RU2517112C2 - Method of cultivating mesenchymal stem cells, isolated from bone marrow - Google Patents
Method of cultivating mesenchymal stem cells, isolated from bone marrow Download PDFInfo
- Publication number
- RU2517112C2 RU2517112C2 RU2011128444/10A RU2011128444A RU2517112C2 RU 2517112 C2 RU2517112 C2 RU 2517112C2 RU 2011128444/10 A RU2011128444/10 A RU 2011128444/10A RU 2011128444 A RU2011128444 A RU 2011128444A RU 2517112 C2 RU2517112 C2 RU 2517112C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- stem cells
- mesenchymal stem
- growth medium
- vial
- Prior art date
Links
Abstract
Description
Способ культивирования мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга, относится к области медицины - трансфузиологии и к разделам биотехнологии.A method of culturing mesenchymal stem cells isolated from bone marrow relates to the field of medicine - transfusiology and to the sections of biotechnology.
Одним из перспективных направлений в медицине является использование стволовых клеток для замещения в организме поврежденных и изношенных клеток и тканей. Стволовые клетки можно получить из разных частей организма, в частности гемопоэтические стволовые клетки получают из пуповинной и плацентарной крови, мезенхимные стволовые клетки (МСК) получают из костного мозга, жировой ткани, фибробластов. Перспектива использования мезенхимных стволовых клеток состоит в том, чтобы при их трансплантации в организм человека задействовать не только аутологичные клетки, но и клетки аллогенные, расширив таким образом их изготовление и применение. Выделив путем эксфузии небольшое количество костного мозга ~0,5-1 мл, а из него мезенхимные стволовые клетки посредством культивации, можно добиться получения их на несколько порядков больше.One of the promising areas in medicine is the use of stem cells to replace damaged and worn cells and tissues in the body. Stem cells can be obtained from different parts of the body, in particular hematopoietic stem cells obtained from umbilical cord and placental blood, mesenchymal stem cells (MSCs) obtained from bone marrow, adipose tissue, fibroblasts. The prospect of using mesenchymal stem cells is to use not only autologous cells, but also allogeneic cells when transplanting them into the human body, thus expanding their manufacture and use. Having secreted by exfusion a small amount of bone marrow ~ 0.5-1 ml, and from it mesenchymal stem cells through cultivation, it is possible to obtain them several orders of magnitude more.
В медицине известны способы культивирования МСК из костного мозга, так, в статье авторов Шумаков В.И., Казаков Э.Н., Онищенко Н.А., Гуреев С.В., Остроумов Е.Н., Честухин В.В., Крашенников М.Е., Миронков Б.Л., Хубутия А.Ш. «Первый опыт клинического применения аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для сократительной функции миокарда» «Российский кардиологический журнал» №5(43) 2003 г. стр.42-50, описан способ их получения. При получении трансплантационного материала осуществляют забор аутологичных клеток костного мозга путем пункции гребня подвздошной кости больного в количестве 150-300 мл. Путем определенных технологических действий получают клеточный осадок, свободный от эритроидных и тромбоцитарных элементов, в количестве 350-1500×106. Затем эти клетки ресуспендировали в ростовой среде Iskov”s (Gibco, Grand Island), с добавками. Суспензию клеток высевали для культивирования в чашки Петри диаметром 150 мм в концентрации 2,5-3,0×106 кл/мл при 37°C в CO2 инкубаторе - атмосфере с 5% CO2 и 95% влажности на 2-е суток. В конце вторых суток в среду вносили 5-азацитидин до конечной концентрации 6 мкМ на 72 часа для направления дифференцировки стромальных МСК в кардиомиоцитоподобные и для ингибирования спонтанной дифференцировки их в по остеобластоидному направлению. Через 72 часа инкубации на 6-е сутки культивирования смешанная культура МСК использовалась для дальнейшего культивирования. Для этого культуральную среду полностью заменяли ростовой с добавлением к ней (инсулиноподобного фактора роста II, основного фактора роста фибробластов) тироксина и трийодтиронина. Среду заменяли через каждые три дня в течение 2-3 месяцев для наращивания значительной клеточной массы в зависимости от исходного пула стволовых клеток в аспирате больного. Затем пластик-адгезивные клетки снимались трипсином отмывались центрифугированием. Образовавшийся осадок ресуспендировали в растворе Хэнкса с добавками до конечной концентрации 10×106 кл/мл и хранился на льду до введения больному не более 8 часов.In medicine, methods for culturing MSCs from bone marrow are known, for example, in an article by authors Shumakov V.I., Kazakov E.N., Onishchenko N.A., Gureev S.V., Ostroumov E.N., Chestukhin V.V. , Krashennikov M.E., Mironkov B.L., Khubutia A.Sh. "The first experience of the clinical use of autologous mesenchymal bone marrow stem cells for contractile myocardial function""Russian Journal of Cardiology" No. 5 (43) 2003, pp. 42-50, describes a method for their preparation. Upon receipt of the transplant material, autologous bone marrow cells are sampled by puncture the iliac crest of the patient in an amount of 150-300 ml. By certain technological steps, a cell pellet free of erythroid and platelet elements is obtained in an amount of 350-1500 × 10 6 . Then these cells were resuspended in Iskov's growth medium (Gibco, Grand Island), with additives. The cell suspension was sown for cultivation in Petri dishes with a diameter of 150 mm at a concentration of 2.5-3.0 × 10 6 cells / ml at 37 ° C in a CO 2 incubator - atmosphere with 5% CO 2 and 95% humidity for 2 days . At the end of the second day, 5-azacytidine was introduced into the medium to a final concentration of 6 μM for 72 hours to direct the differentiation of stromal MSCs into cardiomyocyte-like ones and to inhibit their spontaneous differentiation in the osteoblastoid direction. After 72 hours of incubation on the 6th day of cultivation, a mixed MSC culture was used for further cultivation. For this, the culture medium was completely replaced by growth medium with the addition of (insulin-like growth factor II, the main fibroblast growth factor) thyroxine and triiodothyronine. The medium was replaced every three days for 2-3 months to build up a significant cell mass depending on the initial stem cell pool in the patient's aspirate. Then the plastic-adhesive cells were removed by trypsin and washed by centrifugation. The resulting precipitate was resuspended in a Hanks solution with additives to a final concentration of 10 × 10 6 cells / ml and stored on ice until the patient was administered for no more than 8 hours.
Недостатками такого способа культивирования являются: очень большой забор костного мозга (150-300 мл), за одну биопсию такое количество аутологичного костного мозга аспирировать травматично для пациента, при осуществлении нескольких эксфузий необходимо было указать, по какой порции костного мозга было взято, сколько раз проведена аспирация, с каким промежутком времени и как был восстановлен пациент, кроме того, в указанном способе отсутствует проверка костного мозга и полученных мезенхимных стволовых клеток на контаминацию, инфицирование, гистосовместимость, биологический посев, при проведении операций инфаркта миокарда (сердечной недостаточности, ишемии и т.д.) зачастую очень срочных, срок получения и культивирования - 3 месяца - очень длителен, данный способ является экспериментальным, пробным и осуществлен лабораторным путем, для более широкого применения способ не технологичен и занимает много времени.The disadvantages of this method of cultivation are: a very large collection of bone marrow (150-300 ml), for one biopsy, this amount of autologous bone marrow is traumatic for the patient to be aspirated, during several exfusions, it was necessary to indicate which portion of the bone marrow was taken, how many times aspiration, with what period of time and how the patient was restored, in addition, in this method there is no check of the bone marrow and the obtained mesenchymal stem cells for contamination, infection , histocompatibility, biological culture, during operations of myocardial infarction (heart failure, ischemia, etc.) are often very urgent, the period of receipt and cultivation of 3 months is very long, this method is experimental, trial and carried out in a laboratory way, for more The method is not widely used and takes a lot of time.
В качестве прототипа известно техническое решение «Способ культивирования мезенхимальных стволовых клеток человека ex vivo», п. РФ №2323252 от 25.10.2006 г, дата публикации 27.04.2008 г., C12N 5/08, заключающееся в выделении из костного мозга ядросодержащих клеток и осуществлении культивирования в ростовой среде, выполненной в виде минерально-солевого раствора, содержащего аминокислоты, антибиотики, L-глютамина и эмбриональную телячью сыворотку, либо в виде среды RPMI-1640 (“Sigma”, USA), содержащей пенициллин (100 ЕД/мл), стрептомицин (100 мкг/мл), амфотерицин (100 нг/мл), L - глютамин 2 мМ, 15% эмбриональной телячьей сыворотки, до получения заданного количества мезенхимальных стволовых клеток, в процессе каждого из которых высевают выделенные клетки в культуральные сосуды, в которых в ростовой среде увеличивают популяцию мезенхимальных стволовых клеток (МСК). Извлечение последних осуществляют 0,03-0,1%-ным раствором трипсина. В процессе каждого цикла культивирования регулярно определяют pH ростовой среды и заменяют ростовой средой, pH которой от 6,0 до 8,0. Перед и после обработки мезенхимальные стволовые клетки отмывают в изотоническом растворе от следов ростовой среды и трипсина.As a prototype, a technical solution is known “Method of cultivating human mesenchymal stem cells ex vivo”, clause of the Russian Federation No. 2323252 dated 10.25.2006, publication date 04/27/2008, C12N 5/08, consisting in the isolation of nucleated cells from the bone marrow and cultivation in a growth medium made in the form of a mineral salt solution containing amino acids, antibiotics, L-glutamine and fetal calf serum, or in the form of RPMI-1640 medium (Sigma, USA) containing penicillin (100 PIECES / ml) , streptomycin (100 μg / ml), amphotericin (100 ng / ml), L - glutamine 2 mM, 15% fetal calf serum, until a given number of mesenchymal stem cells is obtained, during each of which the selected cells are sown in culture vessels in which the population of mesenchymal stem cells (MSCs) is increased in the growth medium. Extraction of the latter is carried out by 0.03-0.1% trypsin solution. During each cultivation cycle, the pH of the growth medium is regularly determined and replaced with growth medium whose pH is from 6.0 to 8.0. Before and after treatment, mesenchymal stem cells are washed in isotonic solution from traces of growth medium and trypsin.
Недостатками вышеуказанного способа культивирования являются: при достижении монослоя популяции МСК наблюдается увеличение адгезии к культуральному сосуду и количество межклеточных контактов, что затрудняет процесс переноса клеток на новый культуральный сосуд. Также при достижении монослоя популяции МСК возникает явление контактного торможения, что отрицательно сказывается на пролиферативном потенциале клеток. Ростовые среды, используемые в способе, недостаточно эффективны и современны для получения МСК, что ведет к возможной потере МСК и не обеспечивает однородную популяцию, отсутствие определения иммунофенотипирования для получения сведений об ядросодержащих клетках, и в какой степени осуществлена однородность популяции МСК.The disadvantages of the above cultivation method are: upon reaching the monolayer of the MSC population, there is an increase in adhesion to the culture vessel and the number of intercellular contacts, which complicates the process of transferring cells to a new culture vessel. Also, when a monolayer of the MSC population is reached, the phenomenon of contact inhibition occurs, which negatively affects the proliferative potential of cells. The growth media used in the method are not efficient enough and up-to-date for obtaining MSCs, which leads to a possible loss of MSCs and does not provide a homogeneous population, the lack of immunophenotyping for obtaining information about nucleated cells, and to what degree the population of MSCs is homogeneous.
Техническим результатом предложенного решения является повышение эффективности выделения стволовых клеток посредством повышения однородности с использованием новой ростовой среды с добавлением к ней заменителя сыворотки, с определением популяции мезенхимных стволовых клеток, повышая экономичность и технологичность процесса выделения МСК из костного мозга.The technical result of the proposed solution is to increase the efficiency of stem cell isolation by increasing homogeneity using a new growth medium with the addition of a serum substitute to it, determining the population of mesenchymal stem cells, increasing the efficiency and manufacturability of the process of isolating MSCs from bone marrow.
Этот результат достигается тем, что в способе культивирования мезенхимных стволовых клеток, заключающемся в осуществлении увеличения мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга, в соответствующих флаконах в процессе культивирования их в ростовой среде не менее двух циклов с увеличивающим по площади дном до получения их до заданного количества в среде углекислого газа при температуре 37°C с промежуточным воздействием на полученные клетки раствором трипсина, при этом флакон с фракцией мезенхимных стволовых клеток в ростовой среде, выполненной в виде раствора, содержащего 45 мл культуральной среды Advanced Stem Cell Media с добавленными к ней 5 мл заменителя сыворотки Advanced Supplement for Stem Cells, 0,5 мл 100-кратного раствора глутамина, 1 мл или 0,5 мл раствора стрептомицина или гентамицина, устанавливают в CO2-инкубатор с экспозицией на 3 суток с прикреплением к пластику культурального флакона мезенхимных стволовых клеток, после двукратной промывки в ламинарном боксе содержимого флакона теплым с температурой 36-38°C фосфатным солевым буфером с удалением неприкрепившихся клеток, добавляют во флаконы ростовую среду и вновь вносят флакон с клетками и ростовой средой в CO2-инкубатор, последующее культивирование-субкультивирование проводят с периодом не чаще чем раз в 5 дней при достижении конфлюентности не более 90% со сменой культуральной среды не чаще чем раз в три дня, в ламинарном боксе, удалив из флакона кондиционную среду и двукратно промыв клетки раствором трипсина с ЭДТА, добавляют к клеткам 0,2-0,5 мл последний раствор с ЭДТА и выдерживают содержимое в течение 3 минут, при этом взяв каплю суспензии, содержащей мезенхимные стволовые клетки, считают их количество в камере Горяева, подсчитывая количество клеток в четырех больших квадратах в углах каждой из двух заштрихованных областей, затем разливают суспензию из предыдущего флакона, стряхивая клетки от подложки и отмывая оставшиеся клетки ростовой средой, в новый флакон, содержащий 10 мл ростовой среды с увеличенной площадью дна - 75 см2, и рассеивают клетки во флаконе в соотношении объемов 1 к 3-м или 1 к 4-м в зависимости от площади дна, и вновь для их роста устанавливают флаконы с ростовой средой и с клетками в CO2-инкубатор, после получения мезенхимных стволовых клеток в требуемом количестве до их выдачи проверяют кондиционную среду с клетками на наличие или отсутствие бактериальной контаминации, осуществив анализ на бактериальный посев и иммунофенотипирование с использованием проточного цитометра на наличие маркеров CD90, CD105, CD34, CD45, CD166 с определением количества жизнеспособных мезенхимных стволовых клеток и фиксированием результатов выделения мезенхимных стволовых клеток в паспорт на образец мезенхимных стволовых клеток.This result is achieved by the fact that in the method of culturing mesenchymal stem cells, which consists in increasing the mesenchymal stem cells isolated from the bone marrow in the corresponding bottles in the process of cultivating them in a growth medium for at least two cycles with a bottom increasing in area until they are obtained to the specified the amount in the environment of carbon dioxide at a temperature of 37 ° C with an intermediate exposure to the obtained cells with a trypsin solution, while a bottle with a fraction of mesenchymal stem cells in growth medium, in the form of a solution containing 45 ml of culture medium Advanced Stem Cell Media with added 5 ml of serum substitute Advanced Supplement for Stem Cells, 0.5 ml of 100-fold solution of glutamine, 1 ml or 0.5 ml of streptomycin solution or gentamicin, set in a CO 2 incubator with an exposure of 3 days with the mesenchymal stem cells attached to the plastic culture bottle, after washing the contents of the bottle twice in a laminar box with warm phosphate-buffered saline at 36-38 ° C to remove non-adherent cells, add the growth medium is added to the vials and the vial with cells and growth medium is again introduced into the CO 2 incubator; subsequent cultivation-subculture is carried out with a period of not more than once every 5 days when confluence reaches not more than 90% with a change of culture medium not more than once every three days, in a laminar box, removing the conditioned medium from the vial and washing the cells twice with trypsin solution with EDTA, add 0.2-0.5 ml of the last solution with EDTA to the cells and maintain the contents for 3 minutes, taking a drop of the suspension, containing mesenchymal stem cells, consider their number in Goryaev’s chamber, counting the number of cells in four large squares at the corners of each of the two shaded areas, then the suspension is poured from the previous vial, shaking the cells from the substrate and washing the remaining cells with growth medium into a new vial containing 10 ml of growth medium with an increased bottom area is 75 cm 2 , and the cells in the vial are scattered in a volume ratio of 1 to 3 or 1 to 4 depending on the bottom area, and again, vials with the growth medium and cells are set for their growth in a CO 2 incubator, after receiving the required quantity of mesenchymal stem cells in the required quantity, the conditioned medium with the cells is checked for the presence or absence of bacterial contamination prior to their delivery by analyzing bacterial culture and immunophenotyping using a flow cytometer for the presence of markers CD90, CD105, CD34, CD45 , CD166, determining the number of viable mesenchymal stem cells and recording the results of the isolation of mesenchymal stem cells in a passport for a sample of mesenchymal stem cells.
Сущность изобретения как технического решения выражается в совокупности существенных признаков, достаточной для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата.The invention as a technical solution is expressed in the aggregate of essential features sufficient to achieve the technical result provided by the invention.
Существенными признаками решения, совпадающими с признаками прототипа, являются: А - осуществление увеличения мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга, в соответствующих флаконах в процессе культивирования в ростовой среде не менее двух циклов с увеличивающим по площади дном до получения их до заданного количества в среде углекислого газа при температуре 37°C с промежуточным воздействием на полученные клетки раствором трипсина.The essential features of the solution, which coincide with the features of the prototype, are: A - the implementation of the increase in mesenchymal stem cells isolated from bone marrow in the corresponding bottles during cultivation in a growth medium for at least two cycles with a bottom increasing in area until they are obtained to a predetermined amount in the medium carbon dioxide at a temperature of 37 ° C with an intermediate effect on the obtained cells with a trypsin solution.
Существенными отличительными признаками изобретения являются: Б - флакон с фракцией мезенхимных стволовых клеток в ростовой среде, выполненной в виде раствора 45 мл культуральной среды Advanced Stem Cell Media с добавленными к ней 5 мл заменителя сыворотки Advanced Supplement for Stem Cells, 0,5 мл 100-кратного раствора глутамина, 1 мл или 0,5 мл раствора стрептомицина или гентамицина, устанавливают в CO2-инкубатора с экспозицией на 3 суток с прикреплением к пластику культурального флакона мезенхимные стволовые клетки; В - после двукратной промывки в ламинарном боксе содержимого флакона теплым с температурой 36-38°C фосфатным солевым буфером с удалением неприкрепившихся клеток, добавляют ростовую среду и вновь вносят флакон с клетками и ростовой средой в CO2-инкубатор; Г - последующее культивирование-субкультивирование проводят с периодом не чаще чем раз в 5 дней при достижении конфлюентности не более 90% со сменой ростовой среды не чаще чем раз в три дня; Д - в ламинарном боксе, удалив из флакона кондиционную среду и двукратно промыв клетки раствором трипсина 0,05% (1х) с ЭДТА, добавляют к клеткам 0,2-0,5 мл последний раствор трипсина с ЭДТА и выдерживают содержимое в течение 3-х минут; Е - взяв каплю суспензии, содержащей мезенхимные стволовые клетки, считают их количество в камере Горяева, подсчитывая количество клеток в четырех больших квадратах в углах каждой из двух заштрихованных областей; Ж - разливают суспензию из предыдущего флакона, стряхивая в нем клетки от подложки и отмывая оставшиеся клетки ростовой средой, в новый флакон, содержащий ростовую среду 10 мл с увеличенной площадью дна - 75 см2, рассеивают клетки в флаконе в соотношении объемов 1 к 3-м или 1 к 4-м в зависимости от площади дна культурального флакона, и вновь для их роста устанавливают флакон с ростовой средой и с клетками в CO2-инкубатор; И - после получения мезенхимных стволовых клеток в требуемом количестве до их выдачи проверяют кондиционную среду с клетками на наличие или отсутствие бактериальной контаминации, осуществив анализ на бактериальный посев и иммунофенотипирование с использованием проточного цитометра на наличие маркеров CD90, CD105, CD34, CD45, CD166 с определением количества жизнеспособных мезенхимных стволовых клеток и фиксированием результатов выделения мезенхимных стволовых клеток в паспорт на образец мезенхимных стволовых клеток.The salient features of the invention are: B - a bottle with a fraction of mesenchymal stem cells in a growth medium made in the form of a solution of 45 ml of Advanced Stem Cell Media culture medium with 5 ml of Advanced Supplement for Stem Cells serum substitute added, 0.5 ml of 100- multiple glutamine solution, 1 ml or 0.5 ml of streptomycin or gentamicin solution, set in a CO 2 incubator with exposure for 3 days with attachment of mesenchymal stem cells to the plastic of the culture bottle; C - after washing the contents of the vial twice with a phosphate-buffered saline with a temperature of 36-38 ° C in a laminar box and removing non-adherent cells, add growth medium and re-introduce the vial with cells and growth medium into a CO 2 incubator; G - subsequent cultivation-subculture is carried out with a period of not more than once every 5 days when confluence is not more than 90% with a change in growth medium not more than once every three days; D - in a laminar box, removing the conditioned medium from the vial and washing the cells twice with trypsin solution 0.05% (1x) with EDTA, add the last solution of trypsin with EDTA to the cells 0.2-0.5 ml and keep the contents for 3- x minutes; E - taking a drop of a suspension containing mesenchymal stem cells, consider their number in the Goryaev chamber, counting the number of cells in four large squares at the corners of each of the two shaded areas; G - the suspension is poured from the previous vial, shaking the cells from the substrate in it and washing the remaining cells with growth medium into a new bottle containing 10 ml of growth medium with an increased bottom area of 75 cm 2 , the cells are dispersed in the vial in a volume ratio of 1 to 3- m or 1 to 4, depending on the bottom area of the culture vial, and again for their growth, a vial with growth medium and cells is placed in a CO 2 incubator; And - after receiving the mesenchymal stem cells in the required quantity, before issuing them, the conditioned medium with the cells is checked for the presence or absence of bacterial contamination, by analysis for bacterial culture and immunophenotyping using a flow cytometer for the presence of markers CD90, CD105, CD34, CD45, CD166 with determination the number of viable mesenchymal stem cells and recording the results of the isolation of mesenchymal stem cells in a passport for a sample of mesenchymal stem cells.
Способ культивирования мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга, заключается в следующем. После выделения из костного мозга лейкоцитарного концентрата на фиколе, приготовления ростовой среды, в которой растут клетки, выполненной в виде раствора, содержащего 45 мл культуральной среды Advanced Stem Cell Vedia с добавленными к ней 5 мл заменителя сыворотки Advanced Supplement for Stem Cells, 0,5 мл 100-кратного раствора глутамина, 1 мл или 0,5 мл раствора стрептомицина или гентамицина, и центрифугирования выделяют чистые лейкоциты (ядросодержащие клетки). После соединения последних с чистой культуральной ростовой средой, центрифугирования и слива супернатанта, добавляют ростовую среду и переносят полученную суспензию с мезенхимальными стволовыми клетками на 1-2 флакона с площадью дна 25 см2. Устанавливают флаконы с клетками в ростовой среде в CO2-инкубатор IBBD 6220 (Thermo, Германия) с экспозицией на 3 суток для прикрепления за это время фракции мезенхимных стволовых клеток к пластику. Через 5 суток переносят флаконы из инкубатора в ламинарный бокс “GL-170 Biowizard GoldenLine (Kojair, Finland), промывают 2 раза содержимое флакона 2 мл теплым с температурой 36-38°C фосфатным солевым буфером с удалением неприкрепившихся мезенхимных стволовых клеток. Добавляют новую ростовую среду и вновь устанавливают флакон с клетками в ростовой среде в CO2-инкубатор. Последующее культивирование-субкультивирование проводят не чаще чем раз в 5 дней при достижении конфлюентности не более 90% со сменой ростовой среды не чаще чем раз в 3 дня. В ламинарном боксе, удалив из флакона кондиционную среду (отработанную) серологической пипеткой, двукратно по 2 мл промывают клетки раствором трипсина 0,05% (1х) в ЭДТА. Добавляют к промытым мезенхимным стволовым клеткам 0,2-0,5 мл раствора приготовленного трипсина с ЭДТА и выдерживают содержимое в течение 3-х минут. Вносят в новые флаконы с площадью дна 25 см2 по 5 мл ростовой среды, а во флаконы с площадью дна 75 см2 по 10 мл ростовой среды. Аккуратно стучат по стенке флакона, открепляя (стряхивая) клетки от подложки. Смывают оставшиеся клетки 1,5-1,8 мл ростовой средой и снова пипетируют. Количество клеток в суспензии, т.е. в ростовой среде, считают в камере Горяева. Каплю суспензии, содержащей мезенхимные стволовые клетки, вносят в камеру Горяева и подсчитывают количество клеток в четырех больших квадратах в углах каждой из двух заштрихованных областей. Считают клетки, касающиеся правой и верхней ограничивающих линий, но не клетки, касающиеся левой и нижней ограничивающих линий. Разливают полученную суспензию из предыдущего флакона в новый флакон с ростовой средой. Рассеивают клетки в соотношении объемов 1 к 3-м или 1 к 4-м в зависимости от площади дна культурального флакона. Затем вновь ставят флакон с мезенхимными стволовыми клетками в ростовой среде в CO2-инкубатор, продезинфицировав рабочие наружные поверхности флакона 70% спиртом и освещением его УФ светом в течение 15 минут. После получения мезенхимных стволовых клеток в требуемом количестве до их выдачи проверяют кондиционную среду с клетками на наличие или отсутствие бактериальной контаминации. Кондиционную среду выделяют в отдельный стерильный флакон, откуда переносят ее стерильным шприцем в сосуд для проверки на бактериальный посев. Кроме того, проводят иммунофенотипирование клеток, используя проточный цитометр FC500 (Becman Coulter, USA), на наличие маркеров CD90, CD105, CD34, CD45, CD166 с определением количества жизнеспособных мезенхимных стволовых клеток с использованием для подсчета камеры Горяева. Все результаты культивирования на образец мезенхимных стволовых клеток заносят в соответствующий паспорт.A method for culturing mesenchymal stem cells isolated from bone marrow is as follows. After isolation of leukocyte concentrate on ficol from the bone marrow, preparation of the growth medium in which the cells grow is made in the form of a solution containing 45 ml of Advanced Stem Cell Vedia culture medium with 5 ml of serum substitute Advanced Supplement for Stem Cells, 0.5 added ml of a 100-fold solution of glutamine, 1 ml or 0.5 ml of streptomycin or gentamicin solution, and centrifugation emit pure leukocytes (nucleated cells). After connecting the latter with pure culture growth medium, centrifugation and draining the supernatant growth medium was added and the resulting suspension was transferred with mesenchymal stem cells for 1-2 vial with bottom area of 25 cm 2. Vials with cells are placed in a growth medium in a CO 2 incubator IBBD 6220 (Thermo, Germany) with an exposure of 3 days to attach the fractions of mesenchymal stem cells to the plastic during this time. After 5 days, transfer the vials from the incubator to the GL-170 Biowizard GoldenLine laminar box (Kojair, Finland), wash the contents of the vial 2 times with 2 ml of warm phosphate-buffered saline at 36-38 ° C to remove non-adherent mesenchymal stem cells. A new growth medium is added and a vial of cells in the growth medium is reinstalled in a CO 2 incubator. Subsequent cultivation-subculture is carried out no more than once every 5 days when confluence is reached no more than 90% with a change in growth medium no more than once every 3 days. In a laminar box, removing the conditioned medium (spent) from the vial with a serological pipette, the cells are washed twice with 2 ml of a trypsin solution of 0.05% (1x) in EDTA. Add to the washed mesenchymal stem cells 0.2-0.5 ml of a solution of prepared trypsin with EDTA and maintain the contents for 3 minutes. Contribute to new bottles with a bottom area of 25 cm 2 in 5 ml of growth medium, and in bottles with a bottom area of 75 cm 2 in 10 ml of growth medium. Gently tap on the wall of the vial, detaching (shaking) cells from the substrate. The remaining cells are washed off with 1.5-1.8 ml of growth medium and pipetted again. The number of cells in suspension, i.e. in a growth medium, they believe in the camera Goryaeva. A drop of a suspension containing mesenchymal stem cells is introduced into the Goryaev chamber and the number of cells in four large squares at the corners of each of the two shaded areas is counted. Count cells touching the right and upper bounding lines, but not cells touching the left and lower bounding lines. The resulting suspension is poured from the previous vial into a new vial with growth medium. Cells are scattered in a ratio of 1 to 3 or 1 to 4 volumes, depending on the bottom area of the culture vial. Then again put the bottle with mesenchymal stem cells in the growth medium in a CO 2 incubator, disinfecting the working outer surfaces of the bottle with 70% alcohol and illuminating it with UV light for 15 minutes. After receiving the mesenchymal stem cells in the required quantity, the conditioned medium with the cells is checked for the presence or absence of bacterial contamination prior to their delivery. The conditioned medium is isolated in a separate sterile vial, from where it is transferred with a sterile syringe into a vessel to check for bacterial culture. In addition, immunophenotyping of cells is carried out using an FC500 flow cytometer (Becman Coulter, USA) for the presence of markers CD90, CD105, CD34, CD45, CD166 with the determination of the number of viable mesenchymal stem cells using a Goryaev camera for counting. All results of cultivation on a sample of mesenchymal stem cells are entered in the appropriate passport.
Использование изобретения «Способ культивирования мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга» по сравнению с прототипом повышает качество выделения мезенхимных стволовых клеток, на каждом пассаже выделения конфлюентность достигает 85-90%, используются современные реагенты в основном из Германии (Hy Clone, Gibco), позволяющие получить более качественную, экономичную и эффективную ростовую среду, позволяющую сократить время роста и получить более однородную популяцию мезенхимных стволовых клеток. В предлагаемом способе проводят иммунофенотипирование с использованием маркеров CD90, CD105, CD34, CD45, CD166, что повышает и эффективность конечного определения мезенхимных клеток и надежность и качество фиксации однородности при определении популяции мезенхимных стволовых клеток В предложенном способе выделения и культивирования мезенхимных стволовых клеток из костного мозга используется современное технологичное оборудование из США, Германии, Финляндии, Японии, и проводится выделение и культивирование стволовых клеток в производственном масштабе на предприятии ООО «Покровский банк стволовых клеток» с участием Медицинской Академии постдипломного образования в г. Санкт-Петербурге с фиксацией результатов выделения мезенхимальных стволовых клеток в паспорте на данный образец.Using the invention, “A method for culturing mesenchymal stem cells isolated from bone marrow” compared with the prototype improves the quality of the selection of mesenchymal stem cells, confluency reaches 85-90% at each passage of isolation, modern reagents are used mainly from Germany (Hy Clone, Gibco), allowing to obtain a better, economical and efficient growth medium, which allows to shorten the growth time and get a more homogeneous population of mesenchymal stem cells. In the proposed method, immunophenotyping is performed using markers CD90, CD105, CD34, CD45, CD166, which increases the efficiency of the final determination of mesenchymal cells and the reliability and quality of fixation of homogeneity in determining the population of mesenchymal stem cells in the proposed method for the isolation and cultivation of mesenchymal stem cells from bone marrow modern technological equipment from the USA, Germany, Finland, Japan is used, and stem cells are isolated and cultured in the production scale at the enterprise Pokrovsky stem cell bank LLC with the participation of the Medical Academy of Postgraduate Education in St. Petersburg with fixing the results of the allocation of mesenchymal stem cells in the passport for this sample.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011128444/10A RU2517112C2 (en) | 2011-07-08 | 2011-07-08 | Method of cultivating mesenchymal stem cells, isolated from bone marrow |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011128444/10A RU2517112C2 (en) | 2011-07-08 | 2011-07-08 | Method of cultivating mesenchymal stem cells, isolated from bone marrow |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2011128444A RU2011128444A (en) | 2013-01-20 |
| RU2517112C2 true RU2517112C2 (en) | 2014-05-27 |
Family
ID=48805008
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011128444/10A RU2517112C2 (en) | 2011-07-08 | 2011-07-08 | Method of cultivating mesenchymal stem cells, isolated from bone marrow |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2517112C2 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2722173C1 (en) * | 2019-06-18 | 2020-05-28 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Method for predicting growth rate of culture by amount of aldehyde dehydrogenase-positive bone marrow mesenchymal cells of donors |
| RU2751239C2 (en) * | 2016-03-10 | 2021-07-12 | Кинтароселлспауэр Ко., Лтд. | Method for producing liquid culture product |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2375448C2 (en) * | 2004-03-23 | 2009-12-10 | Асубио Фарма Ко., Лтд. | Method of cultivation pluripotential stem cells |
-
2011
- 2011-07-08 RU RU2011128444/10A patent/RU2517112C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2375448C2 (en) * | 2004-03-23 | 2009-12-10 | Асубио Фарма Ко., Лтд. | Method of cultivation pluripotential stem cells |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2751239C2 (en) * | 2016-03-10 | 2021-07-12 | Кинтароселлспауэр Ко., Лтд. | Method for producing liquid culture product |
| RU2722173C1 (en) * | 2019-06-18 | 2020-05-28 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Method for predicting growth rate of culture by amount of aldehyde dehydrogenase-positive bone marrow mesenchymal cells of donors |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2011128444A (en) | 2013-01-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103805562B (en) | Cultivate the serum free medium of placenta mesenchyma stem cell | |
| CN102002475B (en) | Method for obtaining fat adult stem cells of human and method for establishing stem cell library | |
| CN101400786A (en) | Enrichment of cells | |
| JP5678360B2 (en) | Method for culturing mesenchymal stem cells | |
| CN106465710B (en) | Adipose tissue cryopreservation liquid and adipose tissue cryopreservation method | |
| CN107075476B (en) | Method for inducing three-dimensional osteogenic differentiation of stem cells using hydrogel | |
| CN108315297B (en) | Method for separating and purifying adipose-derived stem cells from adipose tissues | |
| CN104651305A (en) | Method for acquiring bioactive proteins by utilizing umbilical cord mesenchymal stem cells | |
| US20210301258A1 (en) | Method for Producing Dental Pulp-Derived Cells | |
| CN106318906A (en) | Method for large-scale culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells | |
| CN105850979A (en) | Cryoprotective solution and cryopreservation method for bone mesenchymal stem cells | |
| JP2021526125A (en) | How to Induce or Improve Wound Healing Properties of Mesenchymal Stem Cells | |
| KR101380561B1 (en) | Equine Amniotic Fluid-Derived Multipotent Stem Cells and Method for Producing the Same | |
| Shi et al. | The effect of extended passaging on the phenotype and osteogenic potential of human umbilical cord mesenchymal stem cells | |
| CN104694470A (en) | Serum-free medium for stem cells | |
| RU2517112C2 (en) | Method of cultivating mesenchymal stem cells, isolated from bone marrow | |
| CN104419659A (en) | Cultivation and mass-production method of adipose-derived stem cells and stem cell secretion of adipose-derived stem cells | |
| CN110055214B (en) | Application of ginsenoside in promoting in-vitro proliferation of umbilical cord mesenchymal stem cells | |
| CN106591230A (en) | Human umbilical cord mesenchymal stem cell culture solution and culture method thereof | |
| CN101407790A (en) | Processing method for enhancing human medulla ossium mesenchyma stem cell paracrine ability | |
| CN115838685A (en) | Culture medium and culture method of bone marrow mesenchymal stem cells derived from leukemia patient | |
| CN101186899A (en) | Method applied for tumour cell and stem cell co-culture | |
| Smith et al. | Isolation of CD31+ Bone Marrow Endothelial Cells (BMECs) from Mice | |
| Abou Nader et al. | Culture, expansion and differentiation of mouse bone-derived mesenchymal stromal cells | |
| US20210180018A1 (en) | Composition for promoting stem cell differentiation, comprising progenitor cell culture solution and multilayer graphene film, and use thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20130709 |