RU2502805C1

RU2502805C1 - MICROBIOLOGICAL SYNTHESIS METHOD OF TARGET RELEASED PROTEIN IN YEAST Saccharomyces cerevisiae

Info

Publication number: RU2502805C1
Application number: RU2012139788/10A
Authority: RU
Inventors: Дмитрий Георгиевич Козлов; Дарья Викторовна Молчанова; Ирек Ильясович Губайдуллин; Сергей Эдуардович Чеперегин; Борис Дмитриевич Ефремов; Олег Владимирович Тюрин
Priority date: 2012-09-18
Filing date: 2012-09-18
Publication date: 2013-12-27

Abstract

FIELD: biotechnologies.

SUBSTANCE: method involves cultivation in the appropriate conditions of yeast Saccharomyces cerevisiae and release of target protein; besides, release is directed with leader polypeptide, which has amino acid sequence SEQ ID NO1 and representing a variant of a pro-area of leader polypeptide of protein PpPIRl Pichia pastoris.

EFFECT: invention enlarges the range of methods for obtaining target protein in yeast Saccharomyces cerevisiae and increases possibilities for effective synthesis of such proteins.

2 dwg, 4 ex

Description

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа синтеза целевого секретируемого белка человека в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae.The invention relates to the field of biotechnology and relates to a method for the synthesis of the target secreted human protein in Saccharomyces cerevisiae yeast cells.

Под секретируемыми белками будем понимать такие целевые растворимые белки, биосинтез которых в клетках дрожжей S. cerevisiae сопровождается их секрецией во внеклеточную среду.By secreted proteins we mean soluble target proteins whose biosynthesis in S. cerevisiae yeast cells is accompanied by their secretion into the extracellular medium.

Получение белков технического и медицинского назначения с использованием рекомбинантных эукариотических организмов является важным направлением биотехнологической промышленности. Значительное место в общем спектре продуктов занимают секретируемые белки, производство которых более экономично по сравнению с внутриклеточными, благодаря возможности применения упрощенной схемы их выделения и очистки. К числу микроорганизмов, используемых для этих целей, относят дрожжи S.cerevisiae.Obtaining proteins of technical and medical purposes using recombinant eukaryotic organisms is an important area of the biotechnological industry. Secreted proteins occupy a significant place in the overall spectrum of products, the production of which is more economical than intracellular due to the possibility of using a simplified scheme for their isolation and purification. The microorganisms used for these purposes include S. cerevisiae yeast.

Известно, что эффективность секреции белков в дрожжах зависит от выбора направляющих секрецию лидерных полипептидов (лидерных областей) [Romanos et al., 1992, Yeast, 8: 423-488; Simonen et al., 1994, J Biol Chem, 269(19): 13887-13892; Murasugi, 2010, Recent Patents Biotechnology, 4: 153-166]. В наиболее общем виде лидерный полипептид состоит из сигнальной части (пре-области) и про-области, каждая из них удаляется из состава секретируемого белка по мере выполнения своей функции.It is known that the efficiency of protein secretion in yeast depends on the choice of secretion-guiding leader polypeptides (leader regions) [Romanos et al., 1992, Yeast, 8: 423-488; Simonen et al., 1994, J Biol Chem, 269 (19): 13887-13892; Murasugi, 2010, Recent Patents Biotechnology, 4: 153-166]. In its most general form, a leader polypeptide consists of a signal part (pre-region) and a pro-region, each of which is removed from the composition of the secreted protein as it performs its function.

К основным функциям лидерных полипептидов относят:The main functions of leader polypeptides include:

- направление белков по секреторному пути клетки (функция пре- и про-области);- the direction of proteins along the secretory pathway of the cell (function of the pre- and pro-region);

- участие в процессах сворачивания и созревания секретируемых белков (в основном функция про-области) [Takagi & Takahashi, 2003, Appl Microbiol Biotechnol 63:1-9; Simonen et al., 1994, J Biol Chem, 269(19): 13887-13892];- participation in the folding and maturation processes of secreted proteins (mainly the function of the pro-region) [Takagi & Takahashi, 2003, Appl Microbiol Biotechnol 63: 1-9; Simonen et al., 1994, J Biol Chem, 269 (19): 13887-13892];

- повышение растворимости, т.е. термодинамической стабильности секретируемых белков (функция про-области) [Kohara et al., 1994, Biosci Biotechnol Biochem, 58(4):779-81; Zhang et al., 2001, J Cell Biol. 153(6): 1187-98].- increased solubility, i.e. thermodynamic stability of secreted proteins (pro-region function) [Kohara et al., 1994, Biosci Biotechnol Biochem, 58 (4): 779-81; Zhang et al., 2001, J Cell Biol. 153 (6): 1187-98].

Способ с использованием лидерного пептида (пре-про области) α-фактора дрожжей S.cerevisiae, зарекомендовал себя как эффективный и универсальный способ синтеза целевых секретируемых белков [Romanos et al, 1992, Yeast 8, 423-488; Daly & Hearn, 2005, J. Mol. Recognit., 18: 119-138; Gellissen et al., 2005, FEMS Yeast Research 5: 1079-1096].The method using the leader peptide (pre-pro region) of S. cerevisiae yeast α-factor has established itself as an effective and universal method for the synthesis of targeted secreted proteins [Romanos et al, 1992, Yeast 8, 423-488; Daly & Hearn, 2005, J. Mol. Recognit., 18: 119-138; Gellissen et al., 2005, FEMS Yeast Research 5: 1079-1096].

Другим известным секреторным лидером дрожжевого происхождения является пре-про-область гликопротеина HSP150 S. cerevisiae, положительное влияние которой на секрецию гетерологичных белков в клетках дрожжей установлено, например, для β-лактамазы [Simonen et al., 1994, J Biol Chem, 269: 13887-92] и внеклеточного домена рецептора фактора роста нервов крысы [Simonen et al., 1996, Yeast, 12: 457-66].Another well-known secretory leader of yeast origin is the pre-pro-region of the S. cerevisiae HSP150 glycoprotein, whose positive effect on the secretion of heterologous proteins in yeast cells has been established, for example, for β-lactamase [Simonen et al., 1994, J Biol Chem, 269: 13887-92] and the extracellular domain of rat nerve growth factor receptor [Simonen et al., 1996, Yeast, 12: 457-66].

Примером последовательности искусственного происхождения, эффективно выполняющей в клетках дрожжей функции лидерного полипептида, является фрагмент белка интерлейкина-1-бета [Lee et al., 1999, Biotechnol Prog, 15: 884-890; WO98/54339A1].An example of a sequence of artificial origin, effectively performing the functions of a leader polypeptide in yeast cells, is an interleukin-1-beta protein fragment [Lee et al., 1999, Biotechnol Prog, 15: 884-890; WO98 / 54339A1].

Найден ряд модификаций про-областей лидерных полипептидов, которые обеспечивают улучшение процессинга целевых белков [Kjeldsen et al., 1996, Gene, 170: 107-112] и секреторной активности [Kjeldsen, 2000, Appl Microbiol Biotechnol, 54: 277-286]. В частности, известен искусственно сконструированный про-пептид, обеспечивающий 4-кратное увеличение секреции инсулина человека по сравнению со стандартным вариантом про-области α-фактора дрожжей [Kjeldsen, 2000, Appl Microbiol Biotechnol, 54: 277-286].A number of modifications of pro-regions of leader polypeptides have been found that provide improved processing of target proteins [Kjeldsen et al., 1996, Gene, 170: 107-112] and secretory activity [Kjeldsen, 2000, Appl Microbiol Biotechnol, 54: 277-286]. In particular, an artificially engineered pro-peptide is known that provides a 4-fold increase in human insulin secretion compared to the standard pro-region of the yeast α-factor [Kjeldsen, 2000, Appl Microbiol Biotechnol, 54: 277-286].

Однако ни один из известных лидерных полипептидов не может считаться универсальным инструментом для организации синтеза секретируемых белков в клетках дрожжей.However, none of the known leader polypeptides can be considered a universal tool for organizing the synthesis of secreted proteins in yeast cells.

Например, в отношении продукции альбумина в клетках S.cerevisiae пре-про-область α-фактора опосредует не увеличение секреции, а 5-6-кратное увеличение деградации этого белка, тогда, как другие лидерные полипептиды подобных эффектов не обнаруживают [Sleep et al., 1990, Biotechnology, 8:42-46]. Дестабилизация целевого белка в присутствии α-факторного лидера отмечена и в экспериментах по экспрессии лизоцима шелковичного червя в клетках P.pastoris [Koganesawa et al., 2001, Protein Engeneering, 14(9):705-710].For example, in relation to albumin production in S. cerevisiae cells, the pre-pro-region of the α-factor does not mediate an increase in secretion, but a 5-6-fold increase in the degradation of this protein, while other leader polypeptides do not show such effects [Sleep et al. , 1990, Biotechnology, 8: 42-46]. Destabilization of the target protein in the presence of the α-factor leader was also noted in experiments on the expression of silkworm lysozyme in P. pastoris cells [Koganesawa et al., 2001, Protein Engeneering, 14 (9): 705-710].

Различные по протяженности фрагменты белка HSP1500 S. cerevisiae выполняют функцию эффективного секреторного лидера в дрожжах S.cerevisiae, при этом они обладают разными транспортными возможностями и разными возможностями по стимулированию корректного сворачивания секретируемого белка [Simonen et al., 1994, J Biol Chem, 269(19): 13887-13892; Simonen et al., 1996, Yeast, 12(5):457-66].Various length fragments of the S. cerevisiae HSP1500 protein function as an effective secretory leader in S. cerevisiae yeast, while they have different transport capabilities and different possibilities for stimulating the correct folding of the secreted protein [Simonen et al., 1994, J Biol Chem, 269 ( 19): 13887-13892; Simonen et al., 1996, Yeast, 12 (5): 457-66].

Также лишь один из вариантов лидеров на основе последовательности белка HSP150 обеспечивает секрецию высокоактивной бета-лактамазы в клетках S.cerevisiae, тогда как другие варианты лидеров вызывают накопление белка в клетках или секрецию неактивной формы белка [Simonen et al., 1994, J Biol Chem, 269(19): 13887-13892].Also, only one of the leader variants based on the HSP150 protein sequence provides the secretion of highly active beta-lactamase in S. cerevisiae cells, while other leader variants cause protein accumulation in the cells or secretion of the inactive form of the protein [Simonen et al., 1994, J Biol Chem, 269 (19): 13887-13892].

В этой связи расширение арсенала лидерных полипептидов, пригодных для решения задач, связанных с секрецией целевых белков в клетках дрожжей S.cerevisiae, является актуальной задачей.In this regard, the expansion of the arsenal of leader polypeptides suitable for solving problems associated with the secretion of target proteins in S. cerevisiae yeast cells is an urgent task.

В качестве ближайшего аналога заявляемого изобретения рассмотрим способ микробиологического синтеза целевого секретируемого белка в дрожжах S.cerevisiae с использованием лидерного полипептида, включающего 45 аминокислотных остатков субъединицы I белка HSP150 S.cerevisiae [WO93/18167].As the closest analogue of the claimed invention, we consider a method of microbiological synthesis of the target secreted protein in S. cerevisiae yeast using a leader polypeptide comprising 45 amino acid residues of the subunit I of the S. cerevisiae HSP150 protein [WO93 / 18167].

Температуро-индуцируемый белок HSP150 клеточной стенки дрожжей S. cerevisiae, имеет процессируемый лидерный полипептид размером 72 аминокислотных остатка, из которых первые 18 остатков формируют сигнальный пептид, а последующие 54 остатка, образующие субъединицу I белка, выполняют функцию про-области [WO93/18167, Russo et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3671-3675].The temperature-induced protein HSP150 of the cell wall of the yeast S. cerevisiae has a processable leader polypeptide of 72 amino acid residues, of which the first 18 residues form a signal peptide, and the subsequent 54 residues forming the protein I subunit function as a pro-region [WO93 / 18167, Russo et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3671-3675].

В дополнение к возможностям по использованию лидерных фрагментов белка HSP150 в клетках S. cerevisiae [Simonen et al., 1994, J Biol Chem, 269(19): 13887-13892; Simonen et al., 1996, Yeast, 12(5):457-66] известно об эффективном использовании лидерной области белка HSP150 S.cerevisiae в качестве секреторного лидера в клетках дрожжей Pichia pastoris [Sievi et al., 2003, Biotechnol. Prog., 19: 1368-1371]. На модели секреции каталитического домена α2,3-сиалилтрансферазы крысы показано, что лидер HSP150 способен направлять корректное сворачивание и секрецию белка в клетках Р. pastoris. Эффективность этой лидерной области в дрожжах P. pastoris и в дрожжах S.cerevisiae сопоставима с эффективностью универсального α-факторного лидера [Sievi et al., 2003, Biotechnol. Prog, 19: 1368-1371].In addition to the potential for using leader fragments of the HSP150 protein in S. cerevisiae cells [Simonen et al., 1994, J Biol Chem, 269 (19): 13887-13892; Simonen et al., 1996, Yeast, 12 (5): 457-66] is aware of the efficient use of the leader region of the S. cerevisiae HSP150 protein as a secretory leader in Pichia pastoris yeast cells [Sievi et al., 2003, Biotechnol. Prog., 19: 1368-1371]. Using a model of secretion of the catalytic domain of rat α2,3-sialyltransferase, it was shown that the leader of HSP150 is able to direct the correct folding and secretion of protein in P. pastoris cells. The efficiency of this leader region in the yeast P. pastoris and in the yeast S. cerevisiae is comparable with the efficiency of the universal α-factor leader [Sievi et al., 2003, Biotechnol. Prog. 19: 1368-1371].

С другой стороны известен белок PpPIR1 дрожжей Pichia pastoris, гомологичный белку HSP150 S. cerevisiae и также имеющий лидерный полипептид. Известно, что вариант лидерного полипептида белка PpPIR1 P.pastoris, имеющий размер 59 аминокислотных остатков и гомологичный лидерной области белка HSP150 S.cerevisiae, может служить секреторным лидером в клетках P.pastoris [Khasa et al., 2011, Yeast, 28(3):213-26].On the other hand, Pichia pastoris yeast PpPIR1 protein is known homologous to S. cerevisiae HSP150 protein and also having a leader polypeptide. It is known that the P.pastoris PpPIR1 protein leader polypeptide variant, having a size of 59 amino acid residues and homologous to the S. cerevisiae HSP150 leader region, can serve as a secretory leader in P. pastoris cells [Khasa et al., 2011, Yeast, 28 (3) : 213-26].

Про-область лидерного полипептида белка HSP150 S. cerevisiae и про-область лидерного полипептида белка PpPIR1 Pichia pastoris гомологичны друг другу, однако содержат достаточно протяженные негомологичные участки и различаются по длине.The pro-region of the leader polypeptide of the HSP150 protein S. cerevisiae and the pro-region of the leader polypeptide of the PpPIR1 protein Pichia pastoris are homologous to each other, however, they contain rather long non-homologous regions and vary in length.

Задача заявляемого изобретения - расширение арсенала способов микробиологического синтеза целевых секретируемых белков в дрожжах Saccharomyces cerevisiae.The objective of the invention is the expansion of the arsenal of methods for microbiological synthesis of targeted secreted proteins in Saccharomyces cerevisiae yeast.

Задача решена путем разработки способа микробиологического синтеза целевого секретируемого белка путем культивирования в подходящих условиях дрожжей Saccharomyces cerevisiae, секреция целевого белка в клетках которых направлена лидерным полипептидом, в состав которого включен вариант про-области лидерного полипептида белка PpPIRl Pichia pastoris, соответствующий аминокислотной последовательности SEQ ID NO1.The problem is solved by developing a method for microbiological synthesis of the target secreted protein by culturing Saccharomyces cerevisiae yeast under suitable conditions, the secretion of the target protein in the cells of which is directed by the leader polypeptide, which includes the pro-region variant of the leader polypeptide PpPIR Pichia pastoris, corresponding to the amino acid sequence of SEQ ID NO1 .

Используемый в заявляемом изобретении вариант про-области лидерного полипептида белка PpPIR1 Pichia pastoris отличается:Used in the claimed invention, the variant pro-region of the leader polypeptide of the protein PpPIR1 Pichia pastoris is different:

- от известного варианта этой про-области [Khasa et al., 2011, Yeast, 28(3):213-26] тремя аминокислотными заменами, а именно, в положении 38 аминокислотный остаток Asp заменен на остаток Ser, в положении 39 аминокислотный остаток Lys заменен на остаток Met, а в положении 40 аминокислотный остаток Ilе заменен на остаток Glu,- from a known variant of this pro-region [Khasa et al., 2011, Yeast, 28 (3): 213-26] with three amino acid substitutions, namely, at position 38, the amino acid residue Asp is replaced by the residue Ser, at position 39, the amino acid residue Lys is replaced with a Met residue, and at position 40, the amino acid residue Il is replaced with a Glu residue,

- от фрагмента белка HSP150 S. cerevisiae, использованного в способе ближайшем аналоге, отличается размером (42 остатка в SEQ ID NO1 и не менее 45 остатков в ближайшем аналоге) и заменами не менее, чем в 50% аминокислотных позиций.- differs from the HSP150 protein fragment of S. cerevisiae used in the closest analogue method in size (42 residues in SEQ ID NO1 and at least 45 residues in the closest analogue) and substitutions in at least 50% of amino acid positions.

В заявляемом изобретении использован вариант полного лидерного полипептида белка PpPIR1, который отличается от опубликованного варианта [Khasa et al., 2011, Yeast, 28(3):213-26] указанными выше заменами в про-области и наличием дополнительного метионина на N- конце.In the claimed invention, the full leader PpPIR1 protein polypeptide variant was used, which differs from the published version [Khasa et al., 2011, Yeast, 28 (3): 213-26] with the above substitutions in the pro-region and the presence of additional methionine at the N-terminus .

Эффективность заявляемого способа подтверждена на примерах синтеза в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae сывороточного альбумина человека и интерферона альфа-2b человекаThe effectiveness of the proposed method is confirmed by examples of synthesis in yeast cells of Saccharomyces cerevisiae human serum albumin and human interferon alpha-2b

Способ в общем видеThe method in General

Для амплификации фрагмента хромосомной ДНК дрожжей P. pastoris, кодирующей, лидерный полипептид белка PpPIR1. используют метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для того чтобы в процессе амплификации изменить последовательность амплифицируемого фрагмента ДНК так, чтобы измененная последовательность содержала уникальный сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции NcoI и кодировала вариант модифицированного полипептида SEQ ID NO1, используют дополнительные праймеры. Амплифицированный фрагмент ДНК методами генной инженерии сливают с последовательностью ДНК, обладающей функцией промотора в дрожжах S. cerevisiae, и результирующий фрагмент ДНК, прецизионно слитый с последовательностью ДНК, кодирующей целевой секретируемый белок, клонируют в экспрессионном векторе. При этом экспрессионным вектором может быть эписомный или интегративный вектор, способный стабильно и селективно поддерживаться в клетках дрожжей S. cerevisiae.For amplification of a fragment of the chromosomal DNA of the yeast P. pastoris encoding the leader polypeptide of the protein PpPIR1. use the method of polymerase chain reaction (PCR). In order to change the sequence of the amplified DNA fragment in the amplification process so that the altered sequence contains a unique recognition site for the restriction endonuclease NcoI and encodes a variant of the modified polypeptide SEQ ID NO1, additional primers are used. The amplified DNA fragment is fused by genetic engineering to a DNA sequence having the function of a promoter in S. cerevisiae yeast, and the resulting DNA fragment, precision fused to the DNA sequence encoding the target secreted protein, is cloned into an expression vector. Moreover, the expression vector may be an episomal or integrative vector capable of stably and selectively being maintained in S. cerevisiae yeast cells.

Сконструированным вектором трансформируют клетки реципиентного штамма дрожжей S. cerevisiae. Для этого используют одну из рутинных процедур трансформации. Селекцию трансформантов осуществляют за счет комплементации рецессивной хромосомной мутации реципиентного штамма с помощью функционального аллеля гена, локализованного в составе векторной ДНК, или за счет использования в составе векторной ДНК гена, кодирующего один из доминантных признаков (например, определяющего устойчивость клеток к действию антибиотика).The constructed vector transform cells of the recipient strain of S. cerevisiae yeast. To do this, use one of the routine transformation procedures. The selection of transformants is carried out by complementing the recessive chromosomal mutation of the recipient strain using the functional allele of a gene localized in the vector DNA, or by using a gene encoding one of the dominant features in the vector DNA (for example, determining the resistance of cells to the action of an antibiotic).

Полученные трансформанты используют для биосинтеза секретируемого целевого белка. Для этого культивирование клеток полученных трансформантов осуществляют в среде следующего состава, в мас.%: пептон 1-3; дрожжевой экстракт 0,5-3; глюкоза 1-3, вода - остальное, рН среды - естественный в течение 16-48 часов при температуре 22-32°С на качалке 100-350 об/мин.The obtained transformants are used for the biosynthesis of secreted target protein. For this, the cultivation of the cells of the obtained transformants is carried out in an environment of the following composition, in wt.%: Peptone 1-3; yeast extract 0.5-3; glucose 1-3, water - the rest, the pH of the medium is natural for 16-48 hours at a temperature of 22-32 ° C on a rocking chair 100-350 rpm

В этих условиях клетки дрожжей секретируют в среду культивирования целевой белок.Under these conditions, yeast cells secrete the target protein into the culture medium.

Способ позволяет синтезировать различные целевые секретируемые белки, включая сывороточный альбумин и интерферон альфа-2b человека, в количествах, превосходящих или по крайней мере не уступающих количествам белков, синтезируемых с использованием способов, известных из предыдущего уровня развития техники.The method allows the synthesis of various target secreted proteins, including serum albumin and human interferon alpha-2b, in amounts exceeding or at least not inferior to the amounts of proteins synthesized using methods known from the prior art.

Заявляемое изобретение проиллюстрировано следующими фигурами:The invention is illustrated by the following figures:

Фиг 1. Влияние лидерных полипептидов на уровень секреции сыворточного альбумина человека в дрожжах S.cerevisiae. Секреция сывороточного альбумина человека направлена следующими лидерными полипептидами:Fig 1. The effect of leader polypeptides on the level of secretion of human serum albumin in S. cerevisiae yeast. The secretion of human serum albumin is directed by the following leader polypeptides:

HSA5 - сигнальным пептидом «ART» (штамм HSA5-Sc),HSA5 - signal peptide "ART" (strain HSA5-Sc),

HSA7 - лидерным полипептидом на основе сигнального пептида «ART», слитого с про-областью белка HSP150 дрожжей S.cerevisiae (штамм HSA7-Sc),HSA7 - leader polypeptide based on the signal peptide "ART", fused to the pro-region of S. cerevisiae yeast HSP150 protein (HSA7-Sc strain),

HSA8 - полным лидерным полипептидом белка PpPIR1 дрожжей P.pastoris, включающим последовательность SEQ ID NO1 (штамм HSA8-Sc),HSA8 — the complete leader polypeptide of the P.pastoris yeast PpPIR1 protein, comprising the sequence of SEQ ID NO1 (HSA8-Sc strain),

HSA9 - лидерным полипептидом на основе сигнального пептида «ART», слитого с последовательностью SEQ ID NO1 про-области белка PpPIR1 дрожжей P.pastoris (штамм HSA9-Sc).HSA9, the leader polypeptide based on the ART signal peptide, fused to the sequence SEQ ID NO1 of the pro-region of P. pastoris yeast PpPIR1 protein (HSA9-Sc strain).

Штаммы S.cerevisiae HSA5-Sc и HSA7-Sc используют лидерные полипептиды, известные из предыдущего уровня техники, и рассмотрены в качестве контроля к штаммам HSA8-Sc и HSA9-Sc, секретирующим альбумин человека с использованием лидерных полипептидов, включающих последовательность SEQ ID NO1, являющейся вариантом про-области белка PpPIR1 P.pastoris. Приведены сравнительные данные иммуноферментного анализа (ИФА) образцов культуральной жидкости из двух экспериментов. Данные усреднены по 3-10 клонам случайных трансформантов. Указаны величины среднеквадратичного отклонения.The strains of S. cerevisiae HSA5-Sc and HSA7-Sc use leader polypeptides known in the prior art and are considered as a control for HSA8-Sc and HSA9-Sc strains secreting human albumin using leader polypeptides comprising the sequence SEQ ID NO1, a variant of the pro-region of P.pastoris PpPIR1 protein. Comparative data of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of culture fluid samples from two experiments are presented. Data are averaged over 3-10 clones of random transformants. The standard deviation values are indicated.

Фиг.2. Электрофореграмма образцов культуральной жидкости, полученных в результате культивирования штаммов дрожжей: IFN-F-Sc (дорожка «α-factor»), IFN-H-Sc (дорожка «PpPIR1»). Штамм S.cerevisiae IFN-F-Sc использует лидерный полипептид, известный из предыдущего уровня техники, и рассмотрен в качестве контроля к штамму IFN-H-Sc, секретирующему интерферон альфа-2b человека с использованием лидерного полипептида, включающего последовательность SEQ ID NO1.Figure 2. Electrophoregram of culture fluid samples obtained by culturing yeast strains: IFN-F-Sc (lane "α-factor"), IFN-H-Sc (lane "PpPIR1"). The strain S.cerevisiae IFN-F-Sc uses a leader polypeptide known in the art and is considered as a control for the IFN-H-Sc strain secreting human interferon alpha-2b using a leader polypeptide comprising the sequence of SEQ ID NO1.

На дорожки нанесены образцы, содержащие по 5 мкл культуральной жидкости каждого штамма. Маркерами молекулярного веса (дорожка М, слева приведены значения молекулярного веса белковых маркеров (в кДа) служили белки набора PageRuler Prestained Protein Ladder (#SM0671, "Fermentas"). В качестве отрицательного контроля (не способного синтезировать интерферон альфа-2b человека) нанесен образец культуральнгой жидкости реципиентного штамма S.cerevisiae G1L.Samples containing 5 μl of culture fluid of each strain were applied to the tracks. The molecular weight markers (lane M, the molecular weight of the protein markers (in kDa) are shown on the left are the proteins of the PageRuler Prestained Protein Ladder kit (# SM0671, "Fermentas"). A sample was applied as a negative control (unable to synthesize human interferon alpha-2b) culture fluid of the recipient strain of S. cerevisiae G1L.

Заявляемое изобретение проиллюстрировано следующими примерами.The invention is illustrated by the following examples.

Пример 1. Клонирование фрагмента ДНК, кодирующего лидерный полипептид белка PpPIR1 P.pastoris, включающий SEP ID NO1Example 1. Cloning of a DNA fragment encoding a leader polypeptide of P.pastoris PpPIR1 protein including SEP ID NO1

Этап 1. Амплификация геномного фрагмента ДНКStage 1. Amplification of the genomic DNA fragment

Фрагмент ДНК, кодирующий лидерный полипептид белка PpPIR1 P.pastoris получают в результате 2-х этапной ПЦР-амплификации фрагментов хромосомной ДНК штамма GS115 (Invitrogen, USA). Матрицей для амплификации служит хромосомная ДНК штамма GS115 P.pastoris, которую выделяют по методу Сидорука [Сидорук с соавт., 2009]. На 1-ом этапе осуществляют ПЦР-амплификацию фрагмента-1 с использованием пары праймеров N520 (5′-attaaatgatcaaccatgatgtacaggaactt) и N541 (5′-tgtgctccaaggttcggaa), а также фрагмента-2 - с использованием праймеров N540 (5′-ttccgaaccttggagcaca) и N521 (′-ttactcgagtctagatctcttttccatggaggcatctaaggacttaa). На 2-ом этапе осуществляют ПЦР-амплификацию фрагмента-3 с использованием праймеров N520/N521 и смеси фрагментов 1 и 2 в качестве матрицы.A DNA fragment encoding the leader polypeptide of P.pastoris PpPIR1 protein is obtained as a result of 2-step PCR amplification of fragments of chromosomal DNA of strain GS115 (Invitrogen, USA). The amplification matrix is the chromosomal DNA of P. pastoris strain GS115, which is isolated according to the Sidoruk method [Sidoruk et al., 2009]. At the 1st stage, PCR amplification of fragment-1 is carried out using a pair of primers N520 (5′-attaaatgatcaaccatgatgtacaggaactt) and N541 (5′-tgtgctccaaggttcggaa), as well as fragment-2, using primers N540 (5′cta tgcca (′ -Ttactcgagtctagatctcttttccatggaggcatctaaggacttaa). At the 2nd stage, PCR amplification of fragment-3 is carried out using primers N520 / N521 and a mixture of fragments 1 and 2 as a matrix.

Путем обработки эндонуклеазами рестрикции BclI и XhoI на концах амплифицированного фрагмента-3 ДНК открывают липкие концы соответствующих сайтов рестрикции и тем самым получают пригодный для последующего клонирования фрагмент ДНК, кодирующий лидерный полипептид белка PpPIR1 P.pastoris.By treating the restriction endonucleases BclI and XhoI at the ends of the amplified DNA fragment-3, the sticky ends of the corresponding restriction sites are opened, and thereby a DNA fragment encoding the leader polypeptide of P.pastoris PpPIR1 protein is suitable for subsequent cloning.

В результате 2-этапной амплификации в последовательности ДНК, кодирующей лидерный полипептид изменяют расположение уникального сайта узнавания рестриктазы NcoI.As a result of a 2-step amplification in the DNA sequence encoding the leader polypeptide, the location of the unique NcoI restriction enzyme recognition site is changed.

Этап 2. Клонирование фрагмента ДНК, кодирующего лидерный полипептид белка PpPIR1 P.pastoris, включающий SEQ ID NO1Step 2. Cloning of a DNA fragment encoding a leader polypeptide of P.pastoris PpPIR1 protein, including SEQ ID NO1

Плазмиду pUC18x-GAL1-hsp150pp получают в результате одновременного лигирования трех фрагментов ДНК: 1) HindIII/XhoI фрагмента, заключающего векторную часть лабораторной плазмиды pUC18x; 2) HindIII/BamHI фрагмента, заключающего последовательность промотора GAL1 дрожжей S.cerevisiae; 3) BclI/XhoI фрагмента ДНК, полученного на этапе 1 и кодирующего лидерный полипептид, белка PpPIR1 P.pastoris.Plasmid pUC18x-GAL1-hsp150pp is obtained by simultaneous ligation of three DNA fragments: 1) the HindIII / XhoI fragment containing the vector part of the laboratory plasmid pUC18x; 2) a HindIII / BamHI fragment comprising the sequence of the S. cerevisiae yeast GAL1 promoter; 3) BclI / XhoI DNA fragment obtained in stage 1 and encoding a leader polypeptide, P.pastoris PpPIR1 protein.

Результирующая плазмида pUC18x-GAL1-hspl50pp содержит в составе HindIII/NcoI фрагмента ДНК нуклеотидную последовательность промотора GAL1 дрожжей S.cerevisiae, слитую с последовательностью ДНК, кодирующей лидерный полипептид белка PpPIR1 P.pastoris.The resulting plasmid pUC18x-GAL1-hspl50pp contains, in the HindIII / NcoI DNA fragment, the nucleotide sequence of the S. cerevisiae yeast GAL1 promoter fused to the DNA sequence encoding the leader polypeptide of P.pastoris PpPIR1 protein.

Пример 2. Конструирование штаммов дрожжей S.cerevisiae для секреции сывороточного альбумина человекаExample 2. Construction of strains of yeast S. cerevisiae for the secretion of human serum albumin

Этап 1. Конструирование вектора pgkU::HSA8Step 1. Construction of the vector pgkU :: HSA8

С этой целью получают три фрагмента ДНК: 1) HindIII/SalI фрагмент ДНК, заключающий векторную часть интегративного вектора р91-3 [RU2420 567]; 2) Hindlll/Ncol фрагмент ДНК плазмиды pUC18x-GAL1-hsp150pp, заключающий нуклеотидную последовательность промотора GAL1 дрожжей S.cerevisiae, слитую с последовательностью ДНК, кодирующей лидерный полипептид белка PpPIR1 P.pastoris; 3) NcoI/XhoI фрагмент ДНК, кодирующий структурный ген HSA сывороточного альбумина человека, получаемый в результате открытия концевых сайтов рестрикции NcoI и XhoI во фрагменте ДНК, который амплифицируют в реакции ПЦР с использованием праймеров N522 (5'-tatccatggaaaagagagacgctcacaagtcagaa) и N169 (5'-gagcggataacaatttcacacagg) и ДНК вектора р69-63 (RU2009140367) в качестве матрицы.For this purpose, three DNA fragments are obtained: 1) a HindIII / SalI DNA fragment comprising the vector part of the integrative vector p91-3 [RU2420 567]; 2) a Hindlll / Ncol DNA fragment of the plasmid pUC18x-GAL1-hsp150pp containing the nucleotide sequence of the S. cerevisiae yeast GAL1 promoter fused to the DNA sequence encoding the leader polypeptide of P.pastoris PpPIR1 protein; 3) NcoI / XhoI DNA fragment encoding the human serum albumin HSA structural gene obtained by opening the terminal NcoI and XhoI restriction sites in a DNA fragment that is amplified by PCR using N522 primers (5'-tatccatggaaaagagagacgctcacaagtcagaa) -gagcggataacaatttcacacagg) and DNA vector p69-63 (RU2009140367) as a matrix.

Вектор pgkU::HSA8 получают в результате одновременного направленного лигирования этих трех фрагментов ДНК.The pgkU :: HSA8 vector is obtained by simultaneous directional ligation of these three DNA fragments.

Вектор pgkU::HSA8 предназначен для экспрессии в клетках дрожжей S.cerevisiae под контролем промотора GAL1 гена сывороточного альбумина человека, секреция которого направляется модифицированным вариантом лидерного полипептида белка PpPIR1 P.pastoris. The pgkU :: HSA8 vector is designed for expression in S. cerevisiae yeast cells under the control of the GAL1 promoter of the human serum albumin gene, the secretion of which is directed by a modified variant of the leader polypeptide of P.pastoris PpPIR1 protein.

Этап 2. Конструирование вектора pgU::HSA7Step 2. Construction of the pgU :: HSA7 vector

С этой целью HindIII/NcoI фрагмент ДНК вектора pgkU::HSA8, заключающий нуклеотидную последовательность промотора GAL1 дрожжей S.cerevisiae, слитую с последовательностью ДНК, кодирующей лидерный полипептид белка PpPIR1 P.pastoris, замещают на HindIII/NcoI фрагмент ДНК, заключающий нуклеотидную последовательность промотора GAL1 дрожжей S.cerevisiae, слитую с последовательностью ДНК, кодирующей искусственный сигнальный пептид «ART» (HindIII/PstI фрагмент ДНК вектора р69-35, RU2009140367), который в свою очередь слит с последовательностью ДНК, кодирующей про-область белка HSP150 дрожжей S.cerevisiae (PstI/NcoI фрагмент ДНК вектора р91-16, RU2420567).To this end, the HindIII / NcoI DNA fragment of the vector pgkU :: HSA8, comprising the nucleotide sequence of the S. cerevisiae yeast GAL1 promoter, fused to the DNA sequence encoding the leader polypeptide of the P. pastoris PpPIR1 protein, is replaced by the HindIII / NcoI DNA fragment containing the nucleotide sequence of the promoter S. cerevisiae yeast GAL1 fused to the DNA sequence encoding the artificial signal peptide “ART” (HindIII / PstI DNA fragment vector p69-35, RU2009140367), which in turn is fused to the DNA sequence encoding the pro-region of the HSP150 protein of S. yeast cerevisiae (PstI / NcoI DNA fragment of vector p91-16, RU2420567).

В результате получают вектор pgkU::HSA7, который предназначен для экспрессии в клетках дрожжей S.cerevisiae под контролем промотора GAL1 гена сывороточного альбумина человека, секреция которого направлена лидерным полипептидом на основе сигнального пептида «ART», слитого с про-областью белка HSP150 дрожжей S.cerevisiae.The result is the vector pgkU :: HSA7, which is designed for expression in S. cerevisiae yeast cells under the control of the GAL1 promoter of the human serum albumin gene, the secretion of which is directed by the leader polypeptide based on the ART signal peptide fused to the pro-region of the yeast S HSP150 protein .cerevisiae.

Этап 3. Конструирование вектора pgkU::HSA9Step 3. Construction of the pgkU :: HSA9 vector

С этой целью PstI/NcoI фрагмент ДНК вектора pgkU::HSA7, заключающий нуклеотидную последовательность, кодирующую про-область белка HSP150 дрожжей S.cerevisiae, замещают на PstI/NcoI фрагмент ДНК, кодирующий про-область белка PpPIR1 P.pastoris. PstI/NcoI фрагмент ДНК, кодирующий про-область белка PpPIR1 P.pastoris, получают в результате ПЦР-амплификации соответствующего фрагмента ДНК плазмиды pUC18x-GAL1-hsp150pp с использованием праймеровTo this end, the PstI / NcoI DNA fragment of the vector pgkU :: HSA7 containing the nucleotide sequence encoding the pro-region of S. cerevisiae yeast HSP150 protein is replaced by the PstI / NcoI DNA fragment encoding the pro-region of P. pastoris PpPIR1 protein. The PstI / NcoI DNA fragment encoding the pro-region of P.pastoris PpPIR1 protein is obtained by PCR amplification of the corresponding DNA fragment of the plasmid pUC18x-GAL1-hsp150pp using primers

N542 (5′-tgcctgcagctttgggtgcctacgttccttccgaaccttggagcaca) иN542 (5′-tgcctgcagctttgggtgcctacgttccttccgaaccttggagcaca) and

N521 (5′-ttactcgagtctagatctcttttccatggaggcatctaaggacttaa) и последующего открытия липких концов амплифицированного фрагмента путем обработки эндонуклеазами рестрикции PstI и NcoI.N521 (5′-ttactcgagtctagatctctttttccatggaggcatctaaggacttaa) and the subsequent opening of the sticky ends of the amplified fragment by treatment with restriction endonucleases PstI and NcoI.

В результате получают вектор pgkU::HSA9 для экспрессии гена сывороточного альбумина человека в клетках S.cerevisiae под контролем промотора GALL Секреция этого белка направлена лидерным полипептидом на основе сигнального пептида «ART», слитого с последовательностью SEQ ID NO1 про-области белка PpPIR1 P.pastoris.The result is the pgkU :: HSA9 vector for expression of the human serum albumin gene in S. cerevisiae cells under the control of the GALL promoter. The secretion of this protein is directed by the leader polypeptide based on the ART signal peptide fused to the sequence SEQ ID NO1 of the PpPIR1 P protein region. pastoris.

Этап 4. Конструирование штаммов дрожжей S.cerevisiae HSA5-Sc, HSA7-Sc, HSA8-Sc и HSA9-ScStep 4. Construction of S. cerevisiae HSA5-Sc, HSA7-Sc, HSA8-Sc and HSA9-Sc Yeast Strains

С этой целью осуществляют трансформацию реципиентного штамма S. cerevisiae G1L, маркированного четырьмя ауксотрофными мутациями (RU2420567), вектором р69-35 (RU2009140367) или pgkU::HSA7 или pgkU::HSA8 или pgkU::HSA9, соответственно.For this purpose, the transformation of the recipient strain of S. cerevisiae G1L is carried out, marked with four auxotrophic mutations (RU2420567), p69-35 vector (RU2009140367) or pgkU :: HSA7 or pgkU :: HSA8 or pgkU :: HSA9, respectively.

Трансформацию реципиентого штамма дрожжей G1L проводят по методу Ито с соавт.(Ito Н., Fukuda Y., Murata К., Kimura А. 1983. J Bacteriol., 153: 163-168). Для отбора трансформантов используют синтетическую среду с добавлением аминокислот или оснований, соответствующих ауксотрофным мутациям конструируемого штамма, до конечной концентрации 30 мкг/л. Состав синтетической среды, мас.%: КН₂РО₄ - 0,1, MgSO₄ - 0,05, NaCl - 0,01, CaCl₂ - 0,01, (NH₄)₂SO₄ - 0,35, глюкоза - 2, тиамин (витамина В1) - 0,02, рибофлавин (витамина В2) - 0,02, никотиновая кислота (витамина РР) - 0,02, п-аминобензойная кислота - 0,02, пантотенат кальция - 0,02, биотин - 0,0002, пиридоксин (витамина В6) - 0,02, инозит - 1, фолиевая кислота - 0,02, вода - остальное.The transformation of the recipient strain of yeast G1L is carried out according to the method of Ito et al. (Ito N., Fukuda Y., Murata K., Kimura A. 1983. J Bacteriol., 153: 163-168). For the selection of transformants, a synthetic medium is used with the addition of amino acids or bases corresponding to auxotrophic mutations of the constructed strain to a final concentration of 30 μg / L. The composition of the synthetic medium, wt.%: KN ₂ PO ₄ - 0.1, MgSO ₄ - 0.05, NaCl - 0.01, CaCl ₂ - 0.01, (NH ₄ ) ₂ SO ₄ - 0.35, glucose - 2, thiamine (vitamin B1) - 0.02, riboflavin (vitamin B2) - 0.02, nicotinic acid (vitamin PP) - 0.02, p-aminobenzoic acid - 0.02, calcium pantothenate - 0.02, biotin - 0.0002, pyridoxine (vitamin B6) - 0.02, inositol - 1, folic acid - 0.02, water - the rest.

Непосредственно перед трансформацией ДНК каждого вектора обрабатывают рестриктазой XhoI, тем самым удаляя из состава интегрируемого вектора бактериальную часть и направляя интеграцию вектора в локус PGK1 хромосомы дрожжей.Immediately prior to DNA transformation, each vector is treated with XhoI restrictase, thereby removing the bacterial part from the integrable vector and directing the integration of the vector into the PGK1 locus of the yeast chromosome.

В результате трансформации получают по 2 независимых клона штаммов дрожжей S.cerevisiae HSA5-Sc, HSA7-Sc, HSA8-Sc и HSA9-Sc, соответственно. Секреция сывороточного альбумина человека в клетках полученных штаммов дрожжей направлена сигнальным пептидом «ART» (HSA5-Sc), лидерным полипептидом на основе сигнального пептида «ART», слитого с про-областью бежа HSP150 дрожжей S.cerevisiae (HSA7-Sc), лидерным полипептидом на основе сигнального пептида «ART», слитого с последовательностью SEQ ID NO1 про-области белка PpPIR1 дрожжей P.pastoris (HSA9-Sc) или полным лидерным полипептидом белка PpPIR1 дрожжей P.pastoris, содержащим последовательность SEQ ID NO1 про-области (HSA8-Sc).As a result of transformation, 2 independent clones of S. cerevisiae HSA5-Sc, HSA7-Sc, HSA8-Sc and HSA9-Sc yeast strains are obtained, respectively. The secretion of human serum albumin in the cells of the obtained yeast strains is directed by the ART signal peptide (HSA5-Sc), a leader polypeptide based on the ART signal peptide fused to the beige HSP150 beige region of S. cerevisiae (HSA7-Sc), a leader polypeptide based on the ART signal peptide fused to the sequence of SEQ ID NO1 pro-region of P. pastoris yeast PpPIR1 protein (HSA9-Sc) or the complete leader polypeptide of P. pastoris yeast PpPIR1 protein containing the sequence of pro-region SEP ID NO1 (HSA8- Sc).

Штаммы S.cerevisiae HSA5-Sc и HSA7-Sc рассматрены в качестве контроля к штаммам HSA8-Sc и HSA9-Sc, секретирующим альбумин человека с использованием лидерных полипептидов, включающих последовательность SEQ ID NO1 про-области белка PpPIR1 P.pastoris.The strains of S. cerevisiae HSA5-Sc and HSA7-Sc were considered as a control for strains of HSA8-Sc and HSA9-Sc secreting human albumin using leader polypeptides comprising the sequence of SEQ ID NO1 pro-region of P.pastoris PpPIR1 protein.

Пример 3. Конструирование штаммов дрожжей S.cerevisiae для секреции интерферона альфа-2b человекаExample 3. Construction of strains of yeast S. cerevisiae for secretion of human interferon alpha-2b

Этап 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды pUC18x-IFNStep 1. Construction of Recombinant Plasmid pUC18x-IFN

С этой целью осуществляют лигирование двух фрагментов ДНК: 1) BamHI/XhoI фрагмента, заключающего векторную часть лабораторного вектора pUC18x; 2) BamHI/XhoI фрагмента ДНК, который получают в результате ПЦР-амплификации фрагмента ДНК плазмиды pUC18x-GAL1ppI-IFN2b (RU2427645) с использованием праймеров N499 (5'-ataggatccteteatctecctcaaacccac) и N169 (5-gagcggataacaatttcacacagg) и последующего открытия его липких концов с использованием рестриктаз BamHI и XhoI.To this end, two DNA fragments are ligated: 1) a BamHI / XhoI fragment containing the vector part of the laboratory vector pUC18x; 2) BamHI / XhoI DNA fragment obtained by PCR amplification of the DNA fragment of the plasmid pUC18x-GAL1ppI-IFN2b (RU2427645) using primers N499 (5'-ataggatccteteatctecctcaaacccac) and N169 (5-gagccacgacagacagacacaca) using restriction enzymes BamHI and XhoI.

Плазмида pUC18x-IFN заключает нуклеотидную последовательность структурного гена интерферона альфа-2b человека в составе BamHI/XhoI фрагмента ДНК. Этап 2. Конструирование вектора pPDX2H-sIFNPlasmid pUC18x-IFN contains the nucleotide sequence of the structural gene of human interferon alpha-2b in the BamHI / XhoI DNA fragment. Step 2. Construction of the vector pPDX2H-sIFN

С этой целью осуществляют одновременное лигирование трех фрагментов ДНК: 1) HindIII/XhoI фрагмента ДНК, заключающего векторную часть рекомбинантной плазмиды pPDX2-IFN2b (RU2427645); 2) HindIII/BgIII фрагмента ДНК плазмиды pUC18x-GALl-hsp150pp, заключающего нуклеотидную последовательность промотора GAL1 дрожжей S.cerevisiae, слитую с последовательностью ДНК, кодирующей лидерный полипептид белка PpPIR1 P.pastoris; 3) BamHI/XhoI фрагмента ДНК плазмиды pUC18x-IFN, заключающего нуклеотидную последовательность структурного гена интерферона альфа-2b человека.To this end, three DNA fragments are simultaneously ligated: 1) a HindIII / XhoI DNA fragment containing the vector part of the recombinant plasmid pPDX2-IFN2b (RU2427645); 2) the HindIII / BgIII DNA fragment of the plasmid pUC18x-GALl-hsp150pp containing the nucleotide sequence of the S. cerevisiae yeast GAL1 promoter fused to the DNA sequence encoding the leader polypeptide of P.pastoris PpPIR1 protein; 3) BamHI / XhoI DNA fragment of the plasmid pUC18x-IFN, comprising the nucleotide sequence of the structural gene of human interferon alpha-2b.

В результате получают репликативный вектор pPDX2H-sIFN, который предназначен для экспрессии в клетках дрожжей S.cerevisiae под контролем промотора GAL1 гена рекомбинантного интерферона альфа-2b человека, секреция которого направлена лидерным полипептидом белка PpPIR1 P.pastoris.The result is a replicative vector pPDX2H-sIFN, which is designed for expression in S. cerevisiae yeast cells under the control of the GAL1 promoter of the recombinant human interferon alpha-2b gene, the secretion of which is directed by the leader polypeptide of P.pastoris PpPIR1 protein.

Этап 3. Конструируирование вектора pPDX2F-sIFNStep 3. Construction of the vector pPDX2F-sIFN

С этой целью HindIII/NcoI фрагмент ДНК плазмиды pPDX2H-sIFN заменяют на HindIII/NcoI фрагмент ДНК плазмиды pUC18x-GAL1ppI-IFN2b [RU2427645], заключающий нуклеотидную последовательность промотора GAL1 дрожжей S.cerevisiae, слитую с последовательностью ДНК, кодирующей лидерный полипептид α-фактора дрожжей S.cerevisiae (пре-про-область α-фактора дрожжей S.cerevisiae).To this end, the HindIII / NcoI DNA fragment of the plasmid pPDX2H-sIFN is replaced by the HindIII / NcoI DNA fragment of the plasmid pUC18x-GAL1ppI-IFN2b [RU2427645], which contains the nucleotide sequence of the S. cerevisiae yeast GAL1 promoter fused to the DNA sequence of the DNA coding factor S. cerevisiae yeast (pre-pro region of S. cerevisiae yeast α-factor).

В результате получают репликативный вектор pPDX2F-sIFN, который предназначен для экспрессии в клетках дрожжей S.cerevisiae под контролем промотора GAL1 гена рекомбинантного интерферона альфа-2b человека, секреция которого направлена лидерным полипептидом α-фактора дрожжей S.cerevisiae.The result is a replicative vector pPDX2F-sIFN, which is designed for expression in S. cerevisiae yeast cells under the control of the GAL1 promoter of the human recombinant interferon alpha-2b gene, the secretion of which is directed by the S. cerevisiae yeast α-factor leader polypeptide.

Этап 4. Конструирование штаммов дрожжей S.cerevisiae IFN-H-Sc и IFN-F-ScStage 4. Construction of strains of yeast S.cerevisiae IFN-H-Sc and IFN-F-Sc

С этой целью осуществляют трансформацию реципиентного штамма S. cerevisiae G1L, маркированного четырьмя ауксотрофными мутациями (RU2420567), вектором pPDX2H-sIFN или pPDX2F-sIFN, соответственно.To this end, the transformation of the recipient strain S. cerevisiae G1L, marked with four auxotrophic mutations (RU2420567), with the vector pPDX2H-sIFN or pPDX2F-sIFN, respectively, is carried out.

Трансформацию реципиентого штамма дрожжей G1L и селекцию трансформантов осуществляют как в примере 2 за исключением того, что используют кольцевые формы векторных ДНК, не подвергая их расщеплению.The transformation of the recipient strain of the yeast G1L and the selection of transformants is carried out as in example 2 except that the ring forms of vector DNA are used without subjecting them to cleavage.

В результате трансформации получают по 2 независимых клона штаммов дрожжей S.cerevisiae IFN-H-Sc и S.cerevisiae IFN-F-Sc, соответственно. Секреция рекомбинантного интерферона альфа-2b человека в штамме S.cerevisiae IFN-H-Sc направлена лидерным полипептидом белка PpPIR1 P.pastoris (IFN-H-Sc), а в штамме S.cerevisiae IFN-F-Sc, который является контролем, лидерным полипептидом α-фактора дрожжей S.cerevisiae (IFN-F-Sc).As a result of transformation, 2 independent clones of S. cerevisiae IFN-H-Sc and S. cerevisiae IFN-F-Sc yeast strains are obtained, respectively. The secretion of recombinant human interferon alpha-2b in the strain S.cerevisiae IFN-H-Sc is directed by the leader polypeptide of the protein PpPIR1 P. pastoris (IFN-H-Sc), and in the strain S.cerevisiae IFN-F-Sc, which is the control, the leader S. cerevisiae yeast α-factor polypeptide (IFN-F-Sc).

Пример 4. Культивирование дрожжей S.cerevisiae и анализ уровня секреции целевых белковExample 4. Cultivation of S. cerevisiae yeast and analysis of the level of secretion of target proteins

Для выращивания штаммов дрожжей S.cerevisiae IFN-H-Sc, IFN-F-Sc, HSA5-Sc, HSA7-Sc, HSA8-Sc и HSA9-Sc используют комплексную среду YPD следующего состава, мас.%: пептон -2, дрожжевой экстракт -1, глюкоза -2, вода - остальное. Дрожжи культивируют при температуре +28°С на качалке (250 об/мин) в течение 42 часов при плотности засева 5×10⁵ мл^-1.For the cultivation of the yeast strains S. cerevisiae IFN-H-Sc, IFN-F-Sc, HSA5-Sc, HSA7-Sc, HSA8-Sc and HSA9-Sc, YPD complex medium of the following composition is used, wt.%: Peptone -2, yeast extract -1, glucose -2, water - the rest. Yeast is cultivated at a temperature of + 28 ° C on a shaker (250 rpm) for 42 hours at a sowing density of 5 × 10 ⁵ ml ^-1 .

Сравнительный анализ уровня секреции интерферона альфа-2b человека в клетках штаммов IFN-H-Sc и IFN-F-Sc осуществляют путем электрофорез белков культуральной жидкости в 15% ПААГ в денатурирующих редуцирующих условиях с использованием системы Mini-PROTEAN Tetra Cell (#165-8000, "BioRad") по инструкции, прилагаемой к системе. Приготовление буферов, подготовку образцов культуральной жидкости, нанесение на гель и электрофорез проводят согласно инструкции, прилагаемой к системе. Используют маркеры молекулярного веса PageRuler Prestained Protein Ladder (#SM0671, "Fermentas"). Окрашивание геля нитратом серебра проводят при помощи набора PageSilver Silver Staining Kit "Fermentas" (#K0681, "Fermentas") согласно инструкции, прилагаемой к киту.A comparative analysis of the level of human interferon alpha-2b secretion in the cells of IFN-H-Sc and IFN-F-Sc strains is carried out by electrophoresis of the culture fluid proteins in 15% SDS page under denaturing reducing conditions using the Mini-PROTEAN Tetra Cell system (# 165-8000 , "BioRad") according to the instructions that came with the system. The preparation of buffers, the preparation of samples of the culture fluid, application to the gel and electrophoresis are carried out according to the instructions attached to the system. Use the molecular weight markers PageRuler Prestained Protein Ladder (# SM0671, "Fermentas"). Gel staining with silver nitrate is carried out using the PageSilver Silver Staining Kit "Fermentas" (# K0681, "Fermentas") according to the instructions attached to the whale.

Сравнительный анализ уровня секреции сывороточного альбумина человека осуществляют, используя метод и протокол ИФА Albumin Human Bioassay ELISA Kit (A 1274-85, "US Biological"). В качестве отрицательного контроля (не способного синтезировать сывороточный альбумин) используют реципиентный штамм дрожжей S.cerevisiae G1L.A comparative analysis of the level of secretion of human serum albumin is carried out using the method and protocol ELISA Albumin Human Bioassay ELISA Kit (A 1274-85, "US Biological"). As a negative control (unable to synthesize serum albumin), the recipient strain of S. cerevisiae G1L yeast is used.

Результаты сравнительного анализа (фиг.1) демонстрируют, что эффективность синтеза в дрожжах Saccharomyces cerevisiae секретируемого сывороточного альбумина человека с использованием лидерных полипептидов, включающих вариант про-области, SEQ ID NO1, превышает (штамм HSA8-Sc) или, по крайней мере, не уступает (штамм HSA9-SC) эффективности синтеза этого белка с использованием лидерных полипептидов, известных из предыдущего уровня техники (штаммы HSA5-Sc и HSA7-Sc).The results of a comparative analysis (FIG. 1) demonstrate that the efficiency of synthesis in yeast Saccharomyces cerevisiae of secreted human serum albumin using leader polypeptides including the pro-region variant, SEQ ID NO1, exceeds (strain HSA8-Sc) or, at least, not inferior (strain HSA9-SC) to the synthesis efficiency of this protein using leader polypeptides known from the prior art (strains HSA5-Sc and HSA7-Sc).

Данные сравнительного анализа (фиг.2) свидетельствуют, что эффективность синтеза секретируемого интерферона альфа-2b человека с использованием лидерного полипептида белка PpPIR1 P.pastoris, включающего вариант про-области с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO1 (штамм IFN-H-Sc), не уступает эффективности синтеза этого белка с помощью «универсального» лидерного полипептида α-фактора дрожжей, используемого в качестве контроля (штамм IFN-F-Sc). Кроме того, видно (фиг.2), что целевой продукт, синтезированный заявляемым способом с использованием штамма IFN-H-Sc отличается более высоким качеством, чем целевой продукт, синтезированный контрольным штаммом IFN-H-Sc, так как содержит значительно меньшее количество фоновых белков.A comparative analysis (Fig. 2) indicates that the synthesis efficiency of secreted human interferon alpha-2b using the leader polypeptide of P.pastoris PpPIR1 protein, including the pro-region variant with the amino acid sequence of SEQ ID NO1 (IFN-H-Sc strain), is not inferior to the synthesis efficiency of this protein using the “universal” leader yeast α-factor polypeptide used as a control (strain IFN-F-Sc). In addition, it is seen (figure 2) that the target product synthesized by the claimed method using the IFN-H-Sc strain is of higher quality than the target product synthesized by the control IFN-H-Sc strain, since it contains significantly less background proteins.

Таким образом, вариант про-области лидерного полипептида белка PpPIR1 Pichia pastoris, соответствующий аминокислотной последовательности SEQ ID NO1, с использованием которой разработан заявляемый способ, пополняет арсенал известных фрагментов лидерных пептидов для микробиологического синтеза секретируемых целевых белков в дрожжах Saccharomyces cerevisiae и увеличивает возможности для эффективного синтеза этих белков.Thus, the variant region of the leader polypeptide of the PpPIR1 protein of Pichia pastoris, corresponding to the amino acid sequence of SEQ ID NO1, using which the inventive method was developed, replenishes the arsenal of known fragments of leader peptides for microbiological synthesis of secreted target proteins in Saccharomyces cerevisiae yeast and increases the possibilities for efficient synthesis these proteins.

Заявляемый способ позволяет использовать для секреции целевых белков в клетках дрожжей S.cerevisiae вариант про-области лидерного полипептида белка PpPIR1 Pichia pastoris, соответствующий аминокислотной последовательности SEQ ID NO1, в сочетании с различными пре-областями.The inventive method allows the secretion of the target proteins in S. cerevisiae yeast cells to a variant of the pro-region of the leader polypeptide of Pichia pastoris PpPIR1 protein corresponding to the amino acid sequence of SEQ ID NO1 in combination with various pre-regions.

Источники научно-технической информацииSources of scientific and technical information

Сидорук К.В., Левитин Е.И., Пиксасова О.В. (2009). Универсальный метод выделения высокомолекулярной ДНК из микроорганизмов, основанный на предварительной обработке биомассы раствором ацетата аммония. «Актуальные вопросы генетики, радиобиологии и радиоэкологии: Вторые чтения, посвященные памяти В.И.Корогодина и В.А.Шевченко». (Дубна, ОИЯИ, 12-13 января, 2009). Материалы тезисов и докладов. Стр.100.Sidoruk K.V., Levitin E.I., Piksasova O.V. (2009). A universal method for the isolation of high molecular weight DNA from microorganisms, based on preliminary processing of biomass with a solution of ammonium acetate. "Actual issues of genetics, radiobiology and radioecology: Second readings dedicated to the memory of V.I. Korogodin and V.A. Shevchenko." (Dubna, JINR, January 12–13, 2009). Abstracts and reports. Page 100.

Daly, R. and Hearn, M.T.W. (2005) Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: A useful experimental tool in protein engineering and production. JMol Recognit, 18:119-138. Gellissen G., Kunze G., Gaillardin C, Cregg J.M., Berardi E., Veenhuis M., van der Klei I. (2005). New yeast expression platforms based on methylotrophic Hansenula polymorpha and Pichia pastoris and on dimorphic Arxula adeninivorans and Yarrowia lipolytica - a comparison. FEMS Yeast Res. 2005, 5(11):1079-96.Daly, R. and Hearn, M.T.W. (2005) Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: A useful experimental tool in protein engineering and production. JMol Recognit, 18: 119-138. Gellissen G., Kunze G., Gaillardin C, Cregg J.M., Berardi E., Veenhuis M., van der Klei I. (2005). New yeast expression platforms based on methylotrophic Hansenula polymorpha and Pichia pastoris and on dimorphic Arxula adeninivorans and Yarrowia lipolytica - a comparison. FEMS Yeast Res. 2005, 5 (11): 1079-96.

Ito H., Fukuda Y, Murata K, Kimura A.(1983) Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J.Bacteriol. 153:163-168.Ito H., Fukuda Y, Murata K, Kimura A. (1983) Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J. Bacteriol. 153: 163-168.

Khasa Y.P., Conrad S., Sengul M., Plautz S., Meagher M.M., Inan M. (2011). Isolation of Pichia pastoris PIR genes and their utilization for cell surface display and recombinant protein secretion. Yeast, 28(3): 213-226.Khasa Y.P., Conrad S., Sengul M., Plautz S., Meagher M.M., Inan M. (2011). Isolation of Pichia pastoris PIR genes and their utilization for cell surface display and recombinant protein secretion. Yeast, 28 (3): 213-226.

Kjeldsen T. Yeast secretory expression of insulin precursors. Appl Microbiol Biotechnol. 54 (2000) 277-286.Kjeldsen T. Yeast secretory expression of insulin precursors. Appl Microbiol Biotechnol. 54 (2000) 277-286.

Kjeldsen T, Brandt J, Andersen AS, Egel-Mitani M, Hach M, Pettersson AF, Vad К. A removable spacer peptide in an alpha-factor-leader/insulin precursor fusion protein improves processing and concomitant yield of the insulin precursor in Saccharomyces cerevisiae. Gene 170 (1996) 107-112.Kjeldsen T, Brandt J, Andersen AS, Egel-Mitani M, Hach M, Pettersson AF, Vad K. A removable spacer peptide in an alpha-factor-leader / insulin precursor fusion protein improves processing and concomitant yield of the insulin precursor in Saccharomyces cerevisiae. Gene 170 (1996) 107-112.

Koganesawa N, Aizawa T, Masaki K, Matsuura A, Nimori T, Bando H, Kawano K, Nitta K. (2001). Construction of an expression system of insect lysozyme lacking thermal stability: the effect of selection of signal sequence on level of expression in the Pichia pastoris expression system. Protein Eng, 14(9): 705-710.Koganesawa N, Aizawa T, Masaki K, Matsuura A, Nimori T, Bando H, Kawano K, Nitta K. (2001). Construction of an expression system of insect lysozyme lacking thermal stability: the effect of selection of signal sequence on level of expression in the Pichia pastoris expression system. Protein Eng, 14 (9): 705-710.

Kohara A, Yamamoto Y, Kikuchi M. (1994) Processing and secretion of human growth hormone with an artificial signal sequence. Biosci Biotechnol Biochem., 58(4):779-781Kohara A, Yamamoto Y, Kikuchi M. (1994) Processing and secretion of human growth hormone with an artificial signal sequence. Biosci Biotechnol Biochem., 58 (4): 779-781

Lee J., Choi S.-I., Jang J.S., Jang K., Moon J.W., Bae C.S., Yang D.S., Seong B.L. (1999) Novel secretion system of recombinant Saccharomyces cerevisiae using an N-terminus residue of human IL-1β as secretion enhancer. Biotechnol Prog, 15: 884-890.Lee J., Choi S.-I., Jang J.S., Jang K., Moon J.W., Bae C.S., Yang D.S., Seong B.L. (1999) Novel secretion system of recombinant Saccharomyces cerevisiae using an N-terminus residue of human IL-1β as secretion enhancer. Biotechnol Prog, 15: 884-890.

Murasugi A. (2010) Secretory Expression of Human Protein in the Yeast Pichia pastoris by Controlled Fermentor Culture. Recent Patents on Biotechnology, 4: 153-166.Murasugi A. (2010) Secretory Expression of Human Protein in the Yeast Pichia pastoris by Controlled Fermentor Culture. Recent Patents on Biotechnology, 4: 153-166.

Romanos M.A., Scorer C.A., Clare J.J. (1992). Foreign gene expression in yeast: a review. Yeast, 8: 423-488.Romanos M.A., Scorer C.A., Clare J.J. (1992). Foreign gene expression in yeast: a review. Yeast, 8: 423-488.

Russo P., Kalkkinen N., Sareneva H., Paakkola J., Makarow M. A heat shock gene from Saccharomyces cerevisiae encoding a secretory glycoprotein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992)3671-3675.Russo P., Kalkkinen N., Sareneva H., Paakkola J., Makarow M. A heat shock gene from Saccharomyces cerevisiae encoding a secretory glycoprotein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 3671-3675.

Sievi E., Halnninen A.-L., Salo H., Kumar V., Makarow M. Validation of the HSP150 Polypeptide Carrier and HSP150 Promoter in Expression of Rat r2,3-Sialyltransferase in Yeasts. Biotechnol. Prog. 2003,19, 1368-1371Sievi E., Halnninen A.-L., Salo H., Kumar V., Makarow M. Validation of the HSP150 Polypeptide Carrier and HSP150 Promoter in Expression of Rat r2,3-Sialyltransferase in Yeasts. Biotechnol. Prog. 2003.19, 1368-1371

Simonen M., Jamsa E., Makarow M. The role of the carrier protein and disulfide formatioinn the folding of p-lactamase fusion proteins in the endoplasmic reticulum of yeast. The Journal of Biological Chemisitry 269 (1994) 13887-13892 Simonen M, Vihinen H, Jänsä E, Arumäe U, Kalkkinen N, Makarow M. The hsp150 delta-carrier confers secretion competence to the rat nerve growth factor receptor ectodomain in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 12 (1996) 457-466.Simonen M., Jamsa E., Makarow M. The role of the carrier protein and disulfide formatioinn the folding of p-lactamase fusion proteins in the endoplasmic reticulum of yeast. The Journal of Biological Chemisitry 269 (1994) 13887-13892 Simonen M, Vihinen H, Jänsä E, Arumäe U, Kalkkinen N, Makarow M. The hsp150 delta-carrier confers secretion competence to the rat nerve growth factor receptor ectodomain in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 12 (1996) 457-466.

Sleep D., Belfield G.P., Goodey A.R. (1990) The secretion of human serum albumin from the yeast Saccharomyces cerevisiae using five different leader sequences. Biotechnology, 8: 42-46Sleep D., Belfield G.P., Goodey A.R. (1990) The secretion of human serum albumin from the yeast Saccharomyces cerevisiae using five different leader sequences. Biotechnology, 8: 42-46

Takagi H, Takahashi M. (2003). A new approach for alteration of protease functions: pro-sequence engineering. Appl Microbiol Biotechnol, 63(1):1-9.Takagi H, Takahashi M. (2003). A new approach for alteration of protease functions: pro-sequence engineering. Appl Microbiol Biotechnol, 63 (1): 1-9.

Zhang X, Kiechle F. (2001). Hoechst 33342-induced apoptosis is associated with decreased immunoreactive topoisomerase I and topoisomerase I-DNA complex formation. Ann Clin Lab Sci., 31(2):187-198.Zhang X, Kiechle F. (2001). Hoechst 33342-induced apoptosis is associated with decreased immunoreactive topoisomerase I and topoisomerase I-DNA complex formation. Ann Clin Lab Sci., 31 (2): 187-198.

Claims

A method of microbiological synthesis of a target secreted protein by culturing Saccharomyces cerevisiae yeast under suitable conditions, the secretion of the target protein in the cells of which is directed by a leader polypeptide, characterized in that the leader polypeptide includes a variant region of the leader polypeptide of Pichia pastoris PpPIR1 corresponding to the amino acid sequence of SEQ ID NO 1.