавления дуплексов, образованных РНК и двумя зондами с флурофором и тушителем флуоресценции, поводили следующие действия:
Смешивали в плашках с оптически прозрачными крышками: 4 пмоль суммарной РНК; 2 пмоль олигонуклеотида с донором флуоресценции FAM; 4 пмоль олигонуклеотида с тушителем флуоресценции BHQ1; 2 мкл 5хбуфера для гибридизации С (250 мМ Tris-НСl рН 8.3, 200 мМ КСl) и добавляли деионизированную воду до 10 мкл. После перемешивания на смесь сверху наслаивали по 5 мкл минерального масла. Плашку помещали в прибор для ПЦР реального времени CFX96 (Bio-Rad) и проводили гибридизацию/плавление в следующей последовательности: нагревали до 80°С в течение 3 мин, охлаждали до 20°С со скоростью 37 мин, а затем нагревали смесь до 80°С со скоростью 0.5°/30 сек с одновременной детекцией интенсивности флуоресценции на каждом шаге стадии нагревания.
Этап 4. Анализ данных, полученных в результате плавления. В результате эксперимента получали графики зависимости уровня флуоресценции от температуры (кривые плавления, Фиг.2), которые преобразовывали в кривые зависимости производных интенсивности флуоресценции по температуре от температуры (дифференциальные кривые, Фиг.3). Анализу подвергали дифференциальные кривые плавления исследуемых дуплексов, в которых отмечают температуры, соответствующие пикам на кривых.
Разгорание флуоресценции, которое соответствует денатурации более короткого олигонуклеотида, выражается в виде точки перегиба на кривой плавления, которая соответствует пику на дифференциальной кривой. Сравнение структуры РНК проводят путем сравнения температур, соответствующих пикам на дифференциальных кривых, а также путем сравнения характера кривых плавления. В случае, если характер кривых и/или температура плавления не совпадают для контрольной и исследуемой РНК, делают вывод о различной структуре РНК в области исследуемого нуклеотида.
Заявляемый способ имеет ряд преимуществ перед другими методами определения модификаций. Во-первых, он является универсальным, то есть подходит для обнаружения различных типов модификаций РНК. Во-вторых, способ позволяет детектировать наличие модификаций, которые не препятствуют образованию Уотсон-Криковских пар между нуклеотидами и не обладают специфическими химическими свойствами, что крайне выгодно отличает заявленных способ от большинства альтернативных способов. В-третьих, метод крайне простой и быстрый, так как предполагает лишь смешение компонентов и дальнейший анализ в течение не более 2 часов. В-четвертых, заявляемый способ не требует больших материальных затрат на выполнение анализа.
Таким образом, заявляемое изобретение может быть использовано для научно-исследовательских целей, таких, как поиск новых ферментов, отвечающих на формирование известных модификаций, для оценки уровня модифицирования природных РНК в различных условиях, а также при диагностике антибиотикоустойчивости патогенов, где способ предусматривает обнаружение РНК, принадлежащей некоторым бактериям, устойчивым, например, к макролидным антибиотикам.
Claims (17)
1. Способ обнаружения модифицированного нуклеотида в составе исследуемой РНК, включающий получение контрольной РНК, двух олигонуклеотидных зондов разной длины, комплементарных исследуемой РНК, при этом один из зондов, имеющих меньшую длину, комплементарен РНК в области, содержащей исследуемый нуклеотид, и имеет температуру плавления меньшую, чем температура плавления второго зонда, один из зондов содержит молекулу донора флуоресценции, а другой - тушитель флуоресценции, при этом донор флуоресценции и тушитель флуоресценции подобраны с обеспечением перекрывания диапазона длин волн испускаемого донором флуоресценции излучения с диапазоном длин волн излучения, поглощаемого тушителем флуоресценции; смешение зондов с исследуемой и контрольной РНК, после чего полученные смеси подвергают нагреву до температуры, обеспечивающей полную денатурацию исследуемой РНК и зондов, медленному охлаждению до температуры, обеспечивающей образование стабильных дуплексов между РНК и зондами, и повторному медленному контролируемому нагреву с одновременным облучением и измерением интенсивности флуоресценции и получением кривых плавления для исследуемой и контрольной РНК, при этом выводы о наличии или отсутствии модификации в исследуемом нуклеотиде РНК делают по итогам сравнения кривых, и при совпадении характера кривых и/или температуры плавления делают вывод о наличии/отсутствии модификации в исследуемой РНК при наличии/отсутствии модификации в контрольной РНК в зоне гибридизации более короткого зонда.
2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что в качестве контрольной РНК используют РНК с известной структурой в исследуемой области, а исследуемая РНК аналогична контрольной или отличается от контрольной наличием или отсутствием модификации в исследуемом нуклеотиде.
3. Способ по п.1, характеризующийся тем, что исследуемая и контрольная РНК являются рибосомными, или матричными, или транспортными.
4. Способ по п.1, характеризующийся тем, что зонды подбирают из условия гибридизации их на РНК в непосредственной близости без перекрывания.
5. Способ по п.1, характеризующийся тем, что более длинный зонд подбирают с температурой плавления, превышающей температуру плавления второго зонда более чем на 5°С.
6. Способ по п.4, характеризующийся тем, что первый и второй зонды подбирают из условия гибридизации их на РНК на расстоянии друг от друга не далее чем на 10 нуклеотидов между их ближайшими концами.
7. Способ по п.1, характеризующийся тем, что первый и второй зонды подбирают из условия расположения молекул донора флуоресценции и тушителя флуоресценции на расстоянии не более чем на 10 нуклеотидов друг от друга при гибридизации зондов на РНК.
8. Способ по п.1, характеризующийся тем, что молекулы донора флуоресценции и тушителя флуоресценции к зондам присоединяют ковалентно.
9. Способ по п.1, характеризующийся тем, что зонды состоят из рибонуклеотидов и/или дезоксирибонуклеотидов и/или из их аналогов и могут содержать любые модификации, не препятствующие проведению исследования.
10. Способ по п.1, характеризующийся тем, что смешение зондов с РНК осуществляют с добавлением буферного раствора, включающего вещество, поддерживающее рН раствора в диапазоне 6 - 8.5, и соль одновалентного или мультивалентного катиона.
11. Способ по п.10, характеризующийся тем, что для смешения зондов с РНК используют 2-10 пмоль РНК, 2-10 пмоль олигонуклеотида зонда, содержащего донор флуоресценции, 2-10 пмоль зонда, содержащего тушитель флуоресценции, 2-10 мкл 5-кратного буфера для гибридизации, содержащего 200-300 мМ Tris-HCl рН 8.3, 150-250 мМ КСl и деионизированную воду для доведения объема образца до 10-50 мкл.
12. Способ по п.11, характеризующийся тем, что смесь дополнительно содержит минеральное масло в количестве 3-10 мкл.
13. Способ по п.1, характеризующийся тем, что нагрев и охлаждение смесей осуществляют с контролируемой скоростью, при этом измерение интенсивности флуоресценции осуществляют в процессе нагревания.
14. Способ по п.1, характеризующийся тем, что первоначальный нагрев осуществляют до температуры смесей 70-95°С, медленное охлаждение происходит со скоростью 0.5-4°/мин до достижения температуры смеси 30-10°С, повторный нагрев смесей производят со скоростью 0.5°/30 сек до достижения смесями 55-95°С.
15. Способ по п.1, характеризующийся тем, что охлаждение проводят до температуры, значение которой ниже температуры плавления короткого зонда не менее чем на 5°С.
16. Способ по п.1, характеризующийся тем, что повторный нагрев смесей осуществляют до температуры, значение которой превышает температуру плавления более короткого зонда не менее чем на 5°С.
17. Способ по п.1, характеризующийся тем, что полученные кривые плавления преобразуют в кривые зависимости производных интенсивности флуоресценции по температуре от температуры (дифференциальные кривые).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012143256/15A RU2522863C2 (ru) | 2012-10-10 | 2012-10-10 | Способ определения модифицированных нуклеотидов рнк |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012143256/15A RU2522863C2 (ru) | 2012-10-10 | 2012-10-10 | Способ определения модифицированных нуклеотидов рнк |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2012143256A RU2012143256A (ru) | 2014-04-20 |
| RU2522863C2 true RU2522863C2 (ru) | 2014-07-20 |
Family
ID=50480442
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012143256/15A RU2522863C2 (ru) | 2012-10-10 | 2012-10-10 | Способ определения модифицированных нуклеотидов рнк |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2522863C2 (ru) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040067492A1 (en) * | 2002-10-04 | 2004-04-08 | Allan Peng | Reverse transcription on microarrays |
-
2012
- 2012-10-10 RU RU2012143256/15A patent/RU2522863C2/ru active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040067492A1 (en) * | 2002-10-04 | 2004-04-08 | Allan Peng | Reverse transcription on microarrays |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ZHAO X. et al. Detection and quantitation of RNA base modifications. RNA. 2004 June; 10(6): 996-1002 [Найдено 16.10.2013] [он-лайн], Найдено из Интернет: URL: http://rnajournal.cshlp.org/content/10/6/996.full.pdf+html. AUFFINGER P. et al. Appendix 5: Location and distribution of modified nucleotides in tRNA. Modification and editing of RNA. 1998: 569-576 [Найдено 16.10.2013] [он-лайн], Найдено из Интернет: URL: http://www-ibmc.u-strasbg.fr/upr9002/westhof/PDF/r98_PAuffinger_GJ_2.pdf. HILEY S.L. et al. Detection and discovery of RNA modifications using microarrays. Nucleic Acids Research. 2005; 33(1 e2): 1-9 [Найдено 16.10.2013] [он-лайн], Найдено из Интернет: URL: http://morrislab.med.utoronto.ca/papers/HileyNAR05.pdf. ПРОХОРОВА И.В. и др. Связывание тРНК с Р-участком рибосомы: влияние модифицированных оснований m2G966 и m5C967 16S рРНК. Секция "Биоинженерия и биоинформатика". Подсекция "Биоинженерия". 2007, стр.10 [Найдено 16.10.2013] [он-лайн], Найдено из Интернет: URL: http://lomono * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2012143256A (ru) | 2014-04-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zoller et al. | [32] Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors | |
| Behm-Ansmant et al. | Use of specific chemical reagents for detection of modified nucleotides in RNA | |
| Jankowsky et al. | RNA helicases—one fold for many functions | |
| EP3414340B1 (en) | Method for analyzing rna | |
| Zhang et al. | Single-molecule tracking of the transcription cycle by sub-second RNA detection | |
| US9677124B2 (en) | Methods for analyzing nucleic acids | |
| US20060211000A1 (en) | Methods, compositions, and kits for detection of microRNA | |
| CN105821138B (zh) | 一种基于连接反应构建双茎环结构dna模板检测核酸的方法 | |
| EP3601593B1 (en) | Universal hairpin primers | |
| EP2601307A1 (en) | Microarray-based assay integrated with particles for analyzing molecular interactions | |
| JP2002509703A (ja) | 錠型（ｐａｄｌｏｃｋ）プローブのローリングサークル複製 | |
| WO2008092016A2 (en) | Methods, compositions, and kits for detection of micro rna | |
| JP2004501615A (ja) | 分解可能な核酸プローブおよび核酸検出方法 | |
| JP5735213B2 (ja) | 核酸分子の作製法 | |
| JP2002191384A (ja) | 反復性ｐｃｒ産物の融解曲線解析方法 | |
| CN110295231A (zh) | 通过选择性等位基因富集或消耗用低深度测序检测和定量稀有变体 | |
| US20060003337A1 (en) | Detection of small RNAS | |
| JP2018518968A (ja) | マイクロ流体分配を用いた長いヌクレオチド配列の標的富化 | |
| US20210139967A1 (en) | Indel detection by amplicon analysis | |
| RU2522863C2 (ru) | Способ определения модифицированных нуклеотидов рнк | |
| Chen et al. | PNA-based blocker displacement amplification system for in situ visualization of individual microRNAs in cancer cells | |
| US20220026429A1 (en) | Compositions and methods of altering a nucleic acid with ribonuclease | |
| WO2012034041A2 (en) | Detection of chromatin structure | |
| US20200325527A1 (en) | Rna identity method using rnase h digestion and size fractionating | |
| US20010044107A1 (en) | Recombinase mediated gene chip detection |