RU2504389C2

RU2504389C2 - METHOD FOR PORE FORMATION IN HEPATOCYTE MEMBRANES BY Bacillus cereus HEMOLYSIN II PROCESSING

Info

Publication number: RU2504389C2
Application number: RU2012105234/15A
Authority: RU
Inventors: Олег Александрович Холодков; Александр Сергеевич Солонин; Жанна Ивановна Ковалевская
Priority date: 2012-02-16
Filing date: 2012-02-16
Publication date: 2014-01-20
Also published as: RU2012105234A

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention refers to biotechnology and represents a method involving Bacillus cereus hemolysin (HlyII) hemolysin processing of primary membrane hepatocyte and determining the membrane permeability after HlyII processing. Substance of the presented invention consists in the fact that the action of the HlyII preparation on the cell membranes provides the more effective transport of various low-molecular compounds through the cell membranes. The object in view is to form nanometric pores in the hepatocyte membranes ensured by the action of the low concentration of the purified HlyII preparations on the primary hepatocytes. An increase of the hepatocyte membrane permeability after the HlyII preparation processing is determined by microspectral analysis of low-molecular fluorescent dyes. As observed, the increased permeability of the above dyes into the hepatocyte permeability characterises higher permeability of the processed hepatocyte membranes.

EFFECT: invention provides the effective and reliable method for fast and stable increase of the primary hepatocyte membranes for transport of the low-molecular compounds therein.

1 dwg

Description

Описание изобретенияDescription of the invention

Изобретение относится к молекулярной медицине, а именно к экспериментальной гепатологии, и может применяться как в диагностической практике, так и для исследовательских целей.The invention relates to molecular medicine, namely to experimental hepatology, and can be used both in diagnostic practice and for research purposes.

Уровень техникиState of the art

Повышение проницаемости клеточных мембран, называемое термином "пермеабилизация", достигается за счет формирования в мембранном слое клеток поровых каналов. Эффективный транспорт различных веществ осуществляется через сформированные поровые каналы. Предлагаемый способ направлен на пермеабилизацию внешней цитоплазматической мембраны первичных гепатоцитов с целью повышения эффективности транспорта в них низкомолекулярных веществ с молекулярным весом менее 4 килодальтон и диаметром молекул менее 2 нанометров.The increase in the permeability of cell membranes, called the term "permeabilization", is achieved by the formation of pore channels in the membrane layer of cells. Effective transport of various substances through the formed pore channels. The proposed method is aimed at permeabilization of the outer cytoplasmic membrane of primary hepatocytes in order to increase the efficiency of transport in them of low molecular weight substances with a molecular weight of less than 4 kilodaltons and a diameter of molecules of less than 2 nanometers.

Первичными гепатоцитами являются гепатоциты, выделенные для исследования непосредственно из тканей печени. Гепатоциты - основной тип клеток, составляющий более 70% от всех клеток печени, к основным функциям которых относятся синтез и распад белков, дезаминирование и переаминирование аминокислот, синтез и окисление жирных кислот, кетогенез, различные превращения углеводов в процессах гликолиза, гликогенеза, гликогенолиза, глюконеогенеза, переработка токсичных соединений и ряд других процессов, протекающих в паренхиме печени. При изучении основных функций первичных гепатоцитов, а также культивируемых гепатоцитов перевиваемых клеточных линий применяют метод пермеабилизации их мембран с целью введения внутрь клеток печени широкого спектра низкомолекулярных соединений и ионов. Наиболее важными для медицинской практики функциями гепатоцитов, в частности их роли при развитии атеросклероза, являются регуляция в организме уровня холестерина, его синтез, этерификация, транспорт и выведение из печени, синтез и транспорт липопротеинов высокой, низкой и очень низкой плотности. К другим функциям гепатоцитов относится как регуляция синтеза желчных кислот и образование желчных камней, так и ожирение, возникновение различных типов фиброзов, циррозов, токсикация клеток печени лекарствеными препаратами, а также токсинами, в частности этанолом. Известны работы по транспорту через пермеабилизованные мембраны первичных гепатоцитов молекул глюкозы, глюкозо-6 фосфата, фруктозо-2,6 бифосфата, фруктозо-6 фосфата, трегалозы, молекул АТФ, ГТФ, цАМФ, ионов Са²⁺, Mg²⁺ Mn²⁺, СГ, флуоресцентного красителя пропидиум иодида. В этих работах исследовались особенности метаболизма гепатоцитов на стадии гликолиза, гликогенеза, липогенеза, изучалась регуляция ионами Са²⁴ активности гидролаз, фосфатаз, нуклеаз, а также определялась степень повреждения клеточных мембран первичных гепатоцитов. Пермеабилизация мембран гепатоцитов использовалась при исследовании активностей аланин, аспартат, гамма-глутамил аминотрансфераз и щелочной фосфатазы, определение концентраций которых является основным стандартным тестом в диагностике патологий печени.Primary hepatocytes are hepatocytes isolated for examination directly from liver tissue. Hepatocytes are the main type of cells that make up more than 70% of all liver cells, whose main functions include protein synthesis and decomposition, deamination and transamination of amino acids, synthesis and oxidation of fatty acids, ketogenesis, various transformations of carbohydrates in the processes of glycolysis, glycogenesis, glycogenolysis, gluconeogenesis , processing of toxic compounds and a number of other processes occurring in the liver parenchyma. When studying the basic functions of primary hepatocytes, as well as cultured hepatocytes of transplantable cell lines, the method of permeabilization of their membranes is used to introduce a wide range of low molecular weight compounds and ions into the liver cells. The most important functions of hepatocytes for medical practice, in particular, their role in the development of atherosclerosis, are the regulation of cholesterol levels in the body, its synthesis, esterification, transport and excretion from the liver, and the synthesis and transport of high, low and very low density lipoproteins. Other functions of hepatocytes include regulation of the synthesis of bile acids and the formation of gallstones, as well as obesity, the occurrence of various types of fibrosis, cirrhosis, toxicity of liver cells with drugs, as well as toxins, in particular ethanol. Known works on the transport through the permeabilized membranes of primary hepatocytes of glucose, glucose-6 phosphate, fructose-2,6 bisphosphate, fructose-6 phosphate, trehalose, ATP, GTP, cAMP, Ca ²⁺ , Mg ²⁺ Mn ²⁺ molecules, SG, fluorescent dye propidium iodide. In these works, the features of hepatocyte metabolism at the stage of glycolysis, glycogenesis, lipogenesis were studied, the regulation of hydrolases, phosphatases, nucleases by Ca ²⁴ ions was studied, and the degree of damage to the cell membranes of primary hepatocytes was determined. Permeabilization of hepatocyte membranes was used to study the activities of alanine, aspartate, gamma-glutamyl aminotransferases and alkaline phosphatase, the determination of the concentrations of which is the main standard test in the diagnosis of liver pathologies.

С применением пермеабилизации мембран гепатоцитов изучался эффект накопления в печени лекарственных препаратов, который наблюдается при длительном приеме этих лекарств. Также изучалось действие известных препаратов для терапии сердечно-сосудистой системы, таких как гликозиды дигидрокварцетин и ресвератрол, а также препарата уродезоксихолиевой кислоты уросан, применяющегося при лечении распространенных патологий печени. В связи с широким применением методов пермеабилизации мембран гепатоцитов в молекулярной медицине разработка новых способов их пермеабилизации является актуальной.With the use of permeabilization of hepatocyte membranes, the effect of accumulation of drugs in the liver was studied, which is observed with prolonged use of these drugs. The effect of well-known drugs for the treatment of the cardiovascular system, such as glycosides dihydroquarcetin and resveratrol, as well as the drug urodesoxycholic acid Urosan, which is used in the treatment of common liver pathologies, was also studied. In connection with the widespread use of methods for permeabilization of hepatocyte membranes in molecular medicine, the development of new methods for their permeabilization is relevant.

Известны несколько способов, применяющихся для пермеабилизации мембран первичных гепатоцитов путем образования в них поровых каналов различного размера. К способам, основанным на формировании поровых каналов нефиксированного размера, относятся электропермеабилизация [Gordon et al., 1982], а также пермеабилизация неионными детергентами, такими, как сапонин [Post et al., 1992], тритон Х-100 [Baker et al., 2004] и дигитонин [Gnoni et al., 2009].Several methods are known for permeabilizing primary hepatocyte membranes by forming pore channels of various sizes in them. Electropermeabilization [Gordon et al., 1982], as well as permeabilization with nonionic detergents such as saponin [Post et al., 1992], Triton X-100 [Baker et al. , 2004] and digitonin [Gnoni et al., 2009].

Из всех используемых в настоящее время способов пермеабилизации наиболее широко применяется обработка мембран гепатоцитов неионным детергентом дигитонином. Данный способ пермеабилизации основан на формировании в клеточной мембране мицелл, состоящих из сорбирующихся на поверхности мембран молекул дигитонина. В зависимости от концентрации дигитонина изменяются свойства формируемых при этом поровых каналов. При концентрации дигитонина около 30-50 мкг/мл формируемые ионоселективные каналы диаметром около 1 нм, проницаемые только для одно- и двухвалентных ионов, заменяются неселективными перовыми каналами диаметром в несколько десятков нанометров.Of all the methods of permeabilization currently used, the treatment of hepatocyte membranes with the nonionic detergent Digitonin is the most widely used. This method of permeabilization is based on the formation of micelles in the cell membrane, consisting of digitonin molecules adsorbed on the membrane surface. Depending on the concentration of digitonin, the properties of the pore channels formed in this case change. At a digitonin concentration of about 30–50 μg / ml, the formed ion-selective channels with a diameter of about 1 nm, permeable only to monovalent and divalent ions, are replaced by non-selective feather channels with a diameter of several tens of nanometers.

Поэтому основным недостатком, присущим для способа пермеабилизации мембран дигитонином, так же, как и для пермеабилизации всеми другими известными неионными детергентами, является формирование в клеточных мембранах поровых каналов неконтролируемого диаметра. Этот недостаток усложняет подбор условий пермеабилизации и анализ получаемых результатов, так как при данных способах пермеабилизации наблюдается транспорт через мембрану не только необходимых для исследования низкомолекулярных соединений, но и соединений других размеров. Также через поровые каналы диаметром несколько десятков нанометров может происходить выход из клетки белков, имеющих важное значение при проведении исследований.Therefore, the main disadvantage inherent in the method of permeabilization of membranes with digitonin, as well as for permeabilization with all other known non-ionic detergents, is the formation of uncontrolled diameter in the cell membranes of pore channels. This drawback complicates the selection of conditions for permeabilization and analysis of the results obtained, since with these methods of permeabilization, transport through the membrane is observed not only of low molecular weight compounds necessary for the study, but also of compounds of other sizes. Also, through the pore channels with a diameter of several tens of nanometers, proteins that are important in research can exit the cell.

Другим недостатком способов пермеабилизации с применением неионных детергентов является то, что неионные детергенты сами являются низкомолекулярными веществами и поэтому способны проникать через формируемые ими поровые каналы внутрь обрабатываемых клеток. Данный процесс приводит к повышению проницаемости не только внешней цитоплазматической мембраны, но и к нарушению целостности внутриклеточных мембран эндоплазматического ретикулума, лизосом, а также мембран митохондрий и ядра.Another disadvantage of the methods of permeabilization using non-ionic detergents is that non-ionic detergents themselves are low molecular weight substances and therefore are able to penetrate through the pore channels formed by them into the treated cells. This process leads to an increase in the permeability of not only the external cytoplasmic membrane, but also to a violation of the integrity of the intracellular membranes of the endoplasmic reticulum, lysosomes, as well as mitochondrial and nuclear membranes.

Указанные недостатки устраняются тем, что для пермеабилизации клеточных мембран используют пороформирующие гемолизины, такие как стрептолизин О из Streptococcus pyogenes [Houweling et al., 1996] и альфа-токсин из Staphylococcus aureus [Cascante et al., 2000], которые формируют в мембранах более сложные по строению поровые каналы фиксированных размеров.These disadvantages are eliminated by the fact that pore-forming hemolysins, such as streptolysin O from Streptococcus pyogenes [Houweling et al., 1996] and alpha-toxin from Staphylococcus aureus [Cascante et al., 2000], which form more than one membrane in the membranes, are used for permeabilization of cell membranes complex in structure pore channels of fixed sizes.

Из недостатков способов пермеабилизации бактериальными токсинами отмечено, что через формируемые стрептолизином О поровые каналы диаметром около 30 нанометров также возможен выход из цитоплазмы обрабатываемых клеток крупных белковых молекул. Вместе с тем, через формируемые альфа-токсином поровые каналы диаметром около 2 нанометров как выход белковых молекул из клетки, так и вход молекул данного гемолизина внутрь клетки не происходит. Применение данного способа пермеабилизации исключает формирование поровых каналов на внутриклеточных мембранах. Учитывая преимущества данного способа, пермеабилизация мембран гепатоцитов альфа-токсином [McEwen et al., 1985; Stals et al., 1992; Cascante et al., 2000] принята за прототип заявляемого способа.Among the shortcomings of the methods of permeabilization with bacterial toxins, it was noted that large protein molecules can also escape from the cytoplasm through the pore channels formed by streptolysin O with a diameter of about 30 nanometers. At the same time, through the pore channels formed by alpha-toxin with a diameter of about 2 nanometers, both the release of protein molecules from the cell and the entry of the molecules of this hemolysin into the cell do not occur. The use of this method of permeabilization excludes the formation of pore channels on intracellular membranes. Given the advantages of this method, permeabilization of hepatocyte membranes with alpha toxin [McEwen et al., 1985; Stals et al., 1992; Cascante et al., 2000] adopted as a prototype of the proposed method.

Основным недостатком выбранного способа прототипа для пермеабилизации мембран первичных гепатоцитов является применение высоких концентраций альфа-токсина в диапазоне от 10 мкг/мл [Cascante et al., 2000] до 100 мкг/мл [Stals et al., 1992; Geeraert et al., 1997], а также более 200 мкг/мл [Cheung et al., 1989]. Вместе с тем отмечено, что высокие концентрации этого токсина могут приводить к значительным нарушениям мембран гепатоцитов и в некоторых случаях не позволяют применять данный способ для пермеабилизации гепатоцитов альфа-токсином [Bladergroen et al., 1998].The main disadvantage of the selected prototype method for permeabilization of primary hepatocyte membranes is the use of high concentrations of alpha-toxin in the range from 10 μg / ml [Cascante et al., 2000] to 100 μg / ml [Stals et al., 1992; Geeraert et al., 1997], as well as more than 200 μg / ml [Cheung et al., 1989]. However, it was noted that high concentrations of this toxin can lead to significant violations of the hepatocyte membranes and in some cases do not allow the use of this method for permeabilization of hepatocytes with an alpha toxin [Bladergroen et al., 1998].

Данный недостаток указывает на отсутствие к настоящему моменту способа пермеабилизации, удовлетворяющего всем требованиям для повышения проницаемости мембран первичных гепатоцитов, и предполагает поиск способов пермеабилизации мембран гепатоцитов другими бактериальными пороформирующими гемолизинами.This drawback indicates the lack of a permeabilization method to date that meets all the requirements for increasing the permeability of primary hepatocyte membranes, and suggests a search for methods for permeabilizing hepatocyte membranes with other bacterial pore-forming hemolysins.

Указанный недостаток способа прототипа устраняется тем, что предлагается способ пермеабилизации мембран первичных гепатоцитов, включающий их обработку препаратом гемолизина II из Bacillus cereus, проявляющим высокую пороформирующую активность при низких концентрациях данного токсина. Используемый в заявляемом способе гемолизин II из Bacillus cereus формирует стабильные поровые каналы диаметром 1,4-1,6 нанометров как в искусственных, так и в мембранах различных типов клеток [Andreeva et al., 2006; Andreeva et al., 2007; Sineva et al., 2009; Tran et al., 2011] при концентрациях не более 1 мкг/мл. Показано, что гемолизин II проявляет более высокую активность по сравнению с альфа-токсином при его действии на мембраны некоторых типов культивируемых клеток. Было отмечено, что в отличие от использования альфа-токсина в концентрациях более 10 мкг/мл [Riedinger et al., 2005] при обработке культур клеток препаратами HlyII в концентрациях менее 1 мкг/мл проницаемость мембран этих клеток для флуоресцентных красителей пропидиум иодида и JC-1 повышалась [Andreeva et al., 2006]. Также было показано, что HlyII имеет примерно в 15 раз более высокую пороформирующую активность в сравнении с альфа-токсином при действии на мембраны эритроцитов человека, что приводит к эффективному гемолизу этих клеток под действием гемолизина II [Miles et al., 2002; Andreeva et al., 2006].The specified disadvantage of the prototype method is eliminated by the fact that a method of permeabilization of primary hepatocyte membranes is proposed, including their treatment with hemolysin II from Bacillus cereus, which exhibits high pore-forming activity at low concentrations of this toxin. Used in the inventive method, hemolysin II from Bacillus cereus forms stable pore channels with a diameter of 1.4-1.6 nanometers in both artificial and membranes of various types of cells [Andreeva et al., 2006; Andreeva et al., 2007; Sineva et al., 2009; Tran et al., 2011] at concentrations of not more than 1 μg / ml. It was shown that hemolysin II exhibits higher activity compared with alpha-toxin when it acts on the membranes of certain types of cultured cells. It was noted that, in contrast to the use of alpha-toxin in concentrations of more than 10 μg / ml [Riedinger et al., 2005] when treating cell cultures with HlyII preparations at concentrations of less than 1 μg / ml, the membrane permeability of these cells to fluorescent dyes propidium iodide and JC -1 increased [Andreeva et al., 2006]. It was also shown that HlyII has about 15 times higher pore-forming activity compared with alpha-toxin when exposed to human erythrocyte membranes, which leads to effective hemolysis of these cells by hemolysin II [Miles et al., 2002; Andreeva et al., 2006].

В настоящее время нет сообщений, описывающих действие HlyII на мембраны первичных гепатоцитов, а также отсутствует определение условий для эффективного введения в обработанные этим гемолизином гепатоциты низкомолекулярных веществ.Currently, there are no reports describing the effect of HlyII on the membranes of primary hepatocytes, and there is no definition of conditions for the effective introduction of low molecular weight substances into the hepatocytes treated with this hemolysin.

Сущность изобретения SUMMARY OF THE INVENTION

Технической задачей предлагаемого изобретения является повышение проницаемости внешних цитоплазматических мембран первичных гепатоцитов при проведении обработки их высокоочищенным препаратом HlyII, получаемым из условно патогенных почвенных бактерий Bacillus cereus и обладающим высокой мембранной пороформирующей активностью.The technical task of the invention is to increase the permeability of the external cytoplasmic membranes of primary hepatocytes when they are treated with a highly purified HlyII preparation obtained from conditionally pathogenic soil bacteria Bacillus cereus and having a high membrane pore-forming activity.

Поставленная цель достигается выделением и очисткой препарата гемолизина II из рекомбинантного штамма Escherihia coli и его инкубированием с первичными гепатоцитами из печени мыши, после чего пермеабилизованные первичные гепатоциты окрашиваются различными низкомолекулярными флуоресцентными красителями и на основе полученных результатов определяются оптимальные условия повышения проницаемости мембран обработанных гемолизином первичных гепатоцитов.This goal is achieved by isolating and purifying the hemolysin II preparation from a recombinant strain of Escherihia coli and incubating it with primary hepatocytes from the mouse liver, after which the permeabilized primary hepatocytes are stained with various low molecular weight fluorescent dyes and, based on the results obtained, the optimal conditions for increasing the permeability of the membranes of the treated hematolysis are determined.

Сущность предлагаемого способа пермеабилизации мембран первичных гепатоцитов при обработке их HlyII заключается в следующем: 1) из печени лабораторных животных выделяются гепатоциты, часть из которых, в качестве опытной пробы, инкубируется различное время при 20°С в растворе фосфатно-солевого буфера или в культуральной среде без сыворотки, содержащей различные концентрации препарата гемолизина II, после чего обработанные гепатоциты в опытной пробе инкубируются с флуоресцентными красителями; 2) другая часть выделенных гепатоцитов инкубируется в качестве контрольной пробы в том же растворе фосфатно-солевого буфера или в культуральной среде без сыворотки, содержащей флуоресцентные красители в тех же условиях, как в опытной пробе, но без добавления в контрольную пробу препарата гемолизина II;The essence of the proposed method for permeabilization of the membranes of primary hepatocytes when processing them with HlyII is as follows: 1) hepatocytes are isolated from the liver of laboratory animals, some of which, as an experimental sample, are incubated for various times at 20 ° C in a solution of phosphate-saline buffer or in culture medium without serum containing various concentrations of hemolysin II, after which the treated hepatocytes in the experimental sample are incubated with fluorescent dyes; 2) another part of the isolated hepatocytes is incubated as a control sample in the same solution of phosphate-saline buffer or in a culture medium without serum containing fluorescent dyes under the same conditions as in the experimental sample, but without adding hemolysin II to the control sample;

3) проводится измерение интенсивности флуоресценции в соответствующих диапазонах длин волн для опытных и контрольных проб первичных гепатоцитов. По разности в интенсивности флуоресценции контрольных и опытных проб гепатоцитов, обработанных HlyII, определяются условия, необходимые для максимально эффективной пермеабилизации клеточных мембран первичных гепатоцитов.3) a measurement of the fluorescence intensity is carried out in the corresponding wavelength ranges for the experimental and control samples of primary hepatocytes. The difference in the fluorescence intensity of the control and experimental samples of hepatocytes treated with HlyII determines the conditions necessary for the most effective permeabilization of cell membranes of primary hepatocytes.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретенияInformation confirming the possibility of carrying out the invention

Пример 1. Приготовление и тестирование препарата HlyII.Example 1. Preparation and testing of the drug HlyII.

Для пермеабилизации мембран первичных гепатоцитов используется препарат HlyII (источником гена гемолизина II является штамм Bacillus cereus, депонированный в ВКМ под номером В771), выделенный из рекомбинантного штамма Escherihia coli Z85 (PUJ2) как описано ранее [Andreeva et al., 2006]. Препарат белка HlyII имеет чистоту 99%, определенную электрофоретически и хранится в концентрации 20 мкг/мл в буфере, содержащем 20 мМ К-PO₄ рН 7,2, 40 мМ NaCl, 10% глицерина при минус 20°С. Препарат HlyII, используемый для пермеабилизации первичных гепатоцитов, имеет удельную активность примерно 400 ГЕ на мкг белка. Тестирование гемолитической активности проводится на эритроцитах человека с помощью методики, основанной на спектрофотометрической регистрации гемоглобина, высвобождающегося при лизисе эритроцитов. Определение гемолитической активности осуществляется как описано ранее [Andreeva et al., 2006]. Эритроциты отмываются в изотоническом растворе NaCl и ресуспендируются до конечной концентрации 1% в буфере ФСБ (74 мМ Na - фосфатный буфер (рН 6,8), содержащем 77 мМ NaCl). Исходный препарат гемолизина разводится в том же буфере, содержащем 1% суспензию эритроцитов, и инкубируется 30 мин при 37°С. Контролем служит проба с суспензией эритроцитов без гемолизина и проба, полученная осмотическим шоком суспензии эритроцитов при помощи добавления воды.For the permeabilization of primary hepatocyte membranes, the HlyII preparation is used (the source of the hemolysin II gene is the Bacillus cereus strain deposited in VKM under the number B771) isolated from the recombinant Escherihia coli Z85 (PUJ2) strain as previously described [Andreeva et al., 2006]. The protein preparation HlyII has a purity of 99%, determined electrophoretically and stored at a concentration of 20 μg / ml in a buffer containing 20 mm K-PO ₄ pH 7.2, 40 mm NaCl, 10% glycerol at minus 20 ° C. The HlyII preparation used for permeabilization of primary hepatocytes has a specific activity of approximately 400 GE per μg of protein. Hemolytic activity testing is carried out on human erythrocytes using a technique based on spectrophotometric registration of hemoglobin released during erythrocyte lysis. The determination of hemolytic activity is carried out as described previously [Andreeva et al., 2006]. Red blood cells are washed in an isotonic NaCl solution and resuspended to a final concentration of 1% in PBS (74 mM Na - phosphate buffer (pH 6.8) containing 77 mM NaCl). The initial hemolysin preparation is diluted in the same buffer containing a 1% suspension of red blood cells and incubated for 30 min at 37 ° C. The control is a sample with a suspension of red blood cells without hemolysin and a sample obtained by the osmotic shock of a suspension of red blood cells by adding water.

После инкубации пробы центрифугируются 1 мин и измеряется оптическая плотность супернатанта при длине волны 545 нм. За единицу гемолитической активности (ГЕ) принято количество гемолизина, вызывающего лизис половины клеток в 1 мл 0,5%-ной суспензии эритроцитов в ФСБ (рН 6,8) за 30 мин при 37°С. Препарат HlyII, используемый для обработки мембран первичных гепатоцитов, с исходным уровнем активности до 10000 ГЕ/мл, стабилен в течение не менее 6 месяцев хранения при температуре минус 20°С. Допускается уменьшение активности препарата на 10% при его хранении в данных условиях более года. При получении HlyII в концентрациях, превышающих 100 мкг/мл, препарат нестабилен и может агрегировать с уменьшением пороформирующей активности. При более высоких температурах, а именно, при инкубации препарата в течение 30 минут при 37°С его активность уменьшается примерно на 50%. Учитывая нестабильность используемого для пермеабилизации препарата HlyII при повышенных температурах все процедуры с ним проводятся в ледяной бане. При этом связывание HlyII с мембранами эритроцитов происходит очень быстро за несколько секунд при любой температуре и встроенный в эти мембраны гемолизин II стабилен [Andreeva et al., 2007]. При размораживании препарата и его добавлении к первичным гепатоцитам при комнатной температуре все процедуры проводятся по возможности в течение первых нескольких (3-5) минут после размораживания препарата.After incubation, the samples are centrifuged for 1 min and the absorbance of the supernatant is measured at a wavelength of 545 nm. The amount of hemolysin, causing the lysis of half of the cells in 1 ml of a 0.5% suspension of red blood cells in the FSB (pH 6.8) for 30 min at 37 ° C, was taken as a unit of hemolytic activity (GE). The HlyII preparation used to treat primary hepatocyte membranes, with an initial activity level of up to 10,000 GE / ml, is stable for at least 6 months of storage at a temperature of minus 20 ° С. It is allowed to decrease the activity of the drug by 10% when stored under these conditions for more than a year. Upon receipt of HlyII in concentrations exceeding 100 μg / ml, the drug is unstable and can aggregate with a decrease in pore-forming activity. At higher temperatures, namely, when the drug is incubated for 30 minutes at 37 ° C, its activity decreases by about 50%. Given the instability of the HlyII preparation used for permeabilization at elevated temperatures, all procedures with it are carried out in an ice bath. Moreover, the binding of HlyII to erythrocyte membranes occurs very quickly in a few seconds at any temperature and the hemolysin II integrated into these membranes is stable [Andreeva et al., 2007]. When thawing a drug and adding it to primary hepatocytes at room temperature, all procedures are carried out, if possible, during the first few (3-5) minutes after thawing the drug.

Пример 2. Выделение первичных гепатоцитов из печени лабораторных животных для последующей обработки их HlyII.Example 2. Isolation of primary hepatocytes from the liver of laboratory animals for subsequent processing of their HlyII.

Выделение первичных гепатоцитов осуществляется по стандартной методике с некоторыми модификациями, которые определяются особенностями их дальнейшей обработки препаратом HlyII. Выделение первичных гепатоцитов реализуется следующим образом. Под эфирным наркозом у 3-месячных мышей самцов проводят вскрытие брюшной полости, извлекают печень, переносят ее на чашку Петри и промывают 1 мл фосфатно-солевого буфера ФБС. Печень измельчают на 3-5 мм кусочки шириной 1 мм и весом не более 1 г, которые переносят в 1,5 мл пробирки Eppendorf, содержащие по 1 мл среды DMEM в модификации Дульбекко с 1 мМ ЭДТА. Пробы перемешивают на мешалке в течение 5 минут при 60 об/мин. После суспендирования пробы центрифугируют при 1000 об/мин при температуре 20°С в течение 1-2 минут до появления на дне пробирок клеточного осадка. Полученный супернатант удаляют, к осадку добавляют 1 мл свежей среды DMEM без сыворотки и осадок вновь суспендируют. Для полного удаления поврежденных клеток и клеточных обломков проводят трех-четырехкратную процедуру промывки гепатоцитов в 1 мл клеточной среды DMEM. Промытые пробы инкубируют 30 минут при 37°С в 0,2 мл раствора среды DMEM без Са²⁺ и Mg²⁺ с добавлением фермента коллагеназы IV (Sigma, США) в концентрации 50 мкг/мл и гиалуронидазы (Sigma, США) в концентрации 100 мкг/мл. После энзиматической обработки мембран гепатоцитов этими ферментами повторяют трехкратную процедуру промывки клеток 1 мл среды DMEM для полного удаления из проб этих ферментов. Промытые осадки ресуспендируют в минимальном объеме ростовой среды DMEM, часть полученной клеточной суспензии инкубируют в 1% растворе трипанового синего и переносят в камеру Горяева для стандартного определения количества жизнеспособных гепатоцитов при концентрации клеток около 3×10⁶ кл./мл. Полученную клеточную суспензию гепатоцитов высевают в 96 луночные плашки (Nunc), дополнительно обработанные 0,2% раствором желатина (Sigma, США) из расчета плотности посева 6×10 клеток/см². Высеваемые клетки инкубируют в среде DMEM модификации Дульбекко без сыворотки, с добавлением до 10 мМ Hepes (Sigma, США) рН 6,8, а также 100 мкг/мл стрептомицина и 100 мкг/мл пенициллина. Плашки с засеянными гепатоцитами помещают в термостат для прикрепления клеток на поверхности плашек при температуре 37°С в течение 3,5-4 часов инкубирования. По окончании инкубирования лунки промывают избытком среды DMEM в модификации Дульбекко без ЭДТА с добавлением 2 мМ CaCl₂ с интенсивностью, определяемой степенью прикрепленности гепатоцитов к поверхности плашек. Промывку повторяют до полного удаления из лунок клеточного детрита, образованного из остатков первичных гепатоцитов, а также неприкрепившихся элементов крови, гемопоэтических клеток и фрагментов из нескольких клеток, оставшихся после гомогенизации исходных кусочков печени. Оценку промытых проб проводят под микроскопом с помощью окулярной морфометрической сетки, подсчитывая число прикрепившихся гепатоцитов при увеличении ×400, с учетом прикрепления к плашке не менее 100 клеток, наблюдаемых в поле объектива фотокамеры. Часть лунок используют для повторного определения целостности мембран, прикрепившихся к плашкам гепатоцитов, при помощи их окраски стандартным красителем трипановым синим.The selection of primary hepatocytes is carried out according to a standard method with some modifications, which are determined by the features of their further treatment with HlyII. The selection of primary hepatocytes is implemented as follows. Under ether anesthesia in 3-month-old male mice, an abdominal cavity is opened, the liver is removed, transferred to a Petri dish and washed with 1 ml of PBS phosphate-buffered saline. The liver is crushed into 3-5 mm slices 1 mm wide and weighing no more than 1 g, which are transferred into 1.5 ml Eppendorf tubes containing 1 ml of DMEM in Dulbecco's modification with 1 mM EDTA. Samples are mixed on a mixer for 5 minutes at 60 rpm. After suspension, the samples are centrifuged at 1000 rpm at a temperature of 20 ° C for 1-2 minutes until the appearance of cell sediment at the bottom of the tubes. The resulting supernatant was removed, 1 ml of fresh serum-free DMEM medium was added to the pellet, and the pellet was resuspended. To completely remove damaged cells and cell debris, a three to four-fold washing procedure of hepatocytes in 1 ml of DMEM cell medium is performed. The washed samples are incubated for 30 minutes at 37 ° C in 0.2 ml of a DMEM solution without Ca ²⁺ and Mg ²⁺ with the addition of the enzyme collagenase IV (Sigma, USA) at a concentration of 50 μg / ml and hyaluronidase (Sigma, USA) at a concentration 100 mcg / ml. After enzymatic treatment of hepatocyte membranes with these enzymes, the cell washing procedure is repeated three times with 1 ml of DMEM medium to completely remove these enzymes from samples. The washed precipitates are resuspended in the minimum volume of DMEM growth medium, part of the obtained cell suspension is incubated in a 1% trypan blue solution and transferred to the Goryaev chamber for standard determination of the number of viable hepatocytes at a cell concentration of about 3 × 10 ⁶ cells / ml. The resulting cell suspension of hepatocytes is seeded in 96 well plates (Nunc), additionally treated with 0.2% gelatin solution (Sigma, USA) based on a culture density of 6 × 10 cells / cm ² . Inoculated cells are incubated in serum-free Dulbecco's DMEM modification with up to 10 mM Hepes (Sigma, USA) pH 6.8, as well as 100 μg / ml streptomycin and 100 μg / ml penicillin. Plates with seeded hepatocytes are placed in a thermostat to attach cells to the surface of the plates at a temperature of 37 ° C for 3.5-4 hours of incubation. After incubation, the wells are washed with excess DMEM medium in the Dulbecco modification without EDTA with the addition of 2 mM CaCl ₂ with an intensity determined by the degree of attachment of hepatocytes to the plate surface. The washing is repeated until the cell detritus formed from the residues of primary hepatocytes, as well as non-attached blood elements, hematopoietic cells, and fragments from several cells remaining after homogenization of the original liver pieces are completely removed from the wells. Evaluation of the washed samples is carried out under a microscope using an ocular morphometric grid, counting the number of attached hepatocytes at a magnification of × 400, taking into account the attachment of at least 100 cells observed in the camera lens field to the plate. Some of the holes are used to re-determine the integrity of the membranes attached to the hepatocyte plates by staining them with a standard trypan blue dye.

Пример 3. Окрашивание проб первичных гепатоцитов флуоресцентным красителем пропидиум иодидом.Example 3. Staining of samples of primary hepatocytes with a fluorescent dye propidium iodide.

Для измерения интенсивности флуоресценции обрабатываемых проб гепатоцитов проводится предварительное определение условий линейной зависимости величины флуоресценции от числа клеток в исследуемых пробах. Для этого регистрируется контрольное фоновое окрашивание 0,2 мл раствора среды DMEM с 2-кратными разведениями проб суспендированных гепатоцитов. В пробах используются гепатоциты, полученные на стадии после энзиматической обработки мембран гепатоцитов ферментами коллагеназой и гиалуронидазой, как описано в примере 2. После трехкратной промывки клеток 1 мл среды DMEM и полного удаления этих ферментов из проб к разведенным 0,2 мл аликвотам суспензионной культуры первичных гепатоцитов в 1,5 мл пробирках Eppendorf добавляется раствор 100 мкг/мл красителя пропидиум иодида до конечной концентрации 1, 3, 5 и 10 мкг/мл, после чего пробы инкубируются в течение 1 часа. Окрашенные пробы центрифугируют при 1000 об/мин при температуре 20°С в течение 1-2 минут, добавляют 0,2 мл среды DMEM без сыворотки, осадок суспендируют и пробы переносят в 96 луночные плашки. Интенсивность флуоресценции окрашенных проб с максимальным уровнем фонового окрашивания пропидиум иодидом для клеток с ненарушенными мембранами исследуется при помощи флуоресцентного микроскопа (Leica, Германия) при 100, 200 и 800-кратном увеличении. Обработка изображений проб гепатоцитов с флуоресценцией при 610 нм проводится с использованием программ Photoshop Adobe CS и Image J. Выбранные условия линейной зависимости интенсивности флуоресценции от количества окрашенных клеток используются для последующего определения условий пермеабилизации мембран первичных гепатоцитов под действием HlyII.To measure the fluorescence intensity of the processed hepatocyte samples, a preliminary determination of the conditions of a linear dependence of the fluorescence value on the number of cells in the studied samples is carried out. For this, a control background staining of 0.2 ml of a solution of DMEM medium with 2-fold dilutions of samples of suspended hepatocytes is recorded. The samples use hepatocytes obtained at the stage after enzymatic treatment of hepatocyte membranes with collagenase and hyaluronidase enzymes, as described in Example 2. After washing the cells three times with 1 ml of DMEM medium and completely removing these enzymes from the samples, dilute 0.2 ml aliquots of the suspension culture of primary hepatocytes in 1.5 ml Eppendorf tubes, a solution of 100 μg / ml of propidium iodide dye is added to a final concentration of 1, 3, 5 and 10 μg / ml, after which the samples are incubated for 1 hour. The stained samples are centrifuged at 1000 rpm at a temperature of 20 ° C for 1-2 minutes, 0.2 ml of serum-free DMEM medium is added, the precipitate is suspended and the samples are transferred to 96 well plates. The fluorescence intensity of stained samples with the maximum level of background staining with propidium iodide for cells with undisturbed membranes is studied using a fluorescence microscope (Leica, Germany) at 100, 200 and 800-fold magnification. Image processing of samples of hepatocytes with fluorescence at 610 nm is performed using Photoshop Adobe CS and Image J. The selected conditions for the linear dependence of the fluorescence intensity on the number of stained cells are used to further determine the conditions for permeabilization of primary hepatocyte membranes under the influence of HlyII.

Пример 4. Определение оптимальных условий пермеабилизации мембран первичных гепатоцитов.Example 4. Determination of optimal conditions for permeabilization of membranes of primary hepatocytes.

Пробы первичных гепатоцитов, культивируемые на стадии рассева в плашки, как описано в примере 2, обрабатываются различными концентрациями очищенного HlyII. Препарат HlyII, полученный и охарактеризованный, как описано в примере 1, инкубируется с первичными гепатоцитами, прикрепившимися к поверхности плашек, в объеме 0,2 мл среды DMEM модификации Дульбекко без сыворотки с добавлением до 10 мМ Hepes. В каждую лунку с клетками добавляется препарат HlyII до конечной концентрации 1, 2, 3, 5 и 10 мкг/мл HlyII. Продолжительность обработки гепатоцитов пороформирующим агентом составляет 2, 5, 10, 30 и 60 минут инкубации при 20°С. После обработки проб гепатоцитов препаратом HlyII лунки плашек 3-кратно промываются 0,2 мл среды DMEM модификации Дульбекко без сыворотки с 10 мМ Hepes, после чего добавляются аликвоты красителя пропидиум иодида до конечной концентрации 1, 3, 5 и 10 мкг/мл, как определено в примере 3. Регистрация интенсивности флуоресценции проб при 610 нм осуществляется через 2-3 минутные интервалы времени в течение 1-1,5 часов в условиях, определенных на стадии, описанной в примере 3. Обработка изображений проб гепатоцитов проводится с использованием программ Photoshop Adobe CS и Image J.Samples of primary hepatocytes cultured at the stage of sieving in plates, as described in example 2, are processed with various concentrations of purified HlyII. The HlyII preparation prepared and characterized as described in Example 1 is incubated with primary hepatocytes attached to the plate surface in a volume of 0.2 ml of serum-free DMEM modification Dulbecco supplemented with up to 10 mM Hepes. HlyII is added to each cell well to a final concentration of 1, 2, 3, 5, and 10 μg / ml HlyII. The duration of treatment of hepatocytes with a pore-forming agent is 2, 5, 10, 30, and 60 minutes of incubation at 20 ° C. After processing the hepatocyte samples with HlyII, the plate wells are washed 3 times with 0.2 ml of Dulbecco's DMEM modification medium without serum with 10 mM Hepes, after which aliquots of the dye propidium iodide are added to a final concentration of 1, 3, 5 and 10 μg / ml, as determined in example 3. Registration of the fluorescence intensity of samples at 610 nm is carried out after 2-3 minute time intervals for 1-1.5 hours under the conditions determined at the stage described in example 3. Image processing of samples of hepatocytes is carried out using Photoshop Adobe CS and I mage J.

Количественная оценка эффективности пермеабилизации первичных гепатоцитов (П) препаратами HlyII в опытных пробах расчитывается по формуле:A quantitative assessment of the effectiveness of permeabilization of primary hepatocytes (P) with HlyII preparations in experimental samples is calculated by the formula:

П=[(Ф1-Ф0)/К1]/[(Ф2-Ф0)/К2]×100P = [(F1-Ф0) / К1] / [(Ф2-Ф0) / К2] × 100

где Ф0 - фоновое значение флуоресценции,where Ф0 is the background value of fluorescence,

Ф1 - интенсивность флуоресценции тестируемой пробы,F1 is the fluorescence intensity of the test sample,

Ф2 - интенсивность флуоресценции пробы, принятой за максимально пермеабилизованную, полученную обработкой 6×10⁴ гепатоцитов препаратом HlyII в концентрации 10 мкг/мл в объеме 1 мл ростовой среды при температуре 20°С в течение 1 часа инкубации.F2 is the fluorescence intensity of the sample, taken as the most permeabilized, obtained by treating 6 × 10 ⁴ hepatocytes with HlyII at a concentration of 10 μg / ml in a volume of 1 ml of growth medium at a temperature of 20 ° C for 1 hour of incubation.

К1 и К2 - число гепатоцитов в пробах Ф1 и Ф2, соответственно.K1 and K2 - the number of hepatocytes in samples F1 and F2, respectively.

Статистическая обработка данных проводится с помощью пакета программ Microsoft Excel.Statistical data processing is carried out using the Microsoft Excel software package.

При обработке первичных гепатоцитов препаратом HlyII в концентрации 1 мкг/мл в течение 10 минут величина флуоресценции включенного в гепатоциты пропидиум иодида составляет 25%, а при инкубации в течение 1 часа - 80% максимально возможного. Наблюдается зависимость увеличения пермеабилизации мембран гепатоцитов от их обработки различными концентрациями очищенного HlyII. При обработке гепатоцитов увеличенной до 10 мкг/мл концентрацией HlyII та же величина флуоресценции включенного в гепатоциты пропидиум иодида достигается за 2 и 10 минут инкубации клеток с HlyII соответственно.When treating primary hepatocytes with HlyII at a concentration of 1 μg / ml for 10 minutes, the fluorescence of propidium iodide included in hepatocytes is 25%, and when incubated for 1 hour, 80% of the maximum possible. A dependence of the increase in permeabilization of hepatocyte membranes on their treatment with various concentrations of purified HlyII is observed. When treating hepatocytes with an increased concentration of HlyII up to 10 μg / ml, the same fluorescence value of propidium iodide included in hepatocytes is achieved after 2 and 10 minutes of incubation of cells with HlyII, respectively.

Пример 5. Повышение проницаемости мембран первичных гепатоцитов при обработке их минимальными концентрациями HlyII. Определение условий обратимой пермеабилизации мембран первичных гепатоцитов.Example 5. Increasing the permeability of the membranes of primary hepatocytes when processing them with minimal concentrations of HlyII. Determination of conditions for reversible permeabilization of primary hepatocyte membranes.

При обработке мембран первичных гепатоцитов низкими концентрациями HlyII также детектируется увеличение проницаемости мембран гепатоцитов для транспорта молекул пропидиум иодида внутрь обрабатываемых клеток. При инкубации первичных гепатоцитов препаратом HlyII в концентрации 0,1 мкг/мл в течение 10 минут величина флуоресценции включенного в гепатоциты пропидиум иодида достоверно детектируется, составляя 5%, а при инкубации в течение 1 часа достигая 20% максимально возможного. Эти результаты указывают на высокоэффективную пороформирующую активность препарата гемолизина II (HlyII) из бактерий Bacillus cereus на мембранах первичных гепатоцитов. Наблюдаемое образование поровых каналов в мембранах гепатоцитов под действием HlyII в концентрации около 0,1 мкг/мл носит временный характер, то есть является обратимой пермеабилизацией мембран. Тестирование стабильности поровых каналов, обработанных низкими концентрациями HlyII, показывает уменьшение проницаемости мембран гепатоцитов для пропидиум иодида в течение нескольких часов после их обработки гемолизином. При контрольной обработке первичных гепатоцитов препаратом HlyII в концентрации 0,1 мкг/мл в течение 1 часа и последующей окраске клеток пропидиум иодидом пермеабилизация мембран гепатоцитов составляет около 20% максимально возможной. Обработка первичных гепатоцитов препаратом HlyII в этих же условиях, но с отложенным на 4-12 часов окрашиванием клеток пропидиум иодидом, уменьшает интенсивность флуоресценции включенного внутрь клеток красителя, что указывает на уменьшение числа поровых каналов, образованных HlyII в мембранах гепатоцитов. При обработке первичных гепатоцитов препаратом HlyII в концентрации 0,1 мкг/мл в течение 1 часа и последующем культивировании обработанных в таких условиях клеток в 1 мл ростовой среды DMEM в модификации Дульбекко с добавлением 1% сыворотки и 0,2% соды в течение 12 часов при 37°С с последующей окраской клеток пропидиум иодидом, флуоресценция красителя, включаемого в такие гепатоциты, не детектируется, составляя менее 1% максимально возможного.When treating primary hepatocyte membranes with low HlyII concentrations, an increase in the permeability of hepatocyte membranes for transporting propidium iodide molecules into the treated cells is also detected. When incubating primary hepatocytes with HlyII at a concentration of 0.1 μg / ml for 10 minutes, the fluorescence of the propidium iodide included in the hepatocytes was reliably detected, amounting to 5%, and during incubation for 1 hour, reaching 20% of the maximum possible. These results indicate a highly effective pore-forming activity of the hemolysin II (HlyII) preparation from Bacillus cereus bacteria on the membranes of primary hepatocytes. The observed formation of pore channels in hepatocyte membranes under the influence of HlyII at a concentration of about 0.1 μg / ml is temporary, that is, it is a reversible permeabilization of the membranes. Testing the stability of pore channels treated with low HlyII concentrations shows a decrease in the permeability of hepatocyte membranes for propidium iodide within a few hours after they are treated with hemolysin. During the control treatment of primary hepatocytes with HlyII at a concentration of 0.1 μg / ml for 1 hour and subsequent staining of the cells with propidium iodide, permeabilization of hepatocyte membranes is about 20% of the maximum possible. Treatment of primary hepatocytes with HlyII under the same conditions, but with stained propidium iodide stained for 4-12 hours, reduces the fluorescence intensity of the dye incorporated inside the cells, which indicates a decrease in the number of pore channels formed by HlyII in hepatocyte membranes. When processing primary hepatocytes with HlyII at a concentration of 0.1 μg / ml for 1 hour and subsequent cultivation of the cells treated under such conditions in 1 ml of DMEM growth medium in the Dulbecco modification with the addition of 1% serum and 0.2% soda for 12 hours at 37 ° C followed by staining of the cells with propidium iodide, fluorescence of the dye included in such hepatocytes is not detected, amounting to less than 1% of the maximum possible.

Пример 6. Обработка проб первичных гепатоцитов препаратом HlyII и окрашивание красителем флуоресцеином.Example 6. Processing samples of primary hepatocytes with HlyII and staining with fluorescein dye.

Условия обработки первичных гепатоцитов HlyII для оценки эффективности пермеабилизации их мембран при помощи окраски флуоресцеином повторяются, как описано в примере 4. Флуоресцеин натрия также используется в качестве низкомолекулярного красителя, который не способен проходить через неповрежденные мембраны и проникает только в клетки с поврежденной цитоплазматической мембраной. При облучении флуоресцеина синим светом (абсорбция от 465 до 490 нм), наблюдается желто-зеленая флуоресценция с длиной волны от 520 до 530 нм. После обработки первичных гепатоцитов препаратом HlyII в условиях, аналогичных описанным в примере 4, обработанные гепатоциты окрашиваются инкубацией их в насыщенном растворе флуоресцеина натрия в фосфатно-солевом буфере в течение 30 минут. После окрашивания раствором флуоресцеина обработанные клетки интенсивно отмываются в фосфатно-солевом растворе с 3-кратной сменой буфера в течение 3 минут. При обработке гепатоцитов препаратом HlyII в концентрациях 1 мкг/мл и 10 мкг/мл в течение от 2 до 60 минут происходит эффективное окрашивание гепатоцитов флуоресцеином, достигающее 90% максимально возможной эффективности. Окраска первичных гепатоцитов флуоресцеином после их обработки очищенным препаратом HlyII более чувствительна по сравнению с окраской пермеабилизованных HlyII гепатоцитов пропидиум иодидом на 30-50%. В результате обработки первичных гепатоцитов препаратом HlyII в концентрации 10 мкг/мл в течение 1 часа величина флуоресценции включенного в клетки флуоресцеина превышает на 30%, а при инкубации в течение 2 минут на 50% величину максимальной флуоресценции пропидиум иодида, включенного в обработанные в тех же условиях первичные гепатоциты.The treatment conditions for primary HlyII hepatocytes to evaluate the effectiveness of permeabilization of their membranes by staining with fluorescein are repeated as described in example 4. Sodium fluorescein is also used as a low molecular weight dye that cannot pass through intact membranes and penetrates only cells with damaged cytoplasmic membranes. When fluorescein is irradiated with blue light (absorbance from 465 to 490 nm), yellow-green fluorescence with a wavelength of 520 to 530 nm is observed. After treating primary hepatocytes with HlyII under conditions similar to those described in Example 4, the treated hepatocytes are stained by incubating them in a saturated solution of sodium fluorescein in phosphate-buffered saline for 30 minutes. After staining with a fluorescein solution, the treated cells are intensively washed in phosphate-saline solution with a 3-fold buffer change for 3 minutes. When hepatocytes are treated with HlyII at concentrations of 1 μg / ml and 10 μg / ml for 2 to 60 minutes, hepatocytes are effectively stained with fluorescein, reaching 90% of the maximum possible efficiency. The staining of primary hepatocytes with fluorescein after their treatment with purified HlyII preparation is more sensitive compared with staining of permeabilized HlyII hepatocytes with propidium iodide by 30-50%. As a result of treatment of primary hepatocytes with HlyII at a concentration of 10 μg / ml for 1 hour, the fluorescence value of the fluorescein included in the cells exceeds 30%, and when incubated for 2 minutes, the maximum fluorescence of propidium iodide, included in the treated ones, is included in the same primary hepatocytes.

Пример 7. Проведение контрольных измерений при тестировании пороформирующей активности HlyII.Example 7. Carrying out control measurements when testing the pore-forming activity of HlyII.

Контрольные измерения пороформирующей активности препаратов HlyII при подавлении данной активности в результате инкубации первичных гепатоцитов с препаратами ПЭГ 6000 проводятся в условиях, как описано в примере 4. При обработке гепатоцитов препаратом HlyII в концентрации 1 мкг/мл в течение 10 минут эффективность пермеабилизации их мембран составляет 25% максимально возможной. При инкубации HlyII пермеабилизованных гепатоцитов с 10 мМ ПЭГ 6000 эффективность последующего проникновения пропидиум иодида внутрь клеток уменьшается до значений фоновой интенсивности флуоресценции первичных гепатоцитов и составляет менее 1% максимально возможного уровня флуоресценции. Данные результаты блокирования транспорта пропидиум иодида в клетки подтверждают, что при обработке мембран гепатоцитов препаратом HlyII происходит повышение их проницаемости для транспорта внутрь клетки низкомолекулярных соединений, который эффективно блокируется молекулами ПЭГ 6000. Также контрольное измерение уменьшения пороформирующей активности HlyII при предварительном нагревании препарата белка HlyII косвенно подтверждает, что повышение проницаемости мембран гепатоцитов определяется действием на мембраны гепатоцитов белка HlyII. Показано подавление пороформирующей активности HlyII в результате инкубации препарата гемолизина в течение нескольких минут при 60°С. При обработке первичных гепатоцитов 10 мкг/мл HlyII, предварительно прогретым в течение 10 минут при 60°С, в условиях эффективного порообразования, как описано в примере 4, пермеабилизация мембран гепатоцитов не детектируется (менее 1% максимально возможного уровня флуоресценции).Control measurements of the pore-forming activity of HlyII preparations during the suppression of this activity as a result of incubation of primary hepatocytes with PEG 6000 preparations are carried out under the conditions described in Example 4. When treating hepatocytes with HlyII at a concentration of 1 μg / ml for 10 minutes, the permeabilization efficiency of their membranes is 25 % of the maximum possible. Upon incubation of HlyII permeabilized hepatocytes with 10 mM PEG 6000, the efficiency of subsequent penetration of propidium iodide into the cells decreases to the background fluorescence intensity of primary hepatocytes and is less than 1% of the maximum possible fluorescence level. These results of blocking the transport of propidium iodide into cells confirm that, when the hepatocyte membranes are treated with HlyII, they increase their permeability for low molecular weight compounds to be transported inside the cell, which is effectively blocked by PEG 6000 molecules. The control measurement of the decrease in the HlyII pore-forming activity upon preliminary heating of the HlyII protein preparation indirectly confirms that the increase in the permeability of hepatocyte membranes is determined by the effect of the HlyII protein on hepatocyte membranes. The suppression of the pore-forming activity of HlyII as a result of incubation of the hemolysin preparation for several minutes at 60 ° C is shown. When treating primary hepatocytes with 10 μg / ml HlyII, preheated for 10 minutes at 60 ° C, under conditions of effective pore formation, as described in Example 4, permeabilization of hepatocyte membranes is not detected (less than 1% of the maximum possible level of fluorescence).

Пример 8. Сравнение эффективности пермеабилизации мембран первичных гепатоцитов при обработке проб препаратами HlyII и неионным детергентом дигитонином.Example 8. Comparison of the effectiveness of permeabilization of primary hepatocyte membranes when processing samples with HlyII preparations and non-ionic detergent digitonin.

Оценка максимально высокого уровня пермеабилизации мембран первичных гепатоцитов, которая может быть достигнута при обработке гепатоцитов препаратами HlyII и неионным детергентом дигитонином, проводится как описано в примере 4. Для определения максимального уровня пермеабилизации мембран гепатоцитов используются условия, описанные в примере 4, за исключением того, что вместо HlyII мембраны гепатоцитов обрабатываются наиболее часто применяемыми для данных целей неионными детергентами дигитонином, сапонином, эсцином и тритоном Х-100.The assessment of the highest level of permeabilization of primary hepatocyte membranes, which can be achieved by treating hepatocytes with HlyII preparations and the nonionic detergent digitonin, is carried out as described in Example 4. To determine the maximum level of permeabilization of hepatocyte membranes, the conditions described in Example 4 are used, except that instead of HlyII, hepatocyte membranes are treated with the most commonly used nonionic detergents for this purpose, digitonin, saponin, escin and triton X-100.

Сравнительная количественная оценка эффективности пермеабилизации мембран первичных гепатоцитов (П), которая достигается в результате их обработки препаратами HlyII и неионными детергентами, также расчитывается по формуле:A comparative quantitative assessment of the effectiveness of permeabilization of membranes of primary hepatocytes (P), which is achieved as a result of their processing with HlyII preparations and nonionic detergents, is also calculated by the formula:

П=[(Ф1-Ф0)/К1]/[(Ф2-Ф0)/К2]×100.П = [(Ф1-Ф0) / К1] / [(Ф2-Ф0) / К2] × 100.

В отличие от определений эффективности HlyII пермеабилизации, описанной в примере 4, при расчете эффективности пермеабилизации неионными детергентами значение Ф2 означает максимальную пермеабилизацию гепатоцитов препаратом 0,2% тритона Х-100, принятую за 100%.In contrast to the definitions of the effectiveness of HlyII permeabilization described in Example 4, when calculating the effectiveness of permeabilization with nonionic detergents, the value of Ф2 means the maximum permeabilization of hepatocytes with 0.2% Triton X-100, taken as 100%.

В данном примере проводится определение эффективности пороформирования мембран гепатоцитов с использованием неионного детергента дигитонина в концентрации 80 мкг/мл, принимаемого за стандартный положительный контроль пороформирования.In this example, we determine the effectiveness of pore formation of hepatocyte membranes using a non-ionic digitonin detergent at a concentration of 80 μg / ml, which is taken as the standard positive control of pore formation.

Также проводится определение эффективности пороформирования при действии на мембраны гепатоцитов неионного детергента сапонина в концентрации 30 мкг/мл, используемого в качестве другого стандартного положительного контроля пороформирования.Also, the effectiveness of pore formation is determined by the action of a non-ionic detergent saponin on hepatocyte membranes at a concentration of 30 μg / ml, which is used as another standard positive control of pore formation.

Определение максимальной эффективности пороформирования проводится с использованием неионного детергента тритона Х-100 в концентрации 0,2%, при применении которого наблюдается полное разрушение мембран первичных гепатоцитов.Determination of the maximum efficiency of pore formation is carried out using a non-ionic detergent X-100 triton at a concentration of 0.2%, with the use of which complete destruction of the membranes of primary hepatocytes is observed.

Сравнительная оценка пороформирующей активности препаратов HlyII и неионных детергентов проводится при обработке гепатоцитов во всех пробах в течение 1 часа. При данной обработке первичных гепатоцитов достигается высокая эффективность пермеабилизации HlyII мембран гепатоцитов, которая составляет 90% активности дигитонина при условии использования дигитонина в концентрациях не более 80 мкг/мл, не приводящих к полному разрушению внешней мембраны обрабатываемых гепатоцитов. При сравнении пороформирующей активности HlyII и дигитонина также отмечается, что при низких концентрациях гемолизина и дигитонина пороформирующее действие HlyII в сравнении с дигитонином более эффективно, что может способствовать практическому использованию гемолизина II Bacillus cereus для пермеабилизации мембран первичных гепатоцитов.A comparative assessment of the pore-forming activity of HlyII preparations and non-ionic detergents is carried out during the treatment of hepatocytes in all samples for 1 hour. With this treatment of primary hepatocytes, a high efficiency of permeabilization of HlyII hepatocyte membranes is achieved, which is 90% of digitonin activity provided that digitonin is used in concentrations of not more than 80 μg / ml, which do not completely destroy the outer membrane of the treated hepatocytes. When comparing the pore-forming activity of HlyII and digitonin, it is also noted that at low concentrations of hemolysin and digitonin, the pore-forming effect of HlyII is more effective in comparison with digitonin, which can contribute to the practical use of hemolysin II of Bacillus cereus for permeabilization of primary hepatocyte membranes.

Пример 9. Оценка влияния гликокаликсного слоя мембран первичных гепатоцитов на эффективность их пермеабилизации препаратом HlyII.Example 9. Evaluation of the effect of the glycocalyx layer of primary hepatocyte membranes on the effectiveness of their permeabilization with HlyII.

Высокая пороформирующая активность HlyII тестируется, как описано в примерах 4-8, на мембранах гепатоцитов с обработанным слоем гликокаликса, являющимся защитным барьером на внешней стороне плазмолеммы, образованным полимерами на основе гиалуроновой кислоты с погруженными в них молекулами различных белков. При определении активности препаратов HlyII на мембранах первичных гепатоцитов, необработанных мембраноактивными ферментами коллагеназой и гиалуронидазой также детектируется эффективное HlyII пороформирование в мембранах несуспендированных гепатоцитов в составе фрагментов ткани печени, поверхность которых доступна для белка HlyII. После трех-четырехкратной процедуры промывки гепатоцитов в 1 мл клеточной среды DMEM, как описано в примере 2, и обработки промытых проб препаратом HlyII в концентрации 1 мкг/мл в течение 10 минут, величина флуоресценции включенного в энзиматически не обработанные гепатоциты красителя пропидиум иодида составляет 15%, а при инкубации в течение 1 часа - 40% максимально возможного.The high pore-forming activity of HlyII is tested, as described in examples 4-8, on hepatocyte membranes with a treated glycocalyx layer, which is a protective barrier on the outside of the plasmolema formed by hyaluronic acid-based polymers with various protein molecules immersed in them. When determining the activity of HlyII preparations on the membranes of primary hepatocytes untreated with membrane-active enzymes collagenase and hyaluronidase, effective HlyII pore formation in membranes of unsuspended hepatocytes as part of liver tissue fragments, the surface of which is accessible for HlyII protein, is also detected. After a three-four-fold procedure of washing hepatocytes in 1 ml of DMEM cell medium, as described in Example 2, and processing the washed samples with HlyII at a concentration of 1 μg / ml for 10 minutes, the fluorescence value of the propidium iodide dye included in the enzymatically untreated hepatocytes is 15 %, and when incubated for 1 hour - 40% of the maximum possible.

Также наблюдается возрастание пороформирующей активности HlyII на первичных гепатоцитах, выделенных без энзиматической обработки, при последующей инкубации их в течение 10 минут отдельно с ферментом гиалуронидазой (100 мкг/мл) и коллагеназой IV (50 мкг/мл) до 70% и 50% соответственно в сравнении с максимальным уровнем пермеабилизации, описанным в примере 4. Обработка мембран гепатоцитов этими концентрациями ферментов в течение 1 часа повышает эффективность пороформирующей активности HlyII до 90% и 70% соответственно от максимального уровня пермеабилизации гепатоцитов, описанного в примере 4.There is also an increase in the pore-forming activity of HlyII on primary hepatocytes isolated without enzymatic treatment, followed by their incubation for 10 minutes separately with the enzyme hyaluronidase (100 μg / ml) and collagenase IV (50 μg / ml) to 70% and 50%, respectively compared with the maximum level of permeabilization described in example 4. Treatment of hepatocyte membranes with these enzyme concentrations for 1 hour increases the efficiency of the pore-forming activity of HlyII up to 90% and 70%, respectively, of the maximum level of permeabilization ation hepatocytes described in Example 4.

Таким образом, как показано в примерах 4-9, предлагаемый способ пермеабилизации мембран первичных гепатоцитов позволяет увеличивать проницаемость мембран гепатоцитов для низкомолекулярных соединений путем обработки их 0,1-1 мкг/мл концентрациями HlyII из бактерий Bacillus cereus до 90% максимально возможного уровня пермеабилизации данных клеток.Thus, as shown in examples 4-9, the proposed method of permeabilization of primary hepatocyte membranes allows to increase the permeability of hepatocyte membranes for low molecular weight compounds by treating them with 0.1-1 μg / ml HlyII concentrations from Bacillus cereus bacteria to 90% of the maximum possible permeabilization level of the data cells.

В связи с тем, что использование существенных признаков предлагаемого способа, включающих пермеабилизацию мембран первичных гепатоцитов низкими концентрациями HlyII из Bacillus cereus, в научно-технических источниках не обнаружено, можно сделать вывод, что данный способ отвечает критериям изобретения "новизна" и "существенные отличия".Due to the fact that the use of essential features of the proposed method, including permeabilization of primary hepatocyte membranes with low concentrations of HlyII from Bacillus cereus, was not found in scientific and technical sources, we can conclude that this method meets the criteria of the invention of "novelty" and "significant differences" .

ТАБЛИЦАTABLE

Пояснение к таблице.Explanation of the table.

В таблице представлены данные по повышению проницаемости мембран первичных гепатоцитов после обработки их препаратами HlyII Bacillus cereus и неионными детергентами, как описано в примерах 4-8.The table presents data on increasing the permeability of the membranes of primary hepatocytes after treatment with HlyII Bacillus cereus preparations and non-ionic detergents, as described in examples 4-8.

Эффективность пороформирования в мембранах первичных гепатоцитов,определяемая по величине внутриклеточной флуоресценции пропидиум иодидаThe efficiency of pore formation in the membranes of primary hepatocytes, determined by the value of intracellular fluorescence propidium iodide Пороформирующий агентPore Forming Agent Концентрация пороформирующего агентаThe concentration of pore-forming agent Время обработки гепатоцитов пороформирующим агентомHepatocyte Treatment Time with Pore Forming Agent Эффективность флуоресценции пропидиум иодида (%)The efficiency of fluorescence propidium iodide (%) Гемолизин IIHemolysin II 0,1 мкг/мл0.1 μg / ml 10 мин10 min 55 Гемолизин IIHemolysin II 0,1 мкг/мл0.1 μg / ml 60 мин60 min 20twenty Гемолизин IIHemolysin II 1 мкг/мл1 mcg / ml 10 мин10 min 2525 Гемолизин IIHemolysin II 1 мкг/мл1 mcg / ml 60 мин60 min 8080 Гемолизин IIHemolysin II 10 мкг/мл10 mcg / ml 2 мин2 minutes 30thirty Гемолизин IIHemolysin II 10 мкг/мл10 mcg / ml 10 мин10 min 8080 СапонинSaponin 50 мкг/мл50 mcg / ml 60 мин60 min 9090 ДигитонинDigitonin 80 мкг/мл80 mcg / ml 60 мин60 min 9090 Тритон Х-100Triton X-100 0,2%0.2% 10 мин10 min 100one hundred Гемолизин II Hemolysin II 1 мкг/мл1 mcg / ml 10 мин10 min Менее 1Less than 1 ПЭГ 6000PEG 6000 10 мМ10 mm Инактивация HlyII нагреванием 10 мин при 60°СHlyII inactivation by heating for 10 min at 60 ° C 10 мкг/мл10 mcg / ml 60 мин60 min Менее 0,1Less than 0.1

Литературные источники:Literary sources:

Andreeva ZI, Nesterenko VF, Yurkov IS, Budarina ZI, Sineva EV, Solonin AS. Purification and cytotoxic properties of Bacillus cereus hemolysin II // Protein Expr Purif. 2006 V.47(l) P. 186-93.Andreeva ZI, Nesterenko VF, Yurkov IS, Budarina ZI, Sineva EV, Solonin AS. Purification and cytotoxic properties of Bacillus cereus hemolysin II // Protein Expr Purif. 2006 V. 47 (l) P. 186-93.

Andreeva ZI, Nesterenko VF, Fomkina MG, Ternovsky VI, Suzina NE, Bakulina AY, Solonin AS, Sineva EV. The properties of Bacillus cereus hemolysin II pores depend on environmental conditions // Biochim Biophys Acta. 2007 V.I 768(2) P.253-63.Andreeva ZI, Nesterenko VF, Fomkina MG, Ternovsky VI, Suzina NE, Bakulina AY, Solonin AS, Sineva EV. The properties of Bacillus cereus hemolysin II pores depend on environmental conditions // Biochim Biophys Acta. 2007 V.I 768 (2) P.253-63.

Baker PR, Cramer SD, Kennedy M, Assimos DG, Holmes RP. Glycolate and glyoxylate metabolism in HepG2 cells // Am J Physiol Cell Physiol. 2004 V.287 (5) P.C 1359-65.Baker PR, Cramer SD, Kennedy M, Assimos DG, Holmes RP. Glycolate and glyoxylate metabolism in HepG2 cells // Am J Physiol Cell Physiol. 2004 V.287 (5) P.C 1359-65.

Bladergroen BA, Geelen MJ, Reddy AC, Declercq PE, Van Golde LM. Channelling of intermediates in the biosynthesis of phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine in mammalian cells // Biochem J. 1998 V.334 (Pt 3), P.511-7.Bladergroen BA, Geelen MJ, Reddy AC, Declercq PE, Van Golde LM. Channeling of intermediates in the biosynthesis of phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine in mammalian cells // Biochem J. 1998 V.334 (Pt 3), P.511-7.

Cascante M, Centelles JJ, Agius L. Use of alpha-toxin from Staphylococcus aureus to test for channelling of intermediates of glycolysis between glucokinase and aldolase in hepatocytes // Biochem J. 2000 V.352 (Pt 3), P.899-905.Cascante M, Centelles JJ, Agius L. Use of alpha-toxin from Staphylococcus aureus to test for channeled of intermediates of glycolysis between glucokinase and aldolase in hepatocytes // Biochem J. 2000 V.352 (Pt 3), P.899-905 .

Cheung CW, Cohen NS, Raijman L. Channeling of urea cycle intermediates in situ in permeabilized hepatocytes // J Biol Chem. 1989 V.264(7) P.4038-44.Cheung CW, Cohen NS, Raijman L. Channeling of urea cycle intermediates in situ in permeabilized hepatocytes // J Biol Chem. 1989 V.264 (7) P.4038-44.

Geeraert L, Mannaerts GP, van Veldhoven PP. Conversion of dihydroceramide into ceramide: involvement of a desaturase // Biochem J. 1997 V.327 (Pt 1) P.125-32.Geeraert L, Mannaerts GP, van Veldhoven PP. Conversion of dihydroceramide into ceramide: involvement of a desaturase // Biochem J. 1997 V.327 (Pt 1) P.125-32.

Gnoni GV, Paglialonga G, Siculella L. Quercetin inhibits fatty acid and triacylglycerol synthesis in rat-liver cells // Eur J Clin Invest. 2009 V.39(9) P.761-8.Gnoni GV, Paglialonga G, Siculella L. Quercetin inhibits fatty acid and triacylglycerol synthesis in rat-liver cells // Eur J Clin Invest. 2009 V.39 (9) P.761-8.

Gordon PB, Seglen PO. Autophagic sequestration of [14C] sucrose, introduced into rat hepatocytes by reversible electro-permeabilization // Exp Cell Res. 1982 V.142(1) P.1-14.Gordon PB, Seglen PO. Autophagic sequestration of [14C] sucrose, introduced into rat hepatocytes by reversible electro-permeabilization // Exp Cell Res. 1982 V.142 (1) P.1-14.

Houweling M, Cui Z, Anfuso CD, Bussiere M, Chen MH, Vance DE. GTP: phosphocholine cytidylyltransferase is both a nuclear and cytoplasmic protein in primary hepatocytes // Eur J Cell Biol. 1996 V.69(l) P.55-63.Houweling M, Cui Z, Anfuso CD, Bussiere M, Chen MH, Vance DE. GTP: phosphocholine cytidylyltransferase is both a nuclear and cytoplasmic protein in primary hepatocytes // Eur J Cell Biol. 1996 V.69 (l) P.55-63.

McEwen BF, Arion WJ. Permeabilization of rat hepatocytes with Staphylococcus aureus alpha-toxin // J Cell Biol. 1985 V.I 00(6) P.1922-9.McEwen BF, Arion WJ. Permeabilization of rat hepatocytes with Staphylococcus aureus alpha-toxin // J Cell Biol. 1985 V.I 00 (6) P. 1922-9.

Miles G, Bayley H, Cheley S. Properties of Bacillus cereus hemolysin II: a heptameric transmembrane pore // Protein Sci. 2002 V 7 P.1813-24.Miles G, Bayley H, Cheley S. Properties of Bacillus cereus hemolysin II: a heptameric transmembrane pore // Protein Sci. 2002 V 7 P. 1813-24.

Post SR, Miyazaki H, Tager HS. Identification of a Mg(2+)- and guanyl nucleotide-dependent glucagon receptor cycle by use of permeabilized canine hepatocytes // J Biol Chem. 1992 V.267(36) P.25776-85.Post SR, Miyazaki H, Tager HS. Identification of a Mg (2 +) - and guanyl nucleotide-dependent glucagon receptor cycle by use of permeabilized canine hepatocytes // J Biol Chem. 1992 V.267 (36) P.25776-85.

Riedinger HJ, Eger F, Trummler K, Probst H. Replication of simian virus 40 (SV40) DNA in virus-infected CV1 cells selectively permeabilized for small molecules by Staphylococcus aureus alpha-toxin // Biochem J. 2005 V.386 (Pt 3), P.557-66.Riedinger HJ, Eger F, Trummler K, Probst H. Replication of simian virus 40 (SV40) DNA in virus-infected CV1 cells selectively permeabilized for small molecules by Staphylococcus aureus alpha-toxin // Biochem J. 2005 V.386 (Pt 3 ), P.557-66.

Sineva EV, Andreeva-Kovalevskaya ZI, Shadrin AM, Gerasimov YL, Ternovsky VI, Teplova VV, Yurkova TV, Solonin AS. Expression of Bacillus cereus hemolysin II in Bacillus subtilis renders the bacteria pathogenic for the crustacean Daphnia magna II FEMS Microbiol Lett. 2009 V.299(1)P.110-9.Sineva EV, Andreeva-Kovalevskaya ZI, Shadrin AM, Gerasimov YL, Ternovsky VI, Teplova VV, Yurkova TV, Solonin AS. Expression of Bacillus cereus hemolysin II in Bacillus subtilis renders the bacteria pathogenic for the crustacean Daphnia magna II FEMS Microbiol Lett. 2009 V.299 (1) P.110-9.

Stals HK, Mannaerts GP, Declercq PE. Factors influencing triacylglycerol synthesis in permeabilized rat hepatocytes // Biochem J. 1992 V.283 (Pt 3) P.719-25.Stals HK, Mannaerts GP, Declercq PE. Factors influencing triacylglycerol synthesis in permeabilized rat hepatocytes // Biochem J. 1992 V.283 (Pt 3) P.719-25.

Tran SL, Guillemet E, Ngo-Camus M, Clybouw C, Puhar A, Moris A, Gohar M, Lereclus D, Ramarao N. Haemolysin II is a Bacillus cereus virulence factor that induces apoptosis of macrophages // Cell Microbiol. 2011 V.13 (1) P.92-108.Tran SL, Guillemet E, Ngo-Camus M, Clybouw C, Puhar A, Moris A, Gohar M, Lereclus D, Ramarao N. Haemolysin II is a Bacillus cereus virulence factor that induces apoptosis of macrophages // Cell Microbiol. 2011 V.13 (1) P.92-108.

Tran SL, Puha A, Ngo-Camus M, Ramarao N. Trypan Blue Dye Enters Viable Cells Incubated with the Pore-Forming Toxin HlyII of Bacillus cereus II. PLoS ONE 2011 V.6, Issue 9,| e22876.Tran SL, Puha A, Ngo-Camus M, Ramarao N. Trypan Blue Dye Enters Viable Cells Incubated with the Pore-Forming Toxin HlyII of Bacillus cereus II. PLoS ONE 2011 V.6, Issue 9, | e22876.

Claims

A method of permebializing primary hepatocyte membranes, comprising treating liver cells with Hlyll Bacillus cereus pore-forming hemolysin, which increases the efficiency of penetration of low molecular weight substances into cells, in which Hlyll hepatocytes from B. cereus are exposed in a concentration range of 0.1-1 μg / ml.