RU2498821C1

RU2498821C1 - Method for stimulating endogenous production of cytokines and hemopoietins

Info

Publication number: RU2498821C1
Application number: RU2012114023/15A
Authority: RU
Inventors: Татьяна Сергеевна Гвоздева; Евгения Владимировна Долгова; Екатерина Анатольевна Алямкина; Константин Евгеньевич Орищенко; Анастасия Сергеевна Проскурина; Владимир Алексеевич Рогачев; Валерий Петрович Николин; Нелли Александровна Попова; Ярослав Рейнгольдович Ефремов; Ольга Юрьевна Леплина; Александр Анатольевич Останин; Елена Рэмовна Черных; Николай Анатольевич Вараксин; Татьяна Геннадьевна Рябичева; Станислав Николаевич Загребельный; Дмитрий Михайлович Пономаренко; Виктория Владимировна Дворниченко; Сергей Васильевич Сидоров; Сергей Станиславович Богачев; Михаил Аркадьевич Шурдов
Original assignee: Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство образования и науки России
Priority date: 2012-04-10
Filing date: 2012-04-10
Publication date: 2013-11-20
Also published as: RU2012114023A

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention refers to medicine and may be used for preventing and treating the diseases wherein endogenous production of cytokines and hemopoietins is advisable to be stimulated. What is presented is a method for stimulating endogenous production of cytokines and hemopoietins which is based on introducing a preparation presenting a double-stranded genomic sonicated human DNA of fragment size 200-6000 base pairs into the patient's body. The preparation is used in the tableted form in the number of 3 tablets containing 5 mg of the active substance of the preparation daily for 1-14 days.

EFFECT: invention provides more effective stimulation.

1 cl, 21 dwg

Description

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для профилактики и лечения заболеваний, при которых целесообразна стимуляция эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов.The invention relates to medicine and can be used for the prevention and treatment of diseases in which it is advisable to stimulate the endogenous production of cytokines and hematopoietic factors.

В настоящее время в терапии заболеваний, обусловленных дисфункцией иммунной системы, используются иммуномодулирующие и иммуностимулирующие препараты различного происхождения, которые, в основном, делятся на три группы: эндогенные, экзогенные и синтетические.Currently, in the treatment of diseases caused by dysfunction of the immune system, immunomodulating and immunostimulating drugs of various origins are used, which are mainly divided into three groups: endogenous, exogenous and synthetic.

К иммуномодуляторам эндогенного происхождения относятся иммунорегуляторные пептиды, а также их рекомбинатные или синтетические аналоги: тактивин, тималин, тимоген, производные тимопоэтина - имунофан, миелопид. Также к группе эндогенных иммуномодуляторов относятся цитокины и иммуноглобулины.Immunomodulators of endogenous origin include immunoregulatory peptides, as well as their recombinant or synthetic analogues: tactivin, thymalin, thymogen, thymopoietin derivatives - immunofan, myelopid. Also to the group of endogenous immunomodulators are cytokines and immunoglobulins.

Цитокины - низкомолекулярные гормоноподобные биомолекулы, продуцируемые активированными иммунокомпетентными клетками и являющиеся регуляторами межклеточных взаимодействий. Их несколько групп - интерлейкины (около 12), факторы роста (эпидермальный, фактор роста нервов), колониестимулирующие факторы, хемотаксические факторы, фактор некроза опухолей. Интерлейкины являются главными участниками развития иммунного ответа на внедрение микроорганизмов, формирования воспалительной реакции, осуществления противоопухолевого иммунитета и др. Наиболее известны лекарственные формы цитокинов, такие как беталейкин, ронколейкин, лейкинферон, суппозитоферон, реаферон, виферон, гриппферон, кипферон.Cytokines are low molecular weight hormone-like biomolecules produced by activated immunocompetent cells and are regulators of intercellular interactions. There are several groups of them - interleukins (about 12), growth factors (epidermal, nerve growth factor), colony stimulating factors, chemotactic factors, tumor necrosis factor. Interleukins are the main participants in the development of the immune response to the introduction of microorganisms, the formation of an inflammatory reaction, the implementation of antitumor immunity, etc. The best known dosage forms of cytokines, such as betaleikin, roncoleukin, leukinferon, suppositoferon, reaferon, viferon, fluferon, kipferon.

Иммуноглобулины представлены такими фармакопейными препаратами как антигеп, пентаглобин, цитотект, гепатект, октагам, сандоглобулин, веноглубулин, афинолейкин.Immunoglobulins are represented by such pharmacopoeial drugs as antigep, pentaglobin, cytotect, hepatect, octagam, sandoglobulin, venoglubulin, and afinoleukin.

Подавляющее большинство экзогенных иммуномодуляторов - это вещества микробного происхождения, в основном бактериального и грибкового.The vast majority of exogenous immunomodulators are substances of microbial origin, mainly bacterial and fungal.

К медицинскому применению разрешены такие средства микробного происхождения, как БЦЖ, пирогенал, продигиозан, нуклеинат натрия, рибомунил, бронхомунал, ликопид и др. Все они обладают способностью усиливать функциональную активность нейтрофилов и макрофагов. Так ликопид оказывает иммуномодулирующее действие, прежде всего, за счет активации клеток фагоцитарной системы иммунитета (нейтрофилов и макрофагов). Последние путем фагоцитоза уничтожают патогенные микроорганизмы и в то же время секретируют медиаторы естественного иммунитета - цитокины (интерлейкин-1, фактор некроза опухоли, колониестимулирующий фактор, гамма интерферон), которые, воздействуя на широкий спектр клеток-мишеней, вызывают дальнейшее развитие защитной реакции организма.For medical use, microbial agents such as BCG, pyrogenal, prodigiosan, sodium nucleinate, ribomunyl, bronchomunal, lycopid, and others are allowed. All of them have the ability to enhance the functional activity of neutrophils and macrophages. So lycopid has an immunomodulatory effect, primarily due to the activation of cells of the phagocytic immune system (neutrophils and macrophages). The latter by phagocytosis destroy pathogenic microorganisms and at the same time secrete mediators of natural immunity - cytokines (interleukin-1, tumor necrosis factor, colony stimulating factor, gamma interferon), which, acting on a wide range of target cells, cause the further development of a protective reaction of the body.

К третьей группе иммуномодуляторов относятся синтетические вещества, полученные в результате направленного химического синтеза. К синтетическим иммуномодуляторам относится также большинство индукторов интерферонов. Индукторы интерферонов представляют собой разнородное по составу семейство высоко- и низкомолекулярных синтетических и природных соединений, объединенных способностью вызывать в организме образование собственного (эндогенного) интерферона. В фармакопеи представлены следующие препараты левамизол, диуцифон, полиоксидоний, глутоксим, галавит, полудан, амиксин неовир, йодантипирин, ридостин, циклоферон.The third group of immunomodulators include synthetic substances obtained as a result of directed chemical synthesis. Synthetic immunomodulators also include most interferon inducers. Interferon inducers are a heterogeneous family of high and low molecular weight synthetic and natural compounds, combined by the ability to cause the formation of their own (endogenous) interferon in the body. The following drugs are presented in the pharmacopoeia: levamisole, diuciphone, polyoxidonium, glutoxim, galavit, half-dan, amiksin neovir, iodantipyrine, ridostin, cycloferon.

В отельную группу можно выделить иммуномодуляторы на основе нуклеиновых кислот ксеногенного или синтетического происхождения. Препараты на основе нуклеиновых кислот (натрия дезоксирибонуклеат, натрия нуклеинат, оксиметилурацил) восстанавливают баланс про- и противовоспалительных цитокинов.In the hotel group, immunomodulators based on nucleic acids of xenogenic or synthetic origin can be distinguished. Nucleic acid preparations (sodium deoxyribonucleate, sodium nucleinate, oxymethyluracil) restore the balance of pro- and anti-inflammatory cytokines.

Иногда лекарственные препараты, активирующие (восстанавливающие) функцию системы клеточного и/или гуморального иммунитета, называют иммуностимуляторами. Общепринятой классификации иммуномодуляторов, оказывающих преимущественно стимулирующее влияние на иммунитет, нет. Можно определить общее свойство и иммуномодуляторов и иммуностимуляторов как иммунокоррекция, связанная с продукцией цитокинов, ростовых факторов, хемокинов и других молекул иммунитета.Sometimes drugs that activate (restore) the function of the cellular and / or humoral immunity system are called immunostimulants. There is no generally accepted classification of immunomodulators that have a predominantly stimulating effect on immunity. It is possible to determine the general property of both immunomodulators and immunostimulants as immunocorrection associated with the production of cytokines, growth factors, chemokines and other immunity molecules.

Таким образом, сегодня известен широкий спектр иммуномодуляторов, рассчитанных на множество конкретных случаев. Иммунная система состоит из ряда тесно связанных в функциональном плане компонентов, задача которых заключается в элиминации из организма чужеродных веществ антигенной природы. У каждого из компонентов этой системы могут быть свои относительно специфические агенты. В этой связи поиск новых средств, используемых в иммунокорригирующей терапии, является важным направлением в клинической практике.Thus, today a wide range of immunomodulators is known, designed for many specific cases. The immune system consists of a number of components that are closely related in functional terms, the task of which is to eliminate foreign substances of antigenic nature from the body. Each of the components of this system may have its own relatively specific agents. In this regard, the search for new agents used in immunocorrective therapy is an important area in clinical practice.

К основным аналогам заявленного изобретения можно отнести способ активации продукции цитокинов клетками периферической крови препаратом ликопид, в основе механизма иммуномодулирующего действия которого лежит активация фагоцитирующих клеток (макрофаги, нейтрофилы) / Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммуномодуляторы и некоторые аспекты их клинического применения // Клиническая медицина. 1996. Т. 74, №8. С.7-12/ [1], / Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммуномодуляторы: механизм действия и клиническое применение // Иммунология. 2003. №3. С.199/ [2]. Ликопид представляет собой синтезированный универсальный фрагмент клеточной оболочки практически всех бактерий глюкозаминилмурамилдипептид - ГМДП (N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамилаланил-D-изоглутамин). Он активирует клетки моноцитарно-макрофагального звена, стимулируя продукцию ими воспалительных цитокинов / Андронова Т.М., Пинегин Б.В. Иммуномодулятор ликопид: современный подход к лечению заболеваний инфекционной природы // Медицинская картотека. 1999. №1. С.23-25 / [3], / Иванов В.Т., Хаитов P.M., Андронова Т., Пинегин Б.В. Ликопид - новый отечественный иммуномодулятор // Иммунология. 1996. №2. С.4-6/ [4].The main analogues of the claimed invention include a method of activating the production of cytokines by peripheral blood cells with a lycopid preparation, the basis of the immunomodulating mechanism of which is the activation of phagocytic cells (macrophages, neutrophils) / Khaitov P.M., Pinegin B.V. Immunomodulators and some aspects of their clinical use // Clinical medicine. 1996.V. 74, No. 8. S.7-12 / [1], / Khaitov P.M., Pinegin B.V. Immunomodulators: mechanism of action and clinical use // Immunology. 2003. No3. S.199 / [2]. Lycopid is a synthesized universal fragment of the cell membrane of almost all bacteria glucosaminylmuramyl dipeptide - GMDP (N-acetylglucosaminyl-N-acetylmuramylalanyl-D-isoglutamine). It activates cells of the monocytic-macrophage link, stimulating the production of inflammatory cytokines by them / Andronova T.M., Pinegin B.V. Immunomodulator lycopid: a modern approach to the treatment of diseases of an infectious nature // Medical file. 1999. No. 1. S.23-25 / [3], / Ivanov V.T., Khaitov P.M., Andronova T., Pinegin B.V. Likopid - a new domestic immunomodulator // Immunology. 1996. No2. C.4-6 / [4].

Недостатком способа является относительно низкое иммуномодулирующего действие.The disadvantage of this method is the relatively low immunomodulatory effect.

Также известен способ активации иммуномодулирующих свойств организма препаратом D-глюкуроновой кислоты, которая является одним из основных компонентов гликозаминогликанов экстрацеллюлярного матрикса /Laurent TC, Fraser JR. Hyaluronan. FASEB J. 1992 Apr; 6(7): 2397-404/ [5]. Эти структуры с высоким содержанием глюкуроновой кислоты участвуют в регуляции ряда процессов: клеточной адгезии, продукции различных цитокинов, хемокинов и экспресии их рецепторов /Camenisch TD, McDonald JA. Hyaluronan: is bigger better? Am J Respir Cell Mol Biol. 2000 Oct; 23(4): 431-3/ [6], функций дендритных клеток /Termeer CC, Hennies J, Voith U, Ahrens T, Weiss JM, Prehm P, Simon JC. Oligosaccharides of hyaluronan are potent activators of dendritic cells. J Immunol. 2000 Aug 15; 165(4): 1863-70/ [7]. Известно применение D-глюкуроновой кислоты в качестве средства, избирательно стимулирующего грануломоноцитопоэз /Патент RU №2020936/ [8] и функциональную активность нейтрофильных лейкоцитов /Патент RU №205813 7/ [9]. Кроме того, показано наличие у D-глюкуроновой кислоты противоаллергического действия /Патент RU №2240801/ [10]. D-глюкуроновая кислота может применяться в качестве средства, обладающего способностью стимулировать Th-зависимый тип иммунного ответа /Патент RU 2347562/ [11].Also known is a method of activating the immunomodulating properties of an organism with a preparation of D-glucuronic acid, which is one of the main components of extracellular matrix glycosaminoglycans / Laurent TC, Fraser JR. Hyaluronan. FASEB J. 1992 Apr; 6 (7): 2397-404 / [5]. These structures with a high content of glucuronic acid are involved in the regulation of a number of processes: cell adhesion, the production of various cytokines, chemokines and the expression of their receptors / Camenisch TD, McDonald JA. Hyaluronan: is bigger better? Am J Respir Cell Mol Biol. 2000 Oct; 23 (4): 431-3 / [6], dendritic cell functions / Termeer CC, Hennies J, Voith U, Ahrens T, Weiss JM, Prehm P, Simon JC. Oligosaccharides of hyaluronan are potent activators of dendritic cells. J Immunol. 2000 Aug 15; 165 (4): 1863-70 / [7]. It is known the use of D-glucuronic acid as an agent that selectively stimulates granulomonocytopoiesis / Patent RU No. 2020936 / [8] and the functional activity of neutrophilic leukocytes / Patent RU No. 205813 7 / [9]. In addition, the presence of D-glucuronic acid anti-allergic action / Patent RU No. 2240801 / [10]. D-glucuronic acid can be used as an agent with the ability to stimulate the Th-dependent type of immune response / Patent RU 2347562 / [11].

Недостатком способа также является относительно низкое иммуномодулирующего действие.The disadvantage of this method is the relatively low immunomodulatory effect.

Кроме того, известен способ активации иммунокомпетентных клеток к продукции цитокинов полумягкими иммуностимулирующими олигонуклеотидами С класса /Патент US 2005/037731 20051020/ [12], /Патент WO 2006/135434 20061221/ [13]. Олигонуклеотиды С класса индуцируют секрецию интерферона-α, интерлейкина-10 иммунокомпетентными клетками, а также стимулирует активность натуральных киллеров.In addition, there is a method of activation of immunocompetent cells to produce cytokines with semi-soft immunostimulating oligonucleotides of class C / Patent US 2005/037731 20051020 / [12], / Patent WO 2006/135434 20061221 / [13]. C-class oligonucleotides induce the secretion of interferon-α, interleukin-10 by immunocompetent cells, and also stimulates the activity of natural killers.

Однако и этот способ имеет недостаток, связанный с относительно низким иммуномодулирующим действием.However, this method also has the disadvantage associated with a relatively low immunomodulatory effect.

Дополнительно к представленным можно указать, что в последнее время было описано несколько разных классов CpG олигонуклеотидов. Один класс CpG эффективен для активации В-клеток, но обладает относительно слабой активностью в отношении индукции интерверона и активации натуральных киллерных клеток; этот класс был назван В-классом. CpG олигонуклеотиды В-класса, как правило, полностью стабилизированы и включают неметилированный CpG динуклеотид с определенным предпочтительным сочетанием оснований /Патент WO 2006/135434 20061221/ [14], /Патент США 6194388/ [15], /Патент США 6207646/ [16], /Патент США 6214806/ [17], /Патент США 6218371/ [18], /Патент США 6239116/ [19]. Представители другого класса CpG олигонуклеотидов активируют В-клетки и натуральные киллерные клетки и индуцируют интерфероны; этот класс был обозначен как С-класс. CpG олигонуклеотиды С-класса, который был охарактеризован первым, как правило, полностью стабилизированы, включают последовательность В-класса и GC-обогащенный палиндром или близкую к палиндрому структуру /US 10/224523 20020819/ [20], /PCT/US02/26468 - WO 03/015711/ [21].In addition to those presented, it can be pointed out that several different classes of CpG oligonucleotides have recently been described. One class of CpG is effective for B cell activation, but has relatively weak activity with respect to induction of interveron and activation of natural killer cells; this class was called the B-class. B-class CpG oligonucleotides are generally fully stabilized and include an unmethylated CpG dinucleotide with a specific preferred base combination / Patent WO 2006/135434 20061221 / [14], / US Patent 6194388 / [15], / US Patent 6207646 / [16] , / US Patent 6,214,806 / [17], / US Patent 6,218,371 / [18], / US Patent 6,239,116 / [19]. Representatives of another class of CpG oligonucleotides activate B cells and natural killer cells and induce interferons; this class has been designated as C-class. The CpG oligonucleotides of the C-class, which was first characterized, as a rule, are fully stabilized, include a B-class sequence and a GC-enriched palindrome or a structure close to the palindrome / US 10/224523 20020819 / [20], / PCT / US02 / 26468 - WO 03/015711 / [21].

Однако и эти вещества, и способы их применения характеризуются относительно низкой эффективностью активирования продукции цитокинов, обусловленной тем, что известные воздействуют только на различные группы иммунокомпетентных клеток как периферической крови, так и локализующихся в других отделах организма и не затрагивают клетки других тканей организма.However, both these substances and methods of their use are characterized by a relatively low efficiency of activation of cytokine production, due to the fact that the known ones act only on various groups of immunocompetent cells both in peripheral blood and localized in other parts of the body and do not affect cells of other body tissues.

Известны способы и средства для профилактики и лечения заболеваний, при которых целесообразна стимуляция эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов.Known methods and means for the prevention and treatment of diseases in which it is advisable to stimulate the endogenous production of cytokines and hematopoietic factors.

Известен способ регулирования эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов, в соответствии с которым в качестве препарата используют окисленный глутатион, или/и его фармацевтически приемлемые соли, или/и его фармацевтически приемлемые производные, которые вводятся парентерально или локально совместно с пролонгатором полужизни указанного окисленного глутатиона, или/и его фармацевтически приемлемых солей, или/и его фармацевтически приемлемых производных /RU 2153351/ [22].A known method of regulating the endogenous production of cytokines and hematopoietic factors, according to which oxidized glutathione and / or its pharmaceutically acceptable salts and / or its pharmaceutically acceptable derivatives are used as a preparation, which are administered parenterally or locally together with a half-life prolongator of said oxidized glutathione, and / or its pharmaceutically acceptable salts, and / or its pharmaceutically acceptable derivatives / RU 2153351 / [22].

Недостатком способа является относительно низкая эффективность профилактики и лечения заболеваний.The disadvantage of this method is the relatively low effectiveness of the prevention and treatment of diseases.

Известен способ, основанный на использовании в качестве стимулятора эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов глутатиона окисленного, представляющего собой димер глутатиона восстановленного, со структурой гамма-глутамилцистеинилглицина, в котором две молекулы трипептида с вышеозначенной структурой соединены друг с другом ковалентной дисульфидной связью между цистеиновыми остатками, причем, в качестве действующего вещества используется эффективное количество глутатиона окисленного, лекарственная форма которого представляет собой инъекционный раствор глутатиона окисленного в фармацевтически приемлемом растворителе в концентрации 0,01-2,0%, при этом, для усиления и продления лечебного эффекта инъекционный раствор дополнительно содержит фармацевтически приемлемый компонент, способный продлить пребывание глутатиона в окисленной форме, например перекись водорода в концентрации 0,003%, а парентеральное введение фармакологического средства в виде инъекционной лекарственной формы предусматривает его использование в дозах 0,01-0,5 мг на кг массы тела от одной и более инъекций в день курсами длительностью один и более дней или непрерывно до момента достижения лечебного эффекта/RU 2089179/[23].A known method based on the use of endogenous production of cytokines and hematopoietic factors as oxidized glutathione, which is a reduced glutathione dimer with a gamma-glutamylcysteinylglycine structure, in which two tripeptide molecules with the aforementioned structure are connected to each other by a covalent disulfide bond between , as the active substance, an effective amount of oxidized glutathione is used, the dosage form of which It is an injection solution of glutathione oxidized in a pharmaceutically acceptable solvent at a concentration of 0.01-2.0%, while, to enhance and prolong the therapeutic effect, the injection solution additionally contains a pharmaceutically acceptable component that can prolong the stay of glutathione in an oxidized form, for example, hydrogen peroxide concentrations of 0.003%, and parenteral administration of a pharmacological agent in the form of an injectable dosage form provides for its use in doses of 0.01-0.5 mg per kg of body weight from about one or more injections per day in courses lasting one or more days or continuously until the therapeutic effect is achieved / RU 2089179 / [23].

Препарат Глутоксим^® является фармакологическим аналогом окисленного глутатиона (GSSG). Механизмом действия препарата является регулируемая эскалация редокс-состояния клеток. Новый уровень редокс-систем и динамики фосфорилирования ключевых белков сигнал-передающих систем и транскриптационных факторов (NFkB и АР-1), в первую очередь, иммунокомпетентных клеток, определяет иммуномодулирующий и системный цитопротекторный эффект препарата. Глутоксим оказывает дифференцированное воздействие на нормальные (стимуляция пролиферации и дифференцировки) и трансформированные (индукция апоптоза - генетически программированной клеточной гибели) клетки. Среди иммунобиохимических эффектов препарата следует выделить: стимулирующее действие препарата на каскадные механизмы фосфатной модификации основных белков сигнал-передающих систем; инициацию системы цитокинов, в том числе эндогенной продукции ИЛ-1, ИЛ-6, фактора некроза опухоли, интерферона, эритропоэтина, воспроизведение эффектов ИЛ-2 посредством индукции экспрессии его рецепторов /http://www.glutoxim.ru - Инструкция по медицинскому применению препарата Глутоксим/ [24].Glutoxim ^® pharmacological analogue is oxidized glutathione (GSSG). The mechanism of action of the drug is a regulated escalation of the redox state of cells. A new level of redox systems and the dynamics of phosphorylation of key proteins of signal-transmitting systems and transcription factors (NFkB and AP-1), primarily immunocompetent cells, determines the immunomodulating and systemic cytoprotective effect of the drug. Glutoxim has a differentiated effect on normal (stimulation of proliferation and differentiation) and transformed (induction of apoptosis - genetically programmed cell death) cells. Among the immunobiochemical effects of the drug, it is worth highlighting: the stimulating effect of the drug on the cascade mechanisms of phosphate modification of the main proteins of signal-transmitting systems; initiation of the cytokine system, including endogenous production of IL-1, IL-6, tumor necrosis factor, interferon, erythropoietin, reproducing the effects of IL-2 by inducing the expression of its receptors http://www.glutoxim.ru - Instructions for medical use Glutoxim drug / [24].

Однако указанный способ стимуляция эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов обладает относительно низкой эффективностью профилактики и лечения, обусловленной тем, что стимуляция эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов, в первую очередь, происходит в иммунокомпетентных клетках и не дополняется продукцией цитокинов другими соматическими не иммунокомпетентными клетками организма.However, this method of stimulating the endogenous production of cytokines and hematopoietic factors has a relatively low efficiency of prevention and treatment, due to the fact that stimulation of the endogenous production of cytokines and hematopoietic factors primarily occurs in immunocompetent cells and is not supplemented by the production of cytokines by other somatic non-immunocompetent cells of the body.

Наиболее близким к предлагаемому является способ лечения онкологических заболеваний, основанный на введении в организм пациента препарата цитостатической группы и препарата фрагментированной аллогенной двуцепочечной геномной ДНК по патенту РФ №2429019, в котором защищена последовательность и количество введения пациенту указанных препаратов. Результаты свидетельствуют о том, что экзогенная ДНК, введенная в организм экспериментальных мышей в сочетании с кросслинкирующим цитостатиком ЦФ, приводит к торможению роста экспериментальных опухолей мышиClosest to the proposed is a method of treating cancer based on the introduction of a cytostatic group preparation and a fragmented allogeneic double-stranded genomic DNA preparation according to RF patent No. 2429019, in which the sequence and amount of administration of these drugs to a patient is protected. The results indicate that exogenous DNA introduced into the body of experimental mice in combination with a cross-linking cytostatic agent of CF leads to inhibition of the growth of experimental mouse tumors

Заявляемый настоящим изобретением результат заключается в повышении эффективность профилактики и лечения заболеваний, при которых целесообразна стимуляция эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов.The result claimed by the present invention is to increase the effectiveness of the prevention and treatment of diseases in which it is advisable to stimulate the endogenous production of cytokines and hematopoietic factors.

Требуемый результат достигается введением в организм пациента препарата, стимулирующего эндогенную продукцию цитокинов и гемопоэтических факторов, в качестве которого используют препарат Панаген (№ ЛСР-004429/08), представляющий двуцепочечную геномную фрагментированную ДНК человека с размером фрагментов 200-6000 пар оснований.The desired result is achieved by introducing into the patient’s body a drug that stimulates the endogenous production of cytokines and hematopoietic factors, using Panagen (No. LSR-004429/08), which is a double-stranded genomic fragmented human DNA with fragment sizes of 200-6000 base pairs.

Кроме того, требуемый результат достигается тем, что, препарат Панаген используют в таблетированной форме в количестве 3 таблетки, содержащих 5 мг активной субстанции препарата Панаген, ежедневно на протяжении 1-14 дней от начала приема препарата или до момента достижения лечебного эффекта.In addition, the desired result is achieved by the fact that the Panagen preparation is used in tablet form in the amount of 3 tablets containing 5 mg of the active substance of the Panagen preparation, daily for 1-14 days from the start of the preparation or until the therapeutic effect is achieved.

Повышение эффективности профилактики и лечения заболеваний, при которых целесообразна стимуляция эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов, как будет показано ниже, в предложенном способе достигается тем, что, стимуляция эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов осуществляется не только иммунокомпетентными клетками организма, но и клетками других тканей и органов.Improving the effectiveness of the prevention and treatment of diseases in which it is advisable to stimulate the endogenous production of cytokines and hematopoietic factors, as will be shown below, in the proposed method is achieved by the fact that stimulation of the endogenous production of cytokines and hematopoietic factors is carried out not only by immunocompetent cells of the body, but also by cells of other tissues and organs.

В более широком плане задачей настоящего изобретения является расширение арсенала средств, обладающих иммуномодулирующей активностью и которые могут быть использовано для профилактики и лечения заболеваний, при которых целесообразна стимуляция эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов.More broadly, the object of the present invention is to expand the arsenal of agents having immunomodulatory activity and which can be used for the prevention and treatment of diseases in which the stimulation of endogenous production of cytokines and hematopoietic factors is advisable.

Наиболее важным отличием пути активации двуцепочечной ДНК (дцДНК), в отличие от прототипов сравнения, является ее непосредственное воздействие на сверхэкспрессию интеферонов (ИФН) I типа как в антигенпрезентирующих клетках, так и в любых других соматических клетках организма. Показано, что ИФН I типа, в особенности ИФН-Р, наиболее важны для иммуномодулирующего каскада, стимулированного дцДНК /Martin DA, Elkon KB. Intracellular mammalian DNA stimulates myeloid dendritic cells to produce type I interferons predominantly through a toll-like receptor 9-independent pathway. Arthritis Rheum. 2006 Mar; 54(3): 951-62./ [25]. Фактически все эффекты опосредованной дцДНК клеточной активации, в том числе увеличение количества цитокинов, молекулярных маркеров процессинга и созревания, устойчивость к вирусным инфекциям, блокируются анти ИФН-β антителами. Каскад, индуцируемый дцДНК, не зависит от TLR, MyD88 и TRIF (не зависит от активации CpG) [12-21].The most important difference in the activation pathway of double-stranded DNA (dsDNA), in contrast to the prototypes of comparison, is its direct effect on the overexpression of type I interferons (IFN) both in antigen-presenting cells and in any other somatic cells of the body. It was shown that IFN type I, in particular IFN-R, are most important for the immunomodulating cascade stimulated with dsDNA / Martin DA, Elkon KB. Intracellular mammalian DNA stimulates myeloid dendritic cells to produce type I interferons predominantly through a toll-like receptor 9-independent pathway. Arthritis Rheum. 2006 Mar; 54 (3): 951-62./ [25]. Virtually all effects of dsDNA mediated cellular activation, including an increase in the number of cytokines, molecular markers of processing and maturation, and resistance to viral infections, are blocked by anti-IFN-β antibodies. The cascade induced by dsDNA is independent of TLR, MyD88, and TRIF (independent of CpG activation) [12-21].

В современной литературе отсутствуют указания на предлагаемый способ повышения эффективности профилактики и лечения заболеваний, при которых целесообразна стимуляция эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов и которая осуществляется не только иммунокомпетентными клетками организма, но и клетками других тканей и органов.In the modern literature there are no indications of the proposed method for improving the prevention and treatment of diseases in which it is advisable to stimulate the endogenous production of cytokines and hematopoietic factors and which is carried out not only by immunocompetent cells of the body, but also by cells of other tissues and organs.

Следовательно, предложение отвечает критериям новизны и изобретательского уровня.Therefore, the proposal meets the criteria of novelty and inventive step.

Ниже приводятся теоретические и экспериментальные данные, подтверждающие, что изобретение отвечает и критерию практической (промышленной) применяемости.The following are theoretical and experimental data confirming that the invention meets the criterion of practical (industrial) applicability.

Сравнение иммуномодулирующих свойств препарата было выполнено со стандартными иммуномодуляторами, доступными в качестве коммерческих препаратов. Также в экспериментах сравнения был использован препарат поли I/поли C который являлся модельной молекулой двуцепочечной нуклеиновой кислоты в экспериментах по анализу иммуномодулирующих свойств дцДНК и обнаружению и характеристике сенсорных молекул дцДНК /Matsumoto M, Seya Т. TLR3: interferon induction by double-stranded RNA including poly (I:C). Adv Drug Deliv Rev. 2008 Apr 29; 60(7): 805-12/ [26], /Hausmann S, Marq JB, Tapparel C, Kolakofsky D, Garcin D. RIG-I and dsRNA-induced IFNbeta activation. PLoS One. 2008; 3(12): е3965./ [27].A comparison of the immunomodulatory properties of the drug was performed with standard immunomodulators available as commercial preparations. Also, a poly I / poly C preparation was used in the comparison experiments, which was a double-stranded nucleic acid model molecule in experiments to analyze the immunomodulating properties of dsDNA and the detection and characterization of dsDNA / Matsumoto M sensor molecules, Seya T. TLR3: interferon induction by double-stranded RNA including poly (I: C). Adv Drug Deliv Rev. 2008 Apr 29; 60 (7): 805-12 / [26], / Hausmann S, Marq JB, Tapparel C, Kolakofsky D, Garcin D. RIG-I and dsRNA-induced IFNbeta activation. Plos one. 2008; 3 (12): e3965. / [27].

На чертежах представлены:The drawings show:

на фиг.1 - динамика продукции ИЛ-8 мононуклеарными клетками крови при стимуляции различными препаратами (Продукция цитокина пг/мл по оси Y соответствует разнице стимулированной препаратом и спонтанной продукции).figure 1 - the dynamics of the production of IL-8 by mononuclear blood cells during stimulation with various drugs (cytokine production PG / ml along the Y axis corresponds to the difference stimulated by the drug and spontaneous production).

на фиг.2 - динамика продукции ИЛ-18 мононуклеарными клетками крови при стимуляции различными препаратами (Продукция цитокина пг/мл по оси Y соответствует разнице стимулированной препаратом и спонтанной продукции).figure 2 - the dynamics of the production of IL-18 mononuclear blood cells during stimulation with various drugs (cytokine production PG / ml along the Y axis corresponds to the difference stimulated by the drug and spontaneous production).

на фиг.3 - динамика продукции VEGF мононуклеарными клетками крови при стимуляции различными препаратами (Продукция цитокина пг/мл по оси Y соответствует разнице стимулированной препаратом и спонтанной продукции).figure 3 - the dynamics of production of VEGF by mononuclear blood cells upon stimulation with various drugs (Production of cytokine pg / ml along the Y axis corresponds to the difference stimulated by the drug and spontaneous production).

на фиг.4 - динамика продукции ИНФ-г мононуклеарными клетками крови при стимуляции различными препаратами (Продукция цитокина пг/мл по оси Y соответствует разнице стимулированной препаратом и спонтанной продукции).figure 4 - the dynamics of the production of INF-g by mononuclear blood cells upon stimulation with various drugs (Production of cytokine pg / ml along the Y axis corresponds to the difference between the drug stimulated and spontaneous production).

на фиг.5 - динамика продукции МСР мононуклеарными клетками крови при стимуляции различными препаратами (Продукция цитокина пг/мл по оси Y соответствует разнице стимулированной препаратом и спонтанной продукции).figure 5 - the dynamics of the production of MCP by mononuclear blood cells during stimulation with various drugs (Production of cytokine pg / ml along the Y axis corresponds to the difference stimulated by the drug and spontaneous production).

на фиг.6 - динамика продукции ИЛ-6 мононуклеарными клетками крови при стимуляции различными препаратами (Продукция цитокина пг/мл по оси Y соответствует разнице стимулированной препаратом и спонтанной продукции).Fig.6 - the dynamics of the production of IL-6 by mononuclear blood cells upon stimulation with various drugs (Cytokine production pg / ml along the Y axis corresponds to the difference stimulated by the drug and spontaneous production).

на фиг.7 - динамика продукции ИЛ-10 мононуклеарными клетками крови при стимуляции различными препаратами (Продукция цитокина пг/мл по оси Y соответствует разнице стимулированной препаратом и спонтанной продукции).Fig.7 - the dynamics of the production of IL-10 by mononuclear blood cells during stimulation with various drugs (Production of cytokine pg / ml along the Y axis corresponds to the difference stimulated by the drug and spontaneous production).

на фиг.8 - динамика продукции ИЛ-1 бета мононуклеарными клетками крови при стимуляции различными препаратами (Продукция цитокина пг/мл по оси Y соответствует разнице стимулированной препаратом и спонтанной продукции).on Fig - dynamics of the production of IL-1 beta by mononuclear blood cells during stimulation with various drugs (Production of cytokine pg / ml along the Y axis corresponds to the difference stimulated by the drug and spontaneous production).

на фиг.9 - динамика продукции ИЛ-1РА мононуклеарными клетками крови при стимуляции различными препаратами (Продукция цитокина пг/мл по оси Y соответствует разнице стимулированной препаратом и спонтанной продукции).figure 9 - the dynamics of the production of IL-1RA mononuclear blood cells during stimulation with various drugs (cytokine production PG / ml along the Y axis corresponds to the difference stimulated by the drug and spontaneous production).

на фиг.10 - динамика продукции ФНО-α мононуклеарными клетками крови при стимуляции различными препаратами (Продукция цитокина пг/мл по оси Y соответствует разнице стимулированной препаратом и спонтанной продукции).figure 10 - the dynamics of production of TNF-α by mononuclear blood cells during stimulation with various drugs (Production of cytokine PG / ml along the Y axis corresponds to the difference stimulated by the drug and spontaneous production).

на фиг.11 - уровень продукции ИЛ-6 (пг/мл) мононуклеарными клетками, соответствующий разнице стимулированной препаратами и спонтанной продукции.11 - the level of production of IL-6 (PG / ml) by mononuclear cells, corresponding to the difference stimulated by drugs and spontaneous production.

на фиг.12 - уровень продукции ФНО-α (пг/мл) мононуклеарными клетками, соответствующий разнице стимулированной препаратами и спонтанной продукции.on Fig - the level of production of TNF-α (PG / ml) by mononuclear cells, corresponding to the difference stimulated by drugs and spontaneous production.

на фиг.13 - уровень продукции ИЛ-8 (пг/мл) мононуклеарными клетками, соответствующий разнице стимулированной препаратами и спонтанной продукции.on Fig - the level of production of IL-8 (PG / ml) by mononuclear cells corresponding to the difference stimulated by drugs and spontaneous production.

на фиг.14 - уровень продукции ИЛ-1β (пг/мл) мононуклеарными клетками, соответствующий разнице стимулированной препаратами и спонтанной продукции.on Fig - the level of production of IL-1β (PG / ml) by mononuclear cells, corresponding to the difference stimulated by drugs and spontaneous production.

на фиг.15 - уровень продукции ИЛ-10 (пг/мл) мононуклеарными клетками, соответствующий разнице стимулированной препаратами и спонтанной продукции.on Fig - the level of production of IL-10 (PG / ml) by mononuclear cells corresponding to the difference stimulated by drugs and spontaneous production.

на фиг.16 - уровень продукции ИЛ-1РА (пг/мл) мононуклеарными клетками, соответствующий разнице стимулированной препаратами и спонтанной продукции.on Fig - the level of production of IL-1RA (PG / ml) by mononuclear cells, corresponding to the difference stimulated by drugs and spontaneous production.

на фиг.17 - уровень продукции VEGF (пг/мл) мононуклеарными клетками, соответствующий разнице стимулированной препаратами и спонтанной продукции.on Fig - the level of VEGF production (PG / ml) by mononuclear cells, corresponding to the difference stimulated by drugs and spontaneous production.

на фиг.18 - уровень продукции ИЛ-2 (пг/мл) мононуклеарными клетками, соответствующий разнице стимулированной препаратами и спонтанной продукции.on Fig - the level of production of IL-2 (PG / ml) by mononuclear cells, corresponding to the difference stimulated by drugs and spontaneous production.

на фиг.19 - уровень продукции ИЛ-18 (пг/мл) мононуклеарными клетками, соответствующий разнице стимулированной препаратами и спонтанной продукции.on Fig - the level of production of IL-18 (PG / ml) by mononuclear cells corresponding to the difference stimulated by drugs and spontaneous production.

на фиг.20 - уровень продукции ИНФ-г (пг/мл) мононуклеарными клетками, соответствующий разнице стимулированной препаратами и спонтанной продукции.in Fig.20 - the level of production of INF-g (PG / ml) by mononuclear cells, corresponding to the difference stimulated by drugs and spontaneous production.

на фиг.21 - уровень продукции МСР (пг/мл) мононуклеарными клетками, соответствующий разнице стимулированной препаратами и спонтанной продукции.in Fig.21 - the level of MCP production (PG / ml) by mononuclear cells, corresponding to the difference between drug stimulated and spontaneous production.

Предложенный способ, который заключается в повышении эффективности профилактики и лечения заболеваний, при которых целесообразна стимуляция эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов и которая осуществляется не только иммунокомпетентными клетками организма, но и клетками других тканей и органов реализуется следующим образом.The proposed method, which consists in increasing the effectiveness of the prevention and treatment of diseases in which it is advisable to stimulate the endogenous production of cytokines and hematopoietic factors and which is carried out not only by immunocompetent cells of the body, but also by cells of other tissues and organs, is implemented as follows.

Пример реализации способа.An example implementation of the method.

Согласно изобретению стимулятором эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов является препарат Панаген (№ ЛСР-004429/08), представляющий двуцепочечную геномную фрагментированную ДНК человека с размером фрагментов 200-6000 пар оснований.According to the invention, the stimulator of the endogenous production of cytokines and hematopoietic factors is the Panagen preparation (No. LSR-004429/08), which represents double-stranded genomic fragmented human DNA with a fragment size of 200-6000 base pairs.

Способ лечения заболеваний, при которых целесообразна стимуляция эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов, включает использование таблетированной формы препарата в количестве 3 таблетки, содержащих 5 мг активной субстанции препарата Панаген, ежедневно на протяжении 1-14 дней от начала приема препарата или до момента достижения лечебного эффекта.A method of treating diseases in which it is appropriate to stimulate the endogenous production of cytokines and hematopoietic factors involves the use of a tablet form of the drug in the amount of 3 tablets containing 5 mg of the active substance of the Panagen preparation, daily for 1-14 days from the start of the drug or until the therapeutic effect is achieved .

В последнее несколько лет было описано и экспериментально обосновано новое свойство двуцепочечной фрагментированной ДНК активировать продукцию иммунных молекул не только иммунокомпетентными клетками организма и клетками периферической крови, но и клетками других типов, включая мышечные клетки /Takeshita F, Ishii KJ. Intracellular DNA sensors in immunity. Curr Opin Immunol. 2008 Aug; 20(4): 383-8./ [28], /Coban C, Koyama S, Takeshita F, Akira S, Ishii KJ. Molecular and cellular mechanisms of DNA vaccines. Hum Vaccin. 2008 Nov-Dec; 4(6): 453-6/ [29]. Основными иммунными молекулами при такой индукции являются интерфероны первого типа и набор провоспалительных цитокинов. Индукция сверхэксперссии интерферонов как в иммунных, так и других соматических клетках организма, и активация за счет этого иммунной системы связана с проведением внутриклеточного сигнала и фосфорилированием ТВК1 киназой IRF-3 (IRF-7) транскрипционных факторов /Martin DA, Elkon KB. Intracellular mammalian DNA stimulates myeloid dendritic cells to produce type I interferons predominantly through a toll-like receptor 9-independent pathway. Arthritis Rheum. 2006 Mar; 54(3): 951-62/ [25], /Ishii KJ, Akira S. Potential link between the immune system and metabolism of nucleic acids. Curr Opin Immunol. 2008 Oct; 20(5): 524-9./ [30]. Также важным в продукции провоспалительных цитокинов и запуска иммунного ответа клетки является формирование инфламосом под воздействием двуцепочечной фрагментированной ДНК. Индукция продукции иммунных молекул осуществляется за счет взаимодействия двуцепочечной ДНК со специфическими цитозольными сенсорами, такими как DAI, NOD, STING, RIG, NALP молекулами /Barber GN. Cytoplasmic DNA innate immune pathways. Immunol Rev. 2011 Sep; 243(1): 99-108./ [31], /Yanai H, Ban T, Wang Z, Choi MK, Kawamura T, Negishi H, Nakasato M, Lu Y, Hangai S, Koshiba R, Savitsky D, Ronfani L, Akira S, Bianchi ME, Honda K, Tamura T, Kodama T, Taniguchi T. HMGB proteins function as universal sentinels for nucleic-acid-mediated innate immune responses. Nature. 2009 Nov 5; 462(7269): 99-103./ [32]. И таким образом способ активации продукции цитокинов препаратом Панаген состоит в активации к продукции цитокинов 1) иммунокомпетентных клеток и 2) в активации всех соматических клеток организма, включая мышечные, через специфические сенсорные молекулы DAI, NOD, STING, RIG, NALP к продукции интерферонов первого типа и провоспалительных цитокинов [31, 32].In the last few years, a new property of double-stranded fragmented DNA to activate the production of immune molecules not only by immunocompetent cells of the body and peripheral blood cells, but also by other types of cells, including muscle cells / Takeshita F, Ishii KJ, has been described and experimentally substantiated. Intracellular DNA sensors in immunity. Curr Opin Immunol. 2008 Aug; 20 (4): 383-8./ [28], / Coban C, Koyama S, Takeshita F, Akira S, Ishii KJ. Molecular and cellular mechanisms of DNA vaccines. Hum Vaccin. 2008 Nov-Dec; 4 (6): 453-6 / [29]. The main immune molecules in this induction are interferons of the first type and a set of pro-inflammatory cytokines. Induction of overexpression of interferons in both immune and other somatic cells of the body, and activation due to this immune system is associated with the intracellular signal and phosphorylation of TBK1 kinase IRF-3 (IRF-7) transcription factors / Martin DA, Elkon KB. Intracellular mammalian DNA stimulates myeloid dendritic cells to produce type I interferons predominantly through a toll-like receptor 9-independent pathway. Arthritis Rheum. 2006 Mar; 54 (3): 951-62 / [25], / Ishii KJ, Akira S. Potential link between the immune system and metabolism of nucleic acids. Curr Opin Immunol. 2008 Oct; 20 (5): 524-9./ [30]. Also important in the production of pro-inflammatory cytokines and triggering the cell’s immune response is the formation of inflamosomes under the influence of double-stranded fragmented DNA. The production of immune molecules is induced by the interaction of double-stranded DNA with specific cytosolic sensors, such as DAI, NOD, STING, RIG, NALP molecules / Barber GN. Cytoplasmic DNA innate immune pathways. Immunol Rev. 2011 Sep; 243 (1): 99-108./ [31], / Yanai H, Ban T, Wang Z, Choi MK, Kawamura T, Negishi H, Nakasato M, Lu Y, Hangai S, Koshiba R, Savitsky D, Ronfani L , Akira S, Bianchi ME, Honda K, Tamura T, Kodama T, Taniguchi T. HMGB proteins function as universal sentinels for nucleic-acid-mediated innate immune responses. Nature. 2009 Nov 5; 462 (7269): 99-103./ [32]. And thus, the method for activating the production of cytokines by the Panagen preparation consists in activating to the production of cytokines 1) immunocompetent cells and 2) in activating all somatic cells of the body, including muscle cells, through specific sensory molecules DAI, NOD, STING, RIG, NALP to the production of interferons of the first type and pro-inflammatory cytokines [31, 32].

Для подтверждения того, что предложенный способ позволяет достигнуть требуемого результата, приведем его теоретическое и экспериментальное обоснование.To confirm that the proposed method allows to achieve the desired result, we present its theoretical and experimental justification.

Рассмотрим теоретическую основу используемого способа.Consider the theoretical basis of the method used.

Цитокипы - это низкомолекулярные белковые регуляторные вещества, которые образуют универсальную сеть медиаторов, характерную как для иммунной системы, так и для клеток других органов и тканей. Под контролем цитокинов протекают все клеточные события: пролиферация, дифференцировка, апоптоз, специализированная функциональная активность клеток. Они регулируют гемопоэз, межклеточные и межсистемные взаимодействия, обеспечивают согласованность эндокринной и нервной систем в норме и в ответ на патологические воздействия. Эффекты каждого цитокина на клетки характеризуются плейотропностыо, спектр эффектов разных медиаторов перекрывается и, в основном, конечное функциональное состояние клетки зависит от влияния нескольких цитокинов, действующих синергично. Таким образом, система цитокинов представляет собой универсальную, полиморфную регуляторную сеть медиаторов, предназначенных для контроля процессов, протекающих в клетке, а так же функциональной активности клеточных элементов в кроветворной, иммунной и других гомеостатических системах организма /Сенников С.В., Силков А.Н. Методы определения цитокинов // Цитокины и воспаление. 2005. Т.4, №1. С.22-27./ [33].Cytokips are low molecular weight protein regulatory substances that form a universal network of mediators, characteristic of both the immune system and cells of other organs and tissues. Under the control of cytokines, all cellular events occur: proliferation, differentiation, apoptosis, specialized functional activity of cells. They regulate hematopoiesis, intercellular and intersystem interactions, ensure the consistency of the endocrine and nervous systems in the norm and in response to pathological effects. The effects of each cytokine on the cells are characterized by pleiotropicity, the spectrum of effects of different mediators is blocked, and, basically, the final functional state of the cell depends on the influence of several cytokines acting synergistically. Thus, the cytokine system is a universal, polymorphic regulatory network of mediators designed to control the processes occurring in the cell, as well as the functional activity of cellular elements in the hematopoietic, immune and other homeostatic systems of the body / Sennikov SV, Silkov A.N . Methods for the determination of cytokines // Cytokines and inflammation. 2005. V. 4, No. 1. S.22-27. / [33].

Контроль и регуляция гемопоэза осуществляется множеством цитокинов, которые способны активировать гемопоэтические клетки (индуцировать их переход из GO- в G1-фазу клеточного цикла), регулировать направленность их дифференцировки в различные ростки кроветворения, стимулировать их пролиферацию и созревание, а также подавлять чрезмерное производство отдельных клеточных типов. Цитокины оказывают регуляторное влияние, как на стволовые гемопоэтические клетки, так и па их зрелых потомков, определяя их функциональную активность.Hematopoiesis is controlled and regulated by a multitude of cytokines that are able to activate hematopoietic cells (induce their transition from GO to the G1 phase of the cell cycle), regulate the direction of their differentiation into various hematopoietic cells, stimulate their proliferation and maturation, and also suppress the excessive production of individual cell types. Cytokines exert a regulatory effect both on stem hematopoietic cells and on their mature offspring, determining their functional activity.

Для лечения злокачественных опухолей широко применяется химиотерапия. Возможность достижения эффекта химиотерапии в значительной степени зависит от ее интенсивности. Повышение интенсивности ограничено токсичностью, то есть повреждающим действием цитостатиков на здоровые клетки и ткани. Токсичность многообразна, но одним из наиболее распространенных и опасных ее видов является миелотоксичность или повреждение клеток костного мозга. Перспективным подходом для борьбы с миелотоксичностью при химиотерапии является применение препаратов, ускоряющих пролиферацию и дифферепцировку предшественников гемопоэза, что позволяет сократить период цитопении и снизить риск развития инфекционных осложнений различной локализации и степени тяжести. В настоящее время известно около 30 цитокинов, влияющих на клетки-предшественники гемопоэза различной степени зрелости, принадлежащие к различным росткам кроветворения. Наиболее широкое применение для преодоления миелосупрессии получили такие гемоцитокины как: гранулоцитарный и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ и ГМ-КСФ). Применение этих факторов позволяет быстро преодолеть повреждение косного мозга, вызванное применением цитостатиков. Однако эти препараты очень дороги и обладают рядом недостатков в связи с из плохой переносимостью примерно у трети пациентов. Поэтому разработка препаратов, обладающих непосредственной высокой гемостимулирующей активностью, либо активирующих клетки к продукции гемоцитокинов, является одной из актуальных задач современной медицины.Chemotherapy is widely used to treat malignant tumors. The ability to achieve the effect of chemotherapy largely depends on its intensity. The increase in intensity is limited by toxicity, that is, the damaging effect of cytostatics on healthy cells and tissues. Toxicity is diverse, but one of its most common and dangerous types is myelotoxicity or damage to bone marrow cells. A promising approach to combat myelotoxicity in chemotherapy is the use of drugs that accelerate the proliferation and differentiation of hematopoietic precursors, which reduces the period of cytopenia and reduces the risk of developing infectious complications of various localization and severity. Currently, about 30 cytokines are known that affect hematopoietic progenitor cells of varying degrees of maturity, belonging to different sprouts of hematopoiesis. The most widely used for overcoming myelosuppression are such hemocytokines as granulocyte and granulocyte macrophage colony stimulating factor (G-CSF and GM-CSF). The use of these factors allows you to quickly overcome the damage to the brain, caused by the use of cytostatics. However, these drugs are very expensive and have several disadvantages due to their poor tolerance in about a third of patients. Therefore, the development of drugs with immediate high hemostimulating activity, or activating cells to produce hemocytokines, is one of the urgent tasks of modern medicine.

Целью данного исследования было оценить влияние препарата Панаген на продукцию цитокинов мононуклеарными клетками цельной крови ex vivo в сравнении с аналогичными уже существующими иммуностимулирующими препаратами (Ридостин, Дезоксил и др.).The aim of this study was to evaluate the effect of the Panagen preparation on the production of cytokines by mononuclear cells of whole blood ex vivo in comparison with similar existing immunostimulating drugs (Ridostin, Deoxyl, etc.).

Ниже приводится экспериментальное доказательство участия экзогенных фрагментов дцДНК в активации противоракового иммунного ответа.The following is experimental evidence for the involvement of exogenous dsDNA fragments in the activation of an anti-cancer immune response.

Используемые методики.Used techniques.

На первом этапе работы была оценена динамика продукции 14 цитокинов моно-нуклеарными клетками крови в зависимости от времени инкубации и активации клеток различными препаратами. Проводилось определение спонтанной продукции цитокинов ех vivo, что позволяет оценить активацию клеток крови в организме обследуемого донора, и индуцированной митогеном, или одним из препаратов, продукции - что демонстрирует потенциальную возможность к секреции цитокинов.At the first stage of the work, the dynamics of the production of 14 cytokines by mononuclear blood cells was evaluated depending on the time of incubation and activation of cells by various drugs. The spontaneous production of ex vivo cytokines was determined, which makes it possible to evaluate the activation of blood cells in the organism of the examined donor, and the products induced by the mitogen, or one of the drugs, which demonstrates the potential for cytokine secretion.

В данных экспериментах использовали образец крови одного условно здорового добровольца в возрасте XX лет. Свежеотобранную периферическую венозную кровь в количестве 20 мл в стерильных условиях смешивали с 80 мл культуральной среды DMEM, содержащей гепарин (2,5 ед/мл), гентамицин (100 мкг/мл) и L-глютамин (0,6 мг/мл). Для проведения экспериментов по спонтанной продукции цитокинов 2 мл полученной разбавленной крови в стерильных условиях переносили во флаконы, которые инкубировали при 37°С в течение разных промежутков времени (1, 3, 6, 24, 72, 168 часов соответственно). После этого клетки крови осаждали на микроцентрифуге при 10000 g в течение 3 мин, супернатант переносили в новую пробирку, замораживали и хранили при -70°С до проведения количественного анализа цитокинов.In these experiments, a blood sample of one conditionally healthy volunteer at the age of XX years was used. Freshly collected peripheral venous blood in an amount of 20 ml under sterile conditions was mixed with 80 ml of DMEM culture medium containing heparin (2.5 u / ml), gentamicin (100 μg / ml) and L-glutamine (0.6 mg / ml). To conduct experiments on the spontaneous production of cytokines, 2 ml of the obtained diluted blood under sterile conditions was transferred into vials, which were incubated at 37 ° C for different periods of time (1, 3, 6, 24, 72, 168 hours, respectively). After this, blood cells were besieged on a microcentrifuge at 10,000 g for 3 min, the supernatant was transferred to a new tube, frozen and stored at -70 ° C until quantitative analysis of cytokines.

Одновременно с экспериментами по спонтанной продукции проводили опыты по стимуляции продукции цитокинов различными препаратами. Для этого 2 мл разбавленной крови в стерильных условиях переносили во флакон и добавляли по 10 мкл раствора 2 мл/мл одного из препаратов: Дезоксил - 1% раствор для инъекций (натриевая соль дезоксирибонуклеиновой кислоты), Ридостин - смесь натриевых солей двуспиральной рибонуклеиновой кислоты и одноцепочечной РНК, 8 мг/амп, производство ЗАО "Вектор-Медика", Реаферон-ЕС - 3 млн МЕ/амп, интерферон-альфа 2 рекомбинантный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций, производство ЗАО "Вектор-Медика", Кольцове, Новосибирск, Панаген субстанция 5 мг/мл, производство ООО «Панаген» и polyinosinic-polycytidylic acid Potassium salt - синтетический аналог двуспиральной РНК, Sigma. Инкубацию и подготовку проб проводили так же, как и при анализе спонтанной продукции. Опыты по стимуляции продукции цитокипов комплексом митогепов (смесь ФГА, Con A, LPS по 4, 4 и 2 мкг/мл соответственно) проводили согласно инструкции из набора «ЦИТОКИН-СТИМУЛ-БЕСТ».Simultaneously with experiments on spontaneous production, experiments were conducted to stimulate the production of cytokines by various drugs. For this, 2 ml of diluted blood under sterile conditions was transferred into a vial and 10 μl of a solution of 2 ml / ml of one of the preparations was added: Deoxyl - 1% solution for injection (sodium salt of deoxyribonucleic acid), Ridostin - a mixture of sodium salts of double-stranded ribonucleic acid and single-stranded RNA, 8 mg / amp, manufactured by Vector-Medica CJSC, Reaferon-EU - 3 million IU / amp, recombinant interferon-alpha 2, lyophilisate for solution for injection, manufactured by Vector-Medica CJSC, Koltsovo, Novosibirsk, Panagen substance 5 mg / ml, manufactured by Panagen LLC and polyinosinic-polycytidylic acid Potassium salt - a synthetic analog of double-stranded RNA, Sigma. Incubation and sample preparation were carried out in the same way as in the analysis of spontaneous production. The experiments on stimulating the production of cytokips by a complex of mitogeps (a mixture of PHA, Con A, LPS of 4, 4 and 2 μg / ml, respectively) were carried out according to the instructions from the kit “CITOKIN-STIMUL-BEST”.

Концентрацию ИНФ-γ, ИНФ-α, ФНО-α, ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-17, ИЛ-18, VEGF, МСР и рецепторного антагониста ИЛ-1 (ИЛ-1РА) в исследуемых образцах измеряли с помощью "sandwich″-варианта твердофазного иммуноферментного анализа с соответствующими наборами реагентов производства ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск).The concentration of INF-γ, INF-α, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-2, IL-4, IL-17, IL-18, VEGF, MCP and receptor antagonist IL-1 (IL-1RA) in the studied samples was measured using the "sandwich" variant of enzyme-linked immunosorbent assay with the corresponding sets of reagents manufactured by CJSC Vector-Best (Novosibirsk).

Рассмотрим влияние препарата ДНК на продукцию цитокинов клетками цельной крови в сравнении с коммерческими иммуномодулирующими препаратами.Consider the effect of a DNA preparation on the production of cytokines by whole blood cells in comparison with commercial immunomodulatory drugs.

Исследование стимуляции различными препаратами целого ряда цитокинов клетками цельной крови одного добровольца показало, что субстанция препарата Панаген стимулирует продукцию ИЛ-8, ИЛ-18, МСР, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-1β, ИЛ1-РА, ФНО-α, VEGF и ИНФ-γ (Фиг.1-10). Причем стимуляция этих цитокинов, за исключением VEGF, детектировалась уже через 6 часов инкубации. При сравнении уровней стимуляции продукции цитокинов субстанцией препарата Панаген и набором митогенов было установлено, что Панаген более эффективно стимулирует продукцию ИЛ-18 (от 1,6 до 6,3 раз в зависимости от времени инкубации) и ИЛ-1 бета (от 1,8 до 4,2 раз). Стимуляция продукции МСР и ИЛ1-РА была примерно одинаковой как в случае митогена, так и в случае Панагена, а синтез ИЛ-8, ИНФ-г, ИЛ-6, ИЛ-10 и ФНО-α более эффективно стимулирует комплекс митогенов.A study of the stimulation by various preparations of a number of cytokines by whole blood cells of one volunteer showed that the substance of the Panagen preparation stimulates the production of IL-8, IL-18, MCP, IL-6, IL-10, IL-1β, IL1-RA, TNF-α, VEGF and INF-γ (Figure 1-10). Moreover, the stimulation of these cytokines, with the exception of VEGF, was detected after 6 hours of incubation. When comparing the levels of stimulation of cytokine production with the substance of Panagen and a set of mitogens, it was found that Panagen more effectively stimulates the production of IL-18 (from 1.6 to 6.3 times depending on the incubation time) and IL-1 beta (from 1.8 up to 4.2 times). The stimulation of the production of MCP and IL1-RA was approximately the same both in the case of mitogen and in the case of Panagen, and the synthesis of IL-8, INF-g, IL-6, IL-10 and TNF-α more effectively stimulates the mitogen complex.

Набор цитокинов, продукцию которых стимулирует препарат Poly I:Poly С, полностью совпадает таковым для Панагена (Фиг.1-10). Различия заключаются только в уровне стимуляции некоторых цитокинов. Так Панаген (в точке 24 ч) более эффективно стимулирует продукцию ИЛ-18, ИЛ-1β и ФНО-α, а препарат Poly I:Poly С - ИНФ-γ и МСР. Препарат Poly I:Poly С представляет собой калиевую соль синтетического аналога двуспиральной РНК, а субстанция препарата Панаген - это смесь двуцепочечных фрагментов геномной ДНК человека размером 200-6000 п.о. с небольшим содержанием белков ядерного матрикса, которая выделена из плацент здоровых рожениц. То есть в состав обоих препаратов входят довольно длинные полимерные отрицательно заряженные молекулы. Поэтому можно предположить, что механизм их действия на активацию синтеза определенного набора цитокинов может быть сходным и ключевыми в этом случае являются структура и заряд молекулы.A set of cytokines, the production of which is stimulated by the preparation Poly I: Poly C, completely coincides with those for Panagen (Figure 1-10). The differences are only in the level of stimulation of certain cytokines. So Panagen (at 24 h) stimulates the production of IL-18, IL-1β and TNF-α more efficiently, and Poly I: Poly C - INF-γ and MCP. The preparation Poly I: Poly C is a potassium salt of the synthetic analogue of double-stranded RNA, and the substance of the Panagen preparation is a mixture of double-stranded fragments of human genomic DNA of 200-6000 bp in size. with a small amount of protein of the nuclear matrix, which is isolated from the placenta of healthy women in childbirth. That is, the composition of both drugs includes rather long polymer negatively charged molecules. Therefore, we can assume that the mechanism of their action on the activation of the synthesis of a specific set of cytokines may be similar and key in this case are the structure and charge of the molecule.

Аналогом препарата Панаген является препарат Дезоксил, который представляет собой натриевую соль дезоксирибонуклеиновой кислоты, получаемую в результате ферментативного гидролиза ДНК молок лососевых рыб. Однако при добавлении данного препарата к клеткам цельной крови не было обнаружено какого-либо стимулирующего эффекта этого препарата на продукцию цитокинов. Несмотря на предполагаемую схожесть Панагена, Poly I:Poly С и Дезоксила отсутствие эффекта последнего может быть связано со способом его производства и обработки ДНК, сильной деградацией ДНК, а так же ее гетерологичностью.An analogue of the Panagen preparation is the Deoxyl drug, which is the sodium salt of deoxyribonucleic acid obtained by enzymatic hydrolysis of DNA of salmon fish milk. However, when this drug was added to whole blood cells, no stimulating effect of this drug on cytokine production was found. Despite the alleged similarity of Panagen, Poly I: Poly C and Deoxyl, the absence of the effect of the latter can be associated with the method of its production and processing of DNA, severe DNA degradation, as well as its heterology.

Препарат Ридостип (Натрия рибонуклеат) относится к иммуномодулирующим средствам и его активным веществом является смесь натриевых солей двуспиральной рибонуклеиновой кислоты и одноцепочечной РНК. Данный препарат относится к индукторам интерферона и является стимулятором фагоцитоза. При анализе стимуляции продукции цитокинов при помощи Ридостина было установлено, что этот препарат приводит к незначительной стимуляции продукции МСР, ИЛ-6, ИЛ-1Ра и ИЛ-8. Стимуляция наблюдалась в 10 и более раз менее эффективная по сравнению с препаратом Панаген, Poly I:Poly С и комплексом митогенов. Использование Реаферона - рекомбинантного интерферона альфа2а приводило лишь к очень слабой стимуляции продукции ИЛ-6 и ИЛ-1РА.The drug Ridostip (Sodium ribonucleate) refers to immunomodulatory agents and its active substance is a mixture of sodium salts of double-stranded ribonucleic acid and single-stranded RNA. This drug belongs to interferon inducers and is a stimulator of phagocytosis. When analyzing the stimulation of cytokine production using Ridostin, it was found that this drug leads to a slight stimulation of the production of MCP, IL-6, IL-1Pa and IL-8. Stimulation was observed 10 times or more less effective compared to Panagen, Poly I: Poly C and the mitogen complex. The use of Reaferon, a recombinant interferon alpha2a, led only to very weak stimulation of the production of IL-6 and IL-1RA.

При оценке динамики продукции цитокинов в зависимости от времени инкубации было установлено, что значительный уровень стимуляции продукции цитокинов достигается уже через 6 часов инкубации. Однако пик продукции цитокинов и выход на плато происходит в промежутке 6-24 часа. Инкубация более 24 часов приводила к неоднозначным результатам. Так продукция ИЛ-8, VEGF и МСР увеличивалась, уровень ИЛ-18, ИГФ-γ и ФНО-α снижался, а уровень ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-1β и ИЛ-1РА сохранялся приблизительно на одном и том же уровне. Изменения в продукции некоторых цитокинов при длительной инкубации могут быть связаны с паракринным эффектом. Поэтому наиболее адекватной точкой для оценки спонтанной и активированной продукции цитокинов является 24 ч.When assessing the dynamics of cytokine production depending on the incubation time, it was found that a significant level of stimulation of cytokine production is achieved after 6 hours of incubation. However, the peak of cytokine production and reaching a plateau occurs in the range of 6-24 hours. Incubation for more than 24 hours led to mixed results. Thus, the production of IL-8, VEGF and MCP increased, the level of IL-18, IGF-γ and TNF-α decreased, and the level of IL-6, IL-10, IL-1β and IL-1RA remained at approximately the same level . Changes in the production of certain cytokines during prolonged incubation may be associated with a paracrine effect. Therefore, the most appropriate point for assessing spontaneous and activated cytokine production is 24 hours.

Таким образом, в результате проведенного сравнительного анализа можно сделать вывод, что субстанция препарата Панаген способна оказывать значительный стимулирующий эффект на продукцию целого ряда цитокинов (ИЛ-8, ИЛ-18, МСР, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-1β, ИЛ1-РА, ФНО-α, и ИНФ-γ) мононуклеарами цельной крови. Графики, отражающие стимуляцию продукции цитокинов, клетками цельной крови в сравнении с коммерческими иммуномодулирующими препаратами представлены на фиг.1-10.Thus, as a result of the comparative analysis, it can be concluded that the substance of the Panagen preparation can have a significant stimulating effect on the production of a number of cytokines (IL-8, IL-18, MCP, IL-6, IL-10, IL-1β, IL1 -PA, TNF-α, and INF-γ) whole blood mononuclear cells. Graphs reflecting the stimulation of the production of cytokines by whole blood cells in comparison with commercial immunomodulating drugs are presented in figures 1-10.

Рассмотрим влияние препарата ДНК на продукцию цитокинов клетками цельной крови здоровых добровольцев в сравнении с коммерческими иммуномодулирующими препаратами.Consider the effect of the DNA preparation on the production of cytokines by whole blood cells of healthy volunteers in comparison with commercial immunomodulating drugs.

На этом этапе работы проводилась оценка достоверности данных по стимуляции субстанцией препарата Панаген продукции цитокинов мононуклеарными клетками в сравнении с Дезоксилом, Ридостином и комплексом митогенов.At this stage of the work, the reliability of the data on the stimulation by the substance of the drug Panagen with the production of cytokines by mononuclear cells was evaluated in comparison with Deoxyl, Ridostin and the mitogen complex.

Для этого использовали образцы крови семи условно здоровых добровольцев. Свежеотобранную периферическую венозную кровь в количестве 2 мл в стерильных условиях вносили во флакон, содержащий 8 мл культуральной среды DMEM, гепарин (2,5 ед/мл), гентамицин (100 мкг/мл) и L-глютамин (0,6 мг/мл). Для проведения экспериментов по спонтанной продукции цитокинов 2 мл полученной разбавленной крови в стерильных условиях переносили во флакон, который инкубировали при 37°С в течение 24 часов. После этого клетки крови осаждали на микроцентрифуге при 10000 g в течение 3 мин, супернатант переносили в новую пробирку, замораживали и хранили при -70°С до проведения количественного анализа цитокинов.For this, blood samples were used from seven conditionally healthy volunteers. Freshly collected peripheral venous blood in an amount of 2 ml under sterile conditions was added to a vial containing 8 ml of DMEM culture medium, heparin (2.5 u / ml), gentamicin (100 μg / ml) and L-glutamine (0.6 mg / ml ) To conduct experiments on the spontaneous production of cytokines, 2 ml of the obtained diluted blood under sterile conditions was transferred to a vial, which was incubated at 37 ° C for 24 hours. After this, blood cells were besieged on a microcentrifuge at 10,000 g for 3 min, the supernatant was transferred to a new tube, frozen and stored at -70 ° C until quantitative analysis of cytokines.

Параллельно проводили эксперименты по стимуляции продукции цитокинов разными препаратами. Для этого во флаконы, содержащие по 1 мл разбавленной крови, добавляли раствор одного из препаратов: субстанция препарата Панаген, раствор Дезоксила, и раствор Ридостинадо конечной концентрации 10 мкг/мл, а также комплекс митогенов из набора «цитокин-стимул-бест». Все флаконы, содержащие разбавленную кровь с препаратами, инкубировали, центрифугировали, а затем получали и хранили образцы для последующего количественного анализа, как описано выше.In parallel, experiments were conducted to stimulate the production of cytokines by different drugs. To do this, in vials containing 1 ml of diluted blood, a solution of one of the preparations was added: the substance of the drug Panagen, a solution of Deoxyl, and a solution of Ridostinado with a final concentration of 10 μg / ml, as well as a mitogen complex from the cytokine-stimulus-best set. All vials containing diluted blood with the preparations were incubated, centrifuged, and then samples were obtained and stored for subsequent quantitative analysis, as described above.

Концентрацию ИНФ-γ, ФНО-α, ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-2, ИЛ-18, VEGF, МСР и рецепторного антагониста ИЛ-1 (ИЛ-1РА) в исследуемых образцах измеряли с помощью "sandwich″-варианта твердофазного иммуноферментного анализа с соответствующими наборами реагентов производства ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск).The concentration of INF-γ, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-2, IL-18, VEGF, MCP and the receptor antagonist IL-1 (IL-1RA) in the studied samples was measured using the sandwich variant of enzyme-linked immunosorbent assay with the appropriate sets of reagents manufactured by Vector-Best CJSC (Novosibirsk).

Графики, отражающие стимуляцию продукции цитокинов, представлены на фиг.11-21. Так как полученные экспериментальные данные не удовлетворяют закону нормального распределения, то для сравнения стимулирующего эффекта препаратов на клетки цельной крови были использованы медианы концентраций секретируемых цитокинов с квартальным размахом 25-75 процентиль. Митоген использовался в качестве стандартного индуктора продукции цитокинов для того чтобы оценить потенциальную способность клеток к секреции цитокинов.Graphs reflecting the stimulation of cytokine production are presented in FIGS. 11-21. Since the obtained experimental data do not satisfy the law of normal distribution, medians of the concentrations of secreted cytokines with a quarterly range of 25-75 percentile were used to compare the stimulating effect of the drugs on whole blood cells. Mitogen was used as a standard inducer of cytokine production in order to assess the potential ability of cells to secrete cytokines.

В результате анализа стимуляции продукции цитокинов мононуклеарными клетками крови разными препаратами было обнаружено, что Панаген значительно активирует продукцию ИЛ-6, ФНО-α, ИЛ-8, ИЛ-1β, ИЛ-10 и ИЛ-1РА, что согласуется с результатами полученными на образце крови одного добровольца, которые описаны выше. Также Пана-ген стимулировал в образцах крови всех добровольцев продукцию ИНФ-γ, хотя уровень продукции находился на более низком уровне чем в случае митогена. Стимуляция секреции ИЛ-18 и МСР детектировалась у 40% выборки, что скорее всего связано с индивидуальными особенностями. На продукцию VEGF и ИЛ-2 Панаген не оказывал какого-либо существенного влияния.As a result of the analysis of stimulation of cytokine production by mononuclear blood cells with different drugs, it was found that Panagen significantly activates the production of IL-6, TNF-α, IL-8, IL-1β, IL-10 and IL-1RA, which is consistent with the results obtained on the sample blood of one volunteer, which are described above. Also, the Pan gene stimulated the production of INF-γ in blood samples of all volunteers, although the level of production was at a lower level than in the case of mitogen. Stimulation of secretion of IL-18 and MCP was detected in 40% of the sample, which is most likely due to individual characteristics. Panagen did not have any significant effect on the production of VEGF and IL-2.

Препарат Ридостин приводил к очень слабой стимуляции продукции ИЛ-8, ИЛ-1РА и МСР, а Дезоксил вызывал стимуляцию на крайне низком уровне ИЛ-18, ИЛ-1РА и МСР и только в некоторых образцах.The drug Ridostin led to very weak stimulation of the production of IL-8, IL-1RA and MCP, and Deoxyl stimulated at an extremely low level of IL-18, IL-1RA and MCP and only in some samples.

Таким образом, из проанализированных препаратов (за исключением комплекса митогепов) значимый эффект на продукцию цитокинов оказывала только активная субстанция препарата Панаген, причем в случае ФНО-α, ИЛ-1β, ИЛ-1РА, ИЛ-10, ИЛ-8 и ИЛ-6 ее стимулирующий эффект был близким или сравнимым с действием митогена. Это указывает на то, что препарат Панаген обладает выраженными иммуномодулирующими свойствами.Thus, of the analyzed preparations (with the exception of the mitogep complex), only the active substance of the Panagen drug had a significant effect on cytokine production, and in the case of TNF-α, IL-1β, IL-1RA, IL-10, IL-8, and IL-6 its stimulating effect was close to or comparable to that of mitogen. This indicates that the drug Panagen has pronounced immunomodulatory properties.

ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-1β и ФНОα относятся к группе провоспалительных цитокинов. ИЛ-6 является плейотропным цитокином с широким диапазоном биологической активности. В иммунной системе его источником являются мононуклеарные фагоциты, Т- и В-клетки, он регулирует иммунный ответ, острофазный ответ, воспаление, онкогенез и гемопоэз. Одной из основных функций ИЛ-6 является регуляция процессов созревания антителопродуцирующих клеток из В-лимфоцитов и самой продукции иммуноглобулинов. ИЛ-6 участвует в активации Т-лимфоцитов, индуцирует синтез многих острофазных белков: фибриногена, альфа1-антихемотрипсина, гаптоглобина, сывороточного амилоида А, С-реактивного белка и др.IL-6, IL-8, IL-1β and TNFα belong to the group of pro-inflammatory cytokines. IL-6 is a pleiotropic cytokine with a wide range of biological activity. In the immune system, its source is mononuclear phagocytes, T and B cells, it regulates the immune response, acute phase response, inflammation, oncogenesis and hematopoiesis. One of the main functions of IL-6 is the regulation of the maturation of antibody-producing cells from B-lymphocytes and the production of immunoglobulins. IL-6 is involved in the activation of T-lymphocytes, induces the synthesis of many acute phase proteins: fibrinogen, alpha1-antichemotrypsin, haptoglobin, serum amyloid A, C-reactive protein, etc.

ИЛ-8 относится к хемокинам и его основными продуцентами являются мононуклеарные фагоциты, полиморфноядерные лейкоциты и другие клетки. Выработка ИЛ-8 повышается в ответ на ли пополи сахарид стенки бактерий, ИЛ-1β, ФНО-α и др. В этой связи можно предположить, двойное действие препарата Панаген на стимуляцию продукции ИЛ-8 или напрямую или опосредованно, за счет активации других цитокинов. Основная функция ИЛ-8 заключается в привлечении в очаг воспаления нейтрофильных гранулоцитов, макрофагов, эозинофилов и лимфоцитов. Свойства ИЛ-8 вызывать миграцию клеток и способствовать их адгезии определяют его как активного участника острой воспалительной реакции в местах проникновения патогена.IL-8 refers to chemokines and its main producers are mononuclear phagocytes, polymorphonuclear leukocytes and other cells. The production of IL-8 is increased in response to a half-wall saccharide of bacteria, IL-1β, TNF-α, etc. In this regard, we can assume the double effect of Panagen on the stimulation of IL-8 production either directly or indirectly, due to the activation of other cytokines . The main function of IL-8 is to attract neutrophilic granulocytes, macrophages, eosinophils and lymphocytes into the focus of inflammation. The properties of IL-8 to cause cell migration and promote their adhesion define it as an active participant in the acute inflammatory reaction at the pathogen penetration sites.

Одним из ключевых провоспалительных цитокинов является ИЛ-1β, источником которого в иммунной системе являются макрофаги, гранулярные лимфоциты, В-клетки и другие. Основное действие ИЛ-1β заключается в активации лимфоцитов, стимуляции макрофагов, а также увеличении адгезии лейкоцитов к эндотелию и синтеза белков острой фазы. Благодаря способности усиливать продукцию ряда колониестимулирующих факторов, ИЛ-1 стимулирует процессы гемопоэза, начиная с уровня стволовых кроветворных клеток. Показано, что введение ИЛ-1 защищает около 90% мышей от летальной дозы облучения. Это позволило рекомендовать его для использования при остром аварийном облучении человека. Имеются данные об использовании ИЛ-1 при трансплантации костного мозга для стимуляции ранних стадий гемопоэза.One of the key pro-inflammatory cytokines is IL-1β, the source of which in the immune system is macrophages, granular lymphocytes, B cells, and others. The main effect of IL-1β is to activate lymphocytes, stimulate macrophages, as well as increase the adhesion of leukocytes to the endothelium and the synthesis of acute phase proteins. Due to the ability to enhance the production of a number of colony-stimulating factors, IL-1 stimulates hematopoiesis processes, starting from the level of hematopoietic stem cells. It was shown that the introduction of IL-1 protects about 90% of mice from a lethal dose of radiation. This allowed us to recommend it for use in acute emergency human exposure. There is evidence of the use of IL-1 in bone marrow transplantation to stimulate the early stages of hematopoiesis.

Еще одним важным провоспалительным цитокином, продукцию которого стимулирует Панаген, является ФНО-α. Этот цитокин обладает противоопухолевой и противовирусной активностью, усиливает выброс нейтрофилов из костного мозга в кровь, активирует гранулоциты макрофаги и другие клетки. ФНО-α влияет на процессы кроветворения, подавляя эритро-, миело- и лимфопоэз, однако, на фоне подавленного кроветворения проявляется стимулирующее действие ФНО-α. Еще одним важным свойством ФНО-α является индукция апоптоза и клеточной смерти. Кроме возможности непосредственно вызывать цитолиз, ФНО также усиливает экспрессию па клеточной поверхности антигенов гисто-совместимости II класса и опухолеассоциированных антигенов, способствуя тем самым развитию более интенсивного иммунного ответа на опухоль.Another important pro-inflammatory cytokine whose production is stimulated by Panagen is TNF-α. This cytokine has antitumor and antiviral activity, enhances the release of neutrophils from the bone marrow into the bloodstream, activates granulocytes macrophages and other cells. TNF-α affects the processes of hematopoiesis, suppressing erythro-, myelo- and lymphopoiesis, however, the stimulating effect of TNF-α is manifested against the background of suppressed hematopoiesis. Another important property of TNF-α is the induction of apoptosis and cell death. In addition to the ability to directly cause cytolysis, TNF also enhances the expression on the cell surface of histocompatibility class II antigens and tumor associated antigens, thereby contributing to the development of a more intense immune response to the tumor.

Из стимулируемых препаратом Панаген цитокинов к противовоспалительным относятся ИЛ-10 и ИЛ-1РА (рецепторный антагонист ИЛ-1). Наиболее важным из них является ИЛ-10, который обладает многими противововоспалительными свойствами, включая способность подавлять лихорадку. ИЛ-10 продуцируется Т-клетками (Th2) и может рассматриваться как антагонист ряда других цитокинов (подавление синтеза цитокинов Th1 клетками). Он подавляет продукцию всех провоспалительных цитокинов, интерферона, пролиферативный ответ Т-клеток на антигены и митогены, а также подавляет секрецию активированными моноцитами IL-1β, ФНО-α и IL-6. Но одновременно ИЛ-10 может стимулировать синтез IgE. В результате он способствует развитию гуморальной составляющей иммунного ответа, обусловливая антипаразитарную защиту и аллергическую реактивность организма.Of the cytokines stimulated by Panagen, IL-10 and IL-1RA (IL-1 receptor antagonist) are anti-inflammatory. The most important of these is IL-10, which has many anti-inflammatory properties, including the ability to suppress fever. IL-10 is produced by T cells (Th2) and can be considered as an antagonist of several other cytokines (suppression of the synthesis of Th1 cytokines by cells). It inhibits the production of all pro-inflammatory cytokines, interferon, the proliferative response of T cells to antigens and mitogens, and also inhibits the secretion of activated monocytes IL-1β, TNF-α and IL-6. But at the same time, IL-10 can stimulate the synthesis of IgE. As a result, it contributes to the development of the humoral component of the immune response, causing antiparasitic protection and allergic reactivity of the body.

ИЛ-1РА также относится к противовоспалительным цитокинам. Он подавляет биологическую активность интерлейкинов ИЛ-1α и ИЛ-1β, конкурируя с ними за связывание с рецептором.IL-1RA also refers to anti-inflammatory cytokines. It inhibits the biological activity of interleukins IL-1α and IL-1β, competing with them for binding to the receptor.

Таким образом, на основе экспериментальных данных можно сделать вывод, что активная субстанция препарата Панаген относится к группе сильных иммуномодуляторов, активирующим различные типы мононуклеарных клеток крови (Т- и В-клетки, макрофаги, нейтрофилы, моноциты и др.) к продукции как про-, так и противовоспалительных цитокинов (ИЛ-6, ФНО-α, ИЛ-8, ИЛ-1β, ИЛ-10 и ИЛ-1РА).Thus, on the basis of experimental data, it can be concluded that the active substance of the Panagen preparation belongs to the group of strong immunomodulators that activate various types of mononuclear blood cells (T and B cells, macrophages, neutrophils, monocytes, etc.) to produce and anti-inflammatory cytokines (IL-6, TNF-α, IL-8, IL-1β, IL-10 and IL-1RA).

Список использованных источниковList of sources used

1 Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммуномодуляторы и некоторые аспекты их клинического применения // Клиническая медицина. 1996. Т.74, №8. С.7-12.1 Khaitov P.M., Pinegin B.V. Immunomodulators and some aspects of their clinical use // Clinical medicine. 1996. Vol. 74, No. 8. S.7-12.

1. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммуномодуляторы: механизм действия и клиническое применение. // Иммунология. 2003. №3. С.199.1. Khaitov P.M., Pinegin B.V. Immunomodulators: mechanism of action and clinical use. // Immunology. 2003. No3. S.199.

2. Андронова Т.М., Пинегин Б.В. Иммуномодулятор ликопид: современный подход к лечению заболеваний инфекционной природы // Медицинская картотека. 1999. №1. С.23-25.2. Andronova T.M., Pinegin B.V. Immunomodulator lycopid: a modern approach to the treatment of diseases of an infectious nature // Medical file. 1999. No. 1. S.23-25.

3. Иванов В.Т., Хаитов P.M., Андронова Т., Пипегин Б.В. Ликопид - новый отечественный иммуномодулятор // Иммунология. 1996. №2. С.4-6.3. Ivanov V.T., Khaitov P.M., Andronova T., Pipegin B.V. Likopid - a new domestic immunomodulator // Immunology. 1996. No2. S.4-6.

4. Laurent TC, Fraser JR. Hyaluronan. FASEB J. 1992 Apr; 6(7): 2397-404.4. Laurent TC, Fraser JR. Hyaluronan. FASEB J. 1992 Apr; 6 (7): 2397-404.

5. Camenisch TD, McDonald JA. Hyaluronan: is bigger better? Am J Respir Cell Mol Biol. 2000 Oct; 23(4): 431-3.5. Camenisch TD, McDonald JA. Hyaluronan: is bigger better? Am J Respir Cell Mol Biol. 2000 Oct; 23 (4): 431-3.

6. Termeer CC, Hennies J, Voith U, Ahrens T, Weiss JM, Prehm P, Simon JC. Oligosaccharides of hyaluronan are potent activators of dendritic cells. J Immunol. 2000 Aug 15; 165(4): 1863-70.6. Termeer CC, Hennies J, Voith U, Ahrens T, Weiss JM, Prehm P, Simon JC. Oligosaccharides of hyaluronan are potent activators of dendritic cells. J Immunol. 2000 Aug 15; 165 (4): 1863-70.

7. Патент RU №2020936.7. Patent RU No. 2020936.

8. Патент RU №2058137.8. Patent RU No. 2058137.

9. Патент RU №2240801.9. Patent RU No. 2240801.

10. Патент RU 2347562.10. Patent RU 2347562.

11. Патент US 2005/03773120051020.11. Patent US 2005/03773120051020.

12. Патент WO 2006/13543420061221.12. Patent WO 2006/13543420061221.

13. Патент США 6194388.13. US patent 6194388.

14. Патент США 6207646.14. U.S. Patent 6,207,646.

15. Патент США 6214806.15. U.S. Patent 6,214,806.

16. Патент США 6218371.16. U.S. Patent 6,218,371.

17. Патент США 6239116.17. US Patent 6,239,116.

18. Патент США 6339068.18. U.S. Patent 6,339,068.

19. US 10/224523 20020819.19. US 10/224523 20020819.

20. PCT/US02/26468 - WO 03/015711.20. PCT / US02 / 26468 - WO 03/015711.

21. RU 2153351.21. RU 2153351.

22. RU 2089179.22. RU 2089179.

23. http://www.glutoxim.ru - Инструкция по медицинскому применению препарата Глутоксим.23. http://www.glutoxim.ru - Instructions for the medical use of the drug Glutoxim.

24. Martin DA, Elkon KB. Intracellular mammalian DNA stimulates myeloid dendritic cells to produce type I interferons predominantly through a toll-like receptor 9-independent pathway. Arthritis Rheum. 2006 Mar; 54(3): 951-62.24. Martin DA, Elkon KB. Intracellular mammalian DNA stimulates myeloid dendritic cells to produce type I interferons predominantly through a toll-like receptor 9-independent pathway. Arthritis Rheum. 2006 Mar; 54 (3): 951-62.

25. Matsumoto M, Seya T. TLR3: interferon induction by double-stranded RNA including poly (I:C). Adv Drug Deliv Rev. 2008 Apr 29; 60(7): 805-12.25. Matsumoto M, Seya T. TLR3: interferon induction by double-stranded RNA including poly (I: C). Adv Drug Deliv Rev. 2008 Apr 29; 60 (7): 805-12.

26. Hausmann S, Marq JB, Tapparel C, Kolakofsky D, Garcin D. RIG-I and dsRNA-induced IFNbeta activation. PLoS One. 2008; 3(12): e3965.26. Hausmann S, Marq JB, Tapparel C, Kolakofsky D, Garcin D. RIG-I and dsRNA-induced IFNbeta activation. Plos one. 2008; 3 (12): e3965.

27. Takeshita F, Ishii KJ. Intracellular DNA sensors in immunity. Curr Opin Immunol. 2008 Aug; 20(4): 383-8.27. Takeshita F, Ishii KJ. Intracellular DNA sensors in immunity. Curr Opin Immunol. 2008 Aug; 20 (4): 383-8.

28. Coban C, Koyama S, Takeshita F, Akira S, Ishii KJ. Molecular and cellular mechanisms of DNA vaccines. Hum Vaccin. 2008 Nov-Dec; 4(6): 453-6.28. Coban C, Koyama S, Takeshita F, Akira S, Ishii KJ. Molecular and cellular mechanisms of DNA vaccines. Hum Vaccin. 2008 Nov-Dec; 4 (6): 453-6.

29. Ishii KJ, Akira S. Potential link between the immune system and metabolism of nucleic acids. Curr Opin Immunol. 2008 Oct; 20(5): 524-9.29. Ishii KJ, Akira S. Potential link between the immune system and metabolism of nucleic acids. Curr Opin Immunol. 2008 Oct; 20 (5): 524-9.

30. Barber GN. Cytoplasmic DNA innate immune pathways. Immunol Rev. 2011 Sep; 243(1): 99-108.30. Barber GN. Cytoplasmic DNA innate immune pathways. Immunol Rev. 2011 Sep; 243 (1): 99-108.

31. Yanai H, Ban T, Wang Z, Choi MK, Kawamura T, Negishi H, Nakasato M, Lu Y, Hangai S, Koshiba R, Savitsky D, Ronfani L, Akira S, Bianchi ME, Honda K, Tamura T, Kodama T, Taniguchi T. HMGB proteins function as universal sentinels for nucleic-acid-mediated innate immune responses. Nature. 2009 Nov 5; 462(7269): 99-103.31. Yanai H, Ban T, Wang Z, Choi MK, Kawamura T, Negishi H, Nakasato M, Lu Y, Hangai S, Koshiba R, Savitsky D, Ronfani L, Akira S, Bianchi ME, Honda K, Tamura T, Kodama T, Taniguchi T. HMGB proteins function as universal sentinels for nucleic-acid-mediated innate immune responses. Nature. 2009 Nov 5; 462 (7269): 99-103.

32. Сенников С.В., Силков А.Н. Методы определения цитокинов // Цитокины и воспаление. 2005. Т.4, №1. С.22-27.32. Sennikov S.V., Silkov A.N. Methods for the determination of cytokines // Cytokines and inflammation. 2005. V. 4, No. 1. S.22-27.

Claims

A method of stimulating the endogenous production of cytokines and hematopoietic factors, based on the daily injection into the patient's body of a drug stimulating the endogenous production of cytokines and hematopoietic factors, which is a tablet form of double-stranded genomic fragmented human DNA with fragments of 200-6000 base pairs, characterized in that the drug is administered in the amount of 3 tablets containing 5 mg of the active substance of the drug, daily for 1-14 days.