RU2509807C1 - Method of detecting o-glycosylated proteins in cell homogenates prepared for proteomic and phosphoproteomic analysis - Google Patents
Method of detecting o-glycosylated proteins in cell homogenates prepared for proteomic and phosphoproteomic analysis Download PDFInfo
- Publication number
- RU2509807C1 RU2509807C1 RU2012147255/10A RU2012147255A RU2509807C1 RU 2509807 C1 RU2509807 C1 RU 2509807C1 RU 2012147255/10 A RU2012147255/10 A RU 2012147255/10A RU 2012147255 A RU2012147255 A RU 2012147255A RU 2509807 C1 RU2509807 C1 RU 2509807C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- analysis
- proteomic
- homogenates
- proteins
- phosphoproteomic
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретение: Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к разработке способа подготовки клеточного материала для проведения протеомного и фосфопротеомного анализа с использованием J-агрегатов.The technical field to which the invention relates: The invention relates to the field of biotechnology, in particular to the development of a method for preparing cellular material for proteomic and phosphoproteomic analysis using J-aggregates.
Уровень техники: В настоящее время для молекулярного изучения протеома клетки активно используются протеомные и фосфопротеомные технологии, благодаря которым становится возможным оценить статус сигнального пути клетки, в том числе подвергшейся действию вирусной инфекции, и идентифицировать сигнальные белки, задействованные в ответе на любую вирусную инфекцию вне зависимости от таксономической принадлежности вируса. Такие белки являются наиболее перспективной клеточной мишенью для разработки средств антивирусной терапии, однако для проведения анализа методами протеомики и фосфопротеомики необходима отработка методик предобработки клеточных гомогенатов, применяемых для данного анализа.BACKGROUND OF THE INVENTION At present, proteomic and phosphoproteomic technologies are actively used for molecular study of a cell proteome, due to which it becomes possible to assess the status of the signaling pathway of a cell, including one exposed to a viral infection, and to identify signaling proteins involved in the response to any viral infection, regardless from the taxonomic affiliation of the virus. Such proteins are the most promising cellular target for the development of antiviral therapy, but for analysis using proteomics and phosphoproteomics, it is necessary to develop methods for the pretreatment of cellular homogenates used for this analysis.
Как известно, N- и O-связанные олигосахариды являются основными структурными компонентами многих белков, при этом разнообразие олигосахаридных структур, а именно изменение структуры и разная степень насыщенности сайтов гликозилирования в гликопротеине вносят свой вклад в неоднородность по массе, что обуславливает существенные трудности при анализе белков с использованием различных протеомных и фосфопротеомных методов. Поскольку O-связанные олигосахариды обычно меньше по массе, чем N-связанные гликаны, но при этом являются более многочисленными и более гетерогенными по структуре, подготовка биологического материала к протеомному и фосфопротеомному анализу должна включать дегликозилирование O-гликопротеинов. Методы дегликозилирования можно разделить на две группы: ферментативные и химические. Для ферментативного дегликозилирования используют эндо- и экзогликозидазы, которые гидролизуют O-гликозидную связь между моносахаридными остатками олигосахаридов, а также способны расщеплять связь между углеводной частью и серином/треонином белковой части молекулы. В отличие от дегликозилирования N-гликопротеинов, которое проводят с использованием определенной N-гликаназы, и при этом реакция проходит полностью, в случае O-гликозидной связи олигосахаридная цепь может быть удалена только смесью гликозидаз, каждая из которых характеризуется узкой специфичностью. Подобный метод используется в наборе «prO-LINK Extender™ Kit for Complex O-Linked Glycans» фирмы ProZyme Inc., США (http://www.prozyme.com). Также существуют наборы ферментов для одновременного дегликозилирования N- и O-связанных гликопротеинов: набор «GlycoPro™ Enzymatic Deglycosylation Kit for N-Linked & Simple O-Linked Glycans», фирмы ProZyme Inc., США и набор «Enzymatic Protein Deglycosylation Kit» фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC, США (http://www.sigmaaldrich.com). В патенте US 20060269980 предлагается протокол ферментативного дегликозилирования N- и O-связанных с олигосахаридами гликопротеинов с использованием набора гликозидаз (ПНГаза F, Эндо H, Эндо F, O-гликозидазы и нейраминидазы) с последующей детекцией продуктов гидролиза масс-спектрометрическими методами, в том числе методом SELDI масс-спектрометрии на аффинных чипах [1].As is known, N- and O-linked oligosaccharides are the main structural components of many proteins, while the diversity of oligosaccharide structures, namely, structural changes and different degrees of saturation of glycosylation sites in the glycoprotein, contribute to mass heterogeneity, which leads to significant difficulties in the analysis of proteins using various proteomic and phosphoproteomic methods. Since O-linked oligosaccharides are usually smaller in mass than N-linked glycans, but are more numerous and more heterogeneous in structure, the preparation of biological material for proteomic and phosphoprotein analysis should include deglycosylation of O-glycoproteins. Deglycosylation methods can be divided into two groups: enzymatic and chemical. For enzymatic deglycosylation, endo- and exoglycosidases are used, which hydrolyze the O-glycosidic bond between the monosaccharide residues of the oligosaccharides and are also capable of cleaving the bond between the carbohydrate moiety and the serine / threonine of the protein moiety. In contrast to the deglycosylation of N-glycoproteins, which is carried out using a specific N-glycanase, and the reaction proceeds completely, in the case of an O-glycosidic link, the oligosaccharide chain can only be removed with a mixture of glycosidases, each of which is characterized by a narrow specificity. A similar method is used in the prO-LINK Extender ™ Kit for Complex O-Linked Glycans by ProZyme Inc., USA (http://www.prozyme.com). There are also enzyme kits for the simultaneous deglycosylation of N- and O-linked glycoproteins: the GlycoPro ™ Enzymatic Deglycosylation Kit for N-Linked & Simple O-Linked Glycans by ProZyme Inc., USA and the Sigma Enzymatic Protein Deglycosylation Kit -Aldrich Co. LLC, USA (http://www.sigmaaldrich.com). US20060269980 proposes a protocol for enzymatic deglycosylation of N- and O-linked glycoprotein oligosaccharides using a set of glycosidases (PNgase F, Endo H, Endo F, O-glycosidase and neuraminidase) followed by detection of hydrolysis products by mass spectrometric methods, including mass spectrometric methods by the method of SELDI affinity mass spectrometry [1].
В патенте US 20100190146 для проведения дегликозилирования N- и O-связанных гликопротеинов и последующего анализа профиля отщепленных гликаганов предлагается микрофлюидный прибор. В конструктив прибора входит дегликозилирующая колонка с твердой фазой на инертном носителе, к которой присоединены дегликозилирующие ферменты для специфичного удаления олигосахаридов с поверхности гликопротеинов. Оценка прохождения реакции и идентификация продуктов дегликозилирования возможна с использованием методов масс-спектрометрии и белковых микрочипов [2].In patent US 20100190146 for microfluidic device for deglycosylation of N- and O-linked glycoproteins and subsequent analysis of the profile of cleaved glycagans. The instrument construct includes a solid phase deglycosylating column on an inert carrier, to which deglycosylating enzymes are attached to specifically remove oligosaccharides from the surface of glycoproteins. Evaluation of the progress of the reaction and identification of deglycosylation products is possible using mass spectrometry methods and protein microarrays [2].
Основными достоинствами ферментативных методов являются более мягкие условия и отсутствие неспецифических побочных реакций. К недостаткам данной группы методов можно отнести высокую стоимость анализа, необходимость соблюдения строгих условий хранения набора, возможность получения низкого выхода желаемых продуктов из-за стерических затруднений, а также трудоемкость идентификации дегликозилированных белков ввиду полного отщепления олигосахаридных цепей от гликопротеинов.The main advantages of enzymatic methods are milder conditions and the absence of non-specific adverse reactions. The disadvantages of this group of methods include the high cost of analysis, the need to observe strict storage conditions for the kit, the possibility of obtaining a low yield of the desired products due to steric difficulties, and the complexity of identifying deglycosylated proteins due to the complete cleavage of the oligosaccharide chains from glycoproteins.
Для химического дегликозилирования гликопротеинов используют модифицированный метод периодатного окисления, β-элиминирование, а также методы с безводной трифторметансульфокислотой (TFMS) и безводным гидразином. При периодатном окислении происходит разрыв C-C связи в гликолях с образованием альдегидных групп. Существуют две модификации периодатного окисления: метод Смита (заключается в восстановлении окисленного олигосахарида боргидридом натрия с последующим гидролизом полученного полиола; возможно проведение ступенчатой деградации олигосахарида) и метод Бэрри (заключается в избирательном расщеплении окисленного олигосахарида под действием фенилгидразина; происходит расщепление как ацетальных, так и гликозидных связей). К преимуществам периодатного окисления можно отнести количественное расщепление гликольных группировок и протекание реакций в микрообъемах, тогда как к недостаткам - окисление некоторых аминокислот, что создает дополнительные сложности для дальнейшего анализа свойств белка [3].For the chemical deglycosylation of glycoproteins, a modified method of periodic oxidation, β-elimination, as well as methods with anhydrous trifluoromethanesulfonic acid (TFMS) and anhydrous hydrazine are used. During periodic oxidation, the C-C bond in glycols breaks with the formation of aldehyde groups. There are two modifications of periodic oxidation: the Smith method (consists in the reduction of the oxidized oligosaccharide with sodium borohydride followed by hydrolysis of the obtained polyol; it is possible to carry out stepwise degradation of the oligosaccharide) and the Barry method (consists in the selective cleavage of the oxidized oligosaccharide under the action of phenylhydrazine; cleavage occurs as acetal connections). The advantages of periodical oxidation include the quantitative splitting of glycol groups and the occurrence of reactions in microvolumes, while the disadvantages are the oxidation of certain amino acids, which creates additional difficulties for further analysis of the properties of the protein [3].
Гидразинолиз гликопротеинов, несмотря на возможность одновременного удаления N- и O-связанных олигосахаридов, приводит к полной деградации белковой части ввиду неселективной атаки амидных связей гидразином и образования гидразидов соответствующих аминокислот, и поэтому неприменим в тех случаях, когда требуется сохранение структуры белка для проведения дальнейшего анализа. Подобный метод используется в наборе «GlycoRelease™ Glycan Hydrazinolysis Kit» фирмы ProZyme Inc., США.Hydrazinolysis of glycoproteins, despite the possibility of simultaneous removal of N- and O-linked oligosaccharides, leads to complete degradation of the protein part due to the non-selective attack of amide bonds by hydrazine and the formation of hydrazides of the corresponding amino acids, and therefore is not applicable in cases where the preservation of the protein structure is required for further analysis . A similar method is used in the GlycoRelease ™ Glycan Hydrazinolysis Kit by ProZyme Inc., USA.
Метод с использованием трифторметансульфоновой кислоты (TFMS) в смеси с анизолом позволяет неспецифически разрушать N- и O-связанные олигосахариды гликопротеинов без заметной деградации белковой компоненты. Тем не менее даже в оптимизированном варианте метод с TFMS является очень трудоемким, и при этом приводит к неполному удалению сахара: могут оставаться связанные с гликопротеином моносахариды, для удаления которых требуется раскрытие пиранозного кольца посредством обработки периодатом натрия и повторное проведение реакции с TFMS или β-элиминирования для получения полностью дегликозилированного гликопротеина [4]. Подобный метод используется в наборах «GlycoFree™ Chemical Deglycosylation Kit» фирмы ProZyme Inc., США и «GlycoProfile™ IV Chemical Deglycosylation Kit TFMS Deglycosylation System» фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC, США.The method using trifluoromethanesulfonic acid (TFMS) mixed with anisole allows non-specific destruction of N- and O-linked glycoprotein oligosaccharides without noticeable degradation of the protein component. Nevertheless, even in the optimized version, the method with TFMS is very laborious, and at the same time leads to incomplete removal of sugar: monosaccharides associated with the glycoprotein may remain, the removal of which requires the opening of the pyranose ring by treatment with sodium periodate and a second reaction with TFMS or β- elimination to obtain a fully deglycosylated glycoprotein [4]. A similar method is used in the GlycoFree ™ Chemical Deglycosylation Kit from ProZyme Inc., USA and the GlycoProfile ™ IV Chemical Deglycosylation Kit TFMS Deglycosylation System from Sigma-Aldrich Co. LLC, USA.
Дегликозилирование по механизму β-элиминирования посредством обработки гликопротеинов в мягких щелочных условиях позволяет проводить преимущественное разрушение O-связанных олигосахаридов, а именно отщеплять O-гликаны в виде олигозилальдитолов. Проведение реакции β-элиминирования в присутствии восстанавливающего агента позволяет избежать деградации щелочелабильных связей, что делает данный метод практически без недостатков. Подобный метод используется в наборе «GlycoProfile™ β-Elimination Kit» фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC, США.Deglycosylation by the β-elimination mechanism by treating glycoproteins under mild alkaline conditions allows preferential destruction of O-linked oligosaccharides, namely, cleavage of O-glycans in the form of oligosyl alditols. The reaction of β-elimination in the presence of a reducing agent avoids the degradation of alkali-labile bonds, which makes this method practically without drawbacks. A similar method is used in the Sigma-Aldrich Co. GlycoProfile ™ β-Elimination Kit. LLC, USA.
После проведения дегликозилирования необходимо определить паттерн белков, в том числе выяснить, какие из этих белков были первично гликозилированы, поскольку подобная информация позволит более полно охарактеризовать изучаемый объект. В зависимости от выбранного метода дегликозилирования возможны различные варианты идентификации паттерна дегликозилированных и изначально негликозилированных белков. Так, например, после окисления периодатом натрия происходит раскрытие пиранозного кольца, связанного с гликопротеином моносахарида, и образуются альдегидные группы, которые можно идентифицировать фотоколориметрически методом, основанным на восстановлении хлорида 2,3,5-трифенилтетразолия альдегидными группами с образованием красного красителя формазана. Интенсивность окраски полученного раствора определяют на фотоэлектрическом колориметре с зеленым светофильтром либо на спектрофотометре при длине волны 546 нм. Метод позволяет определить суммарное количество гликопротеинов, подвергшихся окислению периодатом натрия, посредством оценки содержания альдегидных групп по градуировочному графику с использованием контрольных растворов гликопротеинов. Подобный метод детекции используется в наборе (Glycoprotein Carbohydrate Estimation Kit» фирмы Thermo Fisher Scientific Inc., США (http://www.thermoscientific.com)). К преимуществам данного метода можно отнести достаточно точные и хорошо воспроизводимые результаты и возможность определения малых количеств альдегидных групп, при этом основным недостатком является возможность определения степени дегликозилирования только в целом, а не применительно к каждому конкретному белку.After deglycosylation, it is necessary to determine the pattern of proteins, including finding out which of these proteins were primarily glycosylated, since such information will more fully characterize the studied object. Depending on the chosen deglycosylation method, various variants of identification of the pattern of deglycosylated and initially non-glycosylated proteins are possible. So, for example, after oxidation with sodium periodate, the pyranose ring associated with the monosaccharide glycoprotein opens and aldehyde groups are formed, which can be identified by photocolorimetry using the reduction of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride with aldehyde groups to form a red dye formazan. The color intensity of the resulting solution is determined on a photoelectric colorimeter with a green filter or on a spectrophotometer at a wavelength of 546 nm. The method allows you to determine the total number of glycoproteins oxidized with sodium periodate by assessing the content of aldehyde groups according to the calibration graph using control solutions of glycoproteins. A similar detection method is used in the kit (Glycoprotein Carbohydrate Estimation Kit, Thermo Fisher Scientific Inc., USA (http://www.thermoscientific.com)). The advantages of this method include fairly accurate and well reproducible results and the ability to determine small amounts of aldehyde groups, while the main disadvantage is the ability to determine the degree of deglycosylation only in general, and not with respect to each specific protein.
Для визуализации паттерна частично дегликозилированных гликопротеинов с моносахаридными остатками распространены реакции с флуоресцентно мечеными производными аминов, гидразина и гидроксиламина в присутствии восстановителя. Среди наиболее широко используемых реагентов можно выделить дансилгидразин и дансилэтилендиамин [5], различные гидразиды биотина [6], а также различные ароматические амины (например, 2-аминопиридин [7]).To visualize the pattern of partially deglycosylated glycoproteins with monosaccharide residues, reactions with fluorescently labeled derivatives of amines, hydrazine and hydroxylamine in the presence of a reducing agent are common. Among the most widely used reagents are dansilhydrazine and dansylethylenediamine [5], various biotin hydrazides [6], and various aromatic amines (for example, 2-aminopyridine [7]).
В заявке на патент WO 0228841 также предложен новый ряд модифицирующих красителей для флуоресцентного маркирования биомолекул, содержащих функциональные альдегидные группы, которые, в том числе, подходят для флуоресцентного мечения альдегидов, образовавшихся после окисления периодатом натрия моносахаридных остатков гликопротеинов [8].WO 0228841 also proposes a new series of modifying dyes for fluorescent labeling of biomolecules containing functional aldehyde groups, which are also suitable for fluorescence labeling of aldehydes formed after sodium period oxidation of monosaccharide glycoprotein residues [8].
После проведения реакции образовавшийся аддукт стабилизируют посредством обработки боргидридом или цианоборгидридом натрия и далее методами разделительной хроматографии, электрофореза или преципитации проводят прямую или опосредованную детекцию меченых продуктов [9]. В случае биотин-пероксидазного метода детекцию проводят после иммобилизации на нитроцеллюлозной мембране путем проявления биотинилированных моносахаридных остатков гликопротеинов в системе стрептавидин-щелочная фосфатаза.After the reaction, the formed adduct is stabilized by treatment with sodium borohydride or sodium cyanoborohydride, and then direct or indirect detection of labeled products is carried out by separation chromatography, electrophoresis, or precipitation [9]. In the case of the biotin-peroxidase method, detection is carried out after immobilization on a nitrocellulose membrane by the manifestation of biotinylated monosaccharide glycoprotein residues in the streptavidin-alkaline phosphatase system.
После проведения дегликозилирования по механизму β-элиминирования олигосахарид отщепляется от белкового компонента вместе с водородом углеродного атома серина/треонина, что также позволяет проводить дальнейшую модификацию для идентификации паттерна дегликозилированных гликопротеинов. Для маркирования дегликозилированных подобным образом гликопротеинов чаще всего используют дитиотреитол (DTT) и биотин пентиламин (BAP), электрофильное присоединение которых происходит по двойной связи, при этом образуется ковалентная связь между протоном и одним из атомов углерода двойной связи [10]. В случае обработки дегликозилированного гликопротеина DTT образуются стабильные сульфидные аддукты, которые могут быть идентифицированы методами масс-спектрометрии [11]. В свою очередь, использование биотин пентиламина позволяет проводить селективное биотинилирование дегликозилированных гликопротеинов с последующим обогащением с помощью аффинной хроматографии и идентификацией методами жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии. Также возможна визуализация биотинилированных моносахаридных остатков гликопротеинов после переноса на мембрану с использованием стрептавидина и щелочной фосфатазы [10].After deglycosylation by the β-elimination mechanism, the oligosaccharide is cleaved from the protein component together with the hydrogen of the carbon atom of serine / threonine, which also allows further modification to identify the pattern of deglycosylated glycoproteins. Dithiothreitol (DTT) and biotin pentylamine (BAP) are most often used for marking glycoproteins deglycosylated in this way, and their biotin pentylamine (BAP) is electrophilically attached via a double bond, and a covalent bond forms between the proton and one of the carbon atoms of the double bond [10]. In the case of processing a deglycosylated glycoprotein DTT, stable sulfide adducts are formed, which can be identified by mass spectrometry [11]. In turn, the use of biotin pentylamine allows selective biotinylation of deglycosylated glycoproteins, followed by enrichment using affinity chromatography and identification by liquid chromatography and mass spectrometry. Visualization of biotinylated monosaccharide glycoprotein residues after transfer to the membrane using streptavidin and alkaline phosphatase is also possible [10].
Техническим результатом изобретения, достигаемым при осуществлении способа согласно формуле, является идентификация белков, меняющих состав или степень своего O-гликозилирования в результате какого-либо физиологического воздействия на клетку. Идентификация осуществляется визуально в форме выбора пятен на двумерных электрофореграммах, окрашенных азотнокислым серебром, которые далее могут быть экстрагированы и использованы для идентификации белка с помощью MALDI-TOF, фосфопротеомного анализа или другим высокочувствительным методом определения последовательности белка.The technical result of the invention, achieved by implementing the method according to the formula, is the identification of proteins that change the composition or degree of their O-glycosylation as a result of any physiological effect on the cell. Identification is carried out visually in the form of a selection of spots on two-dimensional electrophoregrams stained with silver nitrate, which can then be extracted and used to identify the protein using MALDI-TOF, phosphoproteomic analysis or another highly sensitive method for determining the sequence of the protein.
Раскрытие изобретения: Сущностью изобретения является способ подготовки биологического материала к протеомному и фосфопротеомному анализу посредством дегликозилирования гликопротеинов с последующим введением ковалентной метки и визуализацией паттерна изначально негликозилированных и дегликозилированных белков в предобработанном клеточном гомогенате с использованием J-агрегатов.SUMMARY OF THE INVENTION An inventive concept is a method for preparing biological material for proteomic and phosphoprotein analysis by deglycosylating glycoproteins followed by covalent labeling and visualizing the pattern of initially non-glycosylated and deglycosylated proteins in a pretreated cell homogenate using J-aggregates.
Структурная формула красителя JC-1, используемого в качестве ковалентной метки и базиса для образования J-агрегатов, приведена на Фиг.1. Постадийная схема проведения дегликозилирования белков с введением ковалентной модификации и визуализацией паттерна негликозилированных и дегликозилированных белков в предобработанном клеточном гомогенате с использованием J-агрегатов приведена на Фиг.2.The structural formula of the dye JC-1, used as a covalent label and the basis for the formation of J-aggregates, is shown in Figure 1. A step-by-step diagram of the deglycosylation of proteins with the introduction of covalent modification and visualization of the pattern of non-glycosylated and deglycosylated proteins in the pretreated cell homogenate using J-aggregates is shown in FIG. 2.
Основным аспектом данного изобретения является применение цианиновых красителей, в частности красителя JC-1, для ковалентной модификации O-дегликозилированных по механизму β-элиминирования гликопротеинов и получения меченого продукта. Схема реакций дегликозилирования гликопротеинов и последующего маркирования дегликозилированного белкового продукта цианиновым красителем с указанием возможных механизмов образования ковалентных связей приведена на Фиг.3.The main aspect of this invention is the use of cyanine dyes, in particular JC-1 dye, for covalent modification of O-deglycosylated glycoproteins by β-elimination and to produce a labeled product. The reaction scheme of glycoprotein deglycosylation and subsequent labeling of the deglycosylated protein product with a cyanine dye indicating possible mechanisms for the formation of covalent bonds is shown in FIG. 3.
Другим аспектом данного изобретения является нековалентное мечение первично модифицированных красителем дегликозилированных белков, в частности красителем JC-1, высокими концентрациями того же красителя посредством формирования супрамолекулярных J-агрегатов. Модель упаковки J-агрегатов, сформированных на базе ковалентно-модифицированных красителем дегликозилированных гликопротеинов, при высокой концентрации цианинового красителя JC-1 приведена на Фиг.4.Another aspect of the present invention is the non-covalent labeling of dye-modified deglycosylated proteins, in particular JC-1, with high concentrations of the same dye through the formation of supramolecular J-aggregates. The packaging model of J-aggregates formed on the basis of covalently dye-modified deglycosylated glycoproteins at a high concentration of JC-1 cyanine dye is shown in Figure 4.
Метод основан на способности цианиновых красителей к образованию супрамолекулярных структур, а именно сложных полимолекулярных ассоциатов - J-агрегатов. Формирование J-агрегатов происходит в результате адсорбции краски на поверхности и реализуется путем самосборки в буферном растворе при высокой концентрации красителя в присутствии ионов металлов или полимеров [12]. Известно, что образование J-агрегатов тиокарбоцианиновых красителей индуцируется добавлением желатина и других биологически активных молекул с положительно заряженными группами, с которыми посредством электростатического взаимодействия связываются анионы красителя и происходит дальнейшая самосборка J-агрегатов [13]. При использовании тиокарбоцианиновых красителей для эффективного формирования J-агрегатов необходимым условием является присутствие моновалентных катионов, добавление которых обуславливает снижение электростатического отталкивания молекул красителя и, таким образом, способствует ускорению процессов агрегации [14]. В отличие от тиокарбоцианиновых красителей JC-1 краситель представляет собой липофильный катион 5,5', 6,6'-тетрахлоро-1,1,3,3'-тетраэтилбензимидазолил-карбоцианин, который также широко используется в качестве люминесцентного зонда для биомедицинского применения, в том числе для оценки мембранного потенциала митохондрий, благодаря практически однозначному изменению спектральных характеристик в зависимости от концентрации красителя и сформированной структуры [12, 15]. При низкой концентрации красителя JC-1 в спектре люминесценции (λвозб=490 нм) наблюдается интенсивная полоса мономеров при длине волны 530 нм, тогда как увеличение концентрации JC-1 приводит к смещению пика в длинноволновую область спектра до 595 нм, при этом по мере увеличения концентрации красителя пик также сужается, что свидетельствует не только о формировании и увеличении размеров J-агрегатов JC-1, но и об улучшении их структуры [12, 15]. Так, например, после проведения электрофоретического анализа паттерна всех белков и окрашивания пластины ПААГ азотнокислым серебром вторичное окрашивание модифицированных красителем дегликозилированных гликопротеинов приводит к образованию J-агрегатов, формирование которых определяется методом флуоресцентной детекции с использованием трансиллюминатора синего цвета со светофильтром янтарного цвета Safe Imager™ 2.0 фирмы Life Technologies, США (http://www.lifetechnologies.com) или UVIblue фирмы Uvitec Cambridge, Великобритания (www.uvitec.со.uk) и визуально проявляется в виде светящихся в темноте полос соответствующих дегликозилированных гликопротеинов. Гель-документацию сформированных молекулярных цепочек J-агрегатов на базе ковалентно-модифицированных красителем JC-1 дегликозилированных гликопротеинов проводят с помощью цифровой фотокамеры Panasonic Lumix DMC-GF2C в темной комнате. Подобная простая визуальная детекция паттерна изначально негликозилированных белков и ковалентно-модифицированных дегликозилированных гликопротеинов делает разработанный способ анализа применимым для подготовки биологического материала к протеомному и фосфопротеомному анализу.The method is based on the ability of cyanine dyes to form supramolecular structures, namely, complex polymolecular associates - J-aggregates. The formation of J-aggregates occurs as a result of paint adsorption on the surface and is realized by self-assembly in a buffer solution at a high dye concentration in the presence of metal or polymer ions [12]. It is known that the formation of thiocarbocyanine dye J-aggregates is induced by the addition of gelatin and other biologically active molecules with positively charged groups, to which dye anions bind through electrostatic interaction and further self-assembly of J-aggregates occurs [13]. When using thiocarbocyanine dyes for the efficient formation of J-aggregates, the necessary condition is the presence of monovalent cations, the addition of which causes a decrease in the electrostatic repulsion of the dye molecules and, thus, accelerates the aggregation processes [14]. Unlike the thiocarbocyanine dyes JC-1, the dye is a 5.5 ', 6,6'-tetrachloro-1,1,3,3'-tetraethylbenzimidazolyl-carbocyanine lipophilic cation, which is also widely used as a luminescent probe for biomedical use, including for assessing the membrane potential of mitochondria, due to the almost unambiguous change in spectral characteristics depending on the dye concentration and the formed structure [12, 15]. At a low concentration of JC-1 dye in the luminescence spectrum ( λex = 490 nm), an intense monomer band is observed at a wavelength of 530 nm, while an increase in the concentration of JC-1 leads to a shift of the peak to the long-wavelength region of the spectrum to 595 nm, the increase in the dye concentration also narrows the peak, which indicates not only the formation and increase in the size of J-aggregates of JC-1, but also the improvement of their structure [12, 15]. So, for example, after electrophoretic analysis of the pattern of all proteins and staining of the PAAG plate with silver nitrate, secondary staining of dye-modified deglycosylated glycoproteins leads to the formation of J-aggregates, the formation of which is determined by fluorescence detection using a blue transilluminator with an amber filter Safe Imager ™ 2.0 from the company Life Technologies, USA (http://www.lifetechnologies.com) or UVIblue from Uvitec Cambridge, UK (www.uvitec.co.uk) and visually appears as bands in the dark of the corresponding deglycosylated glycoproteins. The gel documentation of the formed molecular chains of J-aggregates based on covalently dye-modified JC-1 deglycosylated glycoproteins is carried out using a Panasonic Lumix DMC-GF2C digital camera in a dark room. Such simple visual detection of the pattern of initially non-glycosylated proteins and covalently modified deglycosylated glycoproteins makes the developed analysis method applicable for preparing biological material for proteomic and phosphoproteomic analysis.
Примеры анализа результатов, полученных после проведения двумерного электрофореза по О'Фареллу негликозилированных и дегликозилированных белков в гомогенате клеток, зараженных модельным штаммом вируса клещевого энцефалита ЭК-328 или вариантом М штамма ЭК-328, до проведения дегликозилирования гликопротеинов, а также после дегликозилирования и ковалентной модификации красителем JC-1 без обработки пластины ПААГ и с обработкой раствором того же красителя в высокой концентрации с образованием J-агрегатов приведены на Фиг.5.Examples of analysis of the results obtained after two-dimensional electrophoresis by O'Farell of non-glycosylated and deglycosylated proteins in the homogenate of cells infected with a model strain of tick-borne encephalitis virus EK-328 or variant M strain EK-328, before deglycosylation of glycoproteins, as well as after deglycosylation and covalent modification JC-1 dye without treatment of the PAAG plate and treated with a solution of the same dye in high concentration with the formation of J-aggregates are shown in Figure 5.
Краткое описание графических изображений:Brief description of graphic images:
Фиг.1. Структурная формула красителя JC-1, используемого в качестве ковалентной метки и как базиса для образования J-агрегатов.Figure 1. The structural formula of the dye JC-1, used as a covalent label and as a basis for the formation of J-aggregates.
Фиг.2. Постадийная схема преобработки гомогенатов клеток, зараженных модельными штаммами вирусов, посредством проведения дегликозилирования гликопротеинов с последующим введением ковалентной метки и визуализацией паттерна негликозилированных и дегликозилированных белков в предобработанном клеточном гомогенате с использованием J-агрегатов.Figure 2. A step-by-step scheme for the conversion of homogenates of cells infected with model strains of viruses by means of glycoprotein deglycosylation followed by covalent labeling and visualization of the pattern of non-glycosylated and deglycosylated proteins in the pretreated cell homogenate using J-aggregates.
Фиг.3. Схема реакций дегликозилирования гликопротеинов по механизму β-элиминирования и последующего маркирования дегликозилированного белкового продукта цианиновым красителем JC-1 с указанием возможных механизмов образования ковалентных связей.Figure 3. Diagram of glycoprotein deglycosylation reactions according to the β-elimination mechanism and subsequent labeling of the deglycosylated protein product with JC-1 cyanine dye indicating possible mechanisms for the formation of covalent bonds.
Фиг.4. Модель упаковки J-агрегатов, сформированных на базе ковалентно-модифицированных красителем дегликозилированных гликопротеинов, при высокой концентрации цианинового красителя JC-1.Figure 4. Packing model of J-aggregates formed on the basis of covalently dye-modified deglycosylated glycoproteins at a high concentration of JC-1 cyanine dye.
Фиг.5. Электрофоретический анализ паттерна негликозилированных и дегликозилированных белков в гомогенате клеток СПЭВ, зараженных модельным штаммом вируса клещевого энцефалита ЭК-328 (1-3) или вариантом М штамма ЭК-328 (4-6): до проведения дегликозилирования гликопротеинов (1, 4), после дегликозилирования и ковалентной модификации гликопротеинов красителем JC-1 без обработки пластины ПААГ (2, 5) и с обработкой раствором цианинового красителя JC-1 с образованием упорядоченных молекулярных цепочек J-агрегатов (3, 6). Белки разделены методом 20-электрофореза по О'Фареллу и окрашены на общий белок азотнокислым серебром с использованием набора «PageSilver™ Silver Staining Kit». Стрелками указаны полосы, соответствующие дегликозилированным гликопротеинам.Figure 5. Electrophoretic analysis of the pattern of non-glycosylated and deglycosylated proteins in the homogenate of SPEV cells infected with a model strain of tick-borne encephalitis virus EK-328 (1-3) or variant M strain EK-328 (4-6): before glycoproteins are deglycosylated (1, 4), after deglycosylation and covalent modification of glycoproteins with JC-1 dye without treatment of the PAAG plate (2, 5) and with treatment with a solution of cyanine dye JC-1 with the formation of ordered molecular chains of J-aggregates (3, 6). Proteins were separated by O'Farell 20 electrophoresis and stained for total protein with silver nitrate using the PageSilver ™ Silver Staining Kit. Arrows indicate bands corresponding to deglycosylated glycoproteins.
Осуществление изобретения: На основе метода O-дегликозилирования гликопротеинов по механизму β-элиминирования [10, 11] был разработан и оптимизирован способ идентификации паттерна первично негликозилированных и дегликозилированных белков в предобработанном клеточном гомогенате посредством ковалентного связывания дегликозилированных гликопротеинов с цианиновым красителем JC-1 [12], электрофильное присоединение которого, как и в случае с DTT и ВАР, происходит по двойной связи [10]. До и после дегликозилирования гликопротеинов по механизму β-элиминирования с ковалентной модификацией и мечением дегликозилированных белков цианиновым красителем JC-1 был проведен 2D-электрофорез по О'Фареллу с последующей визуализацией паттерна изначально негликозилированных и модифицированных красителем дегликозилированных белков посредством окрашивания гелей азотнокислым серебром с использованием набора «PageSilver™ Silver Staining Kit» фирмы Thermo Fisher Scientific Inc., США (http://www.fermentas.com). После идентификации паттерна всех белков посредством оценки гель-документированных изображений двумерных электрофореграмм методом сканирования на сканере Epson expression 1680 или с помощью цифровой фотокамеры Panasonic Lumix DMC-GF2C с целью подтверждения проявления на пластине ПААГ полос, соответствующих именно дегликозилированным гликопротеинам, гель был помещен в горизонтальную электрофорезную камеру, и было проведено окрашивание первично меченых дегликозилированных белков посредством добавления цианинового красителя JC-1 в высокой концентрации с образованием упорядоченных молекулярных цепочек J-агрегатов.The implementation of the invention: Based on the method of O-deglycosylation of glycoproteins by the mechanism of β-elimination [10, 11], a method for identifying the pattern of primarily non-glycosylated and deglycosylated proteins in a pre-processed cell homogenate by covalent binding of deglycosylated glycoproteins to 12-
Ковалентная модификация дегликозилированных белков может быть осуществлена с использованием других цианиновых красителей, в том числе окса- и тиацианиновых красителей [16, 17], способных к образованию супрамолекулярных J-агрегатов.Covalent modification of deglycosylated proteins can be carried out using other cyanine dyes, including oxa- and thiacyanine dyes [16, 17], capable of forming supramolecular J-aggregates.
Повторная идентификация с использованием трансиллюминатора синего цвета со светофильтром янтарного цвета Safe Imager™ 2.0 («Life Technologies), США) или UVIblue («Uvitec Cambridge), Великобритания) и цифровой фотокамеры Panasonic Lumix DMC-GF2C в темной комнате с последующим наложением полученных гель-документированных изображений позволяет быстро и с удобным способом визуальной детекции определить паттерн изначально негликозилированных белков и ковалентно-модифицированных дегликозилированных белков, что делает данный метод оптимальным для использования при подготовке биологического материала к протеомному и фосфопротеомному анализу.Re-identification using a blue transilluminator with an amber filter Safe Imager ™ 2.0 (Life Technologies), USA or UVIblue (Uvitec Cambridge, UK) and a Panasonic Lumix DMC-GF2C digital camera in a dark room, followed by the application of gel documented images allows you to quickly and with a convenient method of visual detection to determine the pattern of initially non-glycosylated proteins and covalently modified deglycosylated proteins, which makes this method optimal for use in preparing f the biological material to fosfoproteomnomu and proteomic analysis.
Далее изобретение иллюстрируется примерами, которые показывают применение предлагаемого способа подготовки биологического материала к протеомному и фосфопротеомному анализу, основанного на предобработке гомогенатов клеток, в том числе зараженных модельными штаммами вирусов, а именно дегликозилировании содержащихся в них гликопротеинов и последующем введении ковалентной метки с визуализацией паттерна негликозилированных и дегликозилированных белков с использованием J-агрегатов JC-1. Следует понимать, что приводимые примеры служат исключительно для иллюстрации и не предназначены для ограничения объема притязаний, выраженных в формуле изобретения. На основании настоящего описания специалист в данной области сможет легко предложить свои варианты и модификации осуществления изобретения, не отходя от общей концепции настоящего изобретения и без привлечения собственной изобретательской деятельности, так что должно быть понятно, что такие варианты и модификации также будут входить в объем притязаний настоящего изобретения.The invention is further illustrated by examples that show the application of the proposed method for preparing biological material for proteomic and phosphoproteomic analysis, based on the pretreatment of cell homogenates, including those infected with model strains of viruses, namely, deglycosylation of the glycoproteins contained in them and the subsequent introduction of a covalent label with visualization of the non-glycosylated and deglycosylated proteins using JC-1 J aggregates. It should be understood that the examples provided are for illustration only and are not intended to limit the scope of the claims expressed in the claims. Based on the present description, a person skilled in the art will be able to easily propose their own variants and modifications of the invention without departing from the general concept of the present invention and without involving their own inventive activity, so it should be understood that such variants and modifications will also be included in the scope of the claims of this inventions.
Пример 1. Приготовление лизата клеток, зараженных модельным штаммом вируса клещевого энцефалита ЭК-328 или вариантом М, полученным из штамма ЭК-328.Example 1. The preparation of the lysate of cells infected with a model strain of tick-borne encephalitis virus EK-328 or option M, obtained from strain EK-328.
Суспензию клеток почки эмбриона свиньи СПЭВ после заражения штаммом вируса клещевого энцефалита ЭК-328 или вариантом М штамма ЭК-328, и обработки тщательно перемешивают на ротаторе и отбирают аликвоты следующего объема:The suspension of kidney cells in the SPEV pig embryo after infection with the tick-borne encephalitis virus strain EC-328 or variant M of strain EC-328, and the treatments are thoroughly mixed on a rotator and aliquots of the following volume are selected:
При титре 1:512-0,25 мл,With a titer of 1: 512-0.25 ml,
При титре 1:256-0,5 мл,With a titer of 1: 256-0.5 ml,
При титре 1:128-1 мл.With a titer of 1: 128-1 ml.
К клеточным суспензиям в среде DMEM добавляют 100 мг стеклянных шариков диаметром 0,8 мм, 10 мкл на мл коктейля ингибиторов протеолиза «Halt Protease Inhibitor Cocktail» («Thermo Fisher Scientific Inc.», США) и подвергают интенсивной обработке на встряхивателе ВП1-2: 10 серий по 30 сек для каждого препарата, поддерживая температуру препарата около 0°C путем инкубации на ледяной бане. Затем к суспензиям добавляют детергент Triton Х-100 до конечной концентрации 1% и инкубируют на льду при периодическом встряхивании в течение 3 часов.100 mg glass beads with a diameter of 0.8 mm, 10 μl per ml of a Halt Protease Inhibitor Cocktail proteolysis inhibitor cocktail (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) are added to the cell suspensions in DMEM and subjected to intensive processing with a VP1-2 shaker : 10 episodes of 30 sec for each preparation, maintaining the temperature of the preparation at about 0 ° C by incubation in an ice bath. Then, the Triton X-100 detergent is added to the suspensions to a final concentration of 1% and incubated on ice with periodic shaking for 3 hours.
Суспензии декантируют, осветляют посредством центрифугирования при 2000 g в течение 30 мин и замораживают в жидком азоте для дальнейшего использования.Suspensions are decanted, clarified by centrifugation at 2000 g for 30 minutes and frozen in liquid nitrogen for further use.
Пример 2. Предобработка клеточных гомогенатов: проведение O-дегликозилирования гликопротеинов по механизму β-элиминирования с последующей ковалентной модификацией дегликозилированных белков цианиновым красителем JC-1.Example 2. Pretreatment of cell homogenates: O-deglycosylation of glycoproteins according to the β-elimination mechanism, followed by covalent modification of the deglycosylated proteins with JC-1 cyanine dye.
В качестве буферного раствора для клеточного гомогената используют буферный раствор со слабощелочным pH 7,2 на основе 100 мМ Tris-HCl с добавлением 100 мМ NaCl. Образец объемом 400 мл предварительно концентрируют на ячейке для тангенциальной ультрафильтрации («Amicon», США). Первичный концентрат диализуют против буферного раствора Tris-HCl 100 мМ, NaCl 100 мМ в течение суток при +4°C: 75 мл образца наносят в 3 приема по 25 мл на гель-фильтрационную колонку с Sepharose 6 FastFlow (буфер элюции содержит 100мМ Tris-HCl и 100мМ NaCl, pH 7,2). Условия подобраны таким образом, что большинство примесей белковой и небелковой природы не способны связываться с сорбентом. Вирусный белок выходит из колонки в свободном объеме, равном ~ 66% от общего объема колонки. Для дальнейшей работы используют 3 фракции первого пика.A buffer solution with a slightly alkaline pH of 7.2 based on 100 mM Tris-HCl with the addition of 100 mM NaCl is used as a buffer solution for cell homogenate. A 400 ml sample was preconcentrated on a tangential ultrafiltration cell (Amicon, USA). The primary concentrate is dialyzed against a Tris-HCl buffer solution of 100 mM, 100 mM NaCl during the day at + 4 ° C: 75 ml of the sample is applied in 3 doses of 25 ml on a
К фракции первого пика вирусного материала объемом 0,5 мл добавляют 0,5 мл 0,1 М раствора NaOH и 38 мг NaBH4. Смесь тщательно перемешивают и нагревают 16 часов при +45°C. После этого к смеси добавляют 10 мкл 10-4 М цианинового красителя JC-1, растворенного в бинарном растворе ацетон-Tris-HCl (C=0,05 М, pH=8,5), и инкубируют 15 мин при комнатной температуре (краситель JC-1 предоставлен лабораторией процессов фотосенсибилизации Института биохимической физики имени Н.М. Эмануэля РАН (ИБХФ РАН)). После завершения инкубации вирусный препарат подвергают окончательной очистке методом катионообменной хроматографии на Sepharose 6 Fast Flow при pH 7,2; очищенный белок элюируют из колонки буферным раствором с содержанием 100 мМ Tris-HCl и 100 MM NaCl.0.5 ml of a 0.1 M NaOH solution and 38 mg of NaBH 4 are added to the fraction of the first peak of viral material with a volume of 0.5 ml. The mixture is thoroughly mixed and heated for 16 hours at + 45 ° C. After that, 10 μl of 10 -4 M cyanine dye JC-1 dissolved in a binary solution of acetone-Tris-HCl (C = 0.05 M, pH = 8.5) was added to the mixture and incubated for 15 min at room temperature (dye JC-1 is provided by the photosensitization laboratory of the N.M. Emanuel Institute of Biochemical Physics RAS (IBChF RAS)). After incubation is complete, the viral preparation is subjected to final purification by cation exchange chromatography on a
Пример 5. Анализ белков из первичного и предобработанного препаратов вирусного гомогената с помощью 20-электрофореза.Example 5. Analysis of proteins from primary and pre-processed preparations of viral homogenate using 20 electrophoresis.
Для изучения белкового состава препаратов, полученных до и после проведения O-дегликозилирования гликопротеинов по механизму β-элиминирования с последующим мечением дегликозилированных белков цианиновым красителем JC-1, используют 2D-электрофорез по О'Фареллу. Для этого аликвоты хроматографических фракций объемом 500 мкл, с содержанием общего белка около 100 мкг, осаждают добавлением 100% ацетона (1:1) в течение 30 мин при +4°C и последующим центрифугированием на настольной центрифуге при 14000 об/мин в течение 15 мин. Образовавшийся осадок обессоливают, промывают 1 раз 100 мкл 50% водного ацетона, и солюбилизируют, прогревая при 99°C в течение 10 мин в 50 мкл буфера на основе мочевины 9 М, содержащем в качестве восстановителя 1 М тиомочевину, для денатурации образцов.To study the protein composition of preparations obtained before and after O-deglycosylation of glycoproteins by the β-elimination mechanism, followed by labeling of deglycosylated proteins with JC-1 cyanine dye, O'Farell 2D electrophoresis is used. For this, aliquots of chromatographic fractions with a volume of 500 μl, with a total protein content of about 100 μg, are precipitated by adding 100% acetone (1: 1) for 30 min at + 4 ° C and then centrifuging in a benchtop centrifuge at 14,000 rpm for 15 min The precipitate formed is desalted, washed once with 100 μl of 50% aqueous acetone, and solubilized by heating at 99 ° C for 10 min in 50 μl of 9 M urea buffer containing 1 M thiourea as a reducing agent to denature the samples.
Полученный денатурированный образец центрифугируют на настольной центрифуге при максимальных оборотах в течение 10 мин, после чего осветленный супернатант используют для проведения изофокусировки в трубке. Фракционирование в первом направлении представляет собой изоэлектрофокусирование (ИЭФ) в стеклянных трубках (2,4×180 мм), заполненных 4% ПААГ, приготовленном на 9М растворе мочевины, содержащем 2% тритона Х-100 и 2% смеси амфолинов (pH 5-7, 5-8 и 3,5-10 в соотношении 4/1). Белковый экстракт (от 100 до 150 мкл) наносят на «кислотный» край геля и проводят ИЭФ в приборе фирмы BioRad (США), до достижения 2400 В/час суммарно на каждую колонку ПААГ. Затем колонки ПААГ с разделенными в ходе ИЭФ белками используют в качестве стартовой зоны при фракционировании во втором направлении, которое проводят электрофорезом в пластинах ПААГ (200×200×1 мм) с линейным градиентом концентрации акриламида 7,5-25% и в присутствии 0,1% SDS на приборе для вертикального электрофореза фирмы Helicon (Россия). С края каждой пластины формируют карман для нанесения белков-маркеров. Для визуализации белков пластины ПААГ окрашивают азотнокислым серебром с использованием набора «PageSilver™ Silver Staining Kit» в соответствии с инструкцией производителя («Тhеrmо Fisher Scientific Inc.», США).The resulting denatured sample is centrifuged in a benchtop centrifuge at maximum speed for 10 minutes, after which the clarified supernatant is used to conduct isofocusing in the tube. Fractionation in the first direction is isoelectric focusing (IEF) in glass tubes (2.4 × 180 mm) filled with 4% PAG prepared on a 9 M urea solution containing 2% X-100 triton and 2% ampholine mixture (pH 5-7 , 5-8 and 3.5-10 in a ratio of 4/1). Protein extract (from 100 to 150 μl) is applied to the “acid” edge of the gel and the IEF is carried out in a BioRad device (USA) until a total of 2400 V / hr is achieved on each PAAG column. Then, PAAG columns with proteins separated during IEF are used as a starting zone for fractionation in the second direction, which is performed by electrophoresis in SDS plates (200 × 200 × 1 mm) with a linear gradient of acrylamide concentration of 7.5–25% and in the presence of 0, 1% SDS on a device for vertical electrophoresis company Helicon (Russia). A pocket is formed from the edge of each plate for the application of marker proteins. To visualize proteins, PAG plates were stained with silver nitrate using the PageSilver ™ Silver Staining Kit in accordance with the manufacturer's instructions (Thermo Scientific Fisher Inc., USA).
Гель-документацию полученных двумерных электрофореграмм проводят методом сканирования на сканере «Epson expression 1680» или с помощью цифровой фотокамеры Panasonic Lumix DMC-GF2C. Наложение гель-документированных изображений, полученных после проведения электрофоретического анализа паттерна первично негликозилированных белков (Фиг.5 (1, 4)) и паттерна всех белков (Фиг.5 (2, 5)) позволяет определить возможный паттерн изначально негликозилированных и ковалентно-модифицированных дегликозилированных белков без возможности подтверждения или опровержения артефактности проявившихся на пластине ПААГ полос, предположительно соответствующих именно дегликозилированным гликопротеинам.Gel-documentation of the obtained two-dimensional electrophoregrams is carried out by scanning on an Epson expression 1680 scanner or using a Panasonic Lumix DMC-GF2C digital camera. The imposition of gel-documented images obtained after electrophoretic analysis of the pattern of primarily non-glycosylated proteins (Figure 5 (1, 4)) and the pattern of all proteins (Figure 5 (2, 5)) allows you to determine a possible pattern of initially non-glycosylated and covalently modified deglycosylated proteins without the possibility of confirming or refuting the artifact of the bands appearing on the PAAG plate, presumably corresponding specifically to deglycosylated glycoproteins.
Пример 4. Идентификация паттерна негликозилированных и дегликозилированных белков из очищенного предобработанного гомогената клеток, зараженных модельным штаммом вируса клещевого энцефалита ЭК-328 или вариантом М, полученным из штамма ЭК-328.Example 4. Identification of the pattern of non-glycosylated and deglycosylated proteins from purified pre-processed homogenate of cells infected with a model strain of tick-borne encephalitis virus EC-328 or variant M obtained from strain EC-328.
Для однозначной идентификации паттерна изначально негликозилированных и дегликозилированных белков из предобработанного препарата вирусного гомогената после проведения электрофоретического анализа всех белков и окрашивания геля азотнокислым серебром проводят вторичное окрашивание модифицированных красителем дегликозилированных гликопротеинов. Для этого окрашенную азотнокислым серебром пластину ПААГ помещают в камеру для горизонтального электрофореза multiSUB MAXI («Сleaver Scientific Ltd», Великобритания, www.cleaverscientific.com), добавляют 1200 мл 10-5 M цианинового красителя JC-1 в бинарном растворе ацетон-Tris-НСl (C=0,05 М, pH=8,5), содержащем также предварительно растворенный ПАВ цетилпиридиний бромид в концентрации 10-3 М, добавление которого приводит к образованию оболочки из молекул ПАВ вокруг J-агрегатов, обуславливая более эффективную структуризацию, и выдерживают 10 мин при комнатной температуре. После завершения инкубации раствор для окрашивания сливают, гель промывают охлажденным до +4°C раствором PBS и документируют формирование молекулярных цепочек J-агрегатов на базе ковалентно-модифицированных красителем дегликозилированных гликопротеинов с помощью трансиллюминатора синего цвета со светофильтром янтарного цвета Safe Imager™ 2.0 («Life Technologies», США) или UVIblue («Uvitec Cambridge», Великобритания) и цифровой фотокамеры Panasonic Lumix DMC-GF2C в темной комнате (Фиг.5 (3, 6)).To unambiguously identify the pattern of initially non-glycosylated and deglycosylated proteins from a pretreated viral homogenate preparation, after electrophoretic analysis of all proteins and staining of the gel with silver nitrate, secondary staining of dye-modified deglycosylated glycoproteins is performed. For this, a silver nitric acid PAAG plate is placed in a multiSUB MAXI horizontal electrophoresis chamber (Cleaver Scientific Ltd, UK, www.cleaverscientific.com), 1200 ml of 10 -5 M JC-1 cyanine dye in a binary solution of acetone-Tris- are added Hcl (C = 0.05 M, pH = 8.5), which also contains pre-dissolved surfactant cetylpyridinium bromide at a concentration of 10 -3 M, the addition of which leads to the formation of a shell of surfactant molecules around J-aggregates, leading to more efficient structuring, and incubated for 10 min at room temperature. After completion of the incubation, the staining solution is drained, the gel is washed with PBS solution cooled to + 4 ° C and the formation of molecular chains of J-aggregates based on covalently dye-modified deglycosylated glycoproteins is documented using a blue transilluminator with an amber filter Safe Imager ™ 2.0 (Life Technologies ", USA) or UVIblue (" Uvitec Cambridge ", UK) and a Panasonic Lumix DMC-GF2C digital camera in a dark room (Figure 5 (3, 6)).
Наложение гель-документированных изображений, полученных после проведения электрофоретического анализа паттерна первично негликозилированных белков (Фиг.5 (1, 4)) и паттерна всех белков (Фиг.5 (2, 5)) после окрашивания геля азотнокислым серебром, а также паттерна модифицированных красителем дегликозилированных гликопротеинов после вторичного окрашивания (Фиг.5 (3, 6)), которое приводит к образованию J-агрегатов, позволяет однозначно определить паттерн изначально негликозилированных и ковалентно-модифицированных дегликозилированных белков.Overlay of gel-documented images obtained after electrophoretic analysis of the pattern of primarily non-glycosylated proteins (Figure 5 (1, 4)) and the pattern of all proteins (Figure 5 (2, 5)) after staining the gel with silver nitrate, as well as a dye-modified pattern deglycosylated glycoproteins after secondary staining (Figure 5 (3, 6)), which leads to the formation of J-aggregates, allows us to uniquely determine the pattern of initially non-glycosylated and covalently modified deglycosylated proteins.
Список использованных источниковList of sources used
1. Gibbs B.F. Complete chemical and enzymatic treatment of phosphorylated and glycosylated proteins on protein chip arrays. Дата приоритета 11.05.2005. Патент US 2006269980 (A1).1. Gibbs B.F. Complete chemical and enzymatic treatment of phosphorylated and glycosylated proteins on protein chip arrays. Priority date 05/11/2005. US2006269980 (A1).
2. Bynum M.A., Grimm R., Killeen K.P., Robotti K.M. Microfluidic Glycan Analysis. Дата приоритета 29.01.2009. Патент US 20100190146 (A1).2. Bynum M.A., Grimm R., Killeen K.P., Robotti K.M. Microfluidic Glycan Analysis. Priority date 01/29/2009. U.S. Patent 20100190146 (A1).
3. Виноградов А.А., Ямсков И.А. Дегликозилирование гликопротеинов. Биоорганическая химия. - 1998. - Т. 24. - №11. - С.803-815.3. Vinogradov A.A., Yamskov I.A. Deglycosylation of glycoproteins. Bioorganic chemistry. - 1998. - T. 24. - No. 11. - S.803-815.
4. Edge A.S. Deglycosylation of glycoproteins with trifluoromethanesulphonic acid: elucidation of molecular structure and function. - 2003. Biochemical Journal. - V. 376. - P. 339-350.4. Edge A.S. Deglycosylation of glycoproteins with trifluoromethanesulphonic acid: elucidation of molecular structure and function. - 2003. Biochemical Journal. - V. 376. - P. 339-350.
5. Ingham K.C., Brew S.A. Fluorescent labeling of the carbohydrate moieties of human chorionic gonadotropin and alpha 1-acid glycoprotein. Biochimica et Biophysica Acta. - 1981.- V. 670. -№2. - P. 181-189.5. Ingham K.C., Brew S.A. Fluorescent labeling of the carbohydrate moieties of human chorionic gonadotropin and alpha 1-acid glycoprotein. Biochimica et Biophysica Acta. - 1981.- V. 670.-
6. De Bank P.A., Kellam В., Kendall D.A., Shakesheff K.M. Surface engineering of living myoblasts via selective periodate oxidation. Biotechnology and Bioengineering. - 2003. - V. 81. - №7. - P. 800-808.6. De Bank P.A., Kellam B., Kendall D.A., Shakesheff K.M. Surface engineering of living myoblasts via selective periodate oxidation. Biotechnology and Bioengineering. - 2003. - V. 81. - No. 7. - P. 800-808.
7. Shilova N.V., Galanina O.E., Rubina A.Y., Butvilovskaya V.I., Huflejt M.E., Chambers J., Roucoux A., Bovin N.V. 2-Aminopyridine-a label for bridging of oligosaccharides HPLC profiling and glycoarray printing. Glycoconjugate Journal. - 2008. - V. 25. - №1. - P. 11-14.7. Shilova N.V., Galanina O.E., Rubina A.Y., Butvilovskaya V.I., Huflejt M.E., Chambers J., Roucoux A., Bovin N.V. 2-Aminopyridine-a label for bridging of oligosaccharides HPLC profiling and glycoarray printing. Glycoconjugate Journal. - 2008. - V. 25. - No. 1. - P. 11-14.
8. Haugland R.P., Steinberg Т.Н., Patton W.P., Zhenjun D. Reagents for labeling biomolecules having aldehyde or ketone moieties. Дата приоритета 02.10.2000. Заявка на патент WO 0228841 A2.8. Haugland R.P., Steinberg T.N., Patton W.P., Zhenjun D. Reagents for labeling biomolecules having aldehyde or ketone moieties. Priority Date 02.10.2000. Patent Application WO 0228841 A2.
9. Sinkeldam R.W., Greco N.J., Tor Y. Fluorescent analogs of biomolecular building blocks: design, properties, and applications. Chemical Reviews. - 2010. - V. 110. - №5. - P. 2579-2619.9. Sinkeldam R.W., Greco N.J., Tor Y. Fluorescent analogs of biomolecular building blocks: design, properties, and applications. Chemical Reviews. - 2010. - V. 110. - No. 5. - P. 2579-2619.
10. Wells L., Vosseller K., Cole R.N., Cronshaw J.M., Matunis M.J., Hart G.W. Mapping sites of O-GlcNAc modification using affinity tags for serine and threonine post-translational modifications. Molecular & Cellular Proteomics. - 2002. - V. 1. - №10. - P. 791-804.10. Wells L., Vosseller K., Cole R.N., Cronshaw J.M., Matunis M.J., Hart G.W. Mapping sites of O-GlcNAc modification using affinity tags for serine and threonine post-translational modifications. Molecular & Cellular Proteomics. - 2002. - V. 1. - No. 10. - P. 791-804.
11. Murrey H.E., Hsieh-Wilson L.C. The chemical neurobiology of carbohydrates. Chemical Reviews. - 2008. - V. 108. - №5. - P. 1708-1731.11. Murrey H.E., Hsieh-Wilson L.C. The chemical neurobiology of carbohydrates. Chemical Reviews. - 2008. - V. 108. - No. 5. - P. 1708-1731.
12. Сорокин А.В. Оптические свойства и структура J-агрегатов красителя JC-1 в растворах. Биофизический вестник. - 2008. - Т. 21. - №2. - С.115-121.12. Sorokin A.V. Optical properties and structure of J-aggregates of JC-1 dye in solutions. Biophysical Bulletin. - 2008. - T. 21. - No. 2. - S.115-121.
13. Slavnova T.D., Gorner Н., Chibisov А.К. J-aggregation of anionic ethyl meso-thiacarbocyanine dyes induced by binding to proteins. Journal of Physical Chemistry. - 2007. - V. 111. - №33. - P. 10023-10031.13. Slavnova T. D., Gorner N., Chibisov A.K. J-aggregation of anionic ethyl meso-thiacarbocyanine dyes induced by binding to proteins. Journal of Physical Chemistry. - 2007. - V. 111. - No. 33. - P. 10023-10031.
14. Yao H., Isohashi Т., Kimura K. Electrolyte-induced mesoscopic aggregation of thiacarbocyanine dye in aqueous solution: counterion size specificity. Journal of Physical Chemistry. - 2007. - V. 111. - №25. - P. 7176-7183.14. Yao H., Isohashi T., Kimura K. Electrolyte-induced mesoscopic aggregation of thiacarbocyanine dye in aqueous solution: counterion size specificity. Journal of Physical Chemistry. - 2007. - V. 111. - No. 25. - P. 7176-7183.
15. Reers M., Smith T.W., Chen L.B. J-aggregate formation of a carbocyanine as a quantitative fluorescent indicator of membrane potential. Biochemistry. - 1991. - V. 30. - №18. - P. 4480-4486.15. Reers M., Smith T.W., Chen L.B. J-aggregate formation of a carbocyanine as a quantitative fluorescent indicator of membrane potential. Biochemistry. - 1991. - V. 30. - No. 18. - P. 4480-4486.
16. Yamaguchi A., Kometani N., Yonezawa Y. Luminescence properties of the mixed J-aggregate of oxacyanine dye and thiacyanine dye. Formation of a persistence-type aggregate. Journal of Physical Chemistry. - 2005. - V. 109. - №4. - P. 1408-1414.16. Yamaguchi A., Kometani N., Yonezawa Y. Luminescence properties of the mixed J-aggregate of oxacyanine dye and thiacyanine dye. Formation of a persistence-type aggregate. Journal of Physical Chemistry. - 2005. - V. 109. - No. 4. - P. 1408-1414.
17. Achyuthan K.E., Lu L., Lopez G.P., Whitten D.G. Supramolecular photochemical self-assemblies for fluorescence "turn on" and "turn off assays for chem-bio-helices. Photochemical & Photobiological Sciences. - 2006.- V. 5. - №10.- P. 931-937.17. Achyuthan K.E., Lu L., Lopez G.P., Whitten D.G. Supramolecular photochemical self-assemblies for fluorescence "turn on" and "turn off assays for chem-bio-helices. Photochemical & Photobiological Sciences. - 2006.- V. 5. - No. 10.- P. 931-937.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012147255/10A RU2509807C1 (en) | 2012-11-07 | 2012-11-07 | Method of detecting o-glycosylated proteins in cell homogenates prepared for proteomic and phosphoproteomic analysis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012147255/10A RU2509807C1 (en) | 2012-11-07 | 2012-11-07 | Method of detecting o-glycosylated proteins in cell homogenates prepared for proteomic and phosphoproteomic analysis |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2509807C1 true RU2509807C1 (en) | 2014-03-20 |
Family
ID=50279672
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012147255/10A RU2509807C1 (en) | 2012-11-07 | 2012-11-07 | Method of detecting o-glycosylated proteins in cell homogenates prepared for proteomic and phosphoproteomic analysis |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2509807C1 (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100190146A1 (en) * | 2009-01-29 | 2010-07-29 | Bynum Magdalena A | Microfluidic Glycan Analysis |
-
2012
- 2012-11-07 RU RU2012147255/10A patent/RU2509807C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100190146A1 (en) * | 2009-01-29 | 2010-07-29 | Bynum Magdalena A | Microfluidic Glycan Analysis |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| MURREY H.E. ET AL., The chemical neurobiology of carbohydrates. Chemical Reviews, 2008, v.108, no.5, p.1708-1731. * |
| MURREY H.E. ET AL., The chemical neurobiology of carbohydrates. Chemical Reviews, 2008, v.108, no.5, p.1708-1731. WELLS L. ET AL., Mapping sites of O-GlcNAc modifi cation using affinity tags for serine and threonine posttranslational modifications, Molecular & Cellular Proteomics, 2002, v.1, no.10, p.791-804. СОРОКИН А.В. Оптические свойства и структура J-агрегатов красителя JC-1 в растворах. - Биофизический вестник, 2008, т.21, №2, с.115-121. REERS M. ET AL., J-aggregate formation of a carbocyanine as a quantitative fluorescent indicator of membrane potential, Biochemistry, 1991, v.30, no.18, p.4480-4486. * |
| REERS M. ET AL., J-aggregate formation of a carbocyanine as a quantitative fluorescent indicator of membrane potential, Biochemistry, 1991, v.30, no.18, p.4480-4486. * |
| WELLS L. ET AL., Mapping sites of O-GlcNAc modifi cation using affinity tags for serine and threonine posttranslational modifications, Molecular & Cellular Proteomics, 2002, v.1, no.10, p.791-804. * |
| СОРОКИН А.В. Оптические свойства и структура J-агрегатов красителя JC-1 в растворах. - Биофизический вестник, 2008, т.21, No.2, с.115-121. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Thompson et al. | Methods for the detection, study, and dynamic profiling of O-GlcNAc glycosylation | |
| Mukherjee et al. | Characterization and identification of dityrosine cross-linked peptides using tandem mass spectrometry | |
| Schmidt et al. | A comparative cross-linking strategy to probe conformational changes in protein complexes | |
| Vanderschaeghe et al. | High-throughput profiling of the serum N-glycome on capillary electrophoresis microfluidics systems: toward clinical implementation of GlycoHepatoTest | |
| Černý et al. | Advances in purification and separation of posttranslationally modified proteins | |
| Banerjee et al. | Methylglyoxal-induced modification causes aggregation of myoglobin | |
| Lei et al. | Characterization of N-glycan structures on the surface of mature dengue 2 virus derived from insect cells | |
| JP2003529044A (en) | Polypeptide fingerprinting, metabolic profiles, and bioinformatics databases | |
| Fedorova et al. | Quantitative evaluation of tryptophan oxidation in actin and troponin I from skeletal muscles using a rat model of acute oxidative stress | |
| WO2013192530A2 (en) | Methods and reagents for glycoproteomics | |
| KR19980080505A (en) | How to measure interactions between sugars and targets | |
| JP2021530549A (en) | Identification of post-translational modifications in proteins by single molecule sequencing | |
| Pereira Morais et al. | Analysis of protein glycation using fluorescent phenylboronate gel electrophoresis | |
| Williams | Staining nucleic acids and proteins in electrophoresis gels | |
| Tello et al. | A “fluorescence switch” technique increases the sensitivity of proteomic detection and identification of S‐nitrosylated proteins | |
| EP1947453B1 (en) | Method for analyzing protein | |
| TWI547486B (en) | Compounds and methods for analysis and synthesis of saccharide compounds | |
| RU2509807C1 (en) | Method of detecting o-glycosylated proteins in cell homogenates prepared for proteomic and phosphoproteomic analysis | |
| Leinisch et al. | UV oxidation of cyclic AMP receptor protein, a global bacterial gene regulator, decreases DNA binding and cleaves DNA at specific sites | |
| KR100560127B1 (en) | In-gel tagging and in-gel digestion for phosphoproteins analylsis and phosphorylation site identification | |
| JP2020056727A (en) | Analytical sample preparation method, analytical method, and analytical sample preparation kit | |
| JP2011516463A (en) | Selective enrichment of N-terminally modified peptides from complex samples | |
| Danyluk et al. | A rapid procedure for the purification of 8-aminopyrene trisulfonate (APTS)-labeled glycans for capillary electrophoresis (CE)-based enzyme assays | |
| Brás-Costa et al. | Profilings of subproteomes of lectin-binding proteins of nine Bothrops venoms reveal variability driven by different glycan types | |
| Sundaram et al. | Protein stains and applications |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20141108 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20160210 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20190301 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20191108 |