RU2505303C2 - Method for preparing corneal biotransplant - Google Patents
Method for preparing corneal biotransplant Download PDFInfo
- Publication number
- RU2505303C2 RU2505303C2 RU2011137713/15A RU2011137713A RU2505303C2 RU 2505303 C2 RU2505303 C2 RU 2505303C2 RU 2011137713/15 A RU2011137713/15 A RU 2011137713/15A RU 2011137713 A RU2011137713 A RU 2011137713A RU 2505303 C2 RU2505303 C2 RU 2505303C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- corneal
- biograft
- matrix
- cells
- biotransplant
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и медицины и может быть использовано для ускорения заживления дефектов роговицы, а так же для восстановления эпителия роговицы при различных повреждениях, сопровождающихся частичной или полной утратой эпителиальных прогениторов (лимбальных стволовых клеток) роговицы.The invention relates to the field of biotechnology and medicine and can be used to accelerate the healing of corneal defects, as well as to restore corneal epithelium with various injuries, accompanied by partial or complete loss of corneal epithelial progenitors (limbal stem cells).
Роговица - передняя фиброзная оболочка глаза, состоящая из 5 слоев. Она представляет собой оптически активную среду, обеспечивающую поступление света к световоспринимающему аппарату - сетчатке. При этом прозрачность роговицы зависит от многих факторов, в том числе от сохранности на ее внешней поверхности специфического многослойного неороговевающего эпителия [1]. Его прижизненная регенерация, как физиологическая так и репаративная, обеспечивается стволовыми клетками - эпителиальными прогениторами, локализованными в криптах Вогта зоны лимба [2].The cornea is the anterior fibrous membrane of the eye, consisting of 5 layers. It is an optically active medium that provides light to the light-receiving apparatus - the retina. Moreover, the transparency of the cornea depends on many factors, including the preservation on its outer surface of a specific multilayer non-keratinizing epithelium [1]. Its intravital regeneration, both physiological and reparative, is provided by stem cells - epithelial progenitors localized in the crypts of Vogt of the limb zone [2].
В зависимости от объема поражения лимба, развивается частичная или полная утрата эпителиальных прогениторов роговицы. Это приводит к замещению прозрачного эпителия на непрозрачный конъюнктивальный, что уменьшает светопроницаемость роговицы и резко снижает зрение [3].Depending on the extent of the lesion of the limb, a partial or complete loss of corneal epithelial progenitors develops. This leads to the replacement of a transparent epithelium by an opaque conjunctival, which reduces the light transmission of the cornea and sharply reduces vision [3].
В настоящее время перспективной методикой лечения подобных патологических состояний является трансплантация культивированных ех vivo эпителиальных прогениторов роговицы на матрице. При пересадке происходит восстановление популяции утраченных стволовых клеток, за счет чего восстанавливается эпителий роговицы. Это увеличивает прозрачность роговицы и улучшает остроту зрения поврежденного глаза [4].Currently, a promising method for the treatment of such pathological conditions is the transplantation of cultured ex vivo epithelial corneal progenitors on the matrix. During transplantation, the population of lost stem cells is restored, due to which the corneal epithelium is restored. This increases the transparency of the cornea and improves the visual acuity of the damaged eye [4].
Трансплантация культивированных клеток предусматривает применение носителя (матрицы) для их фиксации на роговице и оптимизации процесса миграции и встраивания клеток в области повреждения. Первоначально в качестве матрицы использовалась человеческая амниотическая мембрана, обладающая противовоспалительным и антиапоптотическим эффектами за счет факторов роста, цитокинов, металлопротеиназ, антимикробных факторов, присутствующих в амнионе [5-7]. Однако процесс получения такой матрицы в обязательном порядке предусматривает как ее тестирование на инфекционную безопасность, так и особые условия хранения и транспортировки (при - 70°С), что обуславливает целесообразность продолжения поиска оптимального носителя.Transplantation of cultured cells involves the use of a carrier (matrix) to fix them on the cornea and optimize the process of migration and incorporation of cells in the area of damage. Initially, the human amniotic membrane was used as a matrix, with anti-inflammatory and anti-apoptotic effects due to growth factors, cytokines, metalloproteinases, antimicrobial factors present in the amnion [5-7]. However, the process of obtaining such a matrix without fail provides both its testing for infectious safety and special storage and transportation conditions (at -70 ° C), which makes it expedient to continue the search for the optimal carrier.
Известна методика получения биотрансплантата эпителиальных прогениторов роговицы, где в качестве носителя (матрицы) используется мягкая контактная линза [8]. Однако использование данного носителя осложняется тем, что любая мягкая контактная линза имеет ту или иную степень подвижности (от 0,2 мм) на роговице при моргании. Соответственно, применение биотрансплантата на основе такого носителя сопровождается его регулярным смещением и приводит к разрыву формирующихся межклеточных контактов. Так же в процессе ношения биотрансплантат может быть легко утрачен за счет особенностей удержания контактных линз на поверхности роговицы. Таким образом, применение биотрансплантата на основе мягких контактных линз может привести к нивелированию миграции и встраивания эпителиальных прогениторов роговицы в области повреждения.A known technique for producing a biograft of corneal epithelial progenitors, where a soft contact lens is used as a carrier (matrix) [8]. However, the use of this carrier is complicated by the fact that any soft contact lens has one degree or another of mobility (from 0.2 mm) on the cornea during blinking. Accordingly, the use of a biograft based on such a carrier is accompanied by its regular displacement and leads to rupture of the formed intercellular contacts. Also in the process of wearing a biograft can be easily lost due to the features of the retention of contact lenses on the surface of the cornea. Thus, the use of a biotransplant based on soft contact lenses can lead to leveling of migration and insertion of corneal epithelial progenitors in the area of damage.
В экспериментальных исследованиях [9; 10] было показано, что для культивирования эпителиальных клеток (любого происхождения, в том числе и эпителиальных прогениторов роговицы), необходимо наличие фидерного слоя. Он не только является источником питательных веществ, но и обеспечивает их транспорт в направлении вышележащих слоев клеток. В большинстве известных исследований [11, 12] для культивирования эпителиальных прогениторов роговицы человека в качестве фидерного слоя использовалась клеточная линия эмбриональных мышиных фибробластов. При культивировании на таком фидерном слое эпителиальные прогениторы тесно ассоциированы и сохраняют прочную связь с мышиными фибробластами при механической и ферментативной обработке, что приводит к адсорбции ксеногенных белков и белок-содержащих высокомолекулярных гликозаминогликанов на мембранах культивируемых прогениторов. Кроме того было показано, что использование фидерного слоя на основе клеточной линии эмбриональных мышиных фибробластов провоцирует иммунный ответ и гибель культивированных клеток при трансплантации за счет содержания сиаловой кислоты Neu5Gc, против которой у людей имеются циркулирующие антитела [13].In experimental studies [9; 10] it was shown that for the cultivation of epithelial cells (of any origin, including corneal epithelial progenitors), the presence of a feeder layer is necessary. It is not only a source of nutrients, but also provides their transport in the direction of the overlying layers of cells. In most known studies [11, 12], a cell line of embryonic murine fibroblasts was used as a feeder layer to cultivate human corneal epithelial progenitors. When cultivated on such a feeder layer, epithelial progenitors are closely associated and retain strong bonds with murine fibroblasts during mechanical and enzymatic treatment, which leads to the adsorption of xenogenic proteins and protein-containing high molecular weight glycosaminoglycans on the membranes of cultivated progenitors. In addition, it was shown that the use of a feeder layer based on the cell line of embryonic murine fibroblasts provokes an immune response and death of cultured cells during transplantation due to the content of Neu5Gc sialic acid, against which humans have circulating antibodies [13].
Таким образом, применение фидерного слоя на основе клеточной линии эмбриональных мышиных фибробластов для получения биотрансплантата для роговицы повышает его иммуногенность и может привести к нивелированию встраивания эпителиальных прогениторов роговицы в области повреждения.Thus, the use of a feeder layer based on the cell line of embryonic murine fibroblasts to obtain a biograft for the cornea increases its immunogenicity and can lead to leveling the incorporation of corneal epithelial progenitors in the lesion area.
Помимо необходимости наличия носителя и фидерного слоя особые требования предъявляются к морфологической структуре биотрансплантата, которая определяет результативность применения биотрансплантата эпителиальных прогениторов роговицы. Наиболее эффективными оказались биотрансплантаты, содержащие на носителе (матрице) многослойные клеточные пласты прогениторов с большим количеством десмосомальных межклеточных соединений и относительно меньшим интерцеллюлярным пространством. Испытание таких биотрансплантатов продемонстрировало их большую эффективность по сравнению с биотрансплантатами, содержащими однослойные клеточные пласты [14].In addition to the need for a carrier and feeder layer, special requirements are imposed on the morphological structure of the biograft, which determines the effectiveness of the use of a biograft of corneal epithelial progenitors. The most effective were biotransplants containing multilayer progenitor cell layers on the carrier (matrix) with a large number of desmosomal intercellular compounds and a relatively smaller intercellular space. Testing of such biotransplants has demonstrated their greater efficiency compared to biotransplants containing single-layer cell layers [14].
Известен биотрансплантат, полученный на матрице с применением аллогенных эпителиальных прогениторов роговицы в концентрации 4×104 клеток/см2 [15]. Он содержит клеточный носитель (матрицу) в виде пленки на основе бедной тромбоцитами плазмы; фидерный (промежуточный) слой на основе клеточной линии эмбриональных мышиных фибробластов и эпителиальные прогениторы роговицы. Данный биотрансплантат способствует восстановлению роговичного эпителия и может быть перспективным для лечения двухсторонних поражений роговицы. Однако его создание затратно, так как требует дополнительных расходов на получение пленки из обедненной тромбоцитами плазмы, на фидерный слой на основе клеточной линии эмбриональных мышиных фибробластов и на синтетические факторы роста. Кроме того, технология получения биотрансплантата отличается многоэтапностью, а использование фидерного слоя на основе клеточной линии эмбриональных мышиных фибробластов усиливает его иммуногенность.Known biotransplant obtained on the matrix using allogeneic corneal epithelial progenitors at a concentration of 4 × 10 4 cells / cm 2 [15]. It contains a cell carrier (matrix) in the form of a film based on a platelet-poor plasma; feeder (intermediate) layer based on the cell line of embryonic murine fibroblasts and epithelial corneal progenitors. This biograft helps to restore corneal epithelium and may be promising for the treatment of bilateral corneal lesions. However, its creation is costly, since it requires additional costs for obtaining a film from platelet-depleted plasma, to a feeder layer based on a cell line of embryonic murine fibroblasts, and to synthetic growth factors. In addition, the technology for producing a biograft is multistage, and the use of a feeder layer based on a cell line of embryonic murine fibroblasts enhances its immunogenicity.
Наиболее близким техническим решением к заявляемому, является способ реконструкции человеческого роговичного эпителия in vitro [16]. Он включает подбор и наращивание эпителиальных прогениторов, способных к регенерации in vitro; получение прозрачной биодеградируемой фибриновой подложки, обеспечивающей рост эпителиальных прогениторов и подготовку культуры эпителиальных прогениторов роговицы на биодеградируемой фибриновой подложке в виде диска, сопоставимой по размеру с роговицей. Подбор эпителиальных прогениторов происходит на основе клонального анализа и использования специфических генетических маркеров, таких как keratin 19, keratin 12, keratin 3, protein p63. Биодеградируемая фибриновая подложка создается на основе двухкомпонентного фибринового клея, Tissucol® (Baxter-Immuno, Vienna, Austria), который модифицируется путем добавления хлоридов натрия и кальция для соллюбилизации тромбина и фибриногена. Это обеспечивает прозрачность и эластичность получаемой подложки. Для создания биотрансплантата на фибриновую подложку наносят клеточную линию эмбриональных мышиных фибробластов, прошедших 10-ти кратное деление. Затем сверху наносят эпителиальные прогениторы из расчета от 2,5×104 до 1×105 клеток на см2. Далее этот комплекс культивируется в среде DMEM, содержащей культуральную концентрацию антибиотиков при 5% СО2 и 37°С в течение срока, необходимого для получения биотрансплантата.The closest technical solution to the claimed is a method of reconstruction of human corneal epithelium in vitro [16]. It includes the selection and extension of epithelial progenitors capable of in vitro regeneration; obtaining a transparent biodegradable fibrin substrate, providing growth of epithelial progenitors and preparing a culture of corneal epithelial progenitors on a biodegradable fibrin substrate in the form of a disk comparable in size to the cornea. The selection of epithelial progenitors is based on clonal analysis and the use of specific genetic markers, such as keratin 19, keratin 12, keratin 3, protein p63. The biodegradable fibrin substrate is based on a two-component fibrin glue, Tissucol® (Baxter-Immuno, Vienna, Austria), which is modified by adding sodium and calcium chlorides to solubilize thrombin and fibrinogen. This ensures the transparency and elasticity of the resulting substrate. To create a biograft, a cell line of mouse embryonic fibroblasts that have undergone 10-fold division is applied to the fibrin substrate. Then, epithelial progenitors are applied on top of the calculation from 2.5 × 10 4 to 1 × 10 5 cells per cm 2 . Further, this complex is cultivated in DMEM medium containing a culture concentration of antibiotics at 5% CO 2 and 37 ° C for the period necessary to obtain a biograft.
Рассматриваемый в качестве прототипа способ позволяет получать биотрансплантат эпителиальных прогениторов роговицы на матрице из модифицированной фибриновой подложки. Его морфологическое строение отличается тем, что, в матрице из фибрина "утопают" клетки фидерного слоя - эмбриональные мышиные фибробласты, а сверху расположены отдельные эпителиальные прогениторы. Биотрансплантат может быть использован для заживления дефектов роговицы, связанных с частичной или полной утратой ее эпителиальных прогениторов.Considered as a prototype method, it is possible to obtain a biograft of corneal epithelial progenitors on a matrix of a modified fibrin substrate. Its morphological structure is distinguished by the fact that cells of the feeder layer — embryonic murine fibroblasts “are buried” in the matrix of fibrin, and individual epithelial progenitors are located on top. A biograft can be used to heal corneal defects associated with the partial or complete loss of its epithelial progenitors.
Процесс получения такого биотрансплантата состоит из четырех основных этапов, включающих этапы получения матрицы, ее модификации, подбора клеток и культивирования. Используемый фидерный слой на основе клеточной линии эмбриональных мышиных фибробластов усиливает иммуногенность биотрансплантата и увеличивает себестоимость его получения. Отсутствует система контроля морфологической структуры биотрансплантата, как в процессе культивирования, так и перед трансплантацией, что снижает терапевтический эффект его применения.The process of obtaining such a biograft consists of four main stages, including the steps of obtaining the matrix, its modification, selection of cells and cultivation. Used feeder layer based on the cell line of embryonic murine fibroblasts enhances the immunogenicity of the biograft and increases the cost of its production. There is no monitoring system for the morphological structure of the biograft, both during cultivation and before transplantation, which reduces the therapeutic effect of its use.
Задачей изобретения является разработка новой технологии получения биотрансплантата для роговицы.The objective of the invention is to develop a new technology for biotransplant for the cornea.
Технический результат, который будет достигнут от использования заявляемого изобретения, заключается в снижении себестоимости и иммуногенности биотрансплантата, в приближении морфологического строения биотрансплантата к строению роговицы человека и возможности контроля его морфологической структуры как в процессе культивирования, так и перед трансплантацией.The technical result that will be achieved by using the claimed invention is to reduce the cost and immunogenicity of the biograft, in approximating the morphological structure of the biograft to the structure of the human cornea and the ability to control its morphological structure both during cultivation and before transplantation.
Технический результат достигается тем, что в способе получения биотрансплантата для роговицы, включающем нанесение на матрицу клеток роговицы с последующим культивированием, в качестве клеток роговицы используют аутогенную смешанную культуру клеток с содержанием эпителиальных прогениторов роговицы не менее 15% и роговичных фибробластов не более 85%, а в качестве матрицы используют полимерную пленку из немодифицированной наноструктурированной гиалуроновой кислоты.The technical result is achieved by the fact that in the method of producing a biograft for the cornea, including applying to the matrix of corneal cells with subsequent cultivation, an autogenous mixed cell culture with a content of at least 15% of corneal epithelial progenitors and no more than 85% of corneal fibroblasts is used as corneal cells as a matrix, a polymer film of unmodified nanostructured hyaluronic acid is used.
Сущность изобретения заключается в нанесении аутогенной смешанной культуры клеток роговицы на матрицу из немодифицированной наноструктуриновой гиалуроновой кислоты.The essence of the invention lies in the application of an autogenous mixed culture of corneal cells to a matrix of unmodified nanostructured hyaluronic acid.
Использование в качестве матрицы пленки из немодифицированной наноструктурированной гиалуроновой кислоты возможно за счет ее устойчивой пространственной нанокаркасной конструкции. Данная конструкция не требует ксеногенного (клеточной линии эмбриональных мышиных фибробластов) или аллогенного фидерных слоев, так как он формируется из аутогенных кератоцитов (роговичных фибробластов), обладающих высоким сродством к матрице из немодифицированной наноструктурированной гиалуроновой кислоты.The use of a film of unmodified nanostructured hyaluronic acid as a matrix is possible due to its stable spatial nanoscale structure. This design does not require xenogenic (cell line of embryonic murine fibroblasts) or allogeneic feeder layers, since it is formed from autogenic keratocytes (corneal fibroblasts), which have high affinity for a matrix of unmodified nanostructured hyaluronic acid.
В данной матрице отсутствуют катализаторы или их примеси. Ее наноструктура обеспечивает пластичность и относительно свободную диффузию кислорода. Применение такого биоматериала в качестве носителя клеток (матрицы) позволяет уменьшить себестоимость и упростить технологию производства.There are no catalysts or impurities in this matrix. Its nanostructure provides plasticity and relatively free diffusion of oxygen. The use of such biomaterial as a carrier of cells (matrix) allows to reduce the cost and simplify the production technology.
Использование аутогенной смешанной культуры клеток роговицы с содержанием эпителиальных прогениторов не менее 15% и кератоцитов (роговичных фибробластов) не более 85% и дальнейшее культивирование на матрице обеспечивает получение многослойных роговичных эпителиальных пластов с плотными межклеточными соединениями. При этом отсутствует необходимость в дополнительном использовании фидерных слоев и дорогостоящих синтетических факторов роста.The use of an autogenous mixed culture of corneal cells with a content of epithelial progenitors of at least 15% and keratocytes (corneal fibroblasts) of not more than 85% and further cultivation on a matrix provides multilayer corneal epithelial layers with dense intercellular junctions. There is no need for additional use of feeder layers and expensive synthetic growth factors.
Применение такой совокупности признаков для получения биотрансплантата уменьшает его себестоимость за счет использования более дешевых исходных материалов, сокращения сроков и упрощения технологии его получения, а за счет содержания аутогенной смешанной культуры клеток роговицы снижается иммуногенность биотрансплантата, приближая морфологическое строение такого биотрансплантата к строению роговицы человека и обеспечивая возможность контроля его морфологической структуры как в процессе культивирования, так и перед трансплантацией.The use of such a combination of features for obtaining a biograft reduces its cost due to the use of cheaper starting materials, shortening the time and simplifying the technology for its production, and due to the content of an autogenous mixed culture of corneal cells, the immunogenicity of the biograft is reduced, bringing the morphological structure of such a biograft to the structure of the human cornea and providing the ability to control its morphological structure both during cultivation and before transplantation s.
Из анализа научно-технической и патентной литературы заявляемой совокупности признаков при получения биотрансплантата, приводящих к значительному снижению себестоимости и иммуногенности, а так же позволяющих получать морфологическую структуру, аналогичную роговице человека по строению и позволяющих осуществлять ее контроль как в процессе культивирования, так и перед трансплантацией нами не выявлено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критериям «новизна» и «изобретательский уровень».From an analysis of the scientific, technical and patent literature of the claimed combination of features when obtaining a biograft, which leads to a significant reduction in cost and immunogenicity, as well as allowing to obtain a morphological structure similar to the human cornea in structure and allowing it to be controlled both during cultivation and before transplantation we have not identified, which allows us to conclude that the proposed technical solution meets the criteria of "novelty" and "inventive step".
Изобретение осуществляется следующим образом.The invention is as follows.
В качестве матрицы используют биоматериал из немодифицированной наноструктурированной гиалуроновой кислоты. В качестве клеток роговицы используют аутогенную смешанную культуру клеток с содержанием эпителиальных прогениторов роговицы не менее 15% и кератоцитов (роговичных фибробластов) не более 85%.As a matrix, biomaterial from unmodified nanostructured hyaluronic acid is used. As a corneal cell, an autogenous mixed cell culture is used with a content of corneal epithelial progenitors of at least 15% and keratocytes (corneal fibroblasts) of not more than 85%.
Биоматериал из немодифицированной наноструктурированной гиалуроновой кислоты в виде пленок закрепляют на поверхности стерильных безадгезивных чашек Петри и инкубируют при 5% CO2 и 37°С в среде DMEM, содержащей культуральную концентрацию антибиотиков.The biomaterial of unmodified nanostructured hyaluronic acid in the form of films is fixed on the surface of sterile non-adhesive Petri dishes and incubated at 5% CO 2 and 37 ° C in DMEM containing a cultural concentration of antibiotics.
По истечении 24 часов из чашек Петри микродозатором удаляют инкубационную среду, а на биоматериал наносят суспензию клеток из расчета 105 клеток на см2 поверхности матрицы. Культивируют по стандартной методике в среде DMEM, содержащей культуральную концентрацию антибиотиков, с 10%-ной эмбриональной телячьей сывороткой при 5% CO2 и 37°С со сменой среды и витальным контролем каждые три дня в течение 9-15 дней до получения на поверхности биоматериала следующей морфологической структуры:After 24 hours, the incubation medium is removed from the Petri dishes with a microdoser, and a suspension of cells is applied to the biomaterial at the rate of 10 5 cells per cm 2 of the matrix surface. Cultured according to standard methods in DMEM medium containing a culture concentration of antibiotics with 10% fetal calf serum at 5% CO 2 and 37 ° C with a change of medium and vital control every three days for 9-15 days until the biomaterial is obtained on the surface following morphological structure:
1) все три слоя биотрансплантата: матрица, кератоциты, эпителиальные прогениторы имеют непрерывающийся контакт, то есть биотрансплантат - монолитный,1) all three layers of the biograft: matrix, keratocytes, epithelial progenitors have uninterrupted contact, i.e. the biograft is monolithic,
2) эпителиальные прогениторы составляют многослойную структуру из 2-4 слоев клеток,2) epithelial progenitors constitute a multilayer structure of 2-4 layers of cells,
3) эпителиальные прогениторы в многослойной структуре плотно прилегают друг к другу.3) epithelial progenitors in a multilayer structure are tightly adjacent to each other.
В случае несоответствия описанным критериям, культивирование продолжают до их достижения.If the described criteria do not meet, cultivation is continued until they are achieved.
Вышеперечисленные морфологические свойства биотрансплантата оценивались по стандартной методике с использованием световой микроскопии и окраской гематоксилин-эозином. Для этого образец биотрансплантата фиксировали в 10-% нейтральном формалине с проводкой по спиртам и заливали в парафиновые блоки. Срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилин-эозином и оценивали при помощи световой микроскопии на микроскопе Leica DM 2500.The above morphological properties of the biograft were evaluated by a standard method using light microscopy and hematoxylin-eosin staining. For this, a biograft sample was fixed in 10% neutral formalin with alcohol wiring and embedded in paraffin blocks. Sections 5 μm thick were stained with hematoxylin-eosin and evaluated by light microscopy using a Leica DM 2500 microscope.
По описанной методике получен монолитный биотрансплантат, в котором эпителиальные прогениторы плотно прилегают друг к другу и составляют многослойную структуру из 2-3-х слоев клеток (рис.1), местами в комплексе с базальной мембраной (рис.2), чего не достигается по прототипу.According to the described method, a monolithic biograft was obtained in which epithelial progenitors are tightly adjacent to each other and make up a multilayer structure of 2-3 cell layers (Fig. 1), sometimes in combination with the basement membrane (Fig. 2), which is not achieved by prototype.
Сравнительные данные свойств биотрансплантатов, полученных по изобретению и прототипу приведены в таблице.Comparative data on the properties of biografts obtained according to the invention and the prototype are shown in the table.
Как видно из таблицы, заявляемое изобретение по сравнению с прототипом позволяет сократить сроки получения на 5-8 дней, снизить себестоимость технологии получения в 3,3 раза, осуществить процесс его получения двустадийно, снизить иммуногенность в 10-20 раз, а также производить контроль морфологического строения биотрансплантата в любой момент.As can be seen from the table, the claimed invention in comparison with the prototype can reduce the time for receipt by 5-8 days, reduce the cost of production technology by 3.3 times, carry out the process of its production in two stages, reduce immunogenicity by 10-20 times, and also control morphological biotransplant structures at any time.
Таким образом, изобретение позволяет получать аутогенные монолитные клеточные конструкции, аналогичные по строению роговице человека, состоящие из многослойных эпителиальных пластов с плотными межклеточными контактами в комплексе с матрицей при отсутствии фидерных слоев.Thus, the invention allows to obtain autologous monolithic cell structures similar in structure to the human cornea, consisting of multilayer epithelial layers with tight intercellular contacts in combination with the matrix in the absence of feeder layers.
Список литературы:Bibliography:
1. Сомов Е.Е. Клиническая офтальмология / Е.Е. Сомов. - М.: МЕДпресс-информ, 2005. - 25-27 с.1. Somov E.E. Clinical Ophthalmology / E.E. Somov. - M .: MEDpress-inform, 2005 .-- 25-27 p.
2. Grueterich М., Espana Е.М., Tseng S.С. Ex vivo expansion of limbal epithelial stem cell: amniotic membrane serving as a stem cell niche. Survey of Ophthalmol. 2003; 48:631-646.2. Grueterich M., Espana E.M., Tseng S.C. Ex vivo expansion of limbal epithelial stem cell: amniotic membrane serving as a stem cell niche. Survey of Ophthalmol. 2003; 48: 631-646.
3. Dua H., King A., and Joseph A. A new classification of ocular surface bums. Br J Ophthalmol 2001; 85:1379-1383.3. Dua H., King A., and Joseph A. A new classification of ocular surface bums. Br J Ophthalmol 2001; 85: 1379-1383.
4. Pellegrini G., Rama P., Mavilio F., De Luca М. Epithelial stem cells in corneal regeneration and epidermal gene therapy. J Pathol. 2009; 217:217-228.4. Pellegrini G., Rama P., Mavilio F., De Luca M. Epithelial stem cells in corneal regeneration and epidermal gene therapy. J Pathol. 2009; 217: 217-228.
5. Koizumi N., Fullwood N.J., Bairaktaris G., et al. Cultivation of corneal epithelial cells on intact and denuded human amniotic membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci 2000; 41:2506-2513.5. Koizumi N., Fullwood N.J., Bairaktaris G., et al. Cultivation of corneal epithelial cells on intact and denuded human amniotic membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci 2000; 41: 2506-2513.
6. Kleelan J.A., Groome N.P., Mitchell М.D. Regulation of activen-A production by human amnion, deciduas and placenta in vitro by pro-inflammatory cytokines. Placenta 1998; 19:429-434.6. Kleelan J.A., Groome N.P., Mitchell M.D. Regulation of activen-A production by human amnion, deciduas and placenta in vitro by pro-inflammatory cytokines. Placenta 1998; 19: 429-434.
7. Kubo M., Sonoda Y., Muramatsu R., Usui M. Immunogenicity of human amniotic membrane in experimental xenotransplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci 2001; 42:1539-1546.7. Kubo M., Sonoda Y., Muramatsu R., Usui M. Immunogenicity of human amniotic membrane in experimental xenotransplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci 2001; 42: 1539-1546.
8. Di Girolano N., Chui J., Wakefield D. et al. Cultured human ocular surface epithelium on therapeutic contact lenses. Br J Ophthalmol 2007; 91:459-464.8. Di Girolano N., Chui J., Wakefield D. et al. Cultured human ocular surface epithelium on therapeutic contact lenses. Br J Ophthalmol 2007; 91: 459-464.
9. Green H., Kehinde O., Thomas J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proc Natl Acad Sci USA. 1979; 76:5665-5668.9. Green H., Kehinde O., Thomas J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proc Natl Acad Sci USA. 1979; 76: 5665-5668.
10. Rochat A., Kobayashi K., Barrandon Y. Location of stem cells of human hair follicles by clonal analysis. Cell. 1994; 25; 76(6):1063-1073.10. Rochat A., Kobayashi K., Barrandon Y. Location of stem cells of human hair follicles by clonal analysis. Cell. 1994; 25; 76 (6): 1063-1073.
11. Koizumi N., Inatomi Т., Suzuki Т., Sotozono C., Kinoshita S. Cultivated corneal epithelial stem cell transplantation in ocular surface disorders. Ophthalmology. 2001; 108:1569-1574.11. Koizumi N., Inatomi T., Suzuki T., Sotozono C., Kinoshita S. Cultivated corneal epithelial stem cell transplantation in ocular surface disorders. Ophthalmology. 2001; 108: 1569-1574.
12. Tsai R.J. F., Li L-M., Chen J-K. Reconstruction of damaged corneas by transplantation of autologous limbal epithelial cells. N Engl J Med. 2000; 343:86-93.12. Tsai R.J. F., Li L-M., Chen J-K. Reconstruction of damaged corneas by transplantation of autologous limbal epithelial cells. N Engl J Med. 2000; 343: 86-93.
13. Martin M.J., Muotri A., Gage F. et al. Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nat Med. 2005; 1:228-232.13. Martin M.J., Muotri A., Gage F. et al. Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nat Med. 2005; 1: 228-232.
14. Koizumi N., Cooper L.J., Fullwood N.J. et al. An evaluation of cultivated corneal limbal epithelial cells, using cell-suspension culture. Invest Ophthalmol Vis Sci 2002; 43:2114-2121.14. Koizumi N., Cooper L.J., Fullwood N.J. et al. An evaluation of cultivated corneal limbal epithelial cells, using cell-suspension culture. Invest Ophthalmol Vis Sci 2002; 43: 2114-2121.
15. Luengo Gimeno F., Lavigne V., Gatto S., Croxatto J.O., Correa L., Gallo J.E. One-year follow-up of epithelial corneal cell sheet allografts mounted on platelet poor plasma in rabbits. - Molecular Vision 2009; 2771-2779.15. Luengo Gimeno F., Lavigne V., Gatto S., Croxatto J. O., Correa L., Gallo J.E. One-year follow-up of epithelial corneal cell sheet allografts mounted on platelet poor plasma in rabbits. - Molecular Vision 2009; 2771-2779.
16. Патент US 6610538, НКИ 435/368, опубл. 02.06.2003.16. Patent US 6610538, NKI 435/368, publ. 06/02/2003.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011137713/15A RU2505303C2 (en) | 2011-09-13 | 2011-09-13 | Method for preparing corneal biotransplant |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011137713/15A RU2505303C2 (en) | 2011-09-13 | 2011-09-13 | Method for preparing corneal biotransplant |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2011137713A RU2011137713A (en) | 2013-06-10 |
| RU2505303C2 true RU2505303C2 (en) | 2014-01-27 |
Family
ID=48784310
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011137713/15A RU2505303C2 (en) | 2011-09-13 | 2011-09-13 | Method for preparing corneal biotransplant |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2505303C2 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0572364A2 (en) * | 1992-05-29 | 1993-12-01 | Istituto Nazionale Per La Ricerca Sul Cancro | Differentiated ocular surface epithelial cell cultures, process for the preparation and carrier for uses thereof |
| US6610538B2 (en) * | 2001-08-03 | 2003-08-26 | Provincia Italiana Della Congregazione Dei Figli Dell' Immacolata Concezione - Istituto Dermopatico Dell' Immacolata | Reconstructed laminae of human epithelium corneae and method of producing the same |
-
2011
- 2011-09-13 RU RU2011137713/15A patent/RU2505303C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0572364A2 (en) * | 1992-05-29 | 1993-12-01 | Istituto Nazionale Per La Ricerca Sul Cancro | Differentiated ocular surface epithelial cell cultures, process for the preparation and carrier for uses thereof |
| US6610538B2 (en) * | 2001-08-03 | 2003-08-26 | Provincia Italiana Della Congregazione Dei Figli Dell' Immacolata Concezione - Istituto Dermopatico Dell' Immacolata | Reconstructed laminae of human epithelium corneae and method of producing the same |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Адельшина Л.Р., Рахматуллин P.P., Барышева Е.С., Гильмутдинова И.Р., Епифанова А.А. КЛЕТОЧНАЯ БИОСОВМЕСТИМОСТЬ ПЛАСТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА «ГИАМАТРИКС» // Современные наукоемкие технологии. 2010, No.8, с.86-88. * |
| Адельшина Л.Р., Рахматуллин P.P., Барышева Е.С., Гильмутдинова И.Р., Епифанова А.А. КЛЕТОЧНАЯ БИОСОВМЕСТИМОСТЬ ПЛАСТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА «ГИАМАТРИКС» // Современные наукоемкие технологии. 2010, №8, с.86-88. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2011137713A (en) | 2013-06-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Mobaraki et al. | Corneal repair and regeneration: current concepts and future directions | |
| Hashimoto et al. | Preparation and characterization of decellularized cornea using high-hydrostatic pressurization for corneal tissue engineering | |
| Chakraborty et al. | Regulation of decellularized matrix mediated immune response | |
| Ramachandran et al. | Concise review: the coming of age of stem cell treatment for corneal surface damage | |
| Rauz et al. | Serum eye drops, amniotic membrane and limbal epithelial stem cells—tools in the treatment of ocular surface disease | |
| Griffith et al. | Regenerative approaches as alternatives to donor allografting for restoration of corneal function | |
| Shojaati et al. | Compressed collagen enhances stem cell therapy for corneal scarring | |
| WO2005078071A1 (en) | Laminate of human corneal endothelial cell culture layer and method of constructing the same | |
| Guérin et al. | The human tissue-engineered cornea (hTEC): Recent Progress | |
| Massie et al. | Optimization of optical and mechanical properties of real architecture for 3-dimensional tissue equivalents: Towards treatment of limbal epithelial stem cell deficiency | |
| Elisseeff et al. | Future perspectives for regenerative medicine in ophthalmology | |
| Utheim et al. | Concise review: altered versus unaltered amniotic membrane as a substrate for limbal epithelial cells | |
| US20220257833A1 (en) | Cultured cell sheet for tissue regeneration, production method thereof, and application method thereof | |
| Lu et al. | Biomaterials and tissue engineering strategies for conjunctival reconstruction and dry eye treatment | |
| Amin et al. | The limbal niche and regenerative strategies | |
| Mertsch et al. | Decellularized human corneal stromal cell sheet as a novel matrix for ocular surface reconstruction | |
| Hussain et al. | Scaffold-free and scaffold-based cellular strategies and opportunities for cornea tissue engineering | |
| US20210205496A1 (en) | Partially cured contact lens-type amniotic membrane dressing and method of manufacturing same | |
| RU2505303C2 (en) | Method for preparing corneal biotransplant | |
| US20230069065A1 (en) | Novel corneal tissues and methods of making the same | |
| Chirila et al. | Reconstruction of the ocular surface using biomaterial templates | |
| KR101645901B1 (en) | Method for culturing limbal stem cell using amniotic membrane slide scaffold | |
| US20180243476A1 (en) | Cultured cell sheet for tissue regeneration, production method thereof, and application method thereof | |
| Senthilkumar et al. | Engraftment and proliferation of thermoreversible-gelation-polymer-encapsulated human corneal limbal-stem-cells on ocular surface of a cadaver cornea | |
| Kang et al. | Novel approaches for restoring the function of the limbal stem cell niche |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20150914 |