RU2499000C1

RU2499000C1 - VARIABLE DOMAINS OF LIGHT AND HEAVY CHAIN OF MURINE MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST TUMOUR NECROSIS FACTOR ALPHA (TNF-α) OF HUMAN BEING (VERSIONS); ANTIGEN-BINDING FRAGMENT (Fab) AGAINST TNF-α OF HUMAN BEING, WHICH CONTAINS ABOVE SAID DOMAINS (VERSIONS)

Info

Publication number: RU2499000C1
Application number: RU2012113360/10A
Authority: RU
Inventors: Ольга Николаевна Солопова; Любовь Петровна Позднякова; Петр Георгиевич Свешников; Сергей Владимирович Беневоленский; Тимур Анверович Ягудин; Сергей Сергеевич Зацепин; Елена Владимировна Морозкина; Елена Витальевна Клячко
Priority date: 2012-04-06
Filing date: 2012-04-06
Publication date: 2013-11-20
Also published as: RU2012113360A

Abstract

FIELD: biotechnologies.

SUBSTANCE: invention proposes variable domains of heavy (VH) and light (VL) chains of murine antibody against tumour necrosis factor alpha (TNF-α) of a human being, as well as antigen-binding fragment Fab, which are selectively bound to TNF-α of the human being and neutralise it.

EFFECT: invention can be further used in development of medicines for therapy of TNF-α-mediated diseases and for diagnostics of such diseases.

3 cl, 5 tbl, 7 ex

Description

Область техникиTechnical field

Настоящее изобретение относится к антителам, в частности к вариабельным доменам легкой и тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела, связывающегося с фактором некроза опухоли альфа (ФНО-α) человека и нейтрализующего его, и антигенсвязывающему фрагменту (Fab) против ФНО-α человека, содержащему указанные домены.The present invention relates to antibodies, in particular to the variable domains of the light and heavy chains of a murine monoclonal antibody that binds to and neutralizes human tumor necrosis factor alpha (TNF-α), and an anti-human TNF-α antigen binding fragment (Fab) containing these domains .

Предшествующий уровень техникиState of the art

Среди хронических воспалительных заболеваний самым частым является ревматоидный артрит (РА). По данным ВОЗ встречаемость этого заболевания колеблется от 0,6 до 1,3%. Ежегодно диагноз «ревматоидный артрит» получает 0,02% населения Земного шара. Из-за постоянных болей в суставах и нарушения их функций 50% больных РА становятся инвалидами в течение 5 лет после начала заболевания, 10% больных становятся инвалидами менее чем за 2 года. Заболевание РА происходит и в детском (ювенильный РА), и в пожилом возрасте, но основной контингент заболевших - это лица среднего возраста, наиболее часто ревматоидный артрит впервые регистрируется у пациентов в возрасте 30-35 лет. Преждевременная утрата трудоспособности вследствие РА приводит к существенным экономическим потерям. Продолжительность жизни больных РА снижается вследствие развития сопутствующих заболеваний, а также в результате побочных эффектов проводимого лечения. Наиболее частыми сопутствующими заболеваниями являются: поражения легких (до 70% всех больных РА), поражения сердечно-сосудистой системы, приводящие к уменьшению продолжительности жизни на 10-15 лет; поражение почек, сопровождающееся артериальной гипертензией; поражения ЖКТ, нервной, эндокринной систем, развитие онкологических заболеваний, главным образом, неходжкинских лимфом. Риск заболеть этим видом рака у больных РА повышается в 26 раз.Among chronic inflammatory diseases, the most common is rheumatoid arthritis (RA). According to WHO, the incidence of this disease ranges from 0.6 to 1.3%. Every year, 0.02% of the world's population receives a diagnosis of rheumatoid arthritis. Due to constant joint pain and impaired function, 50% of RA patients become disabled within 5 years after the onset of the disease, 10% of patients become disabled in less than 2 years. RA disease occurs both in childhood (juvenile RA) and in old age, but the main contingent of patients is middle-aged people, most often rheumatoid arthritis is first registered in patients aged 30-35 years. Premature disability due to RA leads to significant economic losses. The life expectancy of patients with RA decreases due to the development of concomitant diseases, as well as as a result of side effects of the treatment. The most common concomitant diseases are: lung lesions (up to 70% of all patients with RA), cardiovascular system lesions, leading to a decrease in life expectancy by 10-15 years; damage to the kidneys, accompanied by arterial hypertension; lesions of the gastrointestinal tract, nervous, endocrine systems, the development of cancer, mainly non-Hodgkin's lymphomas. The risk of getting this type of cancer in patients with RA rises by 26 times.

Этиология ревматоидного артрита остается невыясненной, так же как и этиология других заболеваний, характеризующихся состоянием хронического воспаления (псориаз, болезнь Крона и др.), поэтому основной целью лечения этих заболеваний является достижение клинико-лабораторной ремиссии, предотвращение деструктивных преобразовании органов, подверженных воспалению, и инвалидизации пациентов.The etiology of rheumatoid arthritis remains unclear, as does the etiology of other diseases characterized by a state of chronic inflammation (psoriasis, Crohn’s disease, etc.), therefore the main goal of treating these diseases is to achieve clinical and laboratory remission, to prevent destructive transformation of organs prone to inflammation, and disability of patients.

Фактор некроза опухоли альфа (ФНО-α) является ключевым медиатором воспалительных реакций, его ингибиторы широко используются как основа препаратов для лечения состояний хронического воспаления, таких как ревматоидный артрит, псориаз, болезнь Крона, псориатический артрит, саркоидоз, болезнь Бехтерева и др. Такие препараты доказали свою эффективность везде, где они используются, в том числе и в России, они способны приводить больного в состояние длительной стойкой ремиссии.Tumor necrosis factor alpha (TNF-α) is a key mediator of inflammatory reactions, its inhibitors are widely used as the basis of drugs for the treatment of chronic inflammation, such as rheumatoid arthritis, psoriasis, Crohn's disease, psoriatic arthritis, sarcoidosis, ankylosing spondylitis, etc. Such drugs They have proven their effectiveness wherever they are used, including in Russia, they are able to bring the patient into a state of prolonged stable remission.

Наиболее значительных успехов в достижении ремиссии удается достигнуть с помощью препаратов, блокирующих действие ФНО-α. Первым таким зарегистрированным препаратом стал препарат Ремикейд (Remicade®), разработанный английской компанией «Centocor» в 1993 году (Knight DM, Trinh H, Le J, Siegel S, Shealy D, McDonough M, Scallon B, Moore MA, Vilcek J, Daddona P, et al.: Construction and initial characterization of a mouse-human chimeric anti-TNF antibody. Mol. Immunol. 1993 Nov;30(16): 1443-53). Основу препарата составляет химерное антитело infliximab, полученное из мышиного моноклонального антитела путем замены мышиных константных областей IgG на человеческие. Во избежание иммунореактивности препарат рекомендуется вводить одновременно с приемом цитостатика, как правило, метотрексата.The most significant success in achieving remission can be achieved with drugs that block the effect of TNF-α. The first such registered drug was Remicade®, developed by Centocor in 1993 (Knight DM, Trinh H, Le J, Siegel S, Shealy D, McDonough M, Scallon B, Moore MA, Vilcek J, Daddona P, et al .: Construction and initial characterization of a mouse-human chimeric anti-TNF antibody. Mol. Immunol. 1993 Nov; 30 (16): 1443-53). The drug is based on the chimeric antibody infliximab, obtained from a murine monoclonal antibody by replacing mouse constant regions of IgG with human ones. In order to avoid immunoreactivity, the drug is recommended to be administered simultaneously with the administration of a cytostatic agent, usually methotrexate.

Дальнейшая эволюция фармпрепаратов была направлена на снижение их иммуногенности и эффекта привыкания, повышение времени полураспада в огранизме. Новые препараты на рынке блокаторов ФНО-α - это Симпони (Simponi®, антитело Golimumab; Евразийские патенты ЕА007005 В1 и ЕА009288 В1) и Симзия (Cimzia®, антитело Certolizumab pegol; патент РФ 2303604). Последний примечателен тем, что представляет собой не полноразмерную молекулу антитела против ФНО-α, а ее антигенсвязывающий фрагмент (Fab-фрагмент).The further evolution of pharmaceuticals was aimed at reducing their immunogenicity and the effect of addiction, increasing the half-life in organism. New drugs on the market of TNF-α blockers are Simponi (Simponi®, Golimumab antibody; Eurasian patents EA007005 B1 and EA009288 B1) and Symzia (Cimzia®, Certolizumab pegol antibody; RF patent 2303604). The latter is noteworthy in that it is not a full-sized anti-TNF-α antibody molecule, but its antigen-binding fragment (Fab fragment).

Однако существует целый ряд ограничений в использовании блокаторов ФНО-α: во-первых, их высокая стоимость; во-вторых, наличие побочных действий; в-третьих, не у всех пациентов применение блокаторов ФНО-α оказывается эффективным; в-четвертых, отсутствуют отечественные препараты на основе блокаторов ФНО-α. Все это заставляет продолжать исследования по поиску новых противовоспалительных средств.However, there are a number of limitations in the use of TNF-α blockers: firstly, their high cost; secondly, the presence of side effects; thirdly, not all patients use TNF-α blockers is effective; fourthly, there are no domestic drugs based on TNF-α blockers. All this forces us to continue research on the search for new anti-inflammatory drugs.

Высокая стоимость препаратов во многом обусловлена тем, что они представляют собой полноразмерные гликозилированные моноклональные антитела либо рецептор ФНО-α 1 типа, соединенный с Fc-фрагменом человеческого иммуноглобулина. Такие молекулы могут производиться только в эукариотической экспрессионной системе, и их продукция весьма затратна. Переход от полноразмерных молекул, произведенных эукариотами, к Fab-фрагментам, произведенным в дрожжевой системе экспрессии и «утяжеленным» полиэтиленгликолем, позволит существенно снизить себестоимость производства препарата без потери эффективности. Такой препарат, Симзия (Cimzia®, антитело Certolizumab pegol; патент РФ 2303604), уже существует. Другая причина высокой стоимости лечения блокатерами ФНО-α - высокие дозы вводимых препаратов: например, дозировка ремикейда - 3-5 мг/кг веса пациента в зависимости от диагноза.The high cost of the drugs is largely due to the fact that they are full-sized glycosylated monoclonal antibodies or a type 1 TNF-α receptor coupled to the Fc fragment of human immunoglobulin. Such molecules can only be produced in a eukaryotic expression system, and their production is very expensive. The transition from full-sized molecules produced by eukaryotes to Fab fragments produced in the yeast expression system and “weighted” with polyethylene glycol will significantly reduce the cost of production of the drug without loss of effectiveness. Such a drug, Symzia (Cimzia®, Certolizumab pegol antibody; RF patent 2303604) already exists. Another reason for the high cost of treatment with TNF-α blockers is the high doses of the drugs administered: for example, the dosage of remicade is 3-5 mg / kg of the patient's weight, depending on the diagnosis.

Краткое описание изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION

Целью настоящего изобретения является получение мышиных антител, связывающихся с фактором некроза опухоли альфа (ФНО-α) человека и нейтрализующих его, определение последовательностей вариабельных доменов тяжелых (VH) и легких (VL) цепей указанных антител и получение антигенсвязывающих фрагментов (Fab) мышиного антитела, связывающихся с ФНО-α человека и нейтрализующих его.The aim of the present invention is to obtain murine antibodies that bind to and neutralize human tumor necrosis factor alpha (TNF-α), determine the sequences of the variable domains of the heavy (VH) and light (VL) chains of these antibodies, and obtain antigen-binding fragments (Fab) of a murine antibody, binding to human TNF-α and neutralizing it.

Указанная цель была достигнута путем выделения двух мышиных антител, Е2 и F11, обладающих способностью к ингибированию активности ФНО-α человека, и определения последовательности их вариабельных участков.This goal was achieved by isolating two murine antibodies, E2 and F11, with the ability to inhibit human TNF-α activity, and determine the sequence of their variable regions.

Настоящее изобретение представляет собой вариабельный участок тяжелой цепи (VH) антитела Е2, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NО: 1, вариабельный участок легкой цепи (VL) указанного антитела, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2, а также антигенсвязывающий фрагмент (Fab), содержащий указанные вариабельные участки.The present invention is a variable region of the heavy chain (VH) of an E2 antibody containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a variable region of the light chain (VL) of the indicated antibody containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, as well as an antigen binding fragment (Fab), containing said variable regions.

Также настоящее изобретение представляет собой вариабельный участок тяжелой цепи (VH) антитела F11, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, вариабельный участок легкой цепи (VL) указанного антитела, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 4, а также антигенсвязывающий фрагмент (Fab), содержащий указанные вариабельные участки.The present invention also provides a variable region of the heavy chain (VH) of an F11 antibody containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, a variable region of the light chain (VL) of the indicated antibody containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and an antigen binding fragment (Fab) containing said variable regions.

Подробное описание настоящего изобретенияDetailed description of the present invention

Антитела обычно состоят из двух тяжелых цепей, связанных между собой дисульфидными связями, и легких цепей, ассоциированных с N-концом каждой из тяжелых цепей. Каждая тяжелая цепь содержит на N-конце вариабельный домен с константным доменом на другом конце. Каждая легкая цепь также содержит на N-конце вариабельный домен с константным доменом. Вариабельные домены каждой пары легкой и тяжелой цепей образуют антигенсвязывающий фрагмент (Fab). Вариабельные домены легкой и тяжелой цепей обладают похожей общей структурой, и каждый домен включает каркас из четырех участков, последовательности которых являются относительно консервативными, связанных посредством трех участков, определяющих комплементарность (complementarity determining regions, CDRs). Четыре каркасных участка формируют конформацию типа бета-складчатого слоя, а CDRs образуют петли, связывающие конструкцию из бета-складчатого слоя. Участки CDRs расположены в непосредственной близости друг от друга благодаря каркасным участкам и вносят вклад в образование антигенсвязывающего участка. Участки CDRs и каркасные участки антител могут быть определены путем ссылки на нумерационную систему Кабата (Kabat numbering system, Kabat et al., (1987) "Sequences of Proteins oflmmunological Interest", US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office) в сочетании in conjunction with x-ray crystallography, as set forth in W091/09967.Antibodies usually consist of two heavy chains linked together by disulfide bonds, and light chains associated with the N-terminus of each of the heavy chains. Each heavy chain contains at the N-terminus a variable domain with a constant domain at the other end. Each light chain also contains at the N-terminus a variable domain with a constant domain. The variable domains of each pair of light and heavy chains form an antigen-binding fragment (Fab). The variable domains of light and heavy chains have a similar overall structure, and each domain includes a framework of four regions, the sequences of which are relatively conservative, linked through three regions that define complementarity (complementarity determining regions, CDRs). Four frame sections form a beta-fold type conformation, and CDRs form loops connecting the beta-fold structure. Plots CDRs are located in close proximity to each other due to the frame sections and contribute to the formation of antigennegative plot. Plots of CDRs and frame regions of antibodies can be determined by reference to the Kabat numbering system (Kabat numbering system, Kabat et al., (1987) "Sequences of Proteins oflmmunological Interest", US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office) combined in conjunction with x-ray crystallography, as set forth in W091 / 09967.

Для получения антитела, которое может связываться с каким-либо специфическим антигеном, обычно используют методику Kohler и Milstein (Kohler et al., (1976) Nature 256:495-497), получившую название гибридомной технологии. Суть метода сводится к получению культуры «бессмертных» гибридов (гибридом) путем слияния плазматической клетки (В-лимфоцита, продуцирующего антитела) и опухолевой клетки (миеломы или плазмоцитомы). Полученная гибридома способна продуцировать моноклональные антитела (как В-клетка) и при этом бесконечно делится (как опухолевая клетка), что позволяет достаточно долгое время секретировать in vitro или in vivo антитело, специфическое для целевого антигена.To obtain antibodies that can bind to any specific antigen, the method of Kohler and Milstein (Kohler et al., (1976) Nature 256: 495-497), called the hybridoma technology, are usually used. The essence of the method is to obtain a culture of “immortal” hybrids (hybridomas) by fusing a plasma cell (B-lymphocyte producing an antibody) and a tumor cell (myeloma or plasmacytoma). The resulting hybridoma is capable of producing monoclonal antibodies (like a B cell) and at the same time it divides endlessly (like a tumor cell), which allows secreting an antibody specific for the target antigen in vitro or in vivo for a rather long time.

Слияние клеток происходит под действием полиэтиленгликоля, изолецитина или вируса Сендай. На следующем этапе необходимо отобрать не слившиеся с лимфоцитами миеломные клетки (неслившиеся лимфоциты убирать не нужно: через недолгое время они погибнут сами). В процессе такой селекции гибридомные клетки высаживают на среды, содержащие вещества, блокирующие синтез нуклеотидов миеломными клетками. Для этого выведены специальные мутантные миеломные клеточные линии, дефектные по некоторым ферментам, участвующим в синтезе нуклеотидов.Cell fusion occurs under the influence of polyethylene glycol, isolecithin or Sendai virus. At the next stage, it is necessary to select myeloma cells that have not merged with lymphocytes (non-merged lymphocytes do not need to be removed: after a short time they will die themselves). In the process of such selection, hybridoma cells are planted on media containing substances that block the synthesis of nucleotides by myeloma cells. For this, special mutant myeloma cell lines were discovered that are defective in some enzymes involved in the synthesis of nucleotides.

Отбор гибридом, секретирующих нужные антитела, проводится путем проверки среды, в которой росли клетки, на предмет наличия в ней антител нужной специфичности.The selection of hybridomas secreting the desired antibodies is carried out by checking the environment in which the cells grew, for the presence of antibodies of the desired specificity in it.

Таким образом отбирают клетки, секретирующие антитела стабильно и в достаточном количестве. Большой объем антител нарабатывают или in vitro, или путем введения гибридом в перитонеальную полость мышей для получения асцита (Свешников. П.Г. Введение в молекулярную иммунологию и гибридомную технологию / П.Г.Свешников, В.В.Малайцев, И.М.Богданова, О.Н.Солопова // изд. МГУ. - М. - 2006).In this way, cells secreting antibodies are stably and in sufficient quantity selected. A large volume of antibodies is produced either in vitro or by introducing hybridomas into the peritoneal cavity of mice to obtain ascites (Sveshnikov. P.G. Introduction to molecular immunology and hybridoma technology / P.G. Sveshnikov, V.V. Malaytsev, I.M. Bogdanova, O.N. Solopova // ed. Of Moscow State University. - M. - 2006).

Получение материала, использующегося в качестве антигена, для инъекций животных включают в себя методики, хорошо известные из уровня техники, например использование полноразмерного белка, использование пептида, выбранного из иммуногенных участков белка, модифицирование антигена такими способами, как, например, связывание с динитрофенолом, связывание с арсаниловой кислотой, денатурация антигена, связывание антигена с белком-переносчиком, таким как, например, гемоцианин улитки, с пептидами, содержащими участки связывания с рецепторами Т-клеток класса II, с бусинами, а также любыми другими методами, известными из уровня техники. Смотри Harlow и др. (см. выше).The preparation of material used as an antigen for injection of animals includes methods well known in the art, for example, the use of a full-sized protein, the use of a peptide selected from immunogenic regions of the protein, modification of the antigen by methods such as, for example, binding to dinitrophenol, binding with arsanilic acid, antigen denaturation, antigen binding to a carrier protein, such as, for example, snail hemocyanin, with peptides containing receptor binding sites -cells class II, with the beads, as well as any other methods known in the art. See Harlow et al. (See above).

В частности, антителами, обладающими способностью к связыванию с фактором некроза опухоли альфа (ФНО-α) человека и нейтрализации его, являются антитела, содержащие вариабельные домены тяжелой и легкой цепи согласно настоящему изобретению. Указанные вариабельные домены тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3, а вариабельные домены легкой цепи антитела (VL) содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, необходимые для функционирования указанного антитела. Изолированный антигенсвязывающий фрагмент (Fab) согласно настоящему изобретению, селективно связывающийся с ФНО-α человека и нейтрализующий его, включает в себя вариабельный домен тяжелой цепи (VH) с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 1 и вариабельный домен легкой цепи (VL) с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 2 или вариабельный домен тяжелой цепи (VH) с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 3 и вариабельный домен легкой цепи (VL) с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 4.In particular, antibodies having the ability to bind to and neutralize human tumor necrosis factor alpha (TNF-α) are antibodies comprising the heavy and light chain variable domains of the present invention. Said monoclonal antibody heavy chain variable domains contain the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, and antibody light chain variable domains (VL) contain the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 necessary for functioning the specified antibodies. An isolated antigen binding fragment (Fab) according to the present invention, selectively binding to and neutralizing human TNF-α, includes a heavy chain variable domain (VH) with an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a light chain variable domain (VL) with an amino acid sequence SEQ ID NO: 2 or the variable domain of the heavy chain (VH) with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and the variable domain of the light chain (VL) with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.

В настоящем изобретении фраза "антитело или Fab, обладающие способностью к связыванию с фактором некроза опухоли альфа (ФНО-α) человека и нейтрализации его" означает молекулу, которая связывается с ФНО-α человека, образует стабильный комплекс и ингибирует активность ФНО-α человека. Стабильным комплексом является комплекс, в котором связывание между партнерами происходит на период времени, достаточный для того, чтобы произвести детектирование указанного комплекса с использованием описанных здесь методов. Термин "селективно связывается ФНО-α человека" означает способность указанной молекулы предпочтительно связываться с ФНО-α человека в отличие от связывания с белками, не имеющими отношения к ФНО-α человека, или связывания с небелковыми компонентами, присутствующими в образце. Антитело или Fab, которые предпочтительно связываются с ФНО-α человека, являются антитело или Fab, которые связываются с ФНО-α человека, но не связываются в существенной степени с другими молекулами или компонентами, которые могут присутствовать в образце. Такое существенное связывание предполагает, например, связывание антитела или Fab, связывающихся с ФНО-α человека, с молекулой, не являющейся ФНО-α человека, с аффиностью или силой, достаточной для того, чтобы помешать способности антитела, связывающегося с ФНО-α человека, определить уровень ФНО-α человека в образце. Примерами таких молекул и компонентов, которые могут присутствовать в образце, являются, но не ограничиваются ими, белки, не являющиеся ФНО-о, липиды и углеводы.In the present invention, the phrase "an antibody or Fab capable of binding to and neutralizing human tumor necrosis factor alpha (TNF-α)" means a molecule that binds to human TNF-α, forms a stable complex and inhibits the activity of human TNF-α. A stable complex is a complex in which binding between partners occurs for a period of time sufficient to detect the specified complex using the methods described here. The term “selectively binds human TNF-α” means the ability of said molecule to preferably bind to human TNF-α, as opposed to binding to proteins unrelated to human TNF-α or binding to non-protein components present in the sample. An antibody or Fab that preferably binds to human TNF-α is an antibody or Fab that binds to human TNF-α but does not substantially bind to other molecules or components that may be present in the sample. Such substantial binding involves, for example, the binding of an antibody or Fab binding to human TNF-α to a non-human TNF-α molecule with an affinity or strength sufficient to interfere with the ability of an antibody that binds human TNF-α, determine the level of human TNF-α in the sample. Examples of such molecules and components that may be present in a sample include, but are not limited to, non-TNF-o proteins, lipids, and carbohydrates.

Способность антитела или Fab к связыванию с антигеном может быть определена специалистом в данной области с использованием методов, включающих, но не ограничивающихся методом ELISA и равновесным диализом. Методы определения аффинности и силы связывания хорошо известны специалисту в данной области техники, подробно описаны Janeway и др. (Immunobiology: The Immune System in Health and Disease (Garland Publishing Company, 1996)).The ability of an antibody or Fab to bind to an antigen can be determined by a person skilled in the art using methods including, but not limited to, ELISA and equilibrium dialysis. Methods for determining affinity and binding strength are well known to those skilled in the art, described in detail by Janeway et al. (Immunobiology: The Immune System in Health and Disease (Garland Publishing Company, 1996)).

Fab, пригодный для осуществления настоящего изобретения, - это Fab, обладающий способностью к связыванию с ФНО-α человека и нейтрализации его, когда концентрация ФНО-α человека составляет от около 10 нг/мл и до около 10 пг/мл. В частности, пригодные в рамках настоящего изобретения Fab связывают ФНО-α человека и нейтрализуют его, когда концентрация ФНО-α человека составляет 10 нг/мл, около 1 нг/лм или менее, предпочтительно 100 нг/мл. Такие антитела и Fab описаны в сопутствующих Примерах.A Fab suitable for practicing the present invention is a Fab having the ability to bind to and neutralize human TNF-α when the concentration of human TNF-α is from about 10 ng / ml to about 10 pg / ml. In particular, Fabs useful in the framework of the present invention bind human TNF-α and neutralize it when the human TNF-α concentration is 10 ng / ml, about 1 ng / lm or less, preferably 100 ng / ml. Such antibodies and Fab are described in the accompanying Examples.

Fab моноклональных мышиных антител в соответствии с настоящим изобретением, которые селективно связываются с ФНО-α человека и нейтрализуют его, также могут быть получены с использованием подходящей гибридомы. Гибридомы могут быть выращены в питательной среде, и накопленные антитела могут быть выделены. Здесь и далее термин "выращиваемые клетки" относится к гибридомам или другим линиям клеток, которые производят антитела. Способы получения и проверки таких выращиваемых клеток описаны Harlow и др. (см. выше). Методы получения антигенного материала для инъекций в животное включают в себя методы, известные из уровня техники, например использование полноразмерного белка, пептидов, выбранных из иммуногенного участка этого белка, модифицирование антигена такими способами, как, например, связывание с динитрофенолом, связывание с арсаниловой кислотой, денатурация антигена, связывание антигена с белком-переносчиком, таким как, например, гемоцианин улитки, с пептидами, содержащими участки связывания с рецепторами Т-клеток класса II, с бусинами, а также любыми другими методами, известными из уровня техники. Смотри Harlow и др. (см. выше).Fab monoclonal murine antibodies in accordance with the present invention, which selectively bind to and neutralize human TNF-α, can also be obtained using a suitable hybridoma. Hybridomas can be grown in culture medium, and accumulated antibodies can be isolated. Hereinafter, the term "grown cells" refers to hybridomas or other cell lines that produce antibodies. Methods for the preparation and verification of such cultured cells are described by Harlow et al. (See above). Methods for producing antigenic material for injection into an animal include methods known in the art, for example, the use of a full-sized protein, peptides selected from the immunogenic region of the protein, modification of the antigen by methods such as, for example, binding to dinitrophenol, binding to arsanilic acid, denaturation of antigen, binding of antigen to a carrier protein, such as, for example, snail hemocyanin, with peptides containing binding sites for class II T-cell receptors, beads, as well as e by any other methods known in the art. See Harlow et al. (See above).

Fab, связывающиеся с ФНО-α человека и нейтрализующие его, согласно настоящему изобретению могут включать в себя многофункциональные молекулы, например бифункциональные молекулы, содержащие, по крайней мере, одну функциональную часть, которая специфически связывается с ФНО-α человека и нейтрализует его. Такие многофункциональные молекулы могут включать в себя, например, химерные молекулы, включающие в себя молекулу, которая связывается с ФНО-α человека и нейтрализует его, и вторую часть, которая дает возможность данной химерной молекуле связываться с субстратом или позволяет детектировать ее способом, при котором связывание с ФНО-α человека и его нейтрализация не ухудшаются. Примерами таких вторых частей являются, но не ограничиваются ими, фрагменты молекулы иммуноглобулина, флуоресцентный белок или фермент. Также Fab, связывающиеся с ФНО-α человека и нейтрализующие его, согласно настоящему изобретению могут быть модифицированы полиэтиленгликолем, т.е. пегилированы.Fabs that bind to and neutralize human TNF-α, according to the present invention may include multifunctional molecules, for example bifunctional molecules containing at least one functional part, which specifically binds to and neutralizes human TNF-α. Such multifunctional molecules can include, for example, chimeric molecules, including a molecule that binds to and neutralizes human TNF-α, and the second part, which allows this chimeric molecule to bind to a substrate or to detect it in a way in which binding to human TNF-α and its neutralization do not worsen. Examples of such second parts are, but are not limited to, fragments of an immunoglobulin molecule, a fluorescent protein, or an enzyme. Also Fab binding to and neutralizing human TNF-α according to the present invention can be modified with polyethylene glycol, i.e. pegylated.

Термин "взаимодействие", использованный здесь, означает введение, добавление образца, предположительно содержащего ФНО-α человека, к Fab, связывающему ФНО-α человека, например, путем объединения или смешения образца с Fab. В случае, если ФНО-α человека присутствует в образце, образуется комплекс Fab с ФНО-α человека; образование такого комплекса означает способность Fab селективно связываться с ФНО-α человека с образованием стабильного комплекса, который может быть детектирован. Детектирование может быть качественным, количественным или полуколичественным. Связывание ФНО-α человека из образца с Fab происходит в условиях, подходящих для формирования комплекса. Такие условия (например, подходящие концентрации, буферы, температура, время реакции), а также методы оптимизации таких условий хорошо известны специалисту в данной области техники. Связывание может быть обнаружено и измерено с использованием множества методов, являющихся стандартными в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, ферментативные методы иммунохимии (например, ELISA), иммунопреципитации, методы иммуноблотинга и другие методы иммунохимии, описанные, например, Sambrook и др. (см. выше) и Harlow и др. (см. выше). Эти ссылки также описывают примеры условий, в которых образуется комплекс.The term “interaction”, as used herein, means introducing, adding a sample, presumably containing human TNF-α, to Fab binding human TNF-α, for example, by combining or mixing the sample with Fab. If human TNF-α is present in the sample, a Fab complex with human TNF-α is formed; the formation of such a complex means the ability of Fab to selectively bind to human TNF-α to form a stable complex that can be detected. Detection can be qualitative, quantitative or semi-quantitative. The binding of human TNF-α from the sample to Fab occurs under conditions suitable for complex formation. Such conditions (e.g., suitable concentrations, buffers, temperature, reaction time), as well as methods for optimizing such conditions, are well known to those skilled in the art. Binding can be detected and measured using a variety of methods that are standard in the art, including, but not limited to, enzymatic immunochemistry methods (e.g., ELISA), immunoprecipitation, immunoblot methods, and other immunochemistry methods described, for example, Sambrook et al. . (see above) and Harlow et al. (see above). These links also describe examples of conditions in which the complex is formed.

Фразы «нейтрализует ФНО-α человека», «ингибирует активность ФНО-α человека» означают, что указанное антитело или Fab связывается с ФНО-α человека таким образом, что нейтрализует его, то есть ингибирует активность ФНО-α и блокирует его действие в качестве ключевого медиатора воспалительных реакций. Способность антитела или Fab к нейтрализации (ингибированию) ФНО-α человека может быть определена, например, методом, описанным в Примерах 3 и 4.The phrases “neutralizes human TNF-α”, “inhibits human TNF-α” mean that the antibody or Fab binds to human TNF-α in such a way that it neutralizes, that is, it inhibits TNF-α activity and blocks its effect as key mediator of inflammatory reactions. The ability of an antibody or Fab to neutralize (inhibit) human TNF-α can be determined, for example, by the method described in Examples 3 and 4.

Методы получения плазмидной ДИК, расщепления и лигирования ДНК, трансформации, подбора олигонуклеотидов в качестве праймеров и подобные методы могут быть стандартными методами, хорошо известными специалисту в данной области техники. Эти методы описаны, например в Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).Methods for obtaining plasmid DIC, DNA cleavage and ligation, transformation, selection of oligonucleotides as primers and similar methods can be standard methods well known to those skilled in the art. These methods are described, for example, in Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).

Последующие примеры приведены для целей объяснения и не ограничивают каким-либо образом рамки настоящего изобретения.The following examples are provided for purposes of explanation and do not in any way limit the scope of the present invention.

Пример 1. Получение мышиных антител против ФНО-α человекаExample 1. Obtaining murine antibodies against human TNF-α

Для получения антител мышей линии BALB/c иммунизировали дважды с интервалом в 2 недели в подушечки задних лап раствором иммуногена в полном (для первой иммунизации) или неполном (для второй иммунизации) адъюванте Фройнда. Гибридизацию клеток подколенных лимфоузлов иммунных мышей с клетками миеломы линии sp2/0 проводили по стандартной методике с использованием полиэтиленгликоля с молекулярной массой 4000 (Kohler, G. Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity / G. Kohler, C. Milstein // Nature. - 1975. - V. 256. - P. 495-497). Скрининг супернатантов гибридных клеток тестировали методом твердофазного иммуноферментного анализа на содержание антител против полноразмерного ФНО-α (Engvall, E. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay ofimmunoglobulin G. / E. Engvall, P. Perlmann.// Immunochemistry. - 1971. - V. 8(9). - P. 871-4). Субизотип определяли при помощи антисывороток, специфичных к определенным субизотипам мышиных иммуноглобулинов, по методике, рекомендованной производителем (Sigma, IS02-1KT). Пятнадцать антител было получено в результате иммунизации полноразмерным рекомбинантным ФНО-о, из которых затем (см. Примеры 2-4) были отобраны 2 антитела, TNF E2 и TNF F11, обладающих наибольшей ингибирующей активностью. Субизотипы указанных антител приведены в Таблице 1.To obtain antibodies, BALB / c mice were immunized twice with an interval of 2 weeks in the paw pads of the hind legs with an immunogen solution in complete (for the first immunization) or incomplete (for the second immunization) Freund adjuvant. Hybridization of the popliteal lymph node cells of immune mice with sp2 / 0 myeloma cells was performed according to the standard method using polyethylene glycol with a molecular weight of 4000 (Kohler, G. Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity / G. Kohler, C. Milstein // Nature . - 1975. - V. 256. - P. 495-497). Screening of hybrid cell supernatants was tested by enzyme-linked immunosorbent assay for antibodies against full-length TNF-α (Engvall, E. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay ofimmunoglobulin G. / E. Engvall, P. Perlmann.// Immunochemistry. - 1971.- V. 8 (9) .- P. 871-4). The subisotype was determined using antisera specific for specific subisotypes of murine immunoglobulins, according to the method recommended by the manufacturer (Sigma, IS02-1KT). Fifteen antibodies were obtained as a result of immunization with full-size recombinant TNF-o, from which then (see Examples 2-4) 2 antibodies were selected, TNF E2 and TNF F11 having the highest inhibitory activity. Subisotypes of these antibodies are shown in Table 1.

Антитела нарабатывали в асцитных жидкостях мышей, затем очищали методом аффинной хроматографии на белок-Ж сефарозе (Jungbauer, A. Comparison of protein A, protein G and copolymerized hydroxyapatite for the purification of human monoclonal antibodies / A. Jungbauer et al. // J.Chromatogr. - 1989. - V. 476. - P. 257-268). Степень чистоты препаратов антител контролировали при помощи электрофореза в 12% полиакриламидном геле в присутствии SDS и DTT в ступенчатой буферной системе Лэмлли, используя Mini PROTEAN 3 Electrophoresis System BIO-RAD, Catalog N 165-3301 (Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 /U. К. Laemmli //Nature. - 1970. - V.227. - P.680-685). Чистота всех полученных антител составила не менее 95%.Antibodies were generated in ascites liquids of mice, then purified by affinity chromatography on protein-J Sepharose (Jungbauer, A. Comparison of protein A, protein G and copolymerized hydroxyapatite for the purification of human monoclonal antibodies / A. Jungbauer et al. // J. Chromatogr. - 1989.- V. 476.- P. 257-268). The purity of antibody preparations was monitored by electrophoresis on a 12% polyacrylamide gel in the presence of SDS and DTT in a Lamley step buffer system using the Mini PROTEAN 3 Electrophoresis System BIO-RAD, Catalog N 165-3301 (Laemmli, UK Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. - 1970. - V.227. - P.680-685). The purity of all obtained antibodies was at least 95%.

Пример 2. Характеристика мышиных моноклональных антител против ФНО-α в иммуноферментном анализеExample 2. Characterization of murine monoclonal antibodies against TNF-α in an enzyme immunoassay

Антитела тестировали в иммуноферментном анализе двумя способами: непрямой ИФА и ИФА с биотинилированным ФНО-α.Antibodies were tested in an enzyme-linked immunosorbent assay in two ways: indirect ELISA and ELISA with biotinylated TNF-α.

- Непрямой ИФА. Антиген ФНО-α сорбировали в концентрации 2 мкг/мл при температуре 4°С в течение ночи в ФСБ (0,01 М KH₂PO₄, 0,1 М NaCl), pH 7,2-7,4 на 96-луночные планшеты с высокой связывающей способностью производства Coming-Costar (Нидерланды, кат.номер 9018). Антитела и конъюгаты разводили в буфере ФСБ-АТ (0,01 М KH₂PO₄, 0,1 M NaCl; 0,2% бычий сывороточный альбумин; 0,1% Твин 20). Конечную точку титрования антитела определяли как концентрацию антитела, при которой оптическая плотность в лунке достоверно отличается от оптической плотности в лунке без антител (от уровня фона). Значения конечных точек титрования для антител TNF E2 и TNF F11 приведены в Таблице 2.- Indirect IFA. TNF-α antigen was adsorbed at a concentration of 2 μg / ml at 4 ° C overnight in PBS (0.01 M KH ₂ PO ₄ , 0.1 M NaCl), pH 7.2-7.4 per 96-well tablets with high binding capacity manufactured by Coming-Costar (Netherlands, cat. no. 9018). Antibodies and conjugates were diluted in FSB-AT buffer (0.01 M KH ₂ PO ₄ , 0.1 M NaCl; 0.2% bovine serum albumin; 0.1% Tween 20). The endpoint of antibody titration was determined as the concentration of the antibody at which the optical density in the well is significantly different from the optical density in the well without antibodies (from the background level). The titration endpoints for the TNF E2 and TNF F11 antibodies are shown in Table 2.

- ИФА с биотинилированным ФНО-α. Все МоАт сорбировали на планшет в концентрации 2,5 мкг/мл в 0,1 М карбонатном буфере pH 9,3. ФНО-α, конъюгированный с биотином, разводили и титровали в буфере ФСБ-АТ в диапазоне концентраций от 300 нг/мл до 0,1 нг/мл. В качестве конъюгата использовали коммерческий препарат ExtrAvidin Peroxidase Conjugate (SIGMA, lot 103K4840). Конъюгат разводили в том же буфере до концентрации 150 нг/мл. Все инкубации проводили при комнатной температуре. В качестве контроля брали антитела infliximab (коммерческий препарат Remicade®). Конечную точку титрования ФНО-α определяли как концентрацию биотинилированного ФНО-α, при которой оптическая плотность в лунке достоверно отличается от оптической плотности в лунке без ФНО-α (от уровня фона). Значения конечных точек титрования ФНО-α для антител TNF E2 и TNF F11 приведены в Таблице 2.- ELISA with biotinylated TNF-α. All MoAb was adsorbed onto the plate at a concentration of 2.5 μg / ml in 0.1 M carbonate buffer pH 9.3. TNF-α conjugated with biotin was diluted and titrated in FSB-AT buffer in a concentration range from 300 ng / ml to 0.1 ng / ml. The commercial preparation ExtrAvidin Peroxidase Conjugate (SIGMA, lot 103K4840) was used as a conjugate. The conjugate was diluted in the same buffer to a concentration of 150 ng / ml. All incubations were performed at room temperature. Infliximab antibodies (commercial drug Remicade®) were taken as a control. The endpoint of the titration of TNF-α was determined as the concentration of biotinylated TNF-α at which the optical density in the well is significantly different from the optical density in the well without TNF-α (from the background level). The values of the endpoints of the titration of TNF-α for antibodies TNF E2 and TNF F11 are shown in Table 2.

- Характеристика полученных моноклональных антител в биохимических константах.- Characterization of the obtained monoclonal antibodies in biochemical constants.

Для измерения аффинности МоАт использовали метод иммуноферментного анализа (Klotz, I.M. The Proteinseds / I.M. Klotz, H.Neurath, K.Bailey// Academic Press, New York. - 1953. - V.1. - P. 727). В качестве антигена использовали антиген ФНО-α, сорбированный на планшет в концентрации 2 мкг/мл. Константу диссоциации (Kd) измеряли по методике, описанной в работе Friguet с соавт. (Friguet, В. Measurements of the true affinity constant in solution of antigen-antibody complexes by enzyme-linked immunosorbent assay. / B. Friguet, A.F. Chaffotte, L. Djavadi-Ohaniance, M. E. Goldberg // Journal of Immunological Methods. - 1985. - V.77. - P.305-319). Результаты показаны в Таблице 2.To measure the affinity of MoAt, an enzyme-linked immunosorbent assay was used (Klotz, I.M. The Proteinseds / I.M. Klotz, H. Neurath, K. Bailey // Academic Press, New York. - 1953. - V. 1. - P. 727). TNF-α antigen sorbed onto a plate at a concentration of 2 μg / ml was used as an antigen. The dissociation constant (Kd) was measured according to the procedure described by Friguet et al. (Friguet, B. Measurements of the true affinity constant in solution of antigen-antibody complexes by enzyme-linked immunosorbent assay. / B. Friguet, AF Chaffotte, L. Djavadi-Ohaniance, ME Goldberg // Journal of Immunological Methods. - 1985 . - V.77. - P.305-319). The results are shown in Table 2.

Пример 3. Изучение in vivo нейтрализующей активности мышиных моноклональных антителExample 3. In vivo study of the neutralizing activity of murine monoclonal antibodies

Клетки мышиной фибросаркомы линии L929 нарабатывали в полной питательной среде DMEM с высоким содержанием глюкозы с добавлением У/о фетальной телячьей сыворотки, L-глютамина и пирувата в концентрациях согласно рекомендациям производителей. Клетки высевали в лунки 96-луночного планшета в полной питательной среде из расчета 10⁴ клеток на лунку. К клеткам добавляли рекомбинантный ФНО-α (Sigma, США) в разных концентрациях так, чтобы максимальная конечная концентрация в лунке составляла 1000 нг/мл, а каждая последующая концентрация отличались от предыдущей в два раза (шаг 2). Затем планшеты инкубировали в течение суток при 37°С в атмосфере 5% углекислого газа. После этого добавляли раствор МТТ до конечной концентрации 0,5 мг/мл и инкубировали при тех же условиях еще 4 часа. Затем все содержимое планшетов вытряхивали и добавляли диметилсульфоксид (ДМСО) по 100 мкл в каждую лунку. Через 10 минут измеряли оптическую плотность раствора в каждой лунке при длине волны 595 нм. Таким образом была определена рабочая концентрация ФНО-α 100 нг/мл, близкая к насыщающей. Для определения нейтрализующей (ингибирующей) способности антител клетки L929 сеяли в лунки 96-луночного планшета, как описано выше. К клеткам L929 добавляли антитела в различных концентрациях, начиная с 10 мкг/мл с шагом 2, и ФНО-α в концентрации 100 нг/мл. В контрольные лунки добавляли антитела без ФНО-α («+» контроль) или ФНО-α с антителами против постороннего антигена («-» контроль). Инкубировали в течение суток при 37°С в инкубаторе с 5%-ным содержанием СО₂, затем добавляли МТТ и инкубировали еще 4 часа. По окончании инкубации содержимое лунок вытряхивали и добавляли в лунки ДМСО. Через 10 минут измеряли оптическую плотность в лунках при длине волны 595 нм.L929 mouse fibrosarcoma cells were obtained in DMEM complete medium with a high glucose content supplemented with U / O fetal calf serum, L-glutamine and pyruvate in concentrations according to the manufacturers recommendations. Cells were plated in the wells of a 96-well plate in complete culture medium at a rate of 10 ⁴ cells per well. Recombinant TNF-α (Sigma, United States) was added to the cells at different concentrations so that the maximum final concentration in the well was 1000 ng / ml, and each subsequent concentration was two times different from the previous one (step 2). Then the plates were incubated overnight at 37 ° C in an atmosphere of 5% carbon dioxide. After that, MTT solution was added to a final concentration of 0.5 mg / ml and incubated under the same conditions for another 4 hours. Then, the entire contents of the plates were shaken out and dimethyl sulfoxide (DMSO) was added 100 μl to each well. After 10 minutes, the optical density of the solution in each well was measured at a wavelength of 595 nm. Thus, a working concentration of TNF-α of 100 ng / ml was determined, which is close to saturating. To determine the neutralizing (inhibitory) ability of antibodies, L929 cells were seeded into the wells of a 96-well plate as described above. Antibodies at various concentrations were added to L929 cells, starting at 10 μg / ml in steps of 2, and TNF-α at a concentration of 100 ng / ml. Antibodies without TNF-α (“+” control) or TNF-α with antibodies against extraneous antigen (“-” control) were added to control wells. Incubated overnight at 37 ° C in an incubator with 5% CO ₂ , then MTT was added and incubated for another 4 hours. At the end of the incubation, the contents of the wells were shaken out and added to the DMSO wells. After 10 minutes, the optical density in the wells was measured at a wavelength of 595 nm.

Нейтрализующую (ингибирующую) активность антител (IС₅₀) вычисляли следующим образом: для каждой концентрации антитела находили процент ингибирования как ОП/ОПо·100%, где ОП- средняя оптическая плотность в лунках с данной концентрацией антитела, ОПо- средняя оптическая плотность в лунках без добавления ФНО-α, строили кривую титрования - зависимость степени ингибирования от концентрации антитела; по кривой титрования находили концентрацию антитела, соответствующую 50%-ному ингибированию. Эксперимент проводили в трех повторах для концентраций ФНО-α 100 нг/мл и 20 нг/мл.The neutralizing (inhibitory) activity of antibodies (IC ₅₀ ) was calculated as follows: for each antibody concentration, the percent inhibition was found as OD / ODO · 100%, where OD is the average optical density in wells with a given antibody concentration, OD is the average optical density in wells without addition of TNF-α, a titration curve was built — the degree of inhibition versus antibody concentration; antibody concentration corresponding to 50% inhibition was found from the titration curve. The experiment was performed in triplicate for TNF-α concentrations of 100 ng / ml and 20 ng / ml.

Зависимость степени ингибирования апоптоза в % от концентрации антителThe dependence of the degree of inhibition of apoptosis in% of the concentration of antibodies

ФНО-α брали в концентрации 100 нг/мл, антитела титровали от концентрации 10 мкг/мл. В качестве отрицательного контроля брали антитела против сальмонеллы (0% ингибирования), в качестве положительного - лунки без добавления ФНО-α (100% ингибирования). Находили концентрацию антител, соответствующую 50%-ному ингибированию.TNF-α was taken at a concentration of 100 ng / ml, antibodies were titrated from a concentration of 10 μg / ml. Antibodies against salmonella (0% inhibition) were taken as a negative control, and wells without the addition of TNF-α (100% inhibition) were taken as a positive control. The concentration of antibodies corresponding to 50% inhibition was found.

Результаты по наиболее активным антителам TNF E2 и TNF F11 приведены в Таблице 3.The results for the most active antibodies TNF E2 and TNF F11 are shown in Table 3.

В результате проведенных экспериментов было установлено, что наибольшей ингибирующей активностью обладают антитела TNF E2 и TNF F11. Эти антитела были взяты для дальнейшей работы по получению протеолитических Fab-фрагментов. Характеристика Fab-фрагментов антител TNF E2 и TNF F11 против ФНО-α, полученных методом ограниченного протеолиза, приведена в Таблице 4.As a result of the experiments, it was found that antibodies TNF E2 and TNF F11 have the greatest inhibitory activity. These antibodies were taken for further work on obtaining proteolytic Fab fragments. Characterization of Fab fragments of antibodies TNF E2 and TNF F11 against TNF-α obtained by limited proteolysis are shown in Table 4.

Пример 4. Исследование влияния антитела TNF E2 на экспрессию ICAM-1 на поверхности эмбриональных клеток человекаExample 4. The study of the effect of antibodies TNF E2 on the expression of ICAM-1 on the surface of human embryonic cells

Эмбриональные клетки (ЭК) выделяли из пупочной вены человека и культивировали, проводя 2-3 пассажа, как описано ранее (Mazurov, A.V. A monoclonal antibody, VM64, reacts with a 130 kDa glycoprotein common to platelets and endothelial cells:Embryonic cells (EC) were isolated from the umbilical vein of a person and cultured for 2-3 passages as previously described (Mazurov, A.V. A monoclonal antibody, VM64, reacts with a 130 kDa glycoprotein common to platelets and endothelial cells:

heterogeneity in antibody binding to human aortic endothelial cells./ Mazurov AV, Vinogradov DV, Kabaeva NV, Antonova GN, Romanov YA, Vlasik TN, Antonov AS, Smirnov VN.// Thrombos. Haemostas., -1991,-V. 66, -P. 494-9). К ЭК добавляли ФНО-α в концентрации 100 ед/мл и антитела против ФНО-α в концентрации 1 мкг/мл или 10 мкг/мл и инкубировали в течение 5 часов или 20 часов. Затем ЭК промывали, фиксировали 0,02% параформальдегидом и окрашивали моноклональными антителами 10F3B2 против ICAM-1. Связывание регистрировали методом проточной цитофлюориметрии, используя программу CellQuest. В каждой пробе анализировали по 10000 клеток. Для последующих расчетов экспрессии ICAM-1 определяли медиану для каждого пика гистограммы. Результаты экспериментов, в которых экспрессию ICAM-1 оценивали по медиане соответствующей гистограммы и в % от контроля (в присутствии ФНО-α, но без антител), представлены в Таблице 5.heterogeneity in antibody binding to human aortic endothelial cells./ Mazurov AV, Vinogradov DV, Kabaeva NV, Antonova GN, Romanov YA, Vlasik TN, Antonov AS, Smirnov VN.// Thrombos. Haemostas., -1991, -V. 66, -P. 494-9). TNF-α at a concentration of 100 u / ml and anti-TNF-α antibodies at a concentration of 1 μg / ml or 10 μg / ml were added to EC and incubated for 5 hours or 20 hours. Then, EC was washed, fixed with 0.02% paraformaldehyde, and stained with monoclonal antibodies 10F3B2 against ICAM-1. Binding was recorded by flow cytometry using CellQuest. In each sample, 10,000 cells were analyzed. For subsequent calculations of ICAM-1 expression, the median for each peak of the histogram was determined. The results of experiments in which the expression of ICAM-1 was evaluated by the median of the corresponding histogram and in% of the control (in the presence of TNF-α, but without antibodies) are presented in Table 5.

Согласно приведенным данным антитело TNF E2 против ФНО-α обладает выраженной ингибирующей активностью, подавляя эффекты ФНО-α: индукцию апоптоза клеток L929 и индукцию экспрессии молекул адгезии ICAM-1 на поверхности ЭК человека.According to the data presented, TNF-α2 anti-TNF-α antibody has a pronounced inhibitory activity, suppressing the effects of TNF-α: induction of apoptosis of L929 cells and induction of expression of ICAM-1 adhesion molecules on the surface of human EC.

Пример 5. Клонирование генов, кодирующих Fab фрагменты мышиного моноклонального антитела TNF E2 против ФНО-α, используя мРНК из подходящих линий клеток в качестве матрицExample 5. Cloning of genes encoding Fab fragments of murine monoclonal antibody TNF E2 against TNF-α using mRNA from suitable cell lines as matrices

Тотальная РНК была очищена из 1х10⁷ клеток подходящих гибридом, продуцирующих антитела согласно настоящему изобретению Mab анти TNF E2. Клетки (10⁷ клеток) два раза промывали однократным буфером PBS. В пробирку со 100 мкл клеток добавляли 400 мкл раствора GTB (4 М гуанидинтиоцинат, 30 мМ цитрат натрия, 1% N-лаурилсаркозил натрия, 120 мМ β-меркаптоэтанол). Клетки суспендировали пипетированием в течение 2-3 минут и помещали на лед. Затем добавляли 50 мкл 3 М ацетата натрия (рН 5,2) и 500 мкл фенола, насыщенного водой, и полученную суспензию тщательно перемешивали на мешалке Vortex. Затем добавляли 100 мкл смеси хлороформ-изоамиловый спирт и суспензию тщательно перемешивали на мешалке Vortex. Суспензию центрифугировали при 12000 g в течение 10 мин и супернатант переносили в новую пробирку. Процедуру повторяли. Добавляли равный объем изопропанола (500 мкл) и хранили при -20°С.Образец центрифугировали при 12000 g в течение 10 минут, осадок промывали этанолом (70%) и растворяли в воде (50 мкл). Выделили в целом 7,5 мкг РНК (0,15 мкг/мкл), которые использовали для дальнейшего синтеза кДНК.Total RNA was purified from 1x10 ⁷ cells of suitable hybridomas producing antibodies of the present invention Mab anti TNF E2. Cells (10 ⁷ cells) were washed twice with a single PBS buffer. 400 μl of a GTB solution (4 M guanidine thiocinate, 30 mM sodium citrate, 1% N-laurylsarcosyl sodium, 120 mM β-mercaptoethanol) was added to a test tube with 100 μl of cells. Cells were suspended by pipetting for 2-3 minutes and placed on ice. Then, 50 μl of 3 M sodium acetate (pH 5.2) and 500 μl of phenol saturated with water were added, and the resulting suspension was thoroughly mixed on a Vortex mixer. Then, 100 μl of a mixture of chloroform-isoamyl alcohol was added, and the suspension was thoroughly mixed on a Vortex mixer. The suspension was centrifuged at 12,000 g for 10 minutes and the supernatant was transferred to a new tube. The procedure was repeated. An equal volume of isopropanol (500 μl) was added and stored at -20 ° C. The sample was centrifuged at 12000 g for 10 minutes, the precipitate was washed with ethanol (70%) and dissolved in water (50 μl). A total of 7.5 μg RNA (0.15 μg / μl) was isolated, which was used for further cDNA synthesis.

кДНК синтезировали с использованием набора RevertAid™ H Minus First Strand cDNA Synthesis (Fermentas) в соответствии с "протоколом синтеза кДНК, подходящего для ПЦР", рекомендованного производителем.cDNA was synthesized using the RevertAid ™ H Minus First Strand cDNA Synthesis (Fermentas) kit according to the “PCR-suitable cDNA synthesis protocol” recommended by the manufacturer.

Дизайн праймеров для клонирования гена, кодирующего тяжелую цепьDesign primers for cloning a gene encoding a heavy chain

Для того чтобы идентифицировать пару праймеров, пригодных для клонирования гена, кодирующего тяжелую цепь, проводили ПЦР для клонирования с использованием ДНК полимеразы Tag (реакционная смесь содержала 10Х буфер для ДНК полимеразы Tag (67 мМ Tris-HCl (рН 8,8 при 25°С), 166 мМ (Ntt^SO^ 100 мМ 2-меркаптоэтанола)+20 мМ MgCl₂, 1,25 мМ dNTP, 5'-концевой праймер (25 пмоль), 3'-концевой праймер (25 пмоль), ДНК полимераза Taq (2.5 U), кДНК 1 мл, бидистиллированная вода до 50 мкл). Тотальную кДНК использовали в качестве матрицы. Программа ПЦР была следующей: 95°С в течение 3 минут; 35 циклов 94°С в течение 1 минуты, 45°С в течение 1 минуты и 72°С в течение 1 минуты; в конце 72°С в течение 10 минут.In order to identify a pair of primers suitable for cloning a gene encoding a heavy chain, PCR was performed for cloning using Tag DNA polymerase (the reaction mixture contained 10X Tag DNA polymerase buffer (67 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25 ° C ), 166 mM (Ntt ^ SO ^ 100 mM 2-mercaptoethanol) +20 mM MgCl ₂ , 1.25 mM dNTP, 5'-terminal primer (25 pmol), 3'-terminal primer (25 pmol), Taq DNA polymerase (2.5 U), cDNA 1 ml, bidistilled water up to 50 μl.) Total cDNA was used as a matrix. The PCR program was as follows: 95 ° C for 3 minutes; 35 cycles of 94 ° C in for 1 minute, 45 ° C for 1 minute and 72 ° C for 1 minute; at the end of 72 ° C for 10 minutes.

5'-концевой праймер соответствовал набору из 16 дегенеративных праймеров (SEQ ID NO: 5-20), узнающих 95% последовательностей сигнальных пептидов в генах, кодирующих тяжелую цепь, выложенных в базе данных Кабат (Kabat, E., Wu, Т., Perry, H. 1991. Sequences of proteins oflmmunological Interest, 5th edn. US Departament of Health and Human Services, Public Health Service, NIH). В качестве 3'-концевого праймера в ПЦР использовали праймер, комплементарный участку, кодирующему аминокислоты 141-147 СН1 домена тяжелой цепи IgG, с введенным сайтом Sail: A12 (SEQ ID NO: 48). С использованием электрофореза продуктов ПЦР было показано, что использование единственной пары праймеров В6 и A12 (SEQ ID NO: 14 и 48) приводило к появлению фрагмента ПЦР. Размер полученного продукта ПЦР (≈500 пар оснований) находился в хорошем соответствии с предсказанной последовательностью кДНК гена тяжелой цепи IgGMus musculus из баз данных Gene-Bank и IMGT-GENE-DB.The 5'-terminal primer corresponded to a set of 16 degenerative primers (SEQ ID NO: 5-20) recognizing 95% of the signal peptide sequences in the heavy chain encoding genes laid out in the Kabat database (Kabat, E., Wu, T., Perry, H. 1991. Sequences of proteins of lmmunological Interest, 5th edn. US Departament of Health and Human Services, Public Health Service, NIH). As the 3'-terminal primer in PCR, a primer was used that is complementary to the region encoding amino acids 141-147 of the CH1 domain of the IgG heavy chain with the Sail: A12 site introduced (SEQ ID NO: 48). Using electrophoresis of PCR products, it was shown that the use of a single pair of primers B6 and A12 (SEQ ID NO: 14 and 48) led to the appearance of a PCR fragment. The size of the obtained PCR product (≈500 base pairs) was in good agreement with the predicted cDNA sequence of the IgGMus musculus heavy chain gene from the Gene-Bank and IMGT-GENE-DB databases.

Дизайн праймеров для клонирования гена. кодирующего легкую цепь. Ранее было показано, что изучаемое антитело содержит легкую цепь типа каппа. На основании этих данных в качестве 5'-концевого праймера использовали набор из 23 дегенеративных праймеров (SEQ ID NO: 22 - 44). Этот набор узнает 95% последовательностей, соответствующих сигнальным пептидам в генах, кодирующих каппа цепь, опубликованных в базе данных Кабат (Kabat, E., Wu, Т., Репу, Н. 1991. Sequences of proteins oflmmunological Interest, 5th edn. US Departament of Health and Human Services, Public Health Service, NIH). В качестве 3'-концевого праймера в ПЦР, соответствовавшего 3'-концу легкой цепи фрагмента Fab (каппа-тип), с введенным на 5'-конец сайтом XhoI использовали праймер L-m-r (SEQ ID NO: 45). С использованием электрофореза продуктов ПЦР было показано, что использование единственной пары праймеров А15 и L-m-r (SEQ ID NO: 22 и 45) приводило к появлению фрагмента ПЦР. Размер полученного продукта ПЦР (≈700 пар оснований) находился в хорошем соответствии с предсказанной последовательностью кДНК гена легкой цепи IgGMus musculus из баз данных Gene-Bank и IMGT-GENE-DB.Design primers for cloning a gene. encoding a light chain. It was previously shown that the antibody under study contains a kappa-type light chain. Based on these data, a set of 23 degenerative primers (SEQ ID NOS: 22 - 44) was used as the 5'-terminal primer. This kit recognizes 95% of the sequences corresponding to signal peptides in the kappa chain encoding genes published in the Kabat database (Kabat, E., Wu, T., Repu, N. 1991. Sequences of proteins oflmmunological Interest, 5th edn. US Departament of Health and Human Services, Public Health Service, NIH). A primer L-m-r (SEQ ID NO: 45) was used as the 3'-terminal primer in PCR corresponding to the 3'-end of the light chain of the Fab fragment (kappa type) with the XhoI site inserted at the 5'-end. Using electrophoresis of PCR products, it was shown that the use of a single pair of primers A15 and L-m-r (SEQ ID NO: 22 and 45) led to the appearance of a PCR fragment. The size of the obtained PCR product (≈700 base pairs) was in good agreement with the predicted cDNA sequence of the IgGMus musculus light chain gene from the Gene-Bank and IMGT-GENE-DB databases.

Клонирование генов, кодирующих Fab фрагменты антител против ФНО-αCloning of genes encoding Fab fragments of antibodies against TNF-α

Pfu ДНК полимеразу (Fermentas) использовали для клонирования генов, кодирующих цепи антитела. Условия ПЦР оптимизировали подбором температуры отжига и концентрации Mg²⁺ (реакционная смесь содержала 10Х буфер для Pfu ДНК полимеразы (200 мМ Tris-HCl (pH 8,8 при 25°С), 100 мМ (NH₄)₂SO₄ 100 мМ КСl, 1% Тритон Х-100, 1 мг/мл БСА)+20 мМ MgCl₂, 1,25 мМ dNTP, 5'-концевой праймер (25 пмоль), 3'-концевой праймер (25 пмоль), Pfu ДНК полимераза (1,25 U), кДНК 1 мкл, бидистиллированная вода до 50 мкл). Каждый их продуктов двух независимых ПЦР элюировали из агарозного геля и фосфорилировали с использованием Т4 ДНК полинуклеотидкиназы. Программа для ПЦР была следующая: 95°С в течение 3 минут; 35 циклов 94°С в течение 1 минуты, 45°С в течение 1 минуты и 72°С в течение 2 минут; в конце 72°С в течение 10 минут. Полученные фрагменты клонировали в плазмидный вектор pUC18, линеаризованный рестриктазой Smol. Рекомбинантные плазмиды, содержащие гены тяжелой и легкой цепей Fab указанного антитела, выделяли и назвали pUC18-TNF-E2-H и pUC18-TNF-E2-L соответственно.Pfu DNA polymerase (Fermentas) was used to clone genes encoding antibody chains. PCR conditions were optimized by selecting annealing temperature and Mg ²⁺ concentration (the reaction mixture contained 10X buffer for Pfu DNA polymerase (200 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25 ° C), 100 mM (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 100 mM KCl , 1% Triton X-100, 1 mg / ml BSA) +20 mM MgCl ₂ , 1.25 mM dNTP, 5'-terminal primer (25 pmol), 3'-terminal primer (25 pmol), Pfu DNA polymerase ( 1.25 U), cDNA 1 μl, bidistilled water up to 50 μl). Each of the two independent PCR products was eluted from the agarose gel and phosphorylated using T4 polynucleotide kinase DNA. The program for PCR was as follows: 95 ° C for 3 minutes; 35 cycles of 94 ° C for 1 minute, 45 ° C for 1 minute and 72 ° C for 2 minutes; at the end of 72 ° C for 10 minutes. The resulting fragments were cloned into the plasmid vector pUC18 linearized with Smol restrictase. Recombinant plasmids containing the Fab heavy and light chain genes of the indicated antibody were isolated and named pUC18-TNF-E2-H and pUC18-TNF-E2-L, respectively.

Пример 6. Клонирование генов, кодирующих Fab фрагменты мышиного моноклонального антитела TNF F11 против ФНО-α, используя мРНК из подходящих линий клеток в качестве матрицExample 6. Cloning of genes encoding Fab fragments of mouse TNF-α11 anti-TNFα monoclonal antibody using mRNA from suitable cell lines as matrices

Тотальная РНК была очищена из 1×10⁷ клеток подходящих гибридом, продуцирующих антитела согласно настоящему изобретению. Клетки (10⁷ клеток) два раза промывали однократным буфером PBS. В пробирку со 100 мкл клеток добавляли 400 мкл раствора GTB (4 М гуанидинтиоцинат, 30 мМ цитрат натрия, 1% N-лаурилсаркозил натрия, 120 мМ β-меркаптоэтанол). Клетки суспендировали пилотированием в течение 2-3 минут и помещали на лед. Затем добавляли 50 мкл 3 М ацетата натрия (рН 5,2) и 500 мкл фенола, насыщенного водой, и полученную суспензию тщательно перемешивали на мешалке Vortex. Затем добавляли 100 мкл смеси хлороформ - изоамиловый спирт и суспензию тщательно перемешивали на мешалке Vortex. Суспензию центрифугировали в течение 10 мин и супернатант переносили в новую пробирку. Процедуру повторяли. Добавляли равный объем изопропанола (500 мкл) и хранили при -20°С. Образец центрифугировали в течение 10 минут, осадок промывали этанолом (70%) и растворяли в воде (50 мкл). Выделили в целом 50 мкг РНК (1,0 мкг/мкл), которые использовали для дальнейшего синтеза кДНК.Total RNA was purified from 1 × 10 ⁷ cells of suitable hybridomas producing antibodies according to the present invention. Cells (10 ⁷ cells) were washed twice with a single PBS buffer. 400 μl of a GTB solution (4 M guanidine thiocinate, 30 mM sodium citrate, 1% N-laurylsarcosyl sodium, 120 mM β-mercaptoethanol) was added to a test tube with 100 μl of cells. Cells were suspended by piloting for 2-3 minutes and placed on ice. Then, 50 μl of 3 M sodium acetate (pH 5.2) and 500 μl of phenol saturated with water were added, and the resulting suspension was thoroughly mixed on a Vortex mixer. Then, 100 μl of a mixture of chloroform - isoamyl alcohol was added and the suspension was thoroughly mixed on a Vortex mixer. The suspension was centrifuged for 10 minutes and the supernatant was transferred to a new tube. The procedure was repeated. An equal volume of isopropanol (500 μl) was added and stored at -20 ° C. The sample was centrifuged for 10 minutes, the precipitate was washed with ethanol (70%) and dissolved in water (50 μl). A total of 50 μg RNA (1.0 μg / μl) was isolated, which was used for further cDNA synthesis.

Дизайн праймеров для клонирования гена. кодирующего тяжелую цепь.Design primers for cloning a gene. encoding a heavy chain.

Для того чтобы идентифицировать пару праймеров, пригодных для клонирования гена, кодирующего тяжелую цепь, проводили ПЦР для клонирования с использованием ДНК полимеразы Tag (реакционная смесь содержала 10Х буфер для ДНК полимеразы Tag (67 мМ Tris-HCl (рН 8,8 при 25°С), 166 мМ (NH₄)₂SO₄ 100 мМ 2-меркаптоэтанола)+20 мМ MgCl₂, 1,25 мМ dNTP, 5'-концевой праймер (25 пмоль), 3'-концевой праймер (25 пмоль), ДНК полимераза Taq (2.5 U), кДНК 1 мл, бидистиллированная вода до 50 мкл). Тотальную кДНК использовали в качестве матрицы. Программа ПЦР была следующей: 95°С в течение 3 минут; 35 циклов 94°С в течение 1 минуты, 45°С в течение 1 минуты и 72°С в течение 1 минуты; в конце 72°С в течение 10 минут.In order to identify a pair of primers suitable for cloning a gene encoding a heavy chain, PCR was performed for cloning using Tag DNA polymerase (the reaction mixture contained 10X Tag DNA polymerase buffer (67 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25 ° C ), 166 mM (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 100 mM 2-mercaptoethanol) +20 mM MgCl ₂ , 1.25 mM dNTP, 5'-terminal primer (25 pmol), 3'-terminal primer (25 pmol), DNA Taq polymerase (2.5 U), cDNA 1 ml, bidistilled water up to 50 μl). Total cDNA was used as template. The PCR program was as follows: 95 ° C for 3 minutes; 35 cycles of 94 ° C for 1 minute, 45 ° C for 1 minute and 72 ° C for 1 minute; at the end of 72 ° C for 10 minutes.

5'-Концевой праймер соответствовал набору из 16 дегенеративных праймеров (SEQ ID NO: 5-20), узнающих 95% последовательностей сигнальных пептидов в генах, кодирующих тяжелую цепь, выложенных в базе данных Кабат (Kabat, E., Wu, Т., Репу, Н. 1991. Sequences of proteins of Immunological Interest, 5th edn. US Departament of Health and Human Services, Public Health Service, NIH). В качестве 3'-концевого праймера в ПЦР, соответствовавшего 3'-концу тяжелой цепи фрагмента Fab (IgGI), с введенным на 5'-конец сайтом XhoI использовали праймер А26 (SEQ ID NО: 21). С использованием электрофореза продуктов ПЦР было показано, что использование единственной пары праймеров А7 и А26 (SEQ ID NO: 9 и 21) приводило к появлению фрагмента ПЦР. Размер полученного продукта ПЦР (≈700 пар оснований) находился в хорошем соответствии с предсказанной последовательностью кДНК гена тяжелой цепи IgGMus musculus из баз данных Gene-Bank и IMGT-GENE-DB.The 5'-terminal primer corresponded to a set of 16 degenerative primers (SEQ ID NO: 5-20) recognizing 95% of the signal peptide sequences in the heavy chain encoding genes laid out in the Kabat database (Kabat, E., Wu, T., Repu, N. 1991. Sequences of proteins of Immunological Interest, 5th edn. US Departament of Health and Human Services, Public Health Service, NIH). Primer A26 (SEQ ID NO: 21) was used as the 3'-terminal primer in PCR corresponding to the 3'-end of the heavy chain of the Fab fragment (IgGI) with the XhoI site inserted at the 5'-end. Using electrophoresis of PCR products, it was shown that using a single pair of primers A7 and A26 (SEQ ID NO: 9 and 21) led to the appearance of a PCR fragment. The size of the obtained PCR product (≈700 base pairs) was in good agreement with the predicted cDNA sequence of the IgGMus musculus heavy chain gene from the Gene-Bank and IMGT-GENE-DB databases.

Дизайн праймеров для клонирования гена, кодирующего легкую цепьDesign primers for cloning a gene encoding a light chain

Ранее было показано, что изучаемое антитело содержит легкую цепь типа каппа. На основании этих данных в качестве 5'-концевого праймера использовали набор из 23 дегенеративных праймеров (SEQ ID NO: 22-44). Этот набор узнает 95% последовательностей, соответствующих сигнальным пептидам в генах, кодирующих каппа цепь, опубликованных в базе данных Кабат (Kabat, E., Wu, Т., Реnу, Н. 1991. Sequences of proteins of Immunological Interest, 5th edn. US Departament of Health and Human Services, Public Health Service, NIH). В качестве 3'-концевого праймера в ПЦР, соответствовавшего 3'-концу легкой цепи фрагмента Fab (каппа-тип), с введенным на 5'-конец сайтом ХhoI, использовали праймер L-m-r (SEQ ID NO: 45). С использованием электрофореза продуктов ПЦР было показано, что использование единственной пары праймеров А19 и L-m-r (SEQ ID NO: 26 и 45)приводило к появлению фрагмента ПЦР. Размер полученного продукта ПЦР (≈700 пар оснований) находился в хорошем соответствии с предсказанной последовательностью кДНК гена легкой цепи IgGMus musculus из баз данных Gene-Bank и IMGT-GENE-DB.It was previously shown that the antibody under study contains a kappa-type light chain. Based on these data, a set of 23 degenerative primers (SEQ ID NOS: 22-44) was used as the 5'-terminal primer. This set recognizes 95% of the sequences corresponding to signal peptides in the kappa chain encoding genes published in the Kabat database (Kabat, E., Wu, T., Renu, N. 1991. Sequences of proteins of Immunological Interest, 5th edn. US Departament of Health and Human Services, Public Health Service, NIH). A primer L-m-r (SEQ ID NO: 45) was used as the 3'-terminal primer in PCR corresponding to the 3'-end of the light chain of the Fab fragment (kappa type) with the xhoI site inserted at the 5'-end. Using electrophoresis of PCR products, it was shown that the use of a single pair of primers A19 and L-m-r (SEQ ID NOs: 26 and 45) led to the appearance of a PCR fragment. The size of the obtained PCR product (≈700 base pairs) was in good agreement with the predicted cDNA sequence of the IgGMus musculus light chain gene from the Gene-Bank and IMGT-GENE-DB databases.

Pfu ДНК полимеразу (Fermentas) использовали для клонирования генов, кодирующих цепи антитела. Условия ПЦР оптимизировали подбором температуры отжига и концентрации Mg²⁺ (реакционная смесь содержала 10Х буфер для Pfu ДНК полимеразы (200 мМ Tris-HCl (pH 8,8 при 25°С), 100 мМ (NH₄)₂SO₄ 100 мМ КСl, 1% Тритон Х-100, 1 мг/мл БСА)+20 мМ MgCli, 1,25 мМ dNTP, 5'-концевой праймер (25 пмоль), 3'-концевой праймер (25 пмоль), Pfu ДНК полимераза (1,25 U), кДНК 1 мкл, бидистиллированная вода до 50 мкл). Каждый их продуктов двух независимых ПЦР элюировали из агарозного геля и фосфорилировали с использованием Т4 ДНК полинуклеотидкиназы. Программа для ПЦР была следующая: 95°С в течение 3 минут; 35 циклов 94°С в течение 1 минуты, 45°С в течение 1 минуты и 72°С в течение 2 минут; в конце 72°С в течение 10 минут. Полученные фрагменты клонировали в плазмидный вектор pUC18, линеаризованный рестриктазой SmaI. Рекомбинантные плазмиды, содержащие гены тяжелой и легкой цепей Fab указанного антитела, выделяли и назвали pUC 18-TNF-F11-Н и pUC 18-TNF-F11-L соответственно.Pfu DNA polymerase (Fermentas) was used to clone genes encoding antibody chains. PCR conditions were optimized by selecting annealing temperature and Mg ²⁺ concentration (the reaction mixture contained 10X buffer for Pfu DNA polymerase (200 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25 ° C), 100 mM (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 100 mM KCl , 1% Triton X-100, 1 mg / ml BSA) +20 mM MgCli, 1.25 mM dNTP, 5'-terminal primer (25 pmol), 3'-terminal primer (25 pmol), Pfu DNA polymerase (1 , 25 U), cDNA 1 μl, bidistilled water up to 50 μl). Each of the two independent PCR products was eluted from the agarose gel and phosphorylated using T4 polynucleotide kinase DNA. The program for PCR was as follows: 95 ° C for 3 minutes; 35 cycles of 94 ° C for 1 minute, 45 ° C for 1 minute and 72 ° C for 2 minutes; at the end of 72 ° C for 10 minutes. The resulting fragments were cloned into the plasmid vector pUC18 linearized with SmaI restrictase. Recombinant plasmids containing the Fab heavy and light chain genes of the indicated antibody were isolated and named pUC 18-TNF-F11-H and pUC 18-TNF-F11-L, respectively.

Пример 7. Секвенирование фрагментов генов, кодирующих вариабельные части Fab-фрагмента мышиного моноклонального антитела против ФНО-α человека.Example 7. Sequencing of fragments of genes encoding the variable parts of the Fab fragment of a murine monoclonal antibody against human TNF-α.

Рекомбинантные плазмиды pUC18-TNF-E2-H, содержащую независимый фрагмент ПЦР, кодирующий тяжелую цепь антитела TNF-E2 против ФНО-α; pUC18-TNF-E2-L, содержащую независимый фрагмент ПЦР, кодирующий легкую цепь антитела TNF-E2 против ФНО-α; pUC 18-TNF-F 11-Н, содержащую независимый фрагмент ПЦР, кодирующий тяжелую цепь антитела TNF-F11 против ФНО-α; и pUC 18-TNF-F 11-L, содержащую независимый фрагмент ПЦР, кодирующий легкую цепь антитела TNF-F11 против ФНО-α, выделяли и фрагменты ПЦР секвенировали в обоих направлениях. Использовали стандартные праймеры для секвенирования SEQ ID NO: 46 и 47.Recombinant plasmids pUC18-TNF-E2-H containing an independent PCR fragment encoding the TNF-E2 anti-TNF-α antibody heavy chain; pUC18-TNF-E2-L containing an independent PCR fragment encoding the TNF-E2 anti-TNF-α antibody light chain; pUC 18-TNF-F 11-H containing an independent PCR fragment encoding the TNF-F11 anti-TNF-α antibody heavy chain; and pUC 18-TNF-F 11-L containing an independent PCR fragment encoding the TNF-α anti-TNF-α antibody light chain was isolated and PCR fragments were sequenced in both directions. Used standard sequencing primers SEQ ID NO: 46 and 47.

Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи мышиного антитела Е2 против ФНО-α человек приведена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 1.The amino acid sequence of the variable domain of the heavy chain of a murine E2 antibody against human TNF-α is shown in the sequence Listing under the number SEQ ID NO: 1.

Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи мышиного антитела Е2 против ФНО-α человек приведена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 2.The amino acid sequence of the variable domain of the light chain of a murine E2 antibody against human TNF-α is shown in the List of sequences under the number SEQ ID NO: 2.

Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи мышиного антитела F 11 против ФНО-α человек приведена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 3.The amino acid sequence of the variable domain of the heavy chain of the murine F 11 anti-human TNF-α antibody is shown in the Sequence Listing under the number SEQ ID NO: 3.

Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи мышиного антитела F11 против ФНО-α человек приведена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 4.The amino acid sequence of the variable domain of the light chain of the murine F11 anti-human TNF-α antibody is shown in the Sequence Listing under the number SEQ ID NO: 4.

Хотя настоящее изобретение было подробно описано со ссылкой на предпочтительные варианты его осуществления, для специалиста в данной области техники ясно, что могут быть сделаны различные замены и применены эквиваленты, которые не выходят за рамки настоящего изобретения. Все процитированные здесь документы являются частью настоящей заявки, включенные путем ссылки.Although the present invention has been described in detail with reference to preferred embodiments thereof, it will be apparent to one skilled in the art that various substitutions can be made and equivalents applied that are not outside the scope of the present invention. All documents cited here are part of this application, incorporated by reference.

Таблица 1Table 1 Антитела против ФНО-αAntibodies against TNF-α ИммуногенImmunogen Название клонаClone name СубизотипSubisotype Рекомбинантный ФНО-αRecombinant TNF-α TNFE 2 TNFF 11TNFE 2 TNFF 11 IgG2b IgGIIgG2b IgGI

Таблица 2table 2 Характеристики моноклональных антител против ФНО-α в сравнении с антителом infliximab.Characteristics of monoclonal antibodies against TNF-α in comparison with the infliximab antibody. Название клонаClone name Конечная точка титрования антител в непрямом ИФА, нг/млThe endpoint of antibody titration in indirect ELISA, ng / ml Конечная точка титрования ФНО-α в ИФА с биотинилированным ФНО-α, нг/млThe endpoint of titration of TNF-α in ELISA with biotinylated TNF-α, ng / ml Константа связывания с ФНО-α, МThe binding constant with TNF-α, M Способность антитела взаимодействовать с ФНО-α в Вестерн блотеThe ability of an antibody to interact with TNF-α in Western blot TNFE2TNFE2 0,30.3 33 5,2×10^-9 5.2 × 10 ^-9 ++ TNFF11TNFF11 0,30.3 0,10.1 2,3×10^-8 2.3 × 10 ^-8 ++ infliximabinfliximab Н.о.But. 0,30.3 8×10^-9 8 × 10 ^-9 ++

Таблица 3Table 3 Ингибирующая активность антител против ФНО-α, определенная в реакции ингибирования ФНО-α -опосредованного апоптоза и выраженная через IС₅₀ (концентрация антитела, способная на 50% ингибировать действие 20нг/мл или 100 нг/мл ФНО-α). Сат/Сфно - отношение молярной концентрации антитела, обладающей 50%-ной ингибирующей активностью, к молярной концентрации ФНО-α, взятой для эксперимента.The inhibitory activity of antibodies against TNF-α, determined in the inhibition reaction of TNF-α-mediated apoptosis and expressed through IC ₅₀ (antibody concentration that can 50% inhibit the effect of 20 ng / ml or 100 ng / ml TNF-α). Sat / Cfno is the ratio of the molar concentration of an antibody having 50% inhibitory activity to the molar concentration of TNF-α taken for the experiment. МоАтMoat IС₅₀, мМ, для 20 нг/мл ФНО-αIC ₅₀ , mM, for 20 ng / ml TNF-α IС₅₀, мМ, для 100 нг/мл ФНО-αIC ₅₀ , mM, for 100 ng / ml TNF-α Сат/СфноSat / Sfno TNFE2TNFE2 0,810.81 2,32,3 0,3910.391 TNFF11TNFF11 0,620.62 4,24.2 0,7140.714 infliximabinfliximab 0,270.27 1,61,6 0,2720.272

Таблица 4Table 4 Характеристика Fab-фрагментов антител против ФНО-α: TNF E2, TNF Н3 и TNF F11Characterization of Fab fragments of antibodies against TNF-α: TNF E2, TNF H3 and TNF F11 Название Fab-фрагментаThe name of the Fab fragment Kd, MKd, M IC₅₀, мМ, для 20нг/мл ФНО-αIC ₅₀ , mm, for 20ng / ml TNF-α IC₅₀, мМ, для 100 нг/мл ФНО-αIC ₅₀ , mm, for 100 ng / ml TNF-α TNF E2 Fab
TNF F11 FabTNF E2 Fab
TNF F11 Fab 4,5×10^-9
2,1×10^-8 4,5 × 10 ^-9
2.1 × 10 ^-8 79,2
2979.2
29th 186
74186
74

Таблица 5 Table 5 Влияние антитела TNF-E2 и антитела infliximab на экспрессию ICAM-1 на поверхности ЭК, стимулированную фактором некроза опухолей (ФНО-α)The effect of TNF-E2 antibodies and infliximab antibodies on the expression of ICAM-1 on the surface of EC stimulated by tumor necrosis factor (TNF-α) №*No. * МетодMethod Условия инкубации с
ФНО-αIncubation conditions with
TNF-α АнтителоAntibody Экспрессия
ICAM-1Expression
ICAM-1 Эффект ФНО-αEffect of TNF-α МедианаMedian %**% ** 1one 10F3B2+ФИТЦ-анти-IgG мыши10F3B2 + FITZ anti-mouse IgG Без ФНО-αWithout TNF-α Без антителWithout antibodies 6767 -- +ФНО-α 100 ед/мл, 5 час+ TNF-α 100 u / ml, 5 hours Без антителWithout antibodies 649649 100one hundred +TNF-E2, 1 мкг/мл+ TNF-E2, 1 μg / ml 9191 4four +TNF-E2, 10 мкг/мл+ TNF-E2, 10 μg / ml 9696 55 +infliximab, 1 мкг/мл+ infliximab, 1 mcg / ml 8787 33 +infliximab, 10 мкг/мл+ infliximab, 10 mcg / ml 8383 33 22 Биотин-10F3B2+РегСР-стрептавидинBiotin-10F3B2 + RegSR-streptavidin Без ФНО-αWithout TNF-α Без антителWithout antibodies 4242 -- +ФНО-α100 ед/мл, 20 час+ TNF-α100 u / ml, 20 hours Без антителWithout antibodies 346346 100one hundred +TNF-E2, 1 мкг/мл+ TNF-E2, 1 μg / ml 192192 4949 +TNF-E2, 10 мкг/мл+ TNF-E2, 10 μg / ml 9797 18eighteen +infliximab, 1 мкг/мл+ infliximab, 1 mcg / ml 7878 1212 +infliximab, 10 мкг/мл+ infliximab, 10 mcg / ml 6868 99 +CRC64***, 10 мкг/мл+ CRC64 ***, 10 μg / ml 327327 9494

*Для экспериментов 1 приведены результаты одного измерения для эксперимента 2 -средние из двух измерений.* For experiments 1, the results of one measurement for experiment 2 are the averages of two measurements.

**Эффект ФНО-α в % рассчитывали по формуле [медиана (+ФНО-α, +антитело) - медиана (-ФНО-α, -антитело] / [медиана (+ФНО-α, -антитело) - медиана (-ФНО-α, -антитело)]×100. Таким образом, за 100% (эффект ФНО без добавления антител) принимали различие между экспрессией ICAM-1, выраженной в медианах, в отсутствие и в присутствии ФНО-α в образцах без антител.** The effect of TNF-α in% was calculated by the formula [median (+ TNF-α, + antibody) - median (-FNO-α, antibody) / [median (+ TNF-α, antibody) - median (-FNO -α, -antibody)] × 100. Thus, for 100% (TNF effect without the addition of antibodies), the difference between the expression of ICAM-1 expressed in medians in the absence and presence of TNF-α in samples without antibodies was taken.

*** CRC64 - контрольное антитело, не взаимодействующее ни с ФНО-α, ни с ЭК, ни с ICAM-1.*** CRC64 is a control antibody that does not interact with either TNF-α, EC, or ICAM-1.

Claims

1. The variable domain of the heavy chain (VH) of a mouse antibody against tumor necrosis factor alpha (TNF-α) of a person containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.

2. The variable domain of the light chain (VL) of a mouse antibody against human TNF-α containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.

3. Antigen-binding fragment (Fab), selectively binding to and neutralizing human TNF-α, which includes the variable domain of the heavy chain (VH) with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the variable domain of the light chain (VL) with the amino acid sequence of SEQ IS NO: 2 or the variable domain of the heavy chain (VH) with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and the variable domain of the light chain (VL) with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.