RU2505602C1

RU2505602C1 - Method for obtaining resident stem cells of mammal heart from myocard sample

Info

Publication number: RU2505602C1
Application number: RU2012122648/10A
Authority: RU
Inventors: Константин Владимирович Дергилев; Ксения Андреевна Рубина; Вероника Юрьевна Сысоева; Ренат Сулейманович Акчурин; Елена Викторовна Парфенова; Всеволод Арсеньевич Ткачук
Priority date: 2012-06-04
Filing date: 2012-06-04
Publication date: 2014-01-27
Also published as: RU2012122648A

Abstract

FIELD: biotechnologies.

SUBSTANCE: there described is a method for obtaining resident stem cells of mammal heart expressing surface markers c-kit or sca-I and/or MDR1, in the course of which the samples of myocard tissues are separated, ground, treated by collagenase and trypsin, cultivated at cultural bowl with coating from fibronectin by method of explant culture of ground samples with the following immunoselection.

EFFECT: invention allows obtaining enriched culture of resident stem cells of heart for the purposes of medicine and transplantology.

8 cl, 3 dwg, 4 ex

Description

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к клеточной и тканевой инженерии, и может быть использовано в медицине и ветеринарии при разработке клинического метода восстановления миокарда и лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы. Предлагается метод получения культуры резидентных стволовых клеток сердца (СКС), предназначенный для тканевой инженерии и заключающийся в выделении мультипотентных СКС из ткани миокарда для использования в качестве инструмента клеточной терапии заболеваний сердечно-сосудистой системы.The present invention relates to the field of biotechnology, in particular to cellular and tissue engineering, and can be used in medicine and veterinary medicine in the development of a clinical method for myocardial restoration and treatment of diseases of the cardiovascular system. A method is proposed for producing a culture of resident stem cells of the heart (SCS), intended for tissue engineering and consisting in the isolation of multipotent SCS from myocardial tissue for use as a tool for cell therapy of diseases of the cardiovascular system.

Хроническая сердечная недостаточность в подавляющем большинстве случаев, возникающая в результате перенесенного инфаркта миокарда (ИМ), представляет собой важную медицинскую, социальную и экономическую проблему. Около 1% взрослого населения развитых стран страдает сердечной недостаточностью (ХСН), а у людей старше 70 лет частота ХСН на порядок выше (около 10%). При этом в российской популяции частота ХСН выше, чем в развитых странах, и достигает 6% [Хроническая сердечная недостаточность / Ф.Т.Агеев [и др]. - М.: Изд-во Гэотар-медиа, 2010]. Несмотря на то что эффективность лечения ХСН возросла за последние двадцать лет, возможности современных методов восстановления функции сердца остаются весьма ограниченными. Это обусловлено в значительной степени отсутствием эффективных средств, позволяющих восстановить необратимо утраченный миокард. В последние годы большие надежды на решение этой проблемы возлагают на развитие методов клеточной терапии [Хроническая сердечная недостаточность /Ф.Т.Агеев [и др]. - М.: Изд-во Гэотар-медиа, 2010], в частности на использование мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, для которых была продемонстрирована возможность кардиомиоцитарной дифференцировки как in vitro, так и in vivo [Fukuda, K. Development of regenerative cardiomyocytes from mesenchymal stem cells for cardiovascular tissue engineering // Artif Organs. - 2001. - V.25. - P.187-93; Kajstura, J., Leri A., Finato N., et al. Myocyte proliferation in end-stage cardiac failure in humans // Proc Nati Acad Sci USA. - 1998. - V.95. - P.8801-5; Kawada, H., Fujita J., Kinjo K. et al. Nonhematopoietic mesenchymal stem cells can be mobilized and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction // Blood. - 2004. - V.104. - Р.3581-7; Povsic, T.J., O'Connor C.M. Cell therapy for heart failure: the need for a new therapeutic strategy // Expert Rev CardiovascTher. - 2010. - V.8. - P.1107-26].Chronic heart failure in the vast majority of cases resulting from myocardial infarction (MI) is an important medical, social and economic problem. About 1% of the adult population of developed countries suffer from heart failure (CHF), and in people older than 70 years, the frequency of heart failure is an order of magnitude higher (about 10%). Moreover, the frequency of heart failure in the Russian population is higher than in developed countries, and reaches 6% [Chronic heart failure / F.T. Ageev [et al.]. - M.: Publishing House of Geotar Media, 2010]. Despite the fact that the effectiveness of treatment of heart failure has increased over the past twenty years, the possibilities of modern methods of restoring heart function remain very limited. This is largely due to the lack of effective means to restore irreversibly lost myocardium. In recent years, great hopes for solving this problem have been placed on the development of cell therapy methods [Chronic heart failure / F.T. Ageev [et al.]. - M .: Geotar Media Publishing House, 2010], in particular, on the use of mesenchymal bone marrow stem cells, for which the possibility of cardiomyocytic differentiation both in vitro and in vivo has been demonstrated [Fukuda, K. Development of regenerative cardiomyocytes from mesenchymal stem cells for cardiovascular tissue engineering // Artif Organs. - 2001. - V.25. - P.187-93; Kajstura, J., Leri A., Finato N., et al. Myocyte proliferation in end-stage cardiac failure in humans // Proc Nati Acad Sci USA. - 1998. - V.95. - P.8801-5; Kawada, H., Fujita J., Kinjo K. et al. Nonhematopoietic mesenchymal stem cells can be mobilized and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction // Blood. - 2004 .-- V.104. - R. 3581-7; Povsic, T.J., O'Connor C.M. Cell therapy for heart failure: the need for a new therapeutic strategy // Expert Rev CardiovascTher. - 2010. - V.8. - P.1107-26].

Однако в результате проведенных экспериментальных и клинических исследований не было показано достаточно высокой эффективности клеточной терапии ХСН и не была подтверждена возможность замещения утраченного миокарда за счет дифференцировки трансплантированных клеток [Lipinski, M.J., Biondi-Zoccai G.G., AbbateA., et al. Impact of intracoronary cell therapy on left ventricular function in the setting of acute myocardial infarction: a collaborative systematic review and meta-analysis of controlled clinical trials // J Am Coil Cardiol. - 2007. - V.50. - P.1761-7; Murry, C.E., Field L.J., Menasche P. Cell-based cardiac repair: reflections at the 10-year point // Circulation. - 2005. - V.112. - P.3174-83; Rubart, M., Field L.J. Stem cell differentiation: cardiac repair // Cells Tissues Organs. - 2008. - V.188. - P.202-11]. Эффекты, наблюдаемые при трансплантации клеток костного мозга, были обусловлены в основном их паракринной активностью, подавляющей апоптоз кардиомиоцитов и стимулирующей ангиогенез и активность собственных резидентных стволовых клеток сердца [Hatzistergos K.E., Quevedo H., Oskouei B.N., et al. Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Stimulate Cardiac Stem Cell Proliferation and Differentiation // Circ Res. - 2009. - V.116. - №27. - P.15885-90; Satija, N.K., Singh V.K., Verma Y.K., et al. Mesenchymal stem cell-based therapy: a new paradigm in regenerative medicine // J Cell Mol Med. - 2009. - V.13. - P.4385-402]. На сегодняшний день ученые заняты поиском новых источников аутологичных стволовых/прогениторных клеток для терапии ХСН. В этом аспекте большой интерес представляют недавно открытые резидентные СКС [Beltrami, A.P., Barlucchi L., Torella D., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration // Cell. - 2003. - V.114. - P.763-768]. Термином «резидентная СКС» обозначается неоднородная популяция низкодифференцированных клеток, обнаруживаемых в миокарде, способных к самообновлению и дифференцировке в клетки сердца (кардиомиоциты, эндотелиальные и гладкомышечные клетки сосудов). Выделяют несколько популяций СКС: 1) клетки, несущие на поверхности рецептор к фактору стволовых клеток (c-kit+ клетки); 2) клетки, несущие на поверхности антиген sca-1, характеризующий стволовые клетки мыши (sca-1+ клетки); 3) клетки, экспрессирующие транскрипционный фактор Islet-1, присутствующий в эмбриональных клетках, формирующих сердце в эмбриогенезе (Islet-1+ клетки). Существование резидентных СКС, участвующих в регенеративных процессах, делает особенно актуальной разработку подходов к активации эндогенного механизма регенерации сердца. Помимо этого применение аутологичных (полученных от самого пациента) СКС для лечения сердечно-сосудистых заболеваний представляется перспективным, так как не требует проведения иммуносупрессивной терапии и исключает возможность переноса инфекционных агентов от донора. Однако, учитывая крайне малое содержание СКС в ткани миокарда, для разработки клинически приемлемой технологии использования этих клеток для клеточной кардиомиопластики необходима разработка клинически приемлемого метода получения СКС из образцов миокарда, которые возможно без вреда для больного получать либо в ходе оперативных вмешательств, либо при проведении биопсии миокарда по клиническим показаниям. Такой метод также абсолютно необходим для разработки методов стимуляции эндогенных СКС и регенеративных процессов в сердце, так как это требует изучения свойств СКС больных сердечно-сосудистыми заболеваниями, что возможно только на культурах этих клеток.However, as a result of experimental and clinical studies, the cell therapy of CHF was not sufficiently effective and the possibility of replacing the lost myocardium due to differentiation of transplanted cells was not confirmed [Lipinski, M.J., Biondi-Zoccai G.G., AbbateA., Et al. Impact of intracoronary cell therapy on left ventricular function in the setting of acute myocardial infarction: a collaborative systematic review and meta-analysis of controlled clinical trials // J Am Coil Cardiol. - 2007. - V.50. - P.1761-7; Murry, C.E., Field L.J., Menasche P. Cell-based cardiac repair: reflections at the 10-year point // Circulation. - 2005. - V.112. - P.3174-83; Rubart, M., Field L.J. Stem cell differentiation: cardiac repair // Cells Tissues Organs. - 2008. - V.188. - P.202-11]. The effects observed during bone marrow cell transplantation were mainly due to their paracrine activity, which suppresses apoptosis of cardiomyocytes and stimulates the angiogenesis and activity of own resident heart stem cells [Hatzistergos K.E., Quevedo H., Oskouei B.N., et al. Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Stimulate Cardiac Stem Cell Proliferation and Differentiation // Circ Res. - 2009. - V.116. - No. 27. - P. 15885-90; Satija, N.K., Singh V.K., Verma Y.K., et al. Mesenchymal stem cell-based therapy: a new paradigm in regenerative medicine // J Cell Mol Med. - 2009. - V.13. - P.4385-402]. Today, scientists are looking for new sources of autologous stem / progenitor cells for the treatment of heart failure. In this aspect, recently discovered resident SCS [Beltrami, A.P., Barlucchi L., Torella D., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration // Cell. - 2003. - V.114. - P.763-768]. The term “resident SCS” refers to a heterogeneous population of low-differentiated cells found in the myocardium, capable of self-renewal and differentiation into heart cells (cardiomyocytes, vascular endothelial and smooth muscle cells). Several SCS populations are distinguished: 1) cells carrying on the surface a stem cell receptor factor (c-kit + cells); 2) cells bearing the sca-1 antigen on the surface, which characterizes mouse stem cells (sca-1 + cells); 3) cells expressing the transcription factor Islet-1 present in embryonic cells forming the heart in embryogenesis (Islet-1 + cells). The existence of resident SCS involved in regenerative processes makes development of approaches to the activation of the endogenous mechanism of heart regeneration particularly urgent. In addition, the use of autologous (obtained from the patient himself) SCS for the treatment of cardiovascular diseases seems promising, since it does not require immunosuppressive therapy and excludes the possibility of the transfer of infectious agents from the donor. However, given the extremely low content of SCS in myocardial tissue, the development of a clinically acceptable technology for using these cells for cell cardiomyoplasty requires the development of a clinically acceptable method for obtaining SCS from myocardial samples, which can be obtained without harm to the patient either during surgery or during a biopsy myocardium according to clinical indications. This method is also absolutely necessary for the development of methods for stimulating endogenous SCS and regenerative processes in the heart, since this requires studying the properties of SCS in patients with cardiovascular diseases, which is possible only on cultures of these cells.

Многие годы считалось, что сердце является терминально дифференцированным органом, а зрелые кардиомиоциты не способны вступать в митоз [Bucher, O.Z. Problem der Amitose // Handb. Allgem.Pathol. - 1971. - V.11. - P.626-699; Grundmann, E. Histologische Untersuchungenu der die Wirkungen experimentallen Sauerstoffmangels auf das KatzenHerz // Beitr. Pathol.Anat. Allgem. Pathol. - 1951. - V.111. - P.36-76], хотя возможность пролиферации других клеток миокарда, таких как фибробласты, гладкомышечные и эндотелиальные клетки, не отрицалась. Предполагалось, что, дифференцируясь вскоре после рождения, кардиомиоциты сохраняются на протяжении всей жизни и не способны к обновлению. Развитие современных методов исследований позволило изменить эти представления. Образование новых кардиомиоцитов происходит в норме и при патологических состояниях на протяжении всей жизни при участии стволовых клеток [Kajstura, J., Urbanek K., Peri S., et al. Cardiomyogenesis in the adult human heart // Circ Res. - 2010. - V.107. - P.305-15]. Оказалось, что около 1% клеток взрослого сердца обновляется в течение года и 45% кардиомиоцитов являются новообразованными к 50 годам [Bergmann, О., Bhardwaj R.D., Bernard S., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans // Science. - 2009. - V.324. - P.98-102]. Альтернативным методом оценки регенеративных возможностей миокарда (использование йоддезоксиуридина) [Kajstura, J., Urbanek K., Peri S., et al. Cardiomyogenesis in the adult human heart // CircRes. - 2010. - V.107. - P.305-15] было показано, что 22% новых кардиомиоцитов, 20% фибробластов и 13% эндотелиальных клеток образуется в течение года. Таким образом, время жизни этих клеток составляет 4, 4,5 и 8 лет соответственно [Kajstura, J., Urbanek K., Peri S., et al. Cardiomyogenesis in the adult human heart // Circ Res. - 2010. - V.107. - P.305-15]. Эти результаты свидетельствуют о том, что кардиомиоциты достаточно интенсивно обновляются - старые кардиомиоциты замещаются на новые. Работами последних лет показано, что это обновления осуществляется за счет СКС, которые активируются при возникновении поражения миокарда, пролиферируют и мигрируют в область поражения, где участвуют в замещении погибших клеток миокарда, дифференцируясь в них [Beltrami А.Р., Barlucchi L., Torella D., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration // Cell. - 2003. - V.114. - P.763-768]. Тем не менее, при длительно текущих заболеваниях (ИБС, ХСН, сахарный диабет), обширных поражениях миокарда, старении эндогенных регенеративных возможностей миокарда оказывается недостаточно для поддержания клеточного гомеостаза. При этих состояниях снижается функциональная активность СКС - их способность к пролиферации, миграции и дифференцировке. Кроме этого увеличивается количество прогениторных клеток, гибнущих за счет апоптоза. В совокупности это приводит к уменьшению численности функционально полноценных СКС и отсутствию эффективной регенерации миокарда. Решением этой проблемы может стать клеточная кардиомиопластика, основанная на использовании аутологичных резидентных СКС, получаемых от больного и наращиваемых в культуре до необходимого количества. Популяция этих клеток характеризуется экспрессией одного или нескольких поверхностных маркеров стволовых клеток (c-kit (рецептор к фактору стволовых клеток - SCF), sca-1, MDR1, Islet-1) и отсутствием экспрессии маркеров гематопоэтических клеток (CD34, CD45, CD20, CD8) [Beltrami, А.Р., Barlucchi L., Torella D., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration // Cell. - 2003. - V.114. - P.763-768]. В миокарде животных количество СКС клеток было небольшим, приблизительно 1 клетка на 104 кардиомиоцита. СКС способны к самообновлению, пролиферации и обладали мультипотентностью (способностью к дифференцировке в кардиомиоцитарном, эндотелиальном и гладкомышечном направлениях in vitro и in vivo), а при трансплантации после инфаркта миокарда способствовали уменьшению зоны некроза и поддержанию насосной функции сердца [Dawn, В., Stein A.B., Urbanek K., et al. Cardiac stem cells delivered intravascularly traverse the vessel barrier, regenerate infarcted myocardium, and improve cardiac function // Proc Nati Acad Sci USA. - 2005. - V.102. - P.3766-71].For many years, it was believed that the heart is a terminally differentiated organ, and mature cardiomyocytes are not able to enter mitosis [Bucher, O.Z. Problem der Amitose // Handb. Allgem.Pathol. - 1971. - V.11. - P.626-699; Grundmann, E. Histologische Untersuchungenu der die Wirkungen experimentallen Sauerstoffmangels auf das KatzenHerz // Beitr. Pathol.Anat. Allgem. Pathol. - 1951. - V.111. - P.36-76], although the possibility of proliferation of other myocardial cells, such as fibroblasts, smooth muscle and endothelial cells, was not denied. It was assumed that, differentiating shortly after birth, cardiomyocytes persist throughout life and are not capable of renewal. The development of modern research methods has allowed us to change these ideas. The formation of new cardiomyocytes occurs normally and in pathological conditions throughout life with the participation of stem cells [Kajstura, J., Urbanek K., Peri S., et al. Cardiomyogenesis in the adult human heart // Circ Res. - 2010 .-- V.107. - P.305-15]. It turned out that about 1% of adult heart cells are renewed within a year and 45% of cardiomyocytes are newly formed by 50 years [Bergmann, O., Bhardwaj R. D., Bernard S., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans // Science. - 2009. - V.324. - P.98-102]. An alternative method for assessing the regenerative capacity of the myocardium (using iododeoxyuridine) [Kajstura, J., Urbanek K., Peri S., et al. Cardiomyogenesis in the adult human heart // CircRes. - 2010 .-- V.107. - P.305-15], it was shown that 22% of new cardiomyocytes, 20% of fibroblasts, and 13% of endothelial cells form within a year. Thus, the lifespan of these cells is 4, 4.5, and 8 years, respectively [Kajstura, J., Urbanek K., Peri S., et al. Cardiomyogenesis in the adult human heart // Circ Res. - 2010 .-- V.107. - P.305-15]. These results indicate that cardiomyocytes are updated quite intensively - old cardiomyocytes are replaced by new ones. Recent studies have shown that this update is carried out due to SCS, which are activated when myocardial damage occurs, proliferate and migrate to the affected area, where they participate in the replacement of dead myocardial cells, differentiating in them [Beltrami A.P., Barlucchi L., Torella D., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration // Cell. - 2003. - V.114. - P.763-768]. Nevertheless, with long-term diseases (IHD, CHF, diabetes mellitus), extensive myocardial damage, aging of the endogenous regenerative capabilities of the myocardium, it is not enough to maintain cell homeostasis. Under these conditions, the functional activity of SCS decreases - their ability to proliferate, migrate and differentiate. In addition, the number of progenitor cells that die due to apoptosis increases. Together, this leads to a decrease in the number of functionally complete SCS and the absence of effective myocardial regeneration. A solution to this problem may be cell cardiomyoplasty, based on the use of autologous resident SCS, obtained from the patient and accumulated in the culture to the required amount. The population of these cells is characterized by the expression of one or more surface stem cell markers (c-kit (stem cell factor receptor - SCF), sca-1, MDR1, Islet-1) and the lack of expression of hematopoietic cell markers (CD34, CD45, CD20, CD8 ) [Beltrami, A.P., Barlucchi L., Torella D., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration // Cell. - 2003. - V.114. - P.763-768]. In the animal myocardium, the number of SCS cells was small, approximately 1 cell per 104 cardiomyocytes. SCS are capable of self-renewal, proliferation, and had multipotency (the ability to differentiate in the cardiomyocyte, endothelial and smooth muscle directions in vitro and in vivo), and during transplantation after myocardial infarction, they helped to reduce the necrosis zone and maintain the pumping function of the heart [Dawn, B., Stein AB , Urbanek K., et al. Cardiac stem cells delivered intravascularly traverse the vessel barrier, regenerate infarcted myocardium, and improve cardiac function // Proc Nati Acad Sci USA. - 2005. - V.102. - P.3766-71].

Методы получения СКС человека, описанные в литературе, основаны на использовании 2 основных источников для выделения клеток: биопсии миокарда [US 2010061966] и аневризмы ЛЖ [RU 2366706]. Однако биопсия миокарда не является рутинным методом обследования пациентов, проводится только по строгим медицинским показания (прогрессирующая ХСН неясной этиологии, нарушения ритма и проводимости неясного генеза, для диагностики миокардита и кардиомиопатии и др.) и позволяет получить очень маленькие образцы миокарда (0,1-0,3 мг). Это не позволяет рассматривать биоптаты миокарда в качестве оптимальною источника для получения СКС. Второй источник ткани для получения СКС (аневризма сердца, которая иссекается при оперативном вмешательстве) также имеет ряд недостатков. Аневризма сердца возникает после обширного ИМ вследствие выпячивания потерявшей свой тонус стенки сердца под действием повышенного внутрижелудочкового давления. Ткань хронической постинфарктной аневризмы представлена в основном фиброзной тканью, лишенной мышечных волокон. Отсутствие мышечной ткани и резкое уменьшение количества СКС в отдаленном постинфарктном периоде [Urbanek, K., Torella D., Sheikh F., et al. Myocardial regeneration by activation of multipotent cardiac stem cells in ischemic heart failure // Proc Nati Acad Sci USA. - 2005. - V.102. - №24. - P.8692-7] накладывают определенные ограничения для использование хронической аневризмы для выделения СКС.The methods for obtaining human SCS described in the literature are based on the use of 2 main sources for cell isolation: myocardial biopsy [US 2010061966] and LV aneurysm [RU 2366706]. However, myocardial biopsy is not a routine method of examining patients, it is carried out only according to strict medical indications (progressive heart failure of unknown etiology, rhythm and conduction disturbances of unknown origin, for the diagnosis of myocarditis and cardiomyopathy, etc.) and allows you to get very small myocardial samples (0.1- 0.3 mg). This does not allow considering myocardial biopsy specimens as the optimal source for obtaining SCS. The second source of tissue for SCS (aneurysm of the heart, which is excised during surgery) also has several disadvantages. Aneurysm of the heart occurs after extensive myocardial infarction due to protrusion of the heart wall that has lost its tone due to increased intraventricular pressure. The tissue of chronic post-infarction aneurysm is represented mainly by fibrous tissue, devoid of muscle fibers. The absence of muscle tissue and a sharp decrease in the number of SCS in the distant post-infarction period [Urbanek, K., Torella D., Sheikh F., et al. Myocardial regeneration by activation of multipotent cardiac stem cells in ischemic heart failure // Proc Nati Acad Sci USA. - 2005. - V.102. - No. 24. - P.8692-7] impose certain restrictions on the use of chronic aneurysm for the allocation of SCS.

Метод получения СКС, предлагаемый в качестве изобретения, позволяет проводить выделение стволовых клеток из образцов миокарда независимо от их размера, полученных из любого отдела сердца человека и животных. Разработанный метод позволяет многократно увеличить (нарастить) ex vivo количество получаемых резидентных СКС, используя культивирование в виде эксплантной культуры, а затем выполнить селекцию с помощью иммуномагнитного сортинга строго определенной популяции стволовых клеток. Метод культивирования эксплантной культуры был выбран авторами по следующим соображениям. Паракринные факторы клеток микроокружения регулируют выживаемость и пролиферацию стволовых клеток in vitro и in vivo [Urbanek, K., Cesselli D., Rota M., et al. Stem ceil niches in the adult mouse heart // Proc Nati Acad Sci USA. - 2006. - V.103. - №24. - P.9226-31]. Следовательно, эксплантная культура может служить аналогом клеточной ниши ех vivo, в которой поддержание и пролиферация резидентных СКС осуществляется с помощью взаимодействия и паракринных факторов клеток микроокружения.The method of obtaining SCS, proposed as an invention, allows for the isolation of stem cells from myocardial samples, regardless of their size, obtained from any part of the heart of humans and animals. The developed method allows one to repeatedly increase (increase) ex vivo the number of obtained resident SCS using cultivation as an explant culture, and then perform selection using immunomagnetic sorting of a strictly defined stem cell population. The method of culturing the explant culture was chosen by the authors for the following reasons. Paracrine microenvironment cell factors regulate in vitro and in vivo stem cell survival and proliferation [Urbanek, K., Cesselli D., Rota M., et al. Stem ceil niches in the adult mouse heart // Proc Nati Acad Sci USA. - 2006. - V.103. - No. 24. - P.9226-31]. Therefore, the explant culture can serve as an analogue of the ex vivo cell niche, in which the maintenance and proliferation of resident SCS is carried out using the interaction and paracrine factors of microenvironment cells.

Метод отработан при использовании в качестве оптимального источника для получения резидентных СКС человека ушка правого предсердия (ПП), которое отсекается в ходе стандартного этапа операции аортокоронарного шунтирования.The method was developed using the right atrium (PP) abutment, which is cut off during the standard stage of coronary artery bypass surgery, as the optimal source for obtaining resident human SCS.

Данный метод может быть использован для получения СКС из любого образца миокарда человека или животного (млекопитающего). При получении культуры СКС для клеточной терапии или изучения их свойств необходима разработка протокола получения чистой культуры СКС, лишенной клеток гематопоэтической природы. В литературе описаны исследования, указывающие, что значительная часть (около половины) СКС коэкспрессирует панлейкоцитарный маркер CD45 [Kubo, H., Jaleel N., Kumarapeli A., Berretta R.M., et al. Increased cardiac myocyte progenitors in failing human hearts // Circulation. - 2008. - V.118. - №6. - P.649-57], что указывает на их гематопоэтическую природу и костномозговое происхождение. Следовательно, при разработке методики выделения необходимо исключить возможность попадания в культуру СКС клеток гематопоэтической природы. Большинство исследователей отрицает возможность присутствия гематопоэтических c-kit+ клеток в миокарде человека и животных. В связи с этим в большинстве методик выделение СКС проводится только с помощью применения метода иммуномагнитной селекции [RU 2366706; Bearzi, С., Leri A., LoMonaco F., et al. Identification of a coronary vascular progenitor cell in the human heart // Proc Nati Acad Sci USA. - 2009. - V.106. - №37. - P.15885-90] или клеточного сортинга [Hosoda, Т., D'Amario D., Cabral-Da-Silva M.C., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo // Proc Nati Acad Sci USA. - 2009. - V.106. - №40. - P.169-174], как правило, по одному антигену - c-kit, характерному для СКС. Эти методы выделения имеют ряд недостатков, связанных с малым количеством получаемых СКС, ограниченным маленьким объемом образцов миокарда, а также с невозможностью получить чистую культуру СКС в связи с присутствием клеток гематопоэтической природы, которые также могут нести на своей поверхности этот антиген.This method can be used to obtain SCS from any sample of the myocardium of a human or animal (mammal). When receiving an SCS culture for cell therapy or studying their properties, it is necessary to develop a protocol for obtaining a pure SCS culture devoid of hematopoietic cells. Studies have been described in the literature indicating that a significant portion (about half) of SCS coexpresses the panleukocyte marker CD45 [Kubo, H., Jaleel N., Kumarapeli A., Berretta R.M., et al. Increased cardiac myocyte progenitors in failing human hearts // Circulation. - 2008. - V.118. - No. 6. - P.649-57], which indicates their hematopoietic nature and bone marrow origin. Therefore, when developing the isolation technique, it is necessary to exclude the possibility of hematopoietic cells entering the SCS culture. Most researchers deny the possibility of the presence of hematopoietic c-kit + cells in the myocardium of humans and animals. In this regard, in most methods, the isolation of SCS is carried out only by using the method of immunomagnetic selection [RU 2366706; Bearzi, C., Leri A., LoMonaco F., et al. Identification of a coronary vascular progenitor cell in the human heart // Proc Nati Acad Sci USA. - 2009. - V.106. - No. 37. - P.15885-90] or cell sorting [Hosoda, T., D'Amario D., Cabral-Da-Silva M.C., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo // Proc Nati Acad Sci USA. - 2009. - V.106. - No. 40. - P.169-174], as a rule, for one antigen - c-kit, characteristic for SCS. These isolation methods have a number of drawbacks associated with the small number of obtained SCS, the limited volume of myocardial samples, and the inability to obtain a pure SCS culture due to the presence of hematopoietic cells that can also carry this antigen on their surface.

Таким образом, несмотря на документированную способность популяции c-kit-положительных (c-kit+) СКС к самообновлению, пролиферации, дифференцировке в клетки миокарда и участию в его регенерации, клиническое использование этой популяции ограничено в связи с недостаточной отработкой методик их выделения из малых образцов миокарда человека и экспансии в культуре.Thus, despite the documented ability of a population of c-kit-positive (c-kit +) SCS to self-renew, proliferate, differentiate into myocardial cells and participate in its regeneration, the clinical use of this population is limited due to insufficient development of methods for their isolation from small samples human myocardium and expansion in culture.

Задачей изобретения является создание нового способа выделения стволовых клеток, позволяющего получить обогащенную популяцию резидентных СКС из любых образцов миокарда человека и животных (млекопитающих). Данный результат достигается за счет использования эксплантной культуры, которая позволяет многократно увеличить (нарастить) количество резидентных СКС ех vivo, и последующего проведения иммуномагнитной селекции для получения строго определенной популяции стволовых клеток.The objective of the invention is to create a new method for the isolation of stem cells, which allows to obtain an enriched population of resident SCS from any samples of the myocardium of humans and animals (mammals). This result is achieved through the use of an explant culture, which allows you to repeatedly increase (increase) the number of resident SCS ex vivo, and the subsequent immunomagnetic selection to obtain a strictly defined population of stem cells.

Поставленная задача решается тем, что в способе выделения резидентных стволовых клеток сердца из образцов миокарда, включающем измельчение образцов, обработку их ферментами и проведение иммуномагнитной селекции, согласно изобретению после обработки образцов ферментами осуществляют культивирование методом эксплантной культуры на культуральной чашке, при этом культуральную чашку используют с покрытием из фибронектина, а в качестве ферментов для обработки образцов используют вещества, обеспечивающие частичное расщепление ткани образца и адгезию эксплантов к поверхности культуральной чашки. Измельчение образцов миокарда проводят до получения кусочков размером 1-3 мм³. Для обработки образцов миокарда используют протеолитические ферменты. Обработку ферментами образцов миокарда проводят в растворе, содержащем 0-0,5% коллагеназы А и 0-0,2% трипсина в фосфатно-солевом буфере, в течение 1-30 минут при 37°С. Фибронектин для покрытия культуральных чашек используют в концентрации от 1 до 1000 мкг/мл. Культивирование образцов миокарда (эксплантов) проводят в среде IMDM, содержащей 1-20% фетальной сыворотки теленка, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 2 мМ Л-глутамина, в течение 7-40 дней при 37°С в атмосфере 5% СО₂, со сменой среды каждые 1-5 дней. Иммуномагнитную селекцию клеток эксплантной культуры для получения резидентных стволовых клеток проводят с поверхностными маркерами c-kit, и/или sca-1, и/или MDR1. При этом иммуномагнитная селекция клеток эксплантной культуры из одного образца миокарда может быть осуществлена от 1-5 последовательных этапов с интервалами 5-21 день.The problem is solved in that in the method for isolating resident stem cells of the heart from myocardial samples, including grinding samples, processing them with enzymes and conducting immunomagnetic selection, according to the invention, after processing the samples with enzymes, cultivation is carried out by the method of explant culture on a culture cup, while the culture cup is used fibronectin coating, and as enzymes for processing samples, substances are used that provide partial cleavage of the tissue zsa and adhesion of explants to the surface of the culture plate. Grinding of myocardial samples is carried out to obtain pieces of size 1-3 mm ³ . Proteolytic enzymes are used to process myocardial samples. The enzyme treatment of myocardial samples is carried out in a solution containing 0-0.5% collagenase A and 0-0.2% trypsin in phosphate-buffered saline, for 1-30 minutes at 37 ° C. Fibronectin for coating culture dishes is used at a concentration of 1 to 1000 μg / ml. The cultivation of myocardial samples (explants) is carried out in IMDM medium containing 1-20% fetal calf serum, 100 units / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin and 2 mM L-glutamine, for 7-40 days at 37 ° C. atmosphere of 5% CO ₂ , with a change of environment every 1-5 days. Immunomagnetic selection of explant cells for obtaining resident stem cells is carried out with surface markers c-kit, and / or sca-1, and / or MDR1. Moreover, immunomagnetic selection of explant culture cells from one myocardial sample can be carried out from 1-5 consecutive stages with intervals of 5-21 days.

Изобретение поясняется чертежами.The invention is illustrated by drawings.

На фиг.1 представлено визуальное отображение экспрессии маркеров кардиомиоцитов и гладкомышечных клеток в c-kit+ CKC ткани ушка правого предсердия сердца человека. Стрелки указывают на окрашенные CKC, экспрессирующие маркеры кардиомиоцитов (Gata 4 (А), саркомерный α-актинин (Б)) и гладкомышечных клеток (гладкомышечный α-актин (В)). Масштабный отрезок 10 мкм.Figure 1 presents a visual display of the expression of markers of cardiomyocytes and smooth muscle cells in c-kit + CKC tissue of the ear of the right atrium of the human heart. The arrows indicate stained CKC expressing markers of cardiomyocytes (Gata 4 (A), sarcomeric α-actinin (B)) and smooth muscle cells (smooth muscle α-actin (B)). The scale segment is 10 microns.

На фиг.2 показано культивирование клеток ушка правого предсердия методом эксплантной культуры. На фигуре присутствуют следующие обозначения: А - 7 день культивирования; Б - образование монослоя фибробластоподобных клеток (11 день); В, Г - появление округлых клеток на поверхности клеток с фибробластоподобной морфологией (19 день). Масштабный отрезок 20 мкм.Figure 2 shows the cultivation of the cells of the ear of the right atrium by the explant culture method. The following symbols are present in the figure: A — 7th day of cultivation; B - the formation of a monolayer of fibroblast-like cells (day 11); B, D - the appearance of rounded cells on the surface of cells with fibroblast-like morphology (19 days). Scale segment of 20 microns.

На фиг.3 представлены c-kit позитивные CKC ушка правого предсердия, полученные методом иммуномагнитной селекции. На фигуре присутствуют следующие обозначения: А - через 24 часа после селекции; Б - через 5 суток после селекции; В - монослой c-kit клеток (14 дней); Г - маркер c-kit на поверхности CKC.Figure 3 presents the c-kit positive CKC of the right atrial abalone obtained by immunomagnetic selection. The following notation is present in the figure: A — 24 hours after selection; B - 5 days after selection; B - monolayer of c-kit cells (14 days); G is the c-kit marker on the surface of the CKC.

Таким образом, заявляется способ получения клеточной культуры резидентных СКС, предназначенной для их использования в качестве инструмента клеточной терапии заболеваний сердечно-сосудистой системы, изучения их биологии и механизмов их участия в регенерации сердца с целью разработки методов стимуляции эндогенных механизмов регенерации миокарда. Предлагаемая методика основана на том, что в ткани миокарда присутствуют резидентные СКС, которые образуются в нем в период эмбрионального развития, способны к мультипотентной дифференцировке in vitro и in vivo и участию в процессах обновления и регенерации миокарда. Эти уникальные характеристики делают СКС потенциально более привлекательными для клеточной терапии с целью регенерации миокарда, чем любые другие клетки, выделяемые из других источников (костный мозг, кровь, скелетные мышцы или жировая ткань) и имеющие ограниченный дифференцировочный потенциал.Thus, the claimed method of obtaining a cell culture of resident SCS, intended for use as a tool for cell therapy of diseases of the cardiovascular system, study of their biology and mechanisms of their participation in cardiac regeneration in order to develop methods for stimulating endogenous mechanisms of myocardial regeneration. The proposed technique is based on the fact that resident SCS are present in the myocardial tissue, which are formed in it during the period of embryonic development, are capable of multipotent differentiation in vitro and in vivo and participate in the processes of myocardial renewal and regeneration. These unique characteristics make SCS potentially more attractive for cell therapy for myocardial regeneration than any other cells isolated from other sources (bone marrow, blood, skeletal muscle or adipose tissue) and having limited differentiation potential.

В настоящем изобретении в качестве источника СКС предлагается использовать образцы миокарда, полученные из любых отделов сердца человека и животных (млекопитающих) с использованием основных маркеров стволовых клеток, таких как С-kit, Sca-1, MDR1, Isletl, SSEA1 и др. В качестве изобретения предлагается методика получения культуры СКС, основанная на сочетании методов эксплантной культуры с последующей иммуномагнитной селекцией. Подробное описание метода выделения резидентных c-kit+ СКС из образца ушка ПП сердца человека представлено в примере 1.In the present invention, it is proposed to use myocardial samples obtained from any parts of the heart of humans and animals (mammals) using the main stem cell markers, such as C-kit, Sca-1, MDR1, Isletl, SSEA1, etc. as a source of SCS. The invention proposes a method for obtaining an SCS culture based on a combination of explant culture methods followed by immunomagnetic selection. A detailed description of the method for isolating resident c-kit + SCS from a human abdominal PP abalone sample is presented in Example 1.

Согласно разработанной методике образцы миокарда доставляли в лабораторию в растворе фосфатно-солевого буфера без Са⁺⁺ и Mg⁺⁺ в течение 1 часа после получения. В условиях культурального бокса с ламинарным потоком воздуха образцы миокарда измельчали с помощью ножниц до получения кусочков размером 1-3 мм³ и после ферментативной обработки (1-30 минут при 37°С при постоянном покачивании на шейкере в растворе с 0-0,5% коллагеназы и 0-0,2% трипсина), культивировали на чашках, покрытых фибронектином 1-1000 мкг/мл, в специальной среде (IMDM, содержащей 1-20% фетальной сыворотки теленка, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 2 мМ Л-глутамина). Через 7-10 дней с момента начала культивирования вокруг экспланта начинали появляться клетки фибробластоподобной морфологии. На 7-40 день культивирования вокруг эксплантов образовывался монослой клеток, поверх которых располагались округлые прозрачные клетки с узким ободком цитоплазмы. Длительное культивирование клеток эксплантов в описанных условиях при отсутствии факторов, поддерживающих жизнеспособность клеток гематопоэтической природы, позволяло полностью избавиться от гематопоэтических/тучных клеток в культуре. Кроме того, условия культивирования эксплантов являлись благоприятными для культивирования СКС, что позволяло длительно сохранять их иммунофенотип, недифференцированное состояние и многократно увеличить их количество в сравнении с их содержанием в исходном образце. После наращивания клетки эксплантной культуры использовали для выделения резидентных СКС на основании экспрессии поверхностных маркеров (C-kit, Sca-1, MDR1). Для этого клетки эксплантной культуры обрабатывали средой для открепления клеток Accutase («ICT», США) в течение 1-20 минут (под визуальным контролем под микроскопом). Полученные клетки фильтровали через нейлоновые мембраны с размером пор 40 микрон и далее использовали для иммуномагнитной селекции. Для проведения селекции СКС использовали коммерческие наборы для иммуномагнитной селекции клеток компаний «Miltenyi Biotec» (США) и «Dynal Biotech» (Норвегия). Проводили несколько этапов иммуномагнитной селекции клеток эксплантной культуры, получаемых из одного и того же образца миокарда. Проведение повторной иммуномагнитной селекции осуществляли каждые 7-14 дней культивирования эксплантной культуры. Эта процедура позволяла многократно повысить количество стволовых клеток, извлекаемых из каждого образца миокарда, и получить культуру, содержащую 95-98% резидентных СКС. Полученные СКС сохраняли свой иммунофенотип, недифференцированное состояние, не экспрессируют маркеров гематопоэтических и тучных клеток, были способны к пролиферации и обладали основными свойствами стволовых клеток.According to the developed technique, myocardial samples were delivered to the laboratory in a solution of phosphate-saline buffer without Ca ⁺⁺ and Mg ⁺⁺ within 1 hour after receipt. In a culture box with a laminar flow of air, myocardial samples were crushed using scissors to obtain pieces 1-3 mm ³ in size and after enzymatic treatment (1-30 minutes at 37 ° C with constant shaking on a shaker in a solution with 0-0.5% collagenase and 0-0.2% trypsin) were cultured on plates coated with fibronectin 1-1000 μg / ml in a special medium (IMDM containing 1-20% fetal calf serum, 100 units / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin and 2 mM L-glutamine). After 7-10 days from the start of cultivation, fibroblast-like morphology cells began to appear around the explant. On the 7th –40th day of cultivation, a monolayer of cells formed around the explants, on top of which there were rounded transparent cells with a narrow rim of the cytoplasm. Prolonged cultivation of explant cells under the described conditions, in the absence of factors supporting the viability of hematopoietic cells, made it possible to completely get rid of hematopoietic / mast cells in culture. In addition, the conditions for explant cultivation were favorable for the cultivation of SCS, which made it possible to preserve their immunophenotype, undifferentiated state for a long time, and increase their number many times in comparison with their content in the initial sample. After growth, explant cells were used to isolate resident SCS based on the expression of surface markers (C-kit, Sca-1, MDR1). For this, the cells of the explant culture were treated with Accutase cell detachment medium (ICT, USA) for 1-20 minutes (under visual inspection under a microscope). The obtained cells were filtered through nylon membranes with a pore size of 40 microns and then used for immunomagnetic selection. For SCS selection, commercial kits for immunomagnetic cell selection by Miltenyi Biotec (USA) and Dynal Biotech (Norway) were used. Several stages of immunomagnetic selection of explant culture cells obtained from the same myocardial specimen were performed. Repeated immunomagnetic selection was carried out every 7-14 days of explant culture. This procedure made it possible to repeatedly increase the number of stem cells extracted from each myocardial sample and to obtain a culture containing 95-98% resident SCS. The obtained SCS retained their immunophenotype, undifferentiated state, did not express hematopoietic and mast cell markers, were capable of proliferation, and possessed the basic properties of stem cells.

Таким образом, объектом настоящего изобретения является метод, который позволяет проводить эффективное выделение резидентных СКС без примеси гематопоэтических и тучных клеток из любых образцов миокарда человека и животных. Разработанный метод выделения стволовых клеток из миокарда может служить основой для разработки технологии клеточной терапии на основе резидентных СКС.Thus, an object of the present invention is a method that allows for the efficient isolation of resident SCS without admixture of hematopoietic and mast cells from any samples of human and animal myocardium. The developed method for the isolation of stem cells from the myocardium can serve as the basis for the development of cell therapy technology based on resident SCS.

При осуществлении изобретения помимо методов, подробно раскрытых в нижеследующих примерах, были использованы известные методики, описанные также в цитированных источниках.When carrying out the invention, in addition to the methods described in detail in the following examples, well-known methods were used, which are also described in the cited sources.

Пример 1. Метод выделения резидентных с kit+ стволовых клеток из образцов миокарда ушка ПП сердца человекаExample 1. The method of isolation of resident with kit + stem cells from myocardial samples of abalone PP human heart

Иссечение ушка ПП проводили при канюляции ПП для подключения к аппарату искусственного кровообращения в ходе стандартного этапа операции аортокоронарного шунтирования. Перед началом выделения были проанализировали срезы миокарда ушка ПП для выявления клеток-предшественников кардиомиоцитов и клеток сосудов с помощью метода иммунофлуоресцентного окрашивания ткани (пример 2). В ткани миокарда c-kit+ CKC экспрессировали маркер пролиферации Ki-67, а также транскрипционные факторы и структурные белки кардиомиоцитов и клеток сосудов, что характеризует их как прогениторные клетки и клетки-предшественники. В c-kit+ клетках ушка ПП была выявлена экспрессия транскрипционного фактора Gata 4, характерного для ранних этапов кардиомиоцитарной дифференцировки, а также саркомерного α-актинина-белка сократительного аппарата кардиомиоцитов, характеризующего более поздние этапы этого типа дифференцировки (фиг.1). Также были обнаружены c-kit+ клетки, локализованные вблизи крупных сосудов и экспрессирующие белок гладкомышечных клеток - гладкомышечный α-актин (фиг.1) и маркер перицитов NG2.The abutment of the abutment was performed during cannulation of the abutment to connect to the cardiopulmonary bypass during the standard stage of coronary artery bypass grafting. Before the selection was started, sections of the myocardium of the abalone PP were analyzed to identify the progenitor cells of cardiomyocytes and vascular cells using the method of immunofluorescence staining of tissue (example 2). In the myocardial tissue c-kit + CKC, the Ki-67 proliferation marker was expressed, as well as transcription factors and structural proteins of cardiomyocytes and vascular cells, which characterizes them as progenitor and progenitor cells. In c-kit + cells of the abalone PP, expression of the transcription factor Gata 4, characteristic of the early stages of cardiomyocytic differentiation, as well as the sarcomeric α-actinin protein of the contractile apparatus of cardiomyocytes, characterizing the later stages of this type of differentiation, was revealed (Fig. 1). Also found were c-kit + cells localized near large vessels and expressing smooth muscle protein — smooth muscle α-actin (FIG. 1) and pericyte marker NG2.

Учитывая присутствие c-kit+ CKC в образцах миокарда с признаками дифференцировки в кардиомиоциты и клетки сосудов in vivo проведено выделение культуры резидентных c-kit+ CKC по методике, включающей подготовку эксплантной культуры с последующей иммуномагнитной селекцией.Given the presence of c-kit + CKC in myocardial samples with signs of differentiation into cardiomyocytes and vascular cells in vivo, a culture of resident c-kit + CKC was isolated by a technique including preparation of an explant culture followed by immunomagnetic selection.

1.1 Получение эксплантной культуры клеток ушка ПП1.1 Obtaining an Explant Culture of Abalone PP Cells

Образец миокарда ушка ПП (в 10 мл раствора фосфатно-солевого буфера без Са⁺⁺ и Mg⁺⁺) был доставлен в лабораторию в течение 1 часа после иссечения в ходе операции аортокоронарного шунтирования. В условиях стерильного культурального бокса с ламинарным потоком воздуха кусочки ткани измельчали ножницами до получения размеров кусочков 1-3 мм³, затем промывали раствором ФСБ 3 раза (для удаления клеток крови). Далее проводили обработку ткани раствором ферментов (0,1% коллагеназы А («Rochediagnostics», США) и 0,2% трипсина («Invitrogen», США) в фосфатно-солевом буфере) при 37°С в течение 15 минут при постоянном покачивании на шейкере. После инкубации к раствору ферментов с кусочками ткани добавляли тройной объем среды IMDM, содержащей 10% фетальной сыворотки теленка («Hyclone», США), и центрифугировали 10 мин со скоростью 1000 оборотов/мин (200g). После центрифугирования проводили удаление жидкости над осадком. Промывку ткани средой и центрифугирование повторяли 2 раза. Затем кусочки ткани миокарда ресуспендировали в среде культивирования (IMDM, содержащей 10% фетальной сыворотки коровы, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ Л-глутамина) и помещали на пластиковые культуральные чашки, предварительно покрытые фибронектином (20 мкг/мл) (фиг.2). Каждые три дня производили частичную замену среды (около 50% от общего объема). Экспланты культивировали до момента появления прозрачных округлых клеток, находящихся на слое фибробластов (21 день).A myocardial abalone PP sample (in 10 ml of a solution of phosphate-saline buffer without Ca ⁺⁺ and Mg ⁺⁺ ) was delivered to the laboratory within 1 hour after excision during coronary artery bypass grafting. Under conditions of a sterile culture box with a laminar flow of air, tissue pieces were crushed with scissors to obtain pieces sizes of 1-3 mm ³ , then washed with a FSB solution 3 times (to remove blood cells). Next, the tissue was treated with a solution of enzymes (0.1% collagenase A (Rochediagnostics, USA) and 0.2% trypsin (Invitrogen, USA) in phosphate-buffered saline) at 37 ° C for 15 minutes with constant shaking on the shaker. After incubation, a triple volume of IMDM medium containing 10% fetal calf serum (Hyclone, USA) was added to a solution of enzymes with tissue pieces and centrifuged for 10 min at a speed of 1000 rpm (200 g). After centrifugation, liquid was removed over the precipitate. Tissue washing with medium and centrifugation were repeated 2 times. Then, myocardial tissue pieces were resuspended in a culture medium (IMDM containing 10% fetal bovine serum, 100 units / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 2 mM L-glutamine) and placed on plastic culture plates previously coated with fibronectin (20 μg / ml) (Fig.2). Every three days, a partial replacement of the medium was made (about 50% of the total volume). Explants were cultured until transparent round cells appeared on the fibroblast layer (21 days).

Для анализа иммунофенотипа клеток эксплантной культуры использовали методы проточной цитофлуориметрии и иммунофлуоресцентного окрашивания (примеры 3, 4). После 3 недель культивирования эксплантов ушка ПП было выявлено несколько субпопуляций клеток на основе экспрессии поверхностных маркеров, соответствующих зрелому эндотелию и его предшественникам - CD31+ (1,3±0,7%), CD34+ (2,3±1,54%)), мезенхимальным клеткам - CD105+ (85,6±6,6%); CD73+ (92,6±4,2%), CD90+ (91,87±6,53%)) и СПКС - c-kit+ (3,37±6,7%), sca-1+ (0,33±0,24%)). Характерной особенностью c-kit+ клеток в эксплантной культуре ушка ПП было отсутствие маркеров гематопоэтических (CD45, CD34, Lin1) и тучных клеток (триптаза, CD33). Кроме того, c-kit+ клетки в эксплантной культуре не экспрессировали маркеров зрелых/дифференцированных эндотелиальных (CD31, KDR), гладкомышечных (Gata 6, гладкомышечный α-актин) клеток и кардиомиоцитов (Nkx 2,5, тропонинI, саркомерный α-актинин).To analyze the immunophenotype of explant cells, flow cytofluorimetry and immunofluorescence staining methods were used (examples 3, 4). After 3 weeks of culturing the abalone explants, PP revealed several cell subpopulations based on the expression of surface markers corresponding to mature endothelium and its predecessors - CD31 + (1.3 ± 0.7%), CD34 + (2.3 ± 1.54%), mesenchymal cells - CD105 + (85.6 ± 6.6%); CD73 + (92.6 ± 4.2%), CD90 + (91.87 ± 6.53%)) and SPKS - c-kit + (3.37 ± 6.7%), sca-1 + (0.33 ± 0.24%)). A characteristic feature of c-kit + cells in the explant culture of abalone PP was the absence of hematopoietic markers (CD45, CD34, Lin1) and mast cells (tryptase, CD33). In addition, c-kit + cells in the explant culture did not express mature / differentiated endothelial (CD31, KDR), smooth muscle (Gata 6, smooth muscle α-actin) cells and cardiomyocytes (Nkx 2,5, troponin I, sarcomeric α-actin) markers.

1.2 Сортировка клеток эксплантной культуры методом иммуномагнитной селекции с использованием антител к c-kit1.2 Sort of explant culture cells by immunomagnetic selection using antibodies to c-kit

Через 21 день с момента начала культивирования клетки эксплантной культуры использовали для проведения иммуномагнитной селекции и получения обогащенной культуры резидентных c-kit+ СКС. Для сортинга использовались первичные моноклональные антитела к антигену c-kit человека («Biolegend», США) и вторичные антитела к Fc-фрагменту мышиных IgG («DynalBiotech», Норвегия), конъюгированные с магнитными бусинами (размер 4,5 мкм). Клетки эксплантной культуры обрабатывали средой для открепления клеток Accutase («ICT», США) в течение 10 минут (под визуальным контролем под микроскопом). Полученные клетки профильтровали через нейлоновые мембраны с размером пор 40 микрон и далее использовали для иммуномагнитной селекции.After 21 days from the start of cultivation, explant cells were used to carry out immunomagnetic selection and obtain an enriched culture of resident c-kit + SCS. For sorting, primary monoclonal antibodies to the human c-kit antigen (Biolegend, USA) and secondary antibodies to the mouse IgG Fc fragment (DynalBiotech, Norway) conjugated with magnetic beads (4.5 μm in size) were used. The explant cells were treated with Accutase cell detachment medium (ICT, USA) for 10 minutes (under visual inspection under a microscope). The resulting cells were filtered through nylon membranes with a pore size of 40 microns and then used for immunomagnetic selection.

Перед проведением иммуномагнитной селекции вторичные антитела, конъюгированные с бусинами, отмывали от азида натрия в 10 мл буфера для селекции (фосфатно-солевой буфер без Са⁺⁺ и Mg⁺⁺/0,l% бычьего сывороточного альбумина/2 мМ ЭДТА, рН 7,4) 2 раза на магните. Далее в 100 мкл холодного буфера для селекции проводили инкубацию первичных моноклональных антител к антигену c-kit человека («Biolegend», США) и вторичных антител к Fc-фрагменту мышиных IgG, связанных с бусинами, в течение 30 минут при постоянном покачивании и перемешивании при +4°С. После инкубации пробирку с магнитными бусами и антителами помещали в магнитное поле. Далее 3 раза проводили отмывку на магните несвязавшихся антител с помощью буфера для селекции (10 мл). После промывки к суспензии клеток (эксплантной культуры) добавляли 7 мл буфера для селекции с антителами (проинкубированные первичные и вторичные антитела) исходя из расчета 3 бусины на клетку и инкубировали при постоянном покачивании и перемешивании на +4°С в течение 40 минут. После инкубации пробирку ставили на магнит на 3 минуты, после чего убирали среду с несвязавшимися клетками. Затем добавляли 10 мл буфера для селекции, ресуспендировали пипеткой и снова ставили на магнит. Эту процедуру повторяли 5 раз. Затем клетки, связанные с магнитными бусами, ресуспендировали в среде культивирования (фиг.3).Before conducting immunomagnetic selection, the secondary antibodies conjugated with beads were washed from sodium azide in 10 ml of selection buffer (phosphate-buffered buffer without Ca ⁺⁺ and Mg ⁺⁺ / 0, l% bovine serum albumin / 2 mM EDTA, pH 7, 4) 2 times on a magnet. Then, in 100 μl of cold selection buffer, primary monoclonal antibodies to the human c-kit antigen (Biolegend, USA) and secondary antibodies to the mouse IgG Fc fragment associated with beads were incubated for 30 minutes with constant shaking and stirring at + 4 ° C. After incubation, the tube with magnetic beads and antibodies was placed in a magnetic field. Then, 3 times, unbound antibodies were washed on a magnet using a selection buffer (10 ml). After washing, 7 ml of selection buffer with antibodies (incubated primary and secondary antibodies) was added to the cell suspension (explant culture) based on the calculation of 3 beads per cell and incubated with constant shaking and stirring at + 4 ° С for 40 minutes. After incubation, the tube was placed on a magnet for 3 minutes, after which the medium with unbound cells was removed. Then, 10 ml of selection buffer was added, resuspended with a pipette and again placed on a magnet. This procedure was repeated 5 times. Then the cells associated with the magnetic beads were resuspended in the culture medium (FIG. 3).

Полученные этим методом резидентные c-kit+ CKC экспрессировали маркер Ki-67, что указывает на их способность к пролиферации in vitro. Отсутствие маркеров CD45, CD34, Lini и триптазы указывает на отсутствие гематопоэтических и тучных клеток в культуре c-kit+ клеток, выделенных из эксплантной культуры. Свежевыделенные c-kit+ клетки не окрашивались специфическими антителами (примеры 3, 4) на маркеры кардиомиоцитов (десмин, α-саркомерный актин, α-саркомерный актинин и коннексин-43), гладкомышечных (α-гладкомышечный актин, десмин), эндотелиальных клеток (CD31, vW) и фибробластов (виментин, фибронектин), что свидетельствует об отсутствии спонтанной дифференцировки в выбранных условиях культивирования эксплантов. Было обнаружено, что выделенные с помощью этого метода резидентные c-kit+ CKC обладают основными свойствами стволовых клеток.Resident c-kit + CKC obtained by this method expressed the Ki-67 marker, indicating their ability to proliferate in vitro. The absence of markers CD45, CD34, Lini and tryptase indicates the absence of hematopoietic and mast cells in the culture of c-kit + cells isolated from the explant culture. Freshly isolated c-kit + cells were not stained with specific antibodies (examples 3, 4) for markers of cardiomyocytes (desmin, α-sarcomeric actin, α-sarcomeric actinin and connexin-43), smooth muscle (α-smooth muscle actin, desmin), endothelial cells (CD31 , vW) and fibroblasts (vimentin, fibronectin), which indicates the absence of spontaneous differentiation in the selected explant cultivation conditions. It was found that the resident c-kit + CKC isolated using this method possess the basic properties of stem cells.

Пример 2. Иммунофлуоресцентное окрашивание ткани миокардаExample 2. Immunofluorescence staining of myocardial tissue

Ткань миокарда замораживали в жидком азоте. Криосрезы миокарда (толщиной 7 мкм) фиксировали в 3,7%-ном растворе формалина в течение 15 мин. Для снижения неспецифического связывания антител с образцами на срезы наносили блокирующий раствор (10% бычьего сывороточного альбумина в фосфатно-солевом буфере) на 30 мин. После удаления блокирующего раствора срезы инкубировали с первичными антителами к антигенам c-kit («Dako», США, и «Biolegend», США), саркомерному α-актинину («Sigma», США), CD31 («BDPharmingen», США), MDR1 («Chemicon», США), Sca-1 («AbDSerotec», США), Islet-1 («Abeam», США), CD45 («Abeam», США), CD34 («BDPharmingen», США; «SantaCruz», США), IGF-1R («Calbiochem», США), C-met («Zymed», США), α-гладкомышечному актину («Sigma», США), VEGFR2 («Abeam», США), CD105 («AbDSerotec», США), NG2 («Chemicon», США), Nkx 2,5 («Abeam», США), Gata 4 («SantaCruz», США), Ki-67 («BDPharmingen», США), триптазе («SantaCruz», США) в разведениях, рекомендованных производителем, в течение 60 мин. Затем срезы отмывали от первичных антител в ФСБ, инкубировали в течение 60 мин со вторичными флуоресцентно-меченными антителами AlexaFluor («Invitrogen», США) в разведении 1:2000 в растворе 1% бычьего сывороточного альбумина в фосфатно-солевом буфере и затем 3 раза отмывали от антител в фосфатно-солевом буфере. Ядра докрашивали DAPI. После отмывки срезы на стеклах заключали в среде Aquapolymount («Polysciencesinc», США). Препараты анализировали с использованием флуоресцентного микроскопа Axiovert 200M («Zeiss», Германия). Документирование изображений производили с помощью цифровой видеокамеры Axiocam HRC («Zeiss», Германия) и обработки изображения в программах Axiovision 3.1 («Zeiss», Германия) и AdobePhotoShopCS («AdobeSystems», США).Myocardial tissue was frozen in liquid nitrogen. Myocardial cryosections (7 μm thick) were fixed in a 3.7% formalin solution for 15 minutes. To reduce the non-specific binding of antibodies to samples, a blocking solution (10% bovine serum albumin in phosphate-buffered saline) was applied to the sections for 30 minutes. After removal of the blocking solution, the sections were incubated with primary antibodies to c-kit antigens (Dako, USA, and Biolegend, USA), sarcomeric α-actinin (Sigma, USA), CD31 (BDPharmingen, USA), MDR1 (Chemicon, USA), Sca-1 (AbDSerotec, USA), Islet-1 (Abeam, USA), CD45 (Abeam, USA), CD34 (BDPharmingen, USA; SantaCruz ", USA), IGF-1R (" Calbiochem ", USA), C-met (" Zymed ", USA), α-smooth muscle actin (" Sigma ", USA), VEGFR2 (" Abeam ", USA), CD105 ( “AbDSerotec”, USA), NG2 (“Chemicon”, USA), Nkx 2.5 (“Abeam”, USA), Gata 4 (“SantaCruz”, USA), Ki-67 (“BDPharmingen”, USA), tryptase ("SantaCruz", USA) in dilutions recommended by the manufacturer for 60 minutes. Then, the sections were washed from primary antibodies in FSB, incubated for 60 min with AlexaFluor secondary fluorescently-labeled antibodies (Invitrogen, USA) at a 1: 2000 dilution in a solution of 1% bovine serum albumin in phosphate-buffered saline and then washed 3 times from antibodies in phosphate buffered saline. The cores were stained with DAPI. After washing, the sections on the glass were enclosed in Aquapolymount medium (Polysciencesinc, USA). The preparations were analyzed using an Axiovert 200M fluorescence microscope (Zeiss, Germany). Image documentation was performed using an Axiocam HRC digital video camera (Zeiss, Germany) and image processing using Axiovision 3.1 (Zeiss, Germany) and AdobePhotoShopCS (AdobeSystems, USA).

Пример 3. Иммунофлуоресцентное окрашивание выделенных клеток и проточная цитофлуориметрияExample 3. Immunofluorescence staining of isolated cells and flow cytofluorimetry

Для анализа методом проточной цитофлуориметрии суспензию выделенных клеток отмывали в ФСБ с 1% ФБС и азидом натрия (0,09%) и окрашивали антителами, конъюгированными с флуоресцентными метками к CD117-RPE («DAKO», США); 1:100), SCA-1-FITC («MiltenyiBiotec», США; 1:100), CD34-APC («DAKO», США; 1:200), CD31-FITC («BDPharmingen», США; 1:100), CD45-RPE-Cy5 («DAKO», CUIA; 1:100), CD33-FITC («BDPharmingen», США; 1:100), CD105-FITC («AbD Serotec», США; 1:100), CD73-PE («BD Pharmingen», США; 1:100), CD90-FITC («BDPharmingen», США; 1:100), Linl-FITC («BD Pharmingen», США; 1:100) с использованием соответствующих контролей: IgG₁-RPE («DAKO», США; 1:100), IgG₁-APC («DAKO», США; 1:200), IgG₁-FITC («BDPharmingen», США; 1:100). Антитела разводили в фосфатно-солевом буфере с 1% фетальной сыворотки коров и окрашивали клетки при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем клетки отмывали от излишков антител в ФСБ. Анализ проводили на клеточном сортере MoFlo («DakoCytomation», Дания) или на проточном цитофлуориметре BDFACSCanto™II («BDPharmingen», США).For analysis by flow cytofluorimetry, the suspension of the isolated cells was washed in PBS with 1% PBS and sodium azide (0.09%) and stained with antibodies conjugated with fluorescent labels to CD117-RPE (DAKO, USA); 1: 100), SCA-1-FITC (Miltenyi Biotec, USA; 1: 100), CD34-APC (DAKO, USA; 1: 200), CD31-FITC (BDPharmingen, USA; 1: 100 ), CD45-RPE-Cy5 ("DAKO", CUIA; 1: 100), CD33-FITC ("BDPharmingen", USA; 1: 100), CD105-FITC ("AbD Serotec", USA; 1: 100), CD73-PE (BD Pharmingen, USA; 1: 100), CD90-FITC (BDPharmingen, USA; 1: 100), Linl-FITC (BD Pharmingen, USA; 1: 100) using appropriate controls : IgG ₁ -RPE ("DAKO", USA; 1: 100), IgG ₁ -APC ("DAKO", USA; 1: 200), IgG ₁ -FITC ("BDPharmingen", USA; 1: 100). Antibodies were diluted in phosphate-buffered saline with 1% fetal bovine serum and stained cells at room temperature for 30 minutes. Then the cells were washed from excess antibodies in the FSB. The analysis was performed on a MoFlo cell sorter (DakoCytomation, Denmark) or on a BDFACSCanto ™ II flow cytometer (BDPharmingen, USA).

Пример 4. Иммунофлуоресцентное окрашивание клетокExample 4. Immunofluorescence staining of cells

Клетки, культивированные на стеклах, промывали в фосфатно-солевом буфере и фиксировали 4% формалином в течение 15 минут. Для снижения неспецифического связывания антител с клетками препараты инкубировали в блокирующем растворе (1% бычьего сывороточного альбумина/10% сыворотки донора вторых антител/фосфатно-солевой буфер) в течение 30 минут. После удаления излишка блокирующего раствора клетки инкубировали в течение 60 мин с первичными антителами (в концентрациях, рекомендованных изготовителем) в растворе (1% бычий сывороточный альбумин/фосфатно-солевой буфер). Использовали первичные антитела против c-kit («Dako», США, и «Biolegend», США), саркомерного α-актинина («Sigma», США), саркомерного α-актина («Sigma», США), CD31 («BDPharmingen», США), vW («Sigma», США), CD45 («Abeam», США), CD34 («BDPharmingen», США), α-гладкомышечного актина («Sigma», США), VEGFR2 («Abeam», США), Nkx 2,5 («Abeam», США, и «SantaCruz», США), Gata 4 («SantaCruz», США), ТропонинаI («SantaCruz», США), Ki-67 («BDPharmingen», США), триптазы («SantaCruz», США), коннексина-43 («Zymedlaboratoriesinc», США). Клетки отмывали от излишков антител 3 раза в фосфатно-солевом буфере. Затем инкубировали клетки в течение 60 минут с вторичными антителами AlexaFluor («Invitrogen», США), меченными TexasRed или FITC в стандартном разведении 1:2000 в растворе (1% бычьего сывороточного альбумина/фосфатно-солевой буфер). Отмывали клетки от излишков антител в фосфатно-солевом буфере 3 раза. Ядра клеток докрашивали DAPI. После отмывки в фосфатно-солевом буфере стекла с клетками заключали в Aquapolymount («Polysciencesinc», США).Cells cultured on glasses were washed in phosphate-buffered saline and fixed with 4% formalin for 15 minutes. To reduce the non-specific binding of antibodies to cells, the preparations were incubated in a blocking solution (1% bovine serum albumin / 10% serum of the second antibody donor / phosphate-buffered saline) for 30 minutes. After removing the excess blocking solution, the cells were incubated for 60 min with primary antibodies (at concentrations recommended by the manufacturer) in a solution (1% bovine serum albumin / phosphate-buffered saline). Primary antibodies were used against c-kit (Dako, USA, and Biolegend, USA), sarcomeric α-actinin (Sigma, USA), sarcomeric α-actin (Sigma, USA), CD31 (BDPharmingen ", USA), vW (" Sigma ", USA), CD45 (" Abeam ", USA), CD34 (" BDPharmingen ", USA), α-smooth muscle actin (" Sigma ", USA), VEGFR2 (" Abeam ", USA), Nkx 2.5 (Abeam, USA, and SantaCruz, USA), Gata 4 (SantaCruz, USA), Troponina I (SantaCruz, USA), Ki-67 (BDPharmingen, USA ), tryptases ("SantaCruz", USA), connexin-43 ("Zymedlaboratoriesinc", USA). Cells were washed from excess antibodies 3 times in phosphate-buffered saline. Cells were then incubated for 60 minutes with AlexaFluor secondary antibodies (Invitrogen, USA) labeled with TexasRed or FITC in a standard dilution of 1: 2000 in solution (1% bovine serum albumin / phosphate buffered saline). Washed cells from excess antibodies in phosphate-buffered saline 3 times. Cell nuclei were stained with DAPI. After washing in phosphate-buffered saline, glass with cells was enclosed in Aquapolymount (Polysciencesinc, USA).

Полученные таким образом препараты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Axiovert 200M («Zeiss», Германия). Документирование изображений производили с помощью цифровой видеокамеры Axiocam HRC («Zeiss», Германия) и обработки изображения в программах Axiovision 3.1 («Zeiss», Германия) и AdobePhotoShop («AdobeSystems», США).The preparations thus obtained were analyzed using an Axiovert 200M fluorescence microscope (Zeiss, Germany). Image documentation was performed using an Axiocam HRC digital video camera (Zeiss, Germany) and image processing using Axiovision 3.1 (Zeiss, Germany) and AdobePhotoShop (AdobeSystems, USA).

Claims

1. A method for producing resident stem cells of a mammalian heart expressing c-kit and / or sca-1 and / or MDR1 surface markers, during which myocardial tissue samples are isolated, samples are crushed, they are enzymatically treated with collagenase and trypsin and cultured on a culture cup coated with fibronectin and further immunomagnetic selection, characterized in that the culture on a culture cup coated with fibronectin is carried out by the method of explant culture of ground samples s obtained after their enzymatic treatment, which is used to partially split the tissue of the sample and the adhesion of explants to the surface of the culture plate.

2. The method according to claim 1, characterized in that the grinding of myocardial samples is carried out to obtain pieces of size 1-3 mm ³ .

3. The method according to claim 1, characterized in that proteolytic enzymes are used to process myocardial samples.

4. The method according to claim 3, characterized in that the enzyme treatment of myocardial samples is carried out in a solution containing 0-0.5% collagenase A and 0-0.2% trypsin for 1-30 minutes at 37 ° C.

5. The method according to claim 1, characterized in that fibronectin for coating the culture cups is used in a concentration of from 1 to 1000 μg / ml.

6. The method according to claim 1, characterized in that the cultivation of myocardial samples (explants) is carried out in IMDM medium containing 1-20% fetal calf serum, 100 units / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin and 2 mm L-glutamine for 7-40 days at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO ₂ , with a change of medium every 1-5 days.

7. The method according to claim 1, characterized in that the immunomagnetic selection of cells of the explant culture to obtain resident stem cells is carried out with surface markers c-kit, and / or sca-1, and / or MDR1.

8. The method according to claim 9, characterized in that the immunomagnetic selection of the cells of the explant culture from one myocardial sample is carried out from 1 to 5 consecutive steps at intervals of 5-21 days.