RU2519071C1 - Highly sensitive method of determining immunoglobulin-protease activity using polymer matrices - Google Patents
Highly sensitive method of determining immunoglobulin-protease activity using polymer matrices Download PDFInfo
- Publication number
- RU2519071C1 RU2519071C1 RU2013117773/15A RU2013117773A RU2519071C1 RU 2519071 C1 RU2519071 C1 RU 2519071C1 RU 2013117773/15 A RU2013117773/15 A RU 2013117773/15A RU 2013117773 A RU2013117773 A RU 2013117773A RU 2519071 C1 RU2519071 C1 RU 2519071C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- igg
- wells
- enzyme
- activity
- substrate
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области биохимии, а именно к способам определения иммуноглобулин-протеиназной активности, и может быть использовано в энзимологии, микробиологии, фармакологии, клинической биохимии для скрининга и количественной оценки активности протеолитических ферментов.The invention relates to the field of biochemistry, and in particular to methods for determining immunoglobulin proteinase activity, and can be used in enzymology, microbiology, pharmacology, clinical biochemistry for screening and quantifying the activity of proteolytic enzymes.
Протеиназы патогенных и условно-патогенных микроорганизмов играют существенную роль в патогенезе поражений. Большое внимание уделяется микробным протеолитическим ферментам, которые расщепляют молекулы иммуноглобулинов (IgG). Для выявления активности этих энзимов были разработаны различные методы: спектрофотометрические, нефелометрические, иммунопреципитирующие, иммунохимические в сочетании с гельфильтрацией в полиакриламидном геле [1-4]. Однако полуколичественная оценка протеолитической активности данными методами обладает невысокой чувствительностью, иногда не поддается стандартизации и поэтому трудно применима в практике. Наиболее перспективным из современных способов определения IgG-протеиназной активности является метод иммуноферментного анализа благодаря своей высокой чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса.Proteinases of pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms play a significant role in the pathogenesis of lesions. Much attention is paid to microbial proteolytic enzymes that break down immunoglobulin (IgG) molecules. Various methods have been developed to identify the activity of these enzymes: spectrophotometric, nephelometric, immunoprecipitating, immunochemical in combination with gel filtration in a polyacrylamide gel [1-4]. However, a semi-quantitative assessment of proteolytic activity by these methods is not very sensitive, sometimes it cannot be standardized, and therefore it is difficult to apply in practice. The most promising of modern methods for determining IgG proteinase activity is the enzyme-linked immunosorbent assay due to its high sensitivity, selectivity and the ability to automate the analytical process.
Наиболее близким к нашему изобретению является способ определения иммуноглобулин-протеиназной (IgG-протеиназной) активности с помощью иммуноферментного метода [5, 6]. В вышеприведенном подходе используется предварительная сорбция бактериальных антигенов (например, полученных из клебсиеллы) в лунках полистиролового планшета, с которыми впоследствии специфически взаимодействует добавляемый к ним IgG. Добавление к такой системе раствора, содержащего протеолитические ферменты, приводит к расщеплению IgG (отщеплению Fc-фрагмента), что легко фиксируется последующим добавлением в лунки конъюгата белка А стафилококка с пероксидазой. Преимуществом этого способа является его достаточно высокая чувствительность, однако использование в качестве сорбируемого на полистироловую поверхность планшета антигена, представляющего собой по сути комплекс бактериальных белков и гликопротеинов, обладает недостатком, а именно подверженностью самого антигена к ферментативному расщеплению протеолитическими энзимами, что может исказить реальную величину активности исследуемого фермента. Для устранения этого нежелательного эффекта была применена схема раздельного осуществления ферментативной реакции - в одной емкости (планшете) с последующим определением концентрации нерасщепленных антител в другой емкости (планшете), содержащей сорбированные антигены [5, 6]. Однако недостатками такого порядка оценки протеолитической активности являются: 1) использование двух планшетов - для проведения гидролиза, а затем переноса реакционной смеси во второй планшет тест-системы для определения IgG, 2) необходимость предварительного подбора разведения тестируемого фермента, чтобы попасть в диапазон концентраций, благоприятных для определения активности.Closest to our invention is a method for determining the immunoglobulin proteinase (IgG proteinase) activity using the enzyme immunoassay [5, 6]. In the above approach, preliminary sorption of bacterial antigens (for example, derived from Klebsiella) in the wells of a polystyrene plate, with which subsequently specifically added IgG interacts with them, is used. Adding a solution containing proteolytic enzymes to such a system leads to IgG cleavage (Fc fragment cleavage), which is easily fixed by subsequent addition of staphylococcus peroxidase protein A to the conjugate. The advantage of this method is its rather high sensitivity, however, the use of an antigen adsorbed onto a polystyrene surface of a tablet, which is essentially a complex of bacterial proteins and glycoproteins, has a drawback, namely, the antigen itself is susceptible to enzymatic cleavage by proteolytic enzymes, which can distort the actual activity test enzyme. To eliminate this undesirable effect, a scheme for the separate implementation of the enzymatic reaction was used — in one container (plate) with subsequent determination of the concentration of undigested antibodies in another container (tablet) containing sorbed antigens [5, 6]. However, the disadvantages of this procedure for assessing proteolytic activity are: 1) the use of two tablets for hydrolysis, and then transfer the reaction mixture to the second tablet of the test system for determining IgG, 2) the need for preliminary selection of dilutions of the test enzyme in order to fall into the concentration range favorable to determine activity.
Вышеупомянутая проблема была устранена в изобретениях [7, 8], где в качестве субстрата использовался IgG, сорбированный непосредственно на полистироловую поверхность планшета без использования бактериального (белкового) антигена. Однако такой подход, несмотря на всю его простоту, обладает существенным недостатком - пониженной доступностью молекул IgG для ферментативного расщепления в силу того, что молекулы иммуноглобулинов благодаря гидрофобному взаимодействию сравнительно жестко зафиксированы на поверхности полистирола. Более того, благодаря большому размеру молекулы IgG сорбированный на полистироле иммуноглобулин может подвергаться многократному протеолитическому расщеплению без потери способности связывать впоследствии специфический конъюгат (белок A стафилококка с пероксидазой или специфический к Fc-фрагменту IgG с пероксидазой), что может привести к заниженной оценки протеолитической активности исследуемого фермента.The above problem was eliminated in the inventions [7, 8], where IgG adsorbed directly onto the polystyrene surface of the plate without the use of bacterial (protein) antigen was used as a substrate. However, this approach, despite its simplicity, has a significant drawback - the reduced availability of IgG molecules for enzymatic cleavage due to the fact that immunoglobulin molecules are relatively rigidly fixed on the polystyrene surface due to hydrophobic interaction. Moreover, due to the large size of the IgG molecule, the immunoglobulin adsorbed on polystyrene can undergo multiple proteolytic cleavage without losing the ability to subsequently bind a specific conjugate (staphylococcus A protein with peroxidase or a specific IgG Fc fragment with peroxidase), which can lead to an underestimation of the studied proteolytic activity of the studied enzyme.
В связи с этим задачей заявленного изобретения является разработка простого способа, позволяющего с высокой точностью и высокой чувствительностью определять протеолитическую активность с использованием иммуноферментного метода.In this regard, the objective of the claimed invention is to develop a simple method that allows with high accuracy and high sensitivity to determine the proteolytic activity using the enzyme immunoassay.
Поставленная задача достигается путем разработки способа определения иммуноглобулин-протеиназной активности, который предусматривает предварительное сорбирование в лунках полистиролового планшета полимерных матриц небелковой природы (нуклеиновая кислота, хитин), добавление в лунки с полимерной матрицей специфических к этой матрице IgG, последующим добавлением в лунки раствора, содержащего протеолитические ферменты, последующей инкубацией, в течение которой происходит протеолитическое расщепление иммуноглобулиновых молекул (отщепление от них Fc-фрагментов), последующим внесением в лунки конъюгата фермента (пероксидазы) с белком A стафилококка, субстрата этого фермента, с последующим учетом результатов реакции с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 492 нм и проведением расчета IgG-протеиназной активности по количеству гидролизованного субстрата ферментативной реакции. Использование в качестве сорбированного антигена полимерных матриц - полинуклеиновой кислоты, хитина - позволяет избежать каталитически эффективного взаимодействия с ними исследуемого протеолитического фермента, что не приводит к возможному искажению истинной величины активности изучаемого фермента. Кроме того, высокая степень полимеризации матриц, с которыми связываются молекулы IgG, позволяет эффективно нивелировать негативный эффект от наличии в среде с протеиназами также ферментов, способных расщеплять эти полимерные матрицы - нуклеаз (для нуклеиновых кислот), хитиназ (для хитина), поскольку эффективное расщепление высокополимерных соединений, сопровождающихся их полной десорбцией с поверхности полистирола, требует наличия очень высоких концентраций специфических энзимов (нуклеаз, хитиназ). Сравнительная схема способов определения IgG представлена на рисунке 1.The task is achieved by developing a method for determining immunoglobulin proteinase activity, which involves preliminary sorption in the wells of a polystyrene tablet of non-protein polymer matrices (nucleic acid, chitin), adding specific IgG specific to this matrix to wells with a polymer matrix, followed by adding a solution containing IgG to the wells proteolytic enzymes, followed by incubation, during which proteolytic cleavage of immunoglobulin molecules occurs ( elimination of Fc fragments from them), subsequent introduction of staphylococcus A protein, a substrate of this enzyme, into the wells of the conjugate of the enzyme (peroxidase), followed by taking into account the results of the reaction using a vertical-beam spectrophotometer by measuring light absorption at 492 nm and calculating IgG proteinase activity from the amount of hydrolyzed substrate of the enzymatic reaction. The use of polymer matrices as a sorbed antigen - polynucleic acid, chitin - avoids the catalytically effective interaction of the studied proteolytic enzyme with them, which does not lead to a possible distortion of the true value of the activity of the studied enzyme. In addition, the high degree of polymerization of the matrices with which IgG molecules bind allows one to effectively neutralize the negative effect of the presence in the medium of proteinases also of enzymes capable of cleaving these polymer matrices - nucleases (for nucleic acids), chitinases (for chitin), since effective cleavage high-polymer compounds, accompanied by their complete desorption from the polystyrene surface, requires the presence of very high concentrations of specific enzymes (nucleases, chitinases). A comparative diagram of the methods for determining IgG is presented in Figure 1.
Техническим результатом заявленного изобретения является разработка простого способа определения IgG-протеиназной активности методом иммуноферментного анализа, характеризующегося хорошей воспроизводимостью результатов, высокой чувствительностью, отсутствием необходимости использовать белковые антигены, малым расходом субстрата, удобством за счет проведения реакции непосредственно в лунках микропланшета, осуществление реакции и детекции результатов реакции в одной и той же лунке.The technical result of the claimed invention is the development of a simple method for determining IgG proteinase activity by enzyme-linked immunosorbent assay, characterized by good reproducibility of results, high sensitivity, the absence of the need to use protein antigens, low substrate consumption, convenience due to the reaction directly in the microtiter wells, the reaction and detection of results reactions in the same well.
Пример 1. Определение IgG-протеиназной активности трипсина. В лунки планшета предварительно сорбируют полимерную матрицу - двунитевую полидезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК). Для этого ДНК растворяют в 0,2 М натрий-фосфатном буферном растворе с рН 7,4 из расчета 20 мкг/мл. Приготовленный раствор в объеме 50 мкл вносят в лунки планшета, инкубируют в течение 24 ч при 4°C. После этого лунки планшета трижды промывают 0,2 М натрий-фосфатным буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,05% твин-20, заливая по 100 мкл в каждую лунку, затем планшет осушаем путем вытряхивания остатка жидкости. Подготовленные таким образом планшеты можно хранить в течение года при 4°C в сухих условиях. Затем растворяем иммуноглобулин G, специфический к двунитевой ДНК, в 0,2 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,4, в концентрациях 0,1-1 мкг/мл и вносим по 50 мкл раствора в лунки планшета. Закрываем крышкой и оставляем на 1 ч при комнатной температуре. Три раза отмываем планшет 0,2 М натрий-фосфатным буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,05% твин-20, заливая по 100 мкл в каждую лунку, затем планшет осушаем путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки планшета вносим по 100 мкл 0,02 М натрий-фосфатного буферного раствора с рН 7,4. В одну из лунок планшета вносим 100 мкл раствора трипсина в том же буфере в концентрации 1 мкг/мл. Далее производим двукратные разведения трипсина, используя несколько следующих лунок. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C, трех отмывок 0,2 М натрий-фосфатным буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,05% твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносим по 100 мкл конъюгата пероксидазы с белком A золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus) в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C, трехкратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносим по 100 мкл субстратного раствора (0,038%-ный раствор о-фенилендиамина в 0,1 М натрий-цитратном буфере, рН 6,0, содержащий 0,06% перекиси водорода). После 30 минутной инкубации в темноте при комнатной температуре реакцию останавливаем внесением в каждую лунку 50 мкл 25% серной кислоты. Результаты реакции учитываем с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 492 нм. Полученные результаты приведены в таблице 1. Количество расщепленного IgG определяем по разнице между количеством иммуноглобулина в контроле и опыте, используя стандартную калибровочную кривую. IgG-протеиназную активность рассчитываем по формуле:Example 1. Determination of IgG proteinase activity of trypsin. A polymer matrix, double-stranded polydeoxyribonucleic acid (DNA), is pre-sorbed into the wells of the plate. For this, DNA is dissolved in 0.2 M sodium phosphate buffer solution with a pH of 7.4 at a rate of 20 μg / ml. The prepared solution in a volume of 50 μl was added to the wells of the plate, incubated for 24 hours at 4 ° C. After that, the wells of the plate are washed three times with 0.2 M sodium phosphate buffer solution, pH 7.4, containing 0.05% tween-20, pouring 100 μl into each well, then the plate is drained by shaking out the remaining liquid. Thus prepared tablets can be stored for 4 hours at 4 ° C under dry conditions. Then we dissolve the double-stranded DNA specific immunoglobulin G in 0.2 M sodium phosphate buffer, pH 7.4, at concentrations of 0.1-1 μg / ml and add 50 μl of the solution to the wells. Close the lid and leave for 1 h at room temperature. Three times, we wash the plate with 0.2 M sodium phosphate buffer solution, pH 7.4, containing 0.05% tween-20, pouring 100 μl into each well, then we dry the tablet by shaking out the remaining liquid. We add 100 μl of 0.02 M sodium phosphate buffer solution with a pH of 7.4 to the wells of the plate. In one of the wells of the tablet we add 100 μl of trypsin solution in the same buffer at a concentration of 1 μg / ml. Next, we make two-fold dilutions of trypsin using the following few wells. After incubating in a thermostat for 1 h at 37 ° C, three washes with 0.2 M sodium phosphate buffer solution, pH 7.4, containing 0.05% tween-20, and draining the plate, we add 100 μl of conjugate to each well peroxidase with protein A of Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus) in the same buffer in a selected dilution. After incubating in a thermostat for 1 h at 37 ° C, washing three times with detergent and draining the plate, we add 100 μl of substrate solution to each well (0.038% solution of o-phenylenediamine in 0.1 M sodium citrate buffer, pH 6 , 0, containing 0.06% hydrogen peroxide). After a 30-minute incubation in the dark at room temperature, we stop the reaction by adding 50 μl of 25% sulfuric acid to each well. The results of the reaction are taken into account using a spectrophotometer with a vertical beam by measuring light absorption at 492 nm. The results are shown in table 1. The amount of cleaved IgG is determined by the difference between the amount of immunoglobulin in the control and the experiment, using a standard calibration curve. IgG proteinase activity is calculated by the formula:
A=(Ck-C0)/tCf;A = (C k -C 0 ) / tC f ;
где:Where:
А - активность фермента (в усл. единицах) активности,A - enzyme activity (in conventional units) of activity,
Сk - концентрация иммуноглобулина в контроле,With k is the concentration of immunoglobulin in the control,
С0 - концентрация иммуноглобулина в лунках, куда вносили раствор фермента,C 0 is the concentration of immunoglobulin in the wells where the enzyme solution was added,
Т - время протеолиза,T is the time of proteolysis,
Cf - концентрация фермента в анализируемом растворе.C f is the concentration of the enzyme in the analyzed solution.
Пример 2. Определение IgG-протеиназной активности проводим аналогично примеру 1, но вместо раствора фермента используем культуральную жидкость культуры бактерий. IgG-протеиназную активность рассчитываем на количество белка в культуральной жидкости.Example 2. The determination of IgG proteinase activity is carried out analogously to example 1, but instead of the enzyme solution we use the culture fluid of the bacterial culture. IgG proteinase activity is calculated on the amount of protein in the culture fluid.
Пример 3. Определение IgG-протеиназной активности проводим аналогично примеру 1, но вместо раствора фермента используем дезинтеграт бактериальных клеток. IgG-протеиназную активность рассчитываем на количество белка в дезинтеграте.Example 3. The determination of IgG proteinase activity is carried out analogously to example 1, but instead of the enzyme solution, we use the disintegration of bacterial cells. IgG proteinase activity is calculated on the amount of protein in the disintegrate.
Пример 4. Определение IgG-протеиназной активности проводим аналогично примеру 1, но вместо раствора фермента используем суспензию бактериальных клеток. IgG-протеиназную активность рассчитываем на количество клеток в объеме жидкости.Example 4. The determination of IgG proteinase activity is carried out analogously to example 1, but instead of the enzyme solution we use a suspension of bacterial cells. IgG proteinase activity is calculated based on the number of cells in the fluid volume.
Пример 5. Определение IgG-протеиназной активности проводим аналогично примеру 1, но вместо конъюгата фермента с белком A золотистого стафилококка используем конъюгат фермента с белком G стрептококка (Streptococcus).Example 5. The determination of IgG proteinase activity is carried out analogously to example 1, but instead of the conjugate of the enzyme with Staphylococcus aureus A protein, we use the conjugate of the enzyme with Streptococcus protein G (Streptococcus).
Пример 6. Определение IgG-протеиназной активности проводим аналогично примеру 1, но вместо конъюгата фермента с белком A золотистого стафилококка используем конъюгат фермента с антителами против Fc-фрагмента иммуноглобулина G.Example 6. The determination of IgG proteinase activity is carried out analogously to example 1, but instead of conjugate of the enzyme with Staphylococcus aureus A protein, we use the enzyme conjugate with antibodies against the immunoglobulin G Fc fragment.
Пример 7. Определение IgG-протеиназной активности проводим аналогично примеру 1, но вместо двунитевой ДНК в качестве полимерной матрицы используем однонитевую ДНК и иммуноглобулины, специфические к однонитевой ДНК.Example 7. The determination of IgG proteinase activity is carried out analogously to example 1, but instead of double-stranded DNA, single-stranded DNA and immunoglobulins specific to single-stranded DNA are used as the polymer matrix.
Пример 8. Определение IgG-протеиназной активности проводим аналогично примеру 1, но вместо двунитевой ДНК в качестве полимерной матрицы используем полирибонуклеиновую кислоту (РНК) и иммуноглобулины, специфические к РНК.Example 8. The determination of IgG proteinase activity is carried out analogously to example 1, but instead of double-stranded DNA, we use polyribonucleic acid (RNA) and RNA-specific immunoglobulins as the polymer matrix.
Пример 9. Определение IgG-протеиназной активности проводим аналогично примеру 1, но вместо двунитевой ДНК в качестве полимерной матрицы используем хитин (поли-N-ацетилглюкозамин) и иммуноглобулины, специфические к хитину.Example 9. The determination of IgG proteinase activity is carried out analogously to example 1, but instead of double-stranded DNA, we use chitin (poly-N-acetylglucosamine) and immunoglobulins specific for chitin as a polymer matrix.
Пример 10. Определение IgG-протеиназной активности проводим аналогично примеру 1, но вместо двунитевой ДНК в качестве полимерной матрицы используем хитозан (полиглюкозамин) и иммуноглобулины, специфические к хитозану.Example 10. The determination of IgG proteinase activity is carried out analogously to example 1, but instead of double-stranded DNA, we use chitosan (polyglucosamine) and immunoglobulins specific for chitosan as a polymer matrix.
Пример 11. Определение IgG-протеиназной активности проводим аналогично примеру 1, но вместо двунитевой ДНК в качестве полимерной матрицы используем ламинарии (поли-β-1-3-глюкан) и иммуноглобулины, специфические к ламинарину.Example 11. The determination of IgG proteinase activity is carried out analogously to example 1, but instead of double-stranded DNA, we use kelp (poly-β-1-3-glucan) and immunoglobulins specific to laminarin as a polymer matrix.
Пример 12. Определение IgG-протеиназной активности проводим аналогично примеру 1, но вместо двунитевой ДНК в качестве полимерной матрицы используем глюкан (поли-β-1-4-глюкан) и иммуноглобулины, специфические к глюкану.Example 12. The determination of IgG proteinase activity is carried out analogously to example 1, but instead of double-stranded DNA, glucan (poly-β-1-4-glucan) and immunoglobulins specific for glucan are used as the polymer matrix.
ЛИТЕРАТУРАLITERATURE
1. Aubaid А.Н., Muhsin Т.М. Partial purification and kinetic studies of exocellular proteinase from Trichophyton mentagrophytes var. erinacei. Mycoses. 1998. V.41.№3-4. P.163-168.1. Aubaid A.N., Muhsin T.M. Partial purification and kinetic studies of exocellular proteinase from Trichophyton mentagrophytes var. erinacei. Mycoses. 1998. V.41.№3-4. P.163-168.
2. Brinkworth R.I., Brindley P.J., Harrop S.A. Structural analysis of the catalytic site of AcCP-1, a cysteine proteinase secreted by the hookworm Ancylostoma caninum. Biochim Biophys Acta. 1996. V.1298. №1. P.4-8.2. Brinkworth R.I., Brindley P.J., Harrop S.A. Structural analysis of the catalytic site of AcCP-1, a cysteine proteinase secreted by the hookworm Ancylostoma caninum. Biochim Biophys Acta. 1996. V.1298. No. 1. P.4-8.
3. Reinholdt J., Kilian M. A sensitive enzyme-linked immunosorbent assay for IgA protease activity. J. Immunol. Methods. 1983.V.63. №3. P.367-376.3. Reinholdt J., Kilian M. A sensitive enzyme-linked immunosorbent assay for IgA protease activity. J. Immunol. Methods 1983.V.63. Number 3. P.367-376.
4. Molla A., Yamamoto Т., Maeda H. Characterization of 73 kDa thiol protease from Serratia marcescens and its effect on plasma proteins. J. Biochem. 1988. V.104. №4. P.616-621.4. Molla A., Yamamoto T., Maeda H. Characterization of 73 kDa thiol protease from Serratia marcescens and its effect on plasma proteins. J. Biochem. 1988. V. 104. Number 4. P.616-621.
5. Зинкевич О.Д., Бондаренко B.M., Тюрин Ю.А., Сафина Н.А., Анохин В.А. Клинико-диагностическое значение оценки активности IgG-протеаз у детей с дисбактериозом кишечника. // Журн. микробиол. 2004. №3. С. 73-77.5. Zinkevich O.D., Bondarenko B.M., Tyurin Yu.A., Safina N.A., Anokhin V.A. Clinical and diagnostic value of assessing the activity of IgG proteases in children with intestinal dysbiosis. // Journal. microbiol. 2004. No3. S. 73-77.
6. Тюрин Ю.А. Протеиназная активность микрофлоры кишечника при острых кишечных инфекциях у детей. // Автореф. дисс.канд. мед. наук -Казань, 2003. - 21 с.6. Tyurin Yu.A. Proteinase activity of intestinal microflora in acute intestinal infections in children. // Abstract. diss. honey. Sciences - Kazan, 2003 .-- 21 p.
7. Козлов Л.В., Мишин А.А., Шемаев В.Б., Дьяков В.Л. / Способ и набор для иммуноферментного определения активности протеиназ. // Патент RU №2312352.7. Kozlov L.V., Mishin A.A., Shemaev V.B., Dyakov V.L. / Method and kit for enzyme immunoassay for determining the activity of proteinases. // Patent RU No. 2312352.
8. Тюрин Ю.А., Куликов С.Н., Фассахов Р.С., Долбин Д.А., Баязитова Л.Т. / Способ определения IgG-протеиназной активности. // Патент RU №2373538.8. Tyurin Yu.A., Kulikov S.N., Fassakhov R.S., Dolbin D.A., Bayazitova L.T. / Method for determining IgG proteinase activity. // Patent RU No. 2373538.
Рисунок 1. Сравнительная схема способов определения IgG-протеиназной активности.Figure 1. Comparative diagram of methods for determining IgG proteinase activity.
А - по способу, описанному в работе [5, 6],And - by the method described in [5, 6],
Б - по способу, описанному в работах [7, 8],B - according to the method described in [7, 8],
В - по заявляемому способу.B - according to the claimed method.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013117773/15A RU2519071C1 (en) | 2013-04-17 | 2013-04-17 | Highly sensitive method of determining immunoglobulin-protease activity using polymer matrices |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013117773/15A RU2519071C1 (en) | 2013-04-17 | 2013-04-17 | Highly sensitive method of determining immunoglobulin-protease activity using polymer matrices |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2519071C1 true RU2519071C1 (en) | 2014-06-10 |
Family
ID=51216581
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013117773/15A RU2519071C1 (en) | 2013-04-17 | 2013-04-17 | Highly sensitive method of determining immunoglobulin-protease activity using polymer matrices |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2519071C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2623875C1 (en) * | 2016-02-19 | 2017-06-29 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства" | Method for biochemical determination of proteolytic enzymes activity in blood |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2312352C1 (en) * | 2006-07-13 | 2007-12-10 | Федеральное Государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Method and kit for immunoferment determination of proteinase activity |
| RU2373538C1 (en) * | 2008-03-28 | 2009-11-20 | Государственное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования "Казанская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" | METHOD OF DETERMINING IgG PROTEINASE ACTIVITY |
| RU2423707C2 (en) * | 2009-06-30 | 2011-07-10 | Федеральное государственное учреждение науки Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора | Method of human biopsy material and excrete analysis for chitinase-like protein ykl-40 |
-
2013
- 2013-04-17 RU RU2013117773/15A patent/RU2519071C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2312352C1 (en) * | 2006-07-13 | 2007-12-10 | Федеральное Государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Method and kit for immunoferment determination of proteinase activity |
| RU2373538C1 (en) * | 2008-03-28 | 2009-11-20 | Государственное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования "Казанская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" | METHOD OF DETERMINING IgG PROTEINASE ACTIVITY |
| RU2423707C2 (en) * | 2009-06-30 | 2011-07-10 | Федеральное государственное учреждение науки Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора | Method of human biopsy material and excrete analysis for chitinase-like protein ykl-40 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| NAKANISHI F.A. et al. Immunoglobulin G proteolytic activity of Actinobacillus actinomycetemcomitans. Brazilian Journal of Microbiology. 2006; 37: 42-46 [Найдено 06.02.2014] [он-лайн], Найдено из Интернет: URL: http://www.scielo.br/pdf/bjm/v37n1/arq08.pdf. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2623875C1 (en) * | 2016-02-19 | 2017-06-29 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства" | Method for biochemical determination of proteolytic enzymes activity in blood |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5798483B2 (en) | Enhancing endotoxin detection | |
| CN109239059B (en) | Glycated serum protein assay kit and preparation method and application thereof | |
| Pérez et al. | Optimization of pancreatic trypsin extraction in PEG/citrate aqueous two-phase systems | |
| Helal et al. | Determination of lysozyme activity by a fluorescence technique in comparison with the classical turbidity assay | |
| US8685639B2 (en) | Diagnosis and prognosis of wound infection by measurement of a phospholipase A2 in wound fluid | |
| RU2519071C1 (en) | Highly sensitive method of determining immunoglobulin-protease activity using polymer matrices | |
| RU2373538C1 (en) | METHOD OF DETERMINING IgG PROTEINASE ACTIVITY | |
| RU2417375C2 (en) | Method and set for immune-enzyme assay of functional activity of human complement component c3 | |
| US20090304778A1 (en) | Diagnostics and Methods for Removal and Detection of Interferents | |
| JP4622836B2 (en) | Analysis equipment | |
| RU2380707C1 (en) | Method and set for immunoenzyme assay of functional activity of component c3 of human complement by alternative pathway of activation | |
| Bernath et al. | Lysozyme activity in the presence of nonionic detergent micelles | |
| RU2426126C1 (en) | METHOD OF DETERMINING IgA-PROTEINASE ACTIVITY | |
| RU2310853C1 (en) | Immunoenzyme method and kit for determining iga1-protease activity | |
| RU2376605C1 (en) | Method and set for immune-enzyme detection of functuinal activity of factor d of human complement | |
| EP1756298B1 (en) | Diagnosis and prognosis of wound infection by measurement of a phospholipase a2 in wound fluid | |
| RU2423707C2 (en) | Method of human biopsy material and excrete analysis for chitinase-like protein ykl-40 | |
| RU2312352C1 (en) | Method and kit for immunoferment determination of proteinase activity | |
| Vidigal et al. | Sequential injection lab-on-valve system for the on-line monitoring of hydrogen peroxide in lens care solutions | |
| RU2447446C2 (en) | METHOD FOR MEASURING ACTIVITY OF PROTEOLYTIC ENZYMES OF VARIOUS TYPES OF ACTIVE CENTRES ABLE TO SPLIT IMMUNOGLOBULINS IgA, IgM, IgG | |
| US8921063B2 (en) | Enhancing endotoxin detection | |
| RU2376606C1 (en) | Method and set for immune-enzyme detection of functional activity of component c4 of human complement | |
| CN113670907B (en) | CGC hybridized nano-composite and preparation method and application thereof | |
| JP2006515265A (en) | Peptide substrates and methods for metalloproteases | |
| KR100436567B1 (en) | Competitive enzyme-linked immunofiltration assay using multi-filters and a kit for the above enzyme-linked competitive immunofiltration assay |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20150418 |