RU2517576C1

RU2517576C1 - Method for preventing and reducing destruction of skeletal proteins of atrophied skeletal muscles caused by hypokinesia and/or discharge by gravity

Info

Publication number: RU2517576C1
Application number: RU2013110043/15A
Authority: RU
Inventors: Татьяна Леонидовна Немировская; Юлия Николаевна Ломоносова
Priority date: 2013-03-06
Filing date: 2013-03-06
Publication date: 2014-05-27

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: it has been shown that in the functional muscle discharge, PD150606 blocked the calpain proteolytic system leading to the protein breakdown, which leads to prevention of atrophic processes. The invention is characterised by preventing thereby for a long period of time, as PD150606 does not decrease the NO production by the muscles. The invention can find application in space medicine to remedy the negative effect of hypokinesia or discharge by gravity.

EFFECT: reducing protein destruction of atrophied skeletal muscles caused by hypokinesia or discharge by gravity.

6 dwg

Description

Изобретение относится к медицине, более точно к фармакологии, может найти применение в космической медицине при устранении негативного последствия гипокинезии или гравитационной разгрузки.The invention relates to medicine, more specifically to pharmacology, can find application in space medicine while eliminating the negative consequences of hypokinesia or gravitational unloading.

Проблема поиска таких средств чрезвычайно актуальна. Известно, что сократительные и цитоскелетные белки скелетных мышц при гипокинезии и гравитационной разгрузке подвергаются деструкции. В то время как начальные физиологические события, сопровождающие атрофию, были хорошо исследованы (снижение мышечной силы, напряжения), немного известно о триггерах, или молекулярных сигнальных событиях, лежащих в основе этого процесса. Атрофия мышц обусловлена снижением в ней белкового синтеза и резким увеличением белкового распада (S.Kandarian и др., 2004). Известны 4 протеолитические системы, включенные в распад мышечных белков: лизосомальная (аутофаги/лизосомы), каспазная, кальпаиновая, убиквитин-протеасомная. Степень вовлечения каждой из этих систем в развитие атрофии при различных ее моделях (кахексия, сепсис, денервация, иммобилизация, вывешивание) разная. В последнее время считается, что при функциональной разгрузке мышц каспазная система практически не задействована. Около 70% от объема мышечного волокна занимают сократительные белки, и эта фракция при атрофии снижается быстрее, чем многие другие (Baldwin КМ и др., 1990). Какая из протеолитических систем задействована в распаде сократительных белков - до недавнего времени оставалось неизвестным. S. Cohen с соавторами в 2009 г. обнаружили, что Е3 лигаза MuRF-1 участвует в убиквитинировании толстых филаментов при атрофии. Остается неизвестным, как может приступить к работе убиквитин-протеасомная система, если толстые филаменты защищены от убиквитирования в миофибриллах связанными белками? На этот вопрос ответа до сих пор не получено. Мы полагаем, что доступность толстых филаментов для убиквитирования может обеспечить кальпаиновая система. Работа кальпаиновой системы при мышечной разгрузке исследована недостаточно. Можно предположить, что кальпаины могут служить начальным звеном, запускающим дальнейшее убиквитинирование белков при функциональной разгрузке мышц. Известны работы, где применяли блокирование кальпаинов на культуре мышечных клеток (Nozaki К.И. др., 2010), при сепсисе мыши (Callahan LA, Supinski GS, 2009) и в некоторых других случаях, в которых сигнальные пути, задействованные в белковой деградации, отличны от процессов, вызывающих атрофию при функциональной разгрузке мышц. Блокирование кальпаинов при функциональной разгрузке мышц у животных применяли в нескольких работах, где исследовали изменение функциональных характеристик мышц и изменение мышечной массы. Однако во всех этих работах использовали трансгенных животных, с повышенной экспрессией кальпастатина (естественного ингибитора кальпаинов) (1, 2, 3). Другие авторы использовали ингибитор кальпаина calpeptin для исследования эффектов предотвращения, или снижения разрушения некоторых белков мышц от повреждений, вызванных экспериментальной аллергией (4), различными другими заболеваниями, а также эксцентрической нагрузкой (5). Введение ингибиторов кальпаинов животным неоднократно использовали для исследований, проводимых на сетчатке глаза, сердце (6, 7) и других органах. Наиболее близким средством (прототипом), направленным на предотвращение атрофии скелетных мышц при их функциональной разгрузке, является L-аргинин (Патент РФ №2444354).The problem of finding such tools is extremely relevant. It is known that contractile and cytoskeletal proteins of skeletal muscles during hypokinesia and gravitational unloading undergo destruction. While the initial physiological events accompanying atrophy have been well investigated (decreased muscle strength, tension), little is known about the triggers, or molecular signaling events that underlie this process. Muscle atrophy is due to a decrease in its protein synthesis and a sharp increase in protein breakdown (S. Kandarian et al., 2004). There are 4 known proteolytic systems involved in the breakdown of muscle proteins: lysosomal (autophages / lysosomes), caspase, calpain, ubiquitin-proteasome. The degree of involvement of each of these systems in the development of atrophy with its various models (cachexia, sepsis, denervation, immobilization, hanging) is different. Recently, it is believed that with the functional unloading of muscles, the caspase system is practically not involved. Contractile proteins occupy about 70% of the muscle fiber volume, and this fraction decreases atrophy faster than many others (Baldwin KM et al., 1990). Which of the proteolytic systems is involved in the breakdown of contractile proteins - until recently, remained unknown. S. Cohen et al. In 2009 found that E3 ligase MuRF-1 is involved in ubiquitination of thick filaments during atrophy. It remains unknown how the ubiquitin-proteasome system can begin to work if thick filaments are protected from bound proteins by ubiquitination in myofibrils? This question has not yet been answered. We believe that the calpain system can provide the availability of thick filaments for ubiquitization. The work of the calpain system during muscle unloading has not been adequately studied. It can be assumed that calpains can serve as the initial link that triggers further ubiquitination of proteins during functional muscle unloading. Known works have been used to block calpains on muscle cell culture (Nozaki K.I. et al., 2010), in mouse sepsis (Callahan LA, Supinski GS, 2009), and in some other cases in which signaling pathways involved in protein degradation are different from processes that cause atrophy during functional unloading of muscles. Blocking calpains during functional muscle unloading in animals was used in several works, where they studied changes in the functional characteristics of muscles and changes in muscle mass. However, transgenic animals with increased expression of calpastatin (a natural calpain inhibitor) were used in all these studies (1, 2, 3). Other authors used calpeptin calpain inhibitor to study the effects of preventing, or reducing the destruction of certain muscle proteins from damage caused by experimental allergies (4), various other diseases, and eccentric stress (5). The administration of calpain inhibitors to animals has been repeatedly used for studies on the retina, heart (6, 7) and other organs. The closest means (prototype) aimed at preventing skeletal muscle atrophy during their functional unloading is L-arginine (RF Patent No. 2444354).

Недостатком этого известного средства является то, что L-аргинин нельзя вводить в течение длительного времени, т.к. в этом случае активность собственной мышечной NO-синтазы снижается, что уменьшает выработку собственной NO мышцами.The disadvantage of this known tool is that L-arginine cannot be administered for a long time, because in this case, the activity of intrinsic muscle NO synthase decreases, which decreases the production of intrinsic NO by the muscles.

Техническим результатом заявленного средства является повышение его эффективности за счет более высокой степени предупреждения атрофии мышц, а так же возможность в течение более длительного времени осуществлять это предупреждение.The technical result of the claimed means is to increase its effectiveness due to a higher degree of prevention of muscle atrophy, as well as the ability to carry out this warning for a longer time.

Этот технический результат обеспечивается следующим техническим эффектом: средство обеспечивает блокирование кальпаиновой протеолитической системы, приводящей к распаду белка при функциональной разгрузке мышц, что ведет к предотвращению в них атрофических процессов.This technical result is provided by the following technical effect: the tool blocks the calpain proteolytic system, leading to protein breakdown during functional unloading of muscles, which leads to the prevention of atrophic processes in them.

Указанный технический результат достигается тем, что блокатор кальпаинов PD150606 применяют в качестве средства для профилактики и снижения деструкции белков скелетных мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной разгрузкой.The specified technical result is achieved in that the PD150606 calpain blocker is used as a means for the prevention and reduction of skeletal muscle protein degradation during their atrophy caused by hypokinesia and / or gravitational unloading.

Применение средства осуществляют следующим образомThe use of funds is as follows

Для выполнения поставленной задачи нами была проведена предварительная работа по подбору специфического ингибитора кальпаинов мыши, его концентрации и метода введения препарата in vivo. Эта работа была необходима, т.к. специфический ингибитор кальпаинов PD150606 применялся ранее только в экспериментах с культурами ткани, и известна единичная работа, в которой этот препарат вводился крысам за 30 минут до забоя. Оригинальность нашего подхода заключалась в том, что до нас длительного введения ингибитора кальпаинов in vivo в мышцы не применяли. На подготовительном этапе мы использовали 23 самца крыс Wistar и определили концентрацию PD150606, и частоту внутримышечного введения препарата для блокирования синтеза µ-кальпаина и тестирования некоторых маркеров сигнальных путей мышц. При этом мы также убедились, что после 3-х дней эксперимента животные, которым препарат вводился внутримышечно, по основным физиологическим показателям не отличались от крыс без введения препарата. Для проведения эксперимента 21 самец крыс Wistar были случайным образом распределены в 3 группы (по 7 крыс в каждой): интактный контроль (гр. К, вес крыс 226±13 г); вторую группу крыс вывешивали 3 дня таким образом, чтобы их передние конечности опирались на пол, а задние конечности его не касались (гр. В, вес крыс 207±7 г); третью группу вывешивали с введением ингибитора кальпаинов PD150606 (гр. PD, вес крыс 215±9 г, введение препарата внутримышечно в 10% DMSO дважды в день (в концентрации 3 мг/кг в день). Крыс забивали сверхдозой нембутала (75 мг/кг веса), m.soleus немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при -85°С. Определяли методом ПЦР в реальном времени уровень мРНК µ-кальпаина, белков теплового шока (Hsp90 и 70), nNOS, Е3 лигаз (атрогена-1 и ), элонгационного фактора eEF2k (ингибирующего функцию белкового синтеза). Методом фореза в полиакриламидном геле и иммуноблота определяли маркеры сигнальных путей протеинового синтеза Akt-mTOR-S6K и MAPK/Erk: pAkt, pFOX03, рР90, а также уровень конъюгированного убиквитина.To accomplish this task, we carried out preliminary work on the selection of a specific mouse calpain inhibitor, its concentration and method of administration of the drug in vivo. This work was necessary because a specific calpain inhibitor PD150606 was previously used only in experiments with tissue cultures, and a single work is known in which this drug was administered to rats 30 minutes before slaughter. The originality of our approach was that before us, long-term administration of a calpain inhibitor in vivo to the muscles was not used. In the preparatory phase, we used 23 male Wistar rats and determined the concentration of PD150606, and the frequency of the intramuscular injection of the drug to block µ-calpain synthesis and test some markers of muscle signaling pathways. At the same time, we also made sure that after 3 days of the experiment, the animals to which the drug was administered intramuscularly did not differ in basic physiological parameters from rats without drug administration. For the experiment, 21 male Wistar rats were randomly assigned to 3 groups (7 rats each): intact control (group K, rat weight 226 ± 13 g); the second group of rats was hung up 3 days in such a way that their forelimbs rested on the floor, and the hind limbs did not touch it (column B, rat weight 207 ± 7 g); the third group was hung up with the administration of a calpain inhibitor PD150606 (gr. PD, rat weight 215 ± 9 g, intramuscular injection in 10% DMSO twice a day (at a concentration of 3 mg / kg per day). The rats were killed with an overdose of Nembutal (75 mg / kg weights), m.soleus was immediately frozen in liquid nitrogen and stored at -85 ° C. The real-time PCR method determined µ-calpain mRNA, heat shock proteins (Hsp90 and 70), nNOS, E3 ligase (atrogen-1 and) , an elongation factor eEF2k (inhibiting the function of protein synthesis). Using polyacrylamide gel and immunoblot assays, we determined rkery signaling pathways of protein synthesis Akt-mTOR-S6K and MAPK / Erk: pAkt, pFOX03, rR90 and the level of ubiquitin-conjugated.

Электрофорез в ПААГ.Electrophoresis in page.

С каждой пробы m.soleus были сделаны срезы толщиной 20 мкм (10-15 мг) и немедленно прогомогенизированы в течение 25 мин в 100 мкл буфера, содержащего 50 мМ Трис-HCl (рН=8), 150 мМ NaCl, 0,1% ДДС-Na, 10 мМ ЭДТА, 50 мМ бета-глицерофосфат, 0,5 мМ DTT, 5 мМ ЭГТА, 10 мкг/мл апротинин, 10 мкг/мл леупептин, 1 мМ PMSF. 50 мМ NaF, 1 мМ Na₃VO₄. 10 мкг/мл пепстатин; 0,1% Тритон Х-100. Затем образцы центрифугировали при 20000xg в течение 15 мин. Часть супернатанта отбирали для определения концентрации общего белка с помощью RC DC Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, США). Электрофорез проводили в 10% разделяющем и 5% концентрирующем акриламидном геле. Образцы загружались из расчета 40 мкг общего белка в каждой пробе на дорожку и нормировались относительно уровня GAPDH, содержащегося в той же пробе.Sections of 20 μm (10-15 mg) thick were made from each m.soleus sample and immediately homogenized for 25 min in 100 μl of buffer containing 50 mM Tris-HCl (pH = 8), 150 mM NaCl, 0.1% DDS-Na, 10 mM EDTA, 50 mM beta-glycerophosphate, 0.5 mM DTT, 5 mM EGTA, 10 μg / ml aprotinin, 10 μg / ml leupeptin, 1 mm PMSF. 50 mM NaF, 1 mM Na ₃ VO ₄ . 10 μg / ml pepstatin; 0.1% Triton X-100. The samples were then centrifuged at 20,000 xg for 15 minutes. Part of the supernatant was selected to determine the concentration of total protein using RC DC Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, USA). Electrophoresis was performed on a 10% separating and 5% concentrating acrylamide gel. Samples were loaded at the rate of 40 μg of total protein in each sample per lane and normalized to the level of GAPDH contained in the same sample.

Вестернблоттинг.Western blotting.

Электроперенос белков производился в буфере (25 мМ Трис pH=8,3, 192 мМ глицин, 20% метанола. 0,04% ДДС-Na) на нитроцеллюлозную мембрану при 100 мД при температуре +4°С в системе mini Trans-Blot (Bio-Rad Laboratories, США) в течение 2 часов. Мембраны блокировали в растворе 5% сухого молока (Bio-Rad Laboratories, США) в TBST. Для выявления были использованы первичные моноклональные антитела: анти-pAkt (Abeam, 1:1000), анти-Р-р90 (Abeam, 1:800), анти-pFOXCe (Santa Cruz, 1:1000), анти-убиквитин (Abeam, 1:1000). Были использованы вторичные антитела: GAM Bio-Rad Laboratories, США 1:50000 и GAR Santa Cruz, 1:1000). Вестернблоттинг был повторен не менее 3 раз. Анализ белковых полос производился с помощью денситометра GS-800 (Quantity-One™ software, BioRad). Для каждой группы были подсчитаны как Mm (средняя±стандартная ошибка).Protein was transferred in a buffer (25 mM Tris pH = 8.3, 192 mM glycine, 20% methanol. 0.04% DDS-Na) onto a nitrocellulose membrane at 100 mD at + 4 ° С in a mini Trans-Blot system ( Bio-Rad Laboratories, USA) for 2 hours. Membranes were blocked in a solution of 5% milk powder (Bio-Rad Laboratories, USA) in TBST. Primary monoclonal antibodies were used for detection: anti-pAkt (Abeam, 1: 1000), anti-P-p90 (Abeam, 1: 800), anti-pFOXCe (Santa Cruz, 1: 1000), anti-ubiquitin (Abeam, 1: 1000). Secondary antibodies were used: GAM Bio-Rad Laboratories, USA 1: 50,000 and GAR Santa Cruz, 1: 1000). Western blotting was repeated at least 3 times. Protein bands were analyzed using a GS-800 densitometer (Quantity-One ™ software, BioRad). For each group, they were calculated as Mm (mean ± standard error).

Анализ экспрессии генов.Analysis of gene expression.

Обратная транскрипция. Тотальная РНК была экстрагирована из 10 мг замороженной m.soleus при помощи RNeasy Micro Kit (QIAGEN, Germany). Все образцы РНК были обработаны протеиназой К и ДНКазой I. Концентрация РНК была определена при длине волны 260 нм. Затем водный раствор выделенной РНК был заморожен при -84°С для последующего проведения обратной транскрипции. Для обратной транскрипции использовали водный раствор 1 мкг РНК, олиго(dT)15, случайные гексануклеотиды d(N)6, обратную транкскриптазу MMLV. Обратную транскрипцию проводили при 37°C в течение 60 мин согласно стандартному протоколу. Все образцы были проанализированы не менее 3-х раз и все реакции измерены с помощью детектирующего амплификатора iQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, США), β-актин и GAPDH использовали в качестве реферепеных генов. Праймеры, использованные для проведения ПЦР-РВ: 5′-GAGGCAGAGGAAGAGAAAGG-3′ и 5′-Reverse transcription. Total RNA was extracted from 10 mg of frozen m.soleus using the RNeasy Micro Kit (QIAGEN, Germany). All RNA samples were treated with proteinase K and DNase I. The concentration of RNA was determined at a wavelength of 260 nm. Then, the aqueous solution of the isolated RNA was frozen at -84 ° C for subsequent reverse transcription. For reverse transcription, an aqueous solution of 1 μg RNA, oligo (dT) 15, random hexanucleotides d (N) 6, reverse transcriptase MMLV were used. Reverse transcription was performed at 37 ° C for 60 min according to the standard protocol. All samples were analyzed at least 3 times and all reactions were measured using the iQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, USA), amplifying β-actin and GAPDH genes were used as reference genes. Primers used for PCR-RV: 5′-GAGGCAGAGGAAGAGAAAGG-3 ′ and 5′-

ATGGGCTTCGTCTTATTCAG-3′ для HSP90β; 5′-CCTCCGATTTCAGCTCAG-3′ и 5′-CGAAGGCGTAGAGATTCCAG-3′ для HSP70; 5′-CTACGATGTTGCAGCCAAGA-3′ и 5′-GGCAGTCGAGAAGTCCAGTC-3′ для MAFbx; 5′-GCCAATTTGGTGCTTTTTGT-3′ и 5′-AAATTCAGTCCTCTCCCCGT-3′ для MuRF-1; 5′-CATGGCTAAGAGCAGGAAGG-3′ и 5′-CGAAGTCTGCAGGTCTAGGG-3′ для calpain1; 5′-AGAAGCTGGTGACAGGCAGT-3′ и 5′-GGGTTCTTGTCCAGTCCAAA-3′ для eLFk; 5′-AGTCCCCTGCTTCGTGAGAG-3′ и 5′-CACCCGAAGACCAGAACCAT-3′ для nNOS; 5′-CACCAAGAAGGTCAAACAGGA-3′ и 5′-GCAAGAACTTTATTCAAAGTGCAA-3′ для убиквитина, 5′-ACCGGCAAGTTCAACGGCACAGTCAA-3′ и 5′-GCTTTCCAGAGGGGC-CATCCACA-3′ для GAPDH: 5′-TCATGAAGTGTGACGTTGACATCC-3′ и 5′-GTAAAA-CGCAGCTCAGTAACAGTC-3′ для β-actin. Для опенки относительных изменений в уровне экспрессии специфического гена в пробе мы использовали следующую формулу: ΔCt=Ct (реф)-Ct (тест), где Ct (реф) - точка пересечения базовой линии и графика амплификации референсного гена в пробе, а Ct(тест) - точка пересечения базовой линии и графика амплификации изучаемого гена в той же пробе. Далее определяли в каждой группе среднее значение ΔCt и его стандартную ошибку. Изменение уровня экспрессии анализируемого гена в экспериментальных группах оценивали относительно контрольного уровня по формуле: ΔΔCt=ΔCt (группа)-ΔCt (контроль).ATGGGCTTCGTCTTATTCAG-3 ′ for HSP90β; 5′-CCTCCGATTTCAGCTCAG-3 ′ and 5′-CGAAGGCGTAGAGATTCCAG-3 ′ for HSP70; 5′-CTACGATGTTGCAGCCAAGA-3 ′ and 5′-GGCAGTCGAGAAGTCCAGTC-3 ′ for MAFbx; 5′-GCCAATTTGGTGCTTTTTTGT-3 ′ and 5′-AAATTCAGTCCTCTCCCCGT-3 ′ for MuRF-1; 5′-CATGGCTAAGAGCAGGAAGG-3 ′ and 5′-CGAAGTCTGCAGGTCTAGGG-3 ′ for calpain1; 5′-AGAAGCTGGTGACAGGCAGT-3 ′ and 5′-GGGTTCTTGTCCAGTCCAAA-3 ′ for eLFk; 5′-AGTCCCCTGCTTCGTGAGAG-3 ′ and 5′-CACCCGAAGACCAGAACCAT-3 ′ for nNOS; 5′-CACCAAGAAGGTCAAACAGGA-3 ′ and 5′-GCAAGAACTTTATATAAAGTGCAA-3 ′ for ubiquitin, 5′-ACCGGCAAGTTCAACGGCACAGTCAA-3 ′ and 5′-GCTTTCCAGAGGGA-5A GAT-5A for 5A-5GATGTAG-5GATGTAG-5A for 3A for GAGA-3A -CGCAGCTCAGTAACAGTC-3 ′ for β-actin. To evaluate the relative changes in the level of expression of a specific gene in a sample, we used the following formula: ΔCt = Ct (ref) -Ct (test), where Ct (ref) is the intersection point of the baseline and the amplification graph of the reference gene in the sample, and Ct (test ) is the intersection point of the baseline and the graph of amplification of the studied gene in the same sample. Next, the average ΔCt value and its standard error were determined in each group. The change in the level of expression of the analyzed gene in the experimental groups was evaluated relative to the control level by the formula: ΔΔCt = ΔCt (group) -ΔCt (control).

Статистическая обработка данных.Statistical data processing.

Все данные приводились как М±m, где М - среднее арифметическое значение; m - стандартная ошибка среднего значения. Статистическая обработка данных производилась с помощью программы Origin Pro v.8.0 SR5. Все выборки были проверены на принадлежность к нормально распределенной совокупности. Достоверность отличий между группами определялась с помощью двуфакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим вычислением значения критерия Ньюмена-Кейлса для множественных сравнений. Достоверность различий между группами также определялась по непарному t-критерию Стьюдента при вероятности нулевой гипотезы p<0.05.All data were presented as M ± m, where M is the arithmetic mean value; m is the standard error of the mean. Statistical data processing was performed using the Origin Pro v.8.0 SR5 program. All samples were tested for belonging to a normally distributed population. The significance of differences between the groups was determined using two-way analysis of variance (ANOVA), followed by calculation of the Newman-Cales test for multiple comparisons. The significance of differences between the groups was also determined by the unpaired Student t-test with the probability of the null hypothesis p <0.05.

Мы обнаружили, что после введения вывешенной группе крыс ингибитора кальпаинов (гр.PD) у нее не наблюдалось снижения веса m.soleus, как и индекса сухого веса мышцы к весу крысы (г) после 3-х дней эксперимента (в отличие от группы, вывешенной без препарата), Фиг.1. Вес m.soleus составлял 106±8 и 114±7 в группах К и PD против 86±5 (p<0,05) в группе В соответственно. Что свидетельствует об адекватном действии препарата на мышцу.We found that after administration of the calpain inhibitor (group PD) to the suspended rat group, it did not show a decrease in m.soleus weight, nor a dry muscle weight index to rat weight (g) after 3 days of the experiment (in contrast to the group posted without a drug), Figure 1. The weight of m.soleus was 106 ± 8 and 114 ± 7 in groups K and PD against 86 ± 5 (p <0.05) in group B, respectively. This indicates an adequate effect of the drug on the muscle.

В группе PD, вывешенной с введением препарата, мы не отметили повышения уровня экспрессии мРНК µ-кальпаина (в отличие от группы, вывешенной без введения ингибитора), Фиг.2.In the PD group posted with the introduction of the drug, we did not notice an increase in the level of µ-calpain mRNA expression (in contrast to the group posted without the administration of an inhibitor), Figure 2.

Мы тестировали работу звеньев системы протеасомной деградации (Е3 лигаз atrogin-1/MAFbx и MuRF-1) и обнаружили отсутствие увеличения уровня экспрессии мРНК Е3-лигазы атрогена-1 (MAFbx) в группе с введением блокатора кальпаина (в отличие от soleus крыс, вывешенных без препарата , Фиг.2). В то же время уровень экспрессии мРНК Е3-лигазы MURF-1 в группе PD повысился так же, как и в группе вывешивания без введения препарата (Фиг.2).We tested the functioning of the links of the proteasome degradation system (E3 ligase atrogin-1 / MAFbx and MuRF-1) and found no increase in the expression level of E3 ligase of atrogen-1 (MAFbx) in the group with the introduction of the calpain blocker (unlike soleus rats posted without drug, Figure 2). At the same time, the level of expression of MURF-1 E3 ligase mRNA in the PD group increased in the same way as in the hanging group without drug administration (Figure 2).

Содержание убиквитинированных белков (как и экспрессия мРНК убиквитина) в soleus крыс, которым вводили ингибитор кальпаинов, не отличалось от группы контроля (в отличие от группы вывешивания, где оно было существенно повышено (p<0,05). Фиг.2, 3.The content of ubiquitinated proteins (as well as the expression of ubiquitin mRNA) in soleus of rats administered with a calpain inhibitor did not differ from the control group (in contrast to the hanging group, where it was significantly increased (p <0.05). FIGS. 2, 3.

Для того чтобы оценить состояние белкового метаболита мышцы, мы тестировали не только экспрессию кальпаина, систему ее протеасомной деградации (Е3 лигазы -atrogin-1 и MuRF-1) и уровень конъюгированного убиквитина, но и протеинового синтеза (маркеры сигнальных путей Akt-mTOR-S6K - pAkt и pFOX03), а также уровень экспрессии элонгационного фактора eEF2k, и P-p90S6k, связанные с работой сигнального пути МАРКУЕгк. Мы обнаружили снижение содержания фосфорилированных белков pAkt и pFOXOS в m.soleus крыс, вывешенных без введения препарата (p<0.05). В то время как в группе PD снижение уровня этих белков было полностью предотвращено (Фиг.4, 5).In order to assess the state of muscle protein metabolite, we tested not only calpain expression, its proteasome degradation system (E3 ligases -atrogin-1 and MuRF-1) and the level of conjugated ubiquitin, but also protein synthesis (Akt-mTOR-S6K signaling markers - pAkt and pFOX03), as well as the expression level of the elongation factor eEF2k, and P-p90S6k associated with the work of the MARKUEgk signaling pathway. We found a decrease in the content of phosphorylated proteins pAkt and pFOXOS in m.soleus rats posted without drug administration (p <0.05). While in the PD group, a decrease in the level of these proteins was completely prevented (Figs. 4, 5).

Мы обнаружили, что содержание рибосомальной P-p90S6k после 3-х дней вывешивания снижено в m.soleus обеих групп (Фиг.6). Следовательно, эта рибосомальная киназа, работающая ассоциированно с МАРК/Erk сигнальным путем, вряд ли напрямую регулируется кальпаинами. Уровень экспрессии мРНК элонгационного фактора eEF2k (ингибирующего функцию белкового синтеза) был заметно понижен в мышце животных, которым при вывешивании вводили препарат (Фиг.2). В то же время как у вывешенных без препарата животных он существенно превышал уровень контрольной группы (Фиг.2).We found that the content of ribosomal P-p90S6k after 3 days of hanging was reduced in m.soleus of both groups (Figure 6). Therefore, this ribosomal kinase, which is associated with the MAPK / Erk signaling pathway, is hardly directly regulated by calpains. The level of expression of mRNA of the elongation factor eEF2k (inhibiting the function of protein synthesis) was significantly reduced in the muscle of animals, which when hanging the drug was administered (Figure 2). At the same time, in animals posted without the drug, it significantly exceeded the level of the control group (Figure 2).

В наших предыдущих исследованиях, выполненных в рамках программы РФФИ, мы показали, что работа таких регуляторных белков, как nNOS и белков теплового шока Hsp90 и 70, которые выполняют защитную функцию для цитоскелетных белков, может регулироваться кальпаинами. Поэтому мы определили их экспрессию при ингибировании кальпаинов во время функциональной разгрузки мышц. Мы обнаружили снижение уровня мРНК Hsp70 в группе вывешивания (гр.B, p<0,05, Фиг.2) там, где концентрация кальпаинов была также существенно повышена (Фиг.2). В то же время в мышце, в которую вводился ингибитор кальпаинов, мы обнаружили существенное снижение как экспрессии Hsp70, так и nNOS (Фиг.2), что может быть связано с отсутствием необходимости в увеличении защитной реакции клетки от разрушения белка.In our previous studies carried out as part of the RFBR program, we showed that the work of regulatory proteins such as nNOS and heat shock proteins Hsp90 and 70, which perform a protective function for cytoskeletal proteins, can be regulated by calpains. Therefore, we determined their expression during inhibition of calpains during functional muscle unloading. We found a decrease in the level of Hsp70 mRNA in the hanging group (column B, p <0.05, Figure 2) where the concentration of calpains was also significantly increased (Figure 2). At the same time, in the muscle into which the calpain inhibitor was injected, we found a significant decrease in both the expression of Hsp70 and nNOS (Figure 2), which may be due to the absence of the need to increase the protective response of the cell from protein breakdown.

Такая же тенденция прослеживается при определении экспрессии мРНК Hsp90 (Фиг.2)The same trend is observed in determining the expression of Hsp90 mRNA (Figure 2)

Для исследования роли кальпаинов в запуске убиквитин-протеасомной системы и регулировании анаболических сигнальных путей мы блокировали работу кальпаинов в мышце при вывешивании крыс. Тестировали систему протеасомной деградации (Е3 лигазы) и регуляторный белок pFOX03, а также маркеры системы протеинового синтеза (Akt-mTOR-S6K и МАРК/Erk сигнальных путей). Если наша гипотеза верна, то блокирование кальпаинов может предотвратить, или снизить содержание убиквитинированных белков, экспрессию Е3-лигаз, а также может предотвратить снижение анаболических процессов в мышце, затормозив тем самым развитие в ней атрофических процессов. При введении ингибитора кальпаинов мы обнаружили у этих крыс как отсутствие снижения веса m.soleus, так и отсутствие снижения индекса сухого веса мышцы по сравнению с группой контроля (в отличие от мышц крыс, вывешенных без ингибитора), фиг.1. Это свидетельствует о предотвращении развития атрофических процессов. Экспрессия мю-кальпаина в m.soleus этой группы также не отличалась от контроля (Фиг.2), в то время как в группе вывешивания (B) она была существенно повышена. Можно заключить, что блокирование работы кальпаинов достигло своей цели и привело к изменению его экспрессии при вывешивании животных. Наша гипотеза о взаимосвязи работы кальпаиновой и убиквитин-протеасомной систем распада белка оправдалась, т.к. как количество убиквитинированных белков, так и экспрессия их мРНК в группе PD не отличалась от уровня контроля, в то время как в группе «вывешивание» они были существенно повышены (Фиг.2, 3). Одновременно в группе B было повышено и содержание Е3-лигаз atrogin-1/muscle atrophy F-box (MAFbx), и мышечно-специфичного RING finger 1 (MuRFl) (Фиг.2). Ранее показано, что такие Е3-лигазы, как атрогин-1 и MuRF1, которые задействованы в процессах протеасомной деградации белков начинают особенно интенсивно активироваться при функциональной разгрузке мышц (Jackman, R.W., and Kandarian, S.C., 2004, Dupont-Versteegden, E.E. et all, 2006). Именно поэтому они были выбраны маркерами протеасомной деградации в нашей работе. Однако мы видим, что в группе PD предотвращено увеличение экспрессии мРНК в m.soleus только атрогена-1 (Фиг.2), тогда как экспрессия MuRFl в этой группе повышена так же, как и в группе, вывешенной без введения ингибитора кальпаина (Фиг.2). Экспрессия atrogin-1/MAFbx может регулироваться транскрипционным фактором forkhead box О (Foxo), который в норме фосфорилируется и (таким образом) инактивируется Akt. Если фосфорилирования не происходит - Foxo транслоцируется в ядро и индуцирует транскрипцию обоих Е3 лигаз - atrogin-1 и MuRF1 (Sandri et al., 2004; Stitt et al., 2004). В нашем эксперименте уровни как pFOX03 и pAkt были существенно снижены в группе вывешивания без препарата (В), фиг.4, 5, в то время как группы контроля и PD существенно не различались между собой по этим показателям. Можно предположить, что FOX03 фосфорилировался Akt и не поступал в ядро для индуцирования транскрипции атрогена-1. В то же время экспрессия MuRF1 регулируется не только FOXO3, но и nF-kapaB. И его повышенный в группе PD уровень мог обеспечиваться этим фактором. Изменения в экспрессии Е3-лигазы атрогина-1 и содержании фосфорилированных белков pAkt и рЕОХО3 свидетельствуют о взаимосвязи между работой кальпаиновой и убиквитин-протеасомной систем, а также о взаимной регуляции работы кальпаинового и Akt-mTOR-S6K сигнальных путей. Akt-mTOR-S6K хорошо известен как главный путь регуляции синтеза белка на уровне инициации трансляции [Bodine SC и др., 2001]. Содержание рибосомальной P-p90S6k (маркера МАРК/Erk анаболического сигнального пути) было достоверно снижено в обеих вывешенных группах (Фиг.6), по-сравнению с группой контроля, что свидетельствует об отсутствии согласования в работе анаболического MAPK/Erk сигнального пути и кальпаиновой протеолитической системы. В то же время экспрессия мРНК элонгационного фактора eEF2k имела явную тенденцию к снижению в мышце вывешенных животных с введением ингибитора кальпаинов по сравнению с группой контрольных животных, тогда как у вывешенных крыс (В) его содержание было достоверно повышено (p<0,05, Фиг.2). eEF2k занимается фосфорилированием фактора eEf2, что приводит к ингибированию процессов элонгации и тормозит процессы синтеза белка. То, что повышения мРНК eEF2k в группе PD (по сравнению с контрольными животными) не обнаружено, свидетельствует о том, что в условиях блокирования активности кальпаинов мышц при функциональной разгрузке снимаются препятствия для синтеза белка.To study the role of calpains in triggering the ubiquitin-proteasome system and regulating anabolic signaling pathways, we blocked calpains in the muscle by hanging rats. The proteasome degradation system (E3 ligases) and the regulatory protein pFOX03, as well as the markers of the protein synthesis system (Akt-mTOR-S6K and MAPK / Erk signaling pathways) were tested. If our hypothesis is true, then blocking calpains can prevent or reduce the content of ubiquitinated proteins, the expression of E3 ligases, and can also prevent a decrease in anabolic processes in the muscle, thereby inhibiting the development of atrophic processes in it. With the administration of a calpain inhibitor, we found in these rats both the absence of m.soleus weight reduction and the absence of a decrease in the muscle dry weight index as compared to the control group (in contrast to the muscles of rats without an inhibitor), Fig. 1. This indicates the prevention of the development of atrophic processes. The expression of mu-calpain in m.soleus of this group also did not differ from the control (Figure 2), while in the hanging group (B) it was significantly increased. It can be concluded that blocking the work of calpains reached its goal and led to a change in its expression when hanging animals. Our hypothesis about the relationship between the work of calpain and ubiquitin-proteasome protein breakdown systems was justified, because both the amount of ubiquitinated proteins and the expression of their mRNA in the PD group did not differ from the control level, while in the hanging group they were significantly increased (Figs. 2, 3). At the same time, the content of E3 ligase atrogin-1 / muscle atrophy F-box (MAFbx) and muscle-specific RING finger 1 (MuRFl) was increased in group B (Figure 2). It has been previously shown that E3 ligases such as atrogin-1 and MuRF1, which are involved in proteasome protein degradation processes, begin to be activated especially intensively during functional muscle unloading (Jackman, RW, and Kandarian, SC, 2004, Dupont-Versteegden, EE et all , 2006). That is why they were chosen as markers of proteasome degradation in our work. However, we see that in the PD group the increase in mRNA expression in m.soleus only atrogen-1 was prevented (Figure 2), while MuRFl expression in this group was increased as well as in the group hung out without the administration of a calpain inhibitor (Fig. 2). The expression of atrogin-1 / MAFbx can be regulated by the transcription factor forkhead box O (Foxo), which is normally phosphorylated and (thus) inactivated by Akt. If phosphorylation does not occur, Foxo translocates to the nucleus and induces transcription of both E3 ligases — atrogin-1 and MuRF1 (Sandri et al., 2004; Stitt et al., 2004). In our experiment, levels like pFOX03 and pAkt were significantly reduced in the hanging group without drug (B), Figs. 4, 5, while the control and PD groups did not differ significantly in these indicators. It can be assumed that FOX03 was phosphorylated by Akt and did not enter the nucleus to induce atrogen-1 transcription. At the same time, MuRF1 expression is regulated not only by FOXO3, but also by nF-kapaB. And its increased level in the PD group could be provided by this factor. Changes in the expression of atrogine-1 E3 ligase and the content of phosphorylated pAkt and pEXO3 proteins indicate the relationship between the work of the calpain and ubiquitin-proteasome systems, as well as the mutual regulation of the calpain and Akt-mTOR-S6K signaling pathways. Akt-mTOR-S6K is well known as the main way of regulating protein synthesis at the level of translation initiation [Bodine SC et al., 2001]. The content of the ribosomal P-p90S6k (marker of MAPK / Erk anabolic signaling pathway) was significantly reduced in both posted groups (Figure 6), compared with the control group, which indicates the lack of coordination in the work of the anabolic MAPK / Erk signaling pathway and calpain proteolytic system. At the same time, expression of the eEF2k elongation factor mRNA showed a clear tendency to decrease in the muscle of hung animals with the administration of a calpain inhibitor compared with the group of control animals, while in suspended rats (B) its content was significantly increased (p <0.05, Fig. .2). eEF2k is involved in the phosphorylation of eEf2 factor, which leads to inhibition of elongation and inhibits protein synthesis. The fact that no increase in eEF2k mRNA in the PD group (as compared with control animals) was not found, indicates that, under conditions of blocking muscle calpain activity during functional unloading, obstacles to protein synthesis are removed.

Мы определяли также содержание мРНК белков теплового шока 90/70 и nNOS в нашем эксперименте. Недавно на культуре клеток С2С12 показано, что nNOS и Hsp90 являются субстратами кальпаинов, и резкое снижение уровня этих белков при разгрузке мышц может быть связано с активированием кальпаинов. Ранее мы показали, что кальпаины могут регулировать in vivo содержание белков теплового шока 90/70 в мышце и активность nNOS при ее функциональной разгрузке (Ломоносова и др., 2011, 2012; Lomonosova et all, 2012). Мы также обнаружили, что nNOS имеет отношение к поддержанию белкового метаболизма мышц. Белки теплового шока синтезируются в скелетной мышце в большом количестве, их уровень быстро увеличивается при различных стрессах, что обеспечивает защиту клеток (Soti С. et all, 2005). Однако при функциональной разгрузке мышц уровень Hsp90/70 падает на 70-75% (параллельно атрофии мышцы) (Takashi Sakurai и др., 2005, Lomonosova et all, 2012). После 3-х дней вывешивания содержание Hsp70 (в группе В) в нашем эксперименте было также снижено (Фиг.2). Однако для нас было неожиданным то, что уровень экспрессии мРНК Hsp70 и nNOS в группе с введением ингибитора кальпаинов был существенно ниже, чем у контрольных животных (Фиг.2), а уровень Hsp90 имел тенденцию к снижению. Мы полагаем, что такое снижение может быть связано с отсутствием необходимости в увеличении защитной реакции клетки от разрушения белка при блокировании кальпаинов. Итак, мы показали, что имеется взаимодействие между работой кальпаиновой и убиквитин-протеасомной системами при разгрузке мышц, увеличение концентрации кальпаинов при разгрузке мышц ведет к повышению убиквитинирования белков, увеличению экспрессии Е3-лигазы атрогина-1. Мы обнаружили, что кальпаин связан с регуляцией белкового синтеза, контролируемого не только анаболическим Akt-mTOR-S6K сигнальным путем, но и другими факторами, регулирующими белковый синтез на уровне элонгации. Концентрация кальпаина имеет также отношение к регуляции экспрессии nNOS и Hsp70 в мышце. Блокирование кальпаинов при функциональной разгрузке мышцы ведет к снижению защитной реакции клетки от разрушения белка, что выражается в уменьшении экспрессии мРНК белков теплового шока и nNOS.We also determined the mRNA content of heat shock proteins 90/70 and nNOS in our experiment. Recently, on C2C12 cell culture, it was shown that nNOS and Hsp90 are substrates of calpains, and a sharp decrease in the level of these proteins during muscle unloading may be associated with activation of calpains. Earlier, we showed that calpains can regulate muscle heat shock protein 90/70 in vivo and nNOS activity during functional unloading (Lomonosova et al., 2011, 2012; Lomonosova et all, 2012). We also found that nNOS is related to maintaining muscle protein metabolism. Heat shock proteins are synthesized in skeletal muscle in large quantities, their level rapidly increases under various stresses, which provides cell protection (Soti C. et all, 2005). However, with functional muscle unloading, the level of Hsp90 / 70 drops by 70-75% (parallel to muscle atrophy) (Takashi Sakurai et al., 2005, Lomonosova et all, 2012). After 3 days of hanging, the content of Hsp70 (in group B) in our experiment was also reduced (Figure 2). However, it was unexpected for us that the expression level of Hsp70 and nNOS mRNA in the group with the introduction of a calpain inhibitor was significantly lower than in control animals (Figure 2), and the level of Hsp90 tended to decrease. We believe that such a decrease may be due to the absence of the need to increase the protective response of the cell from protein breakdown when blocking calpains. So, we have shown that there is an interaction between the work of the calpain and ubiquitin-proteasome systems during muscle unloading, an increase in the concentration of calpains during muscle unloading leads to an increase in the ubiquitination of proteins, an increase in the expression of the E3 ligase of atrogin-1. We found that calpain is associated with the regulation of protein synthesis, controlled not only by the anabolic Akt-mTOR-S6K signaling pathway, but also by other factors that regulate protein synthesis at the elongation level. Calpain concentration is also related to the regulation of muscle expression of nNOS and Hsp70. Blocking calpains during functional unloading of the muscle leads to a decrease in the protective response of the cell from protein breakdown, which is expressed in a decrease in the expression of mRNA of heat shock proteins and nNOS.

Вывод: Введение блокатора кальпаинов PD150606 при функциональной разгрузке мышц предотвращает развитие их атрофии.Conclusion: The introduction of the PD150606 calpain blocker during functional unloading of muscles prevents the development of their atrophy.

Краткое описание рисунковBrief Description of Drawings

Фиг.1. Индекс сухого веса мышцы к весу крысы (в граммах). Отношение сухого веса m.soleus к массе тела животного у вывешенных (В) и вывешенных с введением PD150606 (PD) крыс оценивали относительно контрольного (К) уровня. Результаты приведены в виде М±m (n=7 для каждой группы). * - достоверные отличия от K, p<0,05.Figure 1. Muscle dry weight index to rat weight (in grams). The ratio of the dry weight of m.soleus to the body weight of the animal in rats hung (B) and hung with PD150606 (PD) was evaluated relative to the control (K) level. The results are shown as M ± m (n = 7 for each group). * - significant differences from K, p <0.05.

Фиг.2. Уровень мРНК µ-кальпаинов в m.soleus у вывешенных (В) и вывешенных с введением PD150606 (PD) крыс оценивали относительно контрольного (К) уровня. Результаты приведены в виде медианы и интерквартильной широты (0,25-0,75). * - достоверные отличия от K, p<0,05, # - достоверные отличия от PD, p<0,05.Figure 2. The μ-calpain mRNA level in m.soleus in rats suspended (B) and hanging with PD150606 (PD) was evaluated relative to the control (K) level. The results are shown as median and interquartile latitude (0.25-0.75). * - significant differences from K, p <0.05, # - significant differences from PD, p <0.05.

Фиг.3. Содержание убиквитированных белков у вывешенных (В) и вывешенных с введением PD150606 (PD) крыс оценивали относительно контрольного (К) уровня. Результаты приведены в виде М±m (n=7 для каждой группы). * - достоверные отличия от K, p<0,05, # - достоверные отличия от PD, p<0,05.Figure 3. The content of ubiquitized proteins in the posted (B) and posted with the introduction of PD150606 (PD) rats was evaluated relative to the control (K) level. The results are shown as M ± m (n = 7 for each group). * - significant differences from K, p <0.05, # - significant differences from PD, p <0.05.

Фиг.4. Содержание фосфорилированного белка pAkt у вывешенных (В) и вывешенных с введением PD150606 (PD) крыс оценивали относительно контрольного (К) уровня. Результаты приведены в виде М±m (n=7 для каждой группы). * - достоверные отличия от K, p<0,05, # - достоверные отличия от PD, p<0,05.Figure 4. The content of phosphorylated pAkt protein in rats hung (B) and hung with PD150606 (PD) was evaluated relative to the control (K) level. The results are shown as M ± m (n = 7 for each group). * - significant differences from K, p <0.05, # - significant differences from PD, p <0.05.

Фиг.5. Содержание фосфорилированного белка pFOXO3 у вывешенных (В) и вывешенных с введением PD150606 (PD) крыс оценивали относительно контрольного (К) уровня. Результаты приведены в виде М±m (n=7 для каждой группы). * - достоверные отличия от К, p<0,05.Figure 5. The content of phosphorylated pFOXO3 protein in rats hung (B) and hung with PD150606 (PD) was evaluated relative to the control (K) level. The results are shown as M ± m (n = 7 for each group). * - significant differences from K, p <0.05.

Фиг.6. Содержание фосфорилированного белка рибосомальной киназы P-p90S6k у вывешенных (В) и вывешенных с введением PD150606 (PD) крыс оценивали относительно контрольного (К) уровня. Результаты приведены в виде M±m (n=7 для каждой группы). * - достоверные отличия от K, p<0.05.6. The content of phosphorylated protein of the P-p90S6k ribosomal kinase in rats hung (B) and hanging with the introduction of PD150606 (PD) rats was evaluated relative to the control (K) level. The results are shown as M ± m (n = 7 for each group). * - significant differences from K, p <0.05.

Источники информацииInformation sources

1. Salazar JJ, Michele DE, Brooks SV. Inhibition of calpain prevents muscle weakness and disruption of sarcomere structure during hindlimb suspension. J. Appl Physiol. 2010. Jan; 108 (1): 120-7.1. Salazar JJ, Michele DE, Brooks SV. Inhibition of calpain prevents muscle weakness and disruption of sarcomere structure during hindlimb suspension. J. Appl Physiol. 2010. Jan; 108 (1): 120-7.

2. Tidball JG, Spencer MJ.. Expression of a calpastatin transgene slows muscle wasting and obviates changes in myosin isoform expression during murine muscle disuse. J Physiol 545: 819-828, 2002.2. Tidball JG, Spencer MJ .. Expression of a calpastatin transgene slows muscle wasting and obviates changes in myosin isoform expression during murine muscle disuse. J Physiol 545: 819-828, 2002.

3. Otam K, Han DH, Ford EL, Garcia-Roves PM, Ye H, Horikawa Y, Bell GI, Holloszy JO, Polonsky KS. Calpain system regulates muscle mass and glucose transporter GLUT4 turnover. J Biol Chem. 2004 May 14; 279 (20): 20915-20.3. Otam K, Han DH, Ford EL, Garcia-Roves PM, Ye H, Horikawa Y, Bell GI, Holloszy JO, Polonsky KS. Calpain system regulates muscle mass and glucose transporter GLUT4 turnover. J Biol Chem. 2004 May 14; 279 (20): 20915-20.

4. Park S, Nozaki K, Guyton MK, Smith JA, Ray SK, Banik NL. Calpain inhibition attenuated morphological and molecular changes in skeletal muscle of experimental allergic encephalomyelitis rats. J. Neurosci Res. 2012 Nov; 90 (11): 2134-454. Park S, Nozaki K, Guyton MK, Smith JA, Ray SK, Banik NL. Calpain inhibition attenuated morphological and molecular changes in skeletal muscle of experimental allergic encephalomyelitis rats. J. Neurosci Res. 2012 Nov; 90 (11): 2134-45

5. Zhang ВТ, Yeung SS, Allen DG, Qin L, Yeung EW. Role of the calcium-calpain pathway in cytoskeletal damage after eccentric contractions. J. Appl Physiol. 2008 Jul; 105 (1): 352-75. Zhang VT, Yeung SS, Allen DG, Qin L, Yeung EW. Role of the calcium-calpain pathway in cytoskeletal damage after eccentric contractions. J. Appl Physiol. 2008 Jul; 105 (1): 352-7

6. Das A, Guyton MK, Smith A, Wallace G 4th, McDowell ML, Matzelle DD, Ray SK, Banik NL. Calpain inhibitor attenuated optic nerve damage in acute optic neuritis in rats. J Neurochem. 2013 Jan; 124 (1): 133-46.6. Das A, Guyton MK, Smith A, Wallace G 4th, McDowell ML, Matzelle DD, Ray SK, Banik NL. Calpain inhibitor attenuated optic nerve damage in acute optic neuritis in rats. J Neurochem. 2013 Jan; 124 (1): 133-46.

7. Zhang CM, Gao L, Zheng YJ, Yang HT. Berbamine protects the heart from ischemia/reperfusion injury by maintaining cytosolic Ca(2+) homeostasis and preventing calpain activation. Circ J. 2012; 76 (8): 1993-20027. Zhang CM, Gao L, Zheng YJ, Yang HT. Berbamine protects the heart from ischemia / reperfusion injury by maintaining cytosolic Ca (2+) homeostasis and preventing calpain activation. Circ J. 2012; 76 (8): 1993-2002

8. Ma XW, Li Q, Xu PT, Zhang L, Li H, Yu ZB. Tetanic contractions impair sarcomeric Z-disk of atrophic soleus muscle via calpain pathway. Mol Cell Biochem. 2011 Aug; 354(1-2): 171-80.8. Ma XW, Li Q, Xu PT, Zhang L, Li H, Yu ZB. Tetanic contractions impair sarcomeric Z-disk of atrophic soleus muscle via calpain pathway. Mol Cell Biochem. 2011 Aug; 354 (1-2): 171-80.

Claims

The use of calpain blocker PD150606 as a means to prevent and reduce the degradation of skeletal muscle proteins during their atrophy caused by hypokinesia and / or gravitational unloading.