RU2493251C1

RU2493251C1 - Line of cells cho[v3d], secreting recombinant vessel endothelium growth factor (vegf) of humans, isoform a165, with exogenic 3×ded-epitope

Info

Publication number: RU2493251C1
Application number: RU2012129820/10A
Authority: RU
Inventors: Полина Никитична Вихрева; Елена Юрьевна Лысюк; Марина Игоревна Лукашина; Николай Васильевич Гнучев; Сергей Сергеевич Ларин; Елена Владимировна Коробко; Игорь Викторович Коробко
Original assignee: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук
Priority date: 2012-07-16
Filing date: 2012-07-16
Publication date: 2013-09-20

Abstract

FIELD: biotechnologies.

SUBSTANCE: by the recombinant method a line of cells CHO[V3D] is produced, which are transformed with plasmid pV3D, coding the human vessel endothelium growth factor, isoform A165, with C-terminal 3xDED-epitope (SEQ ID NO: 1), which is able to produce a biologically active recombinant protein VEGF-A165 of humans with C-terminal 3xDED-epitope in the amount of at least 0.2 mg 1 l of medium for 72 hours with 1 ml of growth medium per 5 cm² of single-layer culture. The cell line is deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms VKPM under the registration number VKPM H-123.

EFFECT: no impact at biological activity of protein and possibility to do protein treatment.

4 dwg, 7 ex

Description

Область техники настоящего изобретенияThe technical field of the present invention

Изобретение относится к области клеточной биологии, молекулярной биологии и биотехнологии, в частности, к получению линии генно-модифицированных клеток хомяка, используемых для получения рекомбинантного биологически активного фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) человека, изоформа А165.The invention relates to the field of cell biology, molecular biology and biotechnology, in particular, to the production of a line of genetically modified hamster cells used to produce recombinant biologically active human vascular endothelial growth factor (VEGF), isoform A165.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION

В настоящее время известно, что одним таким ключевым регулятором ангиогенеза является фактор роста эндотелия сосудов (VEGF, также называемый VEGF-A), и роль семейства генов VEGF в регуляции ангиогенеза интенсивно исследуется уже на протяжении более десятилетия [1]. Семейство VEGF включает в себя прототипный член VEGF-A, плацентарный фактор роста (P1GF) [2], VEGF-B [3], VEGF-C [4] и VEGF-D [5]. Убедительные доказательства свидетельствуют, что тогда как построение и созревание сосудистой стенки представляют собой весьма сложные процессы, требующие согласованных воздействий ангиопоэтинов, тромбоцитарного фактора роста В (PDGF-B) и других факторов [6], действие VEGF-A представляет собой лимитирующую стадию нормального и патологического роста кровеносных сосудов [7]. Важным представляется то, что VEGF-C и VEGF-D регулируют ангиогенез лимфатических сосудов [8]. Это подчеркивает уникальную роль этого семейства генов в контроле роста и дифференцировки некоторых анатомических компонентов сосудистой системы.It is now known that one such key regulator of angiogenesis is vascular endothelial growth factor (VEGF, also called VEGF-A), and the role of the VEGF gene family in the regulation of angiogenesis has been intensively studied for more than a decade [1]. The VEGF family includes a prototype member of VEGF-A, placental growth factor (P1GF) [2], VEGF-B [3], VEGF-C [4] and VEGF-D [5]. Convincing evidence suggests that while the construction and maturation of the vascular wall are very complex processes that require the combined effects of angiopoietins, platelet-derived growth factor B (PDGF-B) and other factors [6], the action of VEGF-A is a limiting stage of normal and pathological blood vessel growth [7]. It is important that VEGF-C and VEGF-D regulate angiogenesis of the lymphatic vessels [8]. This underlines the unique role of this family of genes in controlling the growth and differentiation of certain anatomical components of the vascular system.

В 1983 году Senger et al. сообщили о частичном выделении из кондиционной среды опухолевой клеточной линией морской свинки "фактора проницаемости сосудов" (VPF), белка, который индуцировал увеличение проницаемости сосудов кожи [9]. Однако, поскольку VPF не был выделен и секвенирован, на тот момент молекулярная структура фактора осталась неизвестной. В 1989 году появилось сообщение о выделении из кондиционной среды фолликулярных клеток гипофиза коровы "фактора роста эндотелия сосудов" (VEGF), специфичного в отношении эндотелиоцитов митогена [10]. N-концевая аминокислотная последовательность VEGF не совпадала ни с одной последовательностью известных белков, депонированных на тот момент в доступные базы данных [10]. Затем работа Connolly et al., выполненная на основе работы Senger et al., независимо привела к выделению и секвенированию VPF [11]. Клонирование кДНК VEGF [12] и VPF [13] показало, что VEGF и VPF представляют собой одну и ту же молекулу. Этот результат был неожидан, учитывая, что другие митогены эндотелиоцитов, такие как FGF, не усиливают проницаемость сосудов.In 1983, Senger et al. reported partial isolation of conditioned vascular permeability factor (VPF) from a guinea pig tumor cell line from the conditioned medium, a protein that induced an increase in vascular permeability of the skin [9]. However, since VPF was not isolated and sequenced, at that time the molecular structure of the factor remained unknown. In 1989, a message appeared about the isolation of vascular endothelial growth factor (VEGF) specific for mitogen endotheliocytes from follicular cells of the pituitary cortex of a cow [10]. The N-terminal amino acid sequence of VEGF did not match any sequence of known proteins deposited at that time in accessible databases [10]. Then, the work of Connolly et al., Based on the work of Senger et al., Independently led to the isolation and sequencing of VPF [11]. Cloning of cDNA of VEGF [12] and VPF [13] showed that VEGF and VPF are the same molecule. This result was unexpected, given that other mitogen endotheliocytes, such as FGF, do not increase vascular permeability.

VEGF характеризуется значительной гомологией с цепями А и В PDGF [12]. Ген, кодирующий VEGF-A человека, состоит из восьми экзонов, разделенных семью интронами [14,15]. Альтернативный сплайсинг экзонов приводит к образованию четырех основных изоформ - VEGF-A121, VEGF-A165, VEGF-A189 и VEGF-A206, состоящих после отщепления сигнальной последовательности соответственно из 121, 165, 189 и 206 аминокислот [12]. Альтернативный сплайсинг регулирует биологическую доступность VEGF [16,17]. К настоящему времени скопилась масса доказательств того, что VEGF-A165 является наиболее физиологически компетентной изоформой [18,19]. Также в регуляции биологической доступности VEGF важную роль играет внеклеточный протеолиз. Плазмин способен расщеплять VEGF-A165 и VEGF-A189 и высвобождать биологически активный продукт, состоящий из первых 110 аминоконцевых аминокислот [20]. Учитывая важность активации плазминогена в ходе физиологического и патологического ангиогенеза [21], этот механизм может иметь особое значение для регуляции активности и биологической доступности VEGF при развитии ремоделирования и в ответ на сигналы микроокружения. Кроме того, в некоторых опухолях протеолиз VEGF, опосредованный мактриксной металлопротеиназой-9 (ММР9), может быть ответственным за запуск ангиогенеза [22].VEGF is characterized by significant homology with PDGF chains A and B [12]. The gene encoding human VEGF-A consists of eight exons separated by seven introns [14,15]. Alternative exon splicing leads to the formation of four main isoforms - VEGF-A121, VEGF-A165, VEGF-A189, and VEGF-A206, consisting after cleavage of the signal sequence of 121, 165, 189 and 206 amino acids, respectively [12]. Alternative splicing regulates the bioavailability of VEGF [16, 17]. To date, there has been ample evidence that VEGF-A165 is the most physiologically competent isoform [18,19]. Extracellular proteolysis also plays an important role in the regulation of the bioavailability of VEGF. Plasmin is able to cleave VEGF-A165 and VEGF-A189 and release a biologically active product consisting of the first 110 amino-terminal amino acids [20]. Given the importance of plasminogen activation during physiological and pathological angiogenesis [21], this mechanism may be of particular importance for regulating the activity and bioavailability of VEGF during the development of remodeling and in response to microenvironment signals. In addition, in some tumors, VEGF proteolysis mediated by mtrix metalloproteinase-9 (MMP9) may be responsible for triggering angiogenesis [22].

Достоверно установленным действием VEGF является ускорение роста эндотелиоцитов артерий, вен и лимфатических сосудов (обзор приведен в ссылке [23]). VEGF индуцирует мощный ангиогенный ответ во множестве моделей in vivo [12, 24]. Кроме того, как указано выше, VEGF увеличивает проницаемость сосудов, и это свойство лежит в основе важной роли молекулы в воспалении и других патологических процессах [25]. В данном контексте VEGF также индуцирует экспрессию эндотелием некоторых молекул адгезии, регулирующих адгезию лейкоцитов при воспалении [26].A reliably established effect of VEGF is to accelerate the growth of endotheliocytes in arteries, veins and lymphatic vessels (for a review, see reference [23]). VEGF induces a potent angiogenic response in many in vivo models [12, 24]. In addition, as indicated above, VEGF increases vascular permeability, and this property underlies the important role of the molecule in inflammation and other pathological processes [25]. In this context, VEGF also induces endothelial expression of certain adhesion molecules that regulate the adhesion of leukocytes during inflammation [26].

In vitro VEGF предотвращает апоптоз эндотелиоцитов, индуцируемый истощением сыворотки, что опосредуется каскадом фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K)/Akt [27]. VEGF также индуцирует экспрессию в эндотелиоцитах антиапоптотических белков BCL2 и Al [28]. Зависимость от VEGF была показана на эндотелиоцитах вновь образованных, но не до конца сформировавшихся сосудов опухолей [29,30]. Образование выстилки перицитами, предположительно, является одним из ключевых событий, приводящих к утрате эндотелиоцитами зависимости от VEGF [30].In vitro, VEGF prevents serum depletion induced apoptosis of endotheliocytes, which is mediated by the cascade of phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) / Akt [27]. VEGF also induces the expression of antiapoptotic proteins BCL2 and Al in endotheliocytes [28]. Dependence on VEGF was shown on the endothelial cells of newly formed, but not completely formed tumor vessels [29,30]. Pericyte lining is presumably one of the key events leading to the loss of endotheliocyte dependence on VEGF [30].

Следует подчеркнуть, что хотя эндотелиоциты являются главными мишенями VEGF, в ходе нескольких исследований были показаны также его эффекты на митотическую активность/выживаемость некоторых неэндотелиальных клеточных типов, включая нейроны [31].It should be emphasized that although endotheliocytes are the main targets of VEGF, several studies have also shown its effects on the mitotic activity / survival of some nonendothelial cell types, including neurons [31].

VEGF принципиально важен для нормального эмбрионального васкулогенеза и ангиогенеза. Инактивация аллеля VEGF у мышей приводит к эмбриональной смертности [32, 33]. Ингибирование VEGF в раннем неонатальном периоде приводит к остановке роста, апоптозу эндотелиоцитов и летальному исходу главным образом в результате почечной недостаточности [34, 35]. VEGF также необходим для внутрихрящевого окостенения, фундаментального механизма роста трубчатых костей. Ингибиторы VEGF подавляют эти процессы у грызунов и приматов [36, 37]. Важно заметить, что этот эффект полностью обратим при прекращении анти-VEGF обработки [36, 37]. Ангиогенез является ключевым аспектом нормального овариально-менструального цикла и функционирования эндометрия [38]. Экспрессия мРНК VEGF связана во времени и пространстве с пролиферацией кровеносных сосудов в яичниках различных видов [39,40]. Введение ингибиторов VEGF замедляет развитие фолликулов [41] и подавляет ангиогенез в желтом теле грызунов [42] и приматов [37,43,44].VEGF is fundamentally important for normal embryonic vasculogenesis and angiogenesis. Inactivation of the VEGF allele in mice leads to embryonic mortality [32, 33]. Inhibition of VEGF in the early neonatal period leads to stunting, apoptosis of endotheliocytes and death, mainly as a result of renal failure [34, 35]. VEGF is also required for intracranial ossification, a fundamental mechanism for the growth of tubular bones. VEGF inhibitors suppress these processes in rodents and primates [36, 37]. It is important to note that this effect is completely reversible upon termination of anti-VEGF processing [36, 37]. Angiogenesis is a key aspect of the normal ovarian-menstrual cycle and endometrial functioning [38]. The expression of VEGF mRNA is associated in time and space with the proliferation of blood vessels in the ovaries of various species [39,40]. The administration of VEGF inhibitors slows down the development of follicles [41] and inhibits angiogenesis in the corpus luteum of rodents [42] and primates [37,43,44].

Очищенные факторы роста человека, в том числе и фактор роста эндотелия сосудов, находят широкое применение в различных практических приложениях. В частности, к областям их применения относятся разработка лекарственных препаратов, принцип действия которых основан на блокировании биологической активности фактора роста, разработка лекарственных препаратов на основе собственно фактора роста, использование факторов роста in vitro для целей клеточной и тканевой инженерии, использование факторов роста в качестве стандартов в различных биологических тест-системах, имеющих прикладное значение. Однако использование факторов роста человеческого происхождения имеет ряд серьезных ограничений, связанных часто с необходимостью использования большого количества исходного биоматериала, сложностью процедур очистки и, самое главное, возможной биологической опасностью конечного продукта из-за содержания в нем известных и неизвестных патогенов. Все эти ограничения отсутствуют при использовании рекомбинантных белков, полученных в контролируемых условиях.Purified human growth factors, including the vascular endothelial growth factor, are widely used in various practical applications. In particular, their areas of application include the development of drugs, the principle of which is based on blocking the biological activity of the growth factor, the development of drugs based on the growth factor itself, the use of in vitro growth factors for cell and tissue engineering, the use of growth factors as standards in various biological test systems of practical importance. However, the use of growth factors of human origin has a number of serious limitations, often associated with the need to use a large amount of source biomaterial, the complexity of the cleaning procedures, and, most importantly, the possible biological hazard of the final product due to the content of known and unknown pathogens in it. All these limitations are absent when using recombinant proteins obtained under controlled conditions.

Для получения рекомбинантных белков используют различные системы экспрессии, основанные на использовании в качестве продуцентов клеток E.coli, дрожжей, насекомых, млекопитающих. Выбор системы экспрессии для продукции конкретного белка определяется различными факторами, которые включают в себя стоимость продукции и очистки, характеристики выхода целевого белка, необходимость проведения очистки от продуктов неправильного фолдинга и неполноразмерных молекул, необходимость присутствия пост-трансляционных модификаций в рекомбинантном белке. Одним из широко используемых подходов при продукции рекомбинантных секреторных белков млекопитающих, к которым относится VEGF-A165, является использование в качестве продуцентов клеток хомяка линии СНО. Использование для экспрессии клеток линии СНО позволяет добиться присутствия в рекомбинантных белках, продуцируемых в них, наиболее соответствующего эндогенному паттерну пост-трансляционных модификаций, в частности, гликозилирования, что позволяет получить рекомбинантный белок, максимально схожий с натурально встречающимся белком.To obtain recombinant proteins, various expression systems are used, based on the use of E. coli, yeast, insects, and mammals as producers. The choice of expression system for the production of a particular protein is determined by various factors, which include the cost of production and purification, the yield characteristics of the target protein, the need for purification from products of improper folding and incomplete molecules, the need for the presence of post-translational modifications in the recombinant protein. One of the widely used approaches in the production of recombinant mammalian secretory proteins, which include VEGF-A165, is to use the CHO line as a producer of hamster cells. The use of CHO line for expression of cells allows one to achieve the presence in recombinant proteins produced in them of the most consistent with the endogenous pattern of post-translational modifications, in particular, glycosylation, which allows one to obtain a recombinant protein that is most similar to a naturally occurring protein.

Вне зависимости от используемой для продукции рекомбинантного белка системы экспрессии, продуцированный рекомбинантный белок должен быть подвергнут процедуре очистки, призванной удалить примеси как белковой, так и небелковой природы, которые могут интерферировать со специфической активностью самого рекомбинантного белка и проявлять собственную биологическую активность, включая токсическое действие на клетки-мишени для целевого рекомбинантного белка. Процедура очистки основана на специфических физико-химических свойствах целевого белка и может включать в себя методы ультрафильтрации, дифференциального осаждения и различные виды хроматографии.Regardless of the expression system used for the production of the recombinant protein, the produced recombinant protein must be subjected to a purification procedure designed to remove impurities of both protein and non-protein nature that can interfere with the specific activity of the recombinant protein itself and exhibit its own biological activity, including toxic effects on target cells for the target recombinant protein. The purification procedure is based on the specific physicochemical properties of the target protein and may include ultrafiltration, differential precipitation, and various types of chromatography.

Одним из широко используемых подходов при очистке рекомбинантных белков является аффинная хроматография, основанная на специфическом связывании аффинным матриксом (например, за счет иммобилизованных антител) целевого белка. Этот метод позволяет в одну стадию добиться высокой очистки целевого белка от примесей. При использовании антител для получения аффинного матрикса для очистки конкретного рекомбинантного белка предпочтительным является использование антител, способных узнавать антигенные детерминантны белка. Это позволяет проводить аффинную очистку рекомбинантного белка, по своей структуре идентичного натуральному. Однако реализация этого подхода требует получения для каждого белка уникальных препаратов антител, которые в силу необходимости стандартизации процедуры очистки, должны представлять собой моноклональные антитела. Альтернативным подходом является использование стандартных моноклональных антител для очистки различных рекомбинантных белков. Для реализации этого подхода необходимо введение в последовательность рекомбинантного белка специальной последовательности аминокислот (эпитоп), узнаваемой используемыми для аффинной очистки стандартными антителами. Недостатком этого подхода является присутствие в составе рекомбинантного белка экзогенных последовательностей и, соответственно, его неполная идентичность натуральному белку, что может влиять на биологическую активность белка, а также при применении in vitro приводить к возникновению иммунного ответа на эпитоп и сам белок как следствие гаптенации. Однако в ряде случаев присутствие эпитопа не является существенным для практического использования белка при условии сохранения его функциональных свойств. Такими приложениями являются, например, использование рекомбинантных белков в качестве стандартов в иммуноферментном анализе, использование факторов роста in vitro при тканевой и клеточной инженерии, а также в исследовательских целях.One of the widely used approaches for the purification of recombinant proteins is affinity chromatography based on specific binding by the affinity matrix (for example, due to immobilized antibodies) of the target protein. This method allows one stage to achieve high purification of the target protein from impurities. When using antibodies to produce an affinity matrix for purification of a particular recombinant protein, it is preferable to use antibodies capable of recognizing antigenic determinants of the protein. This allows the affinity purification of a recombinant protein, in its structure identical to natural. However, the implementation of this approach requires the production of unique antibody preparations for each protein, which, due to the need for standardization of the purification procedure, must be monoclonal antibodies. An alternative approach is to use standard monoclonal antibodies to purify various recombinant proteins. To implement this approach, it is necessary to introduce into the sequence of the recombinant protein a special amino acid sequence (epitope) recognized by the standard antibodies used for affinity purification. The disadvantage of this approach is the presence of exogenous sequences in the composition of the recombinant protein and, accordingly, its incomplete identity with the natural protein, which can affect the biological activity of the protein, as well as in vitro, lead to an immune response to the epitope and the protein itself as a result of haptation. However, in some cases, the presence of an epitope is not essential for the practical use of the protein, provided that its functional properties are preserved. Such applications are, for example, the use of recombinant proteins as standards in enzyme immunoassay, the use of in vitro growth factors in tissue and cell engineering, as well as for research purposes.

В качестве экзогенных эпитопов для детекции и очистки рекомбинантных белков используются различные последовательности аминокислот. Одной из таких последовательностей является DED-эпитоп («Пептид DED и его применение для идентификации и/или очистки рекомбинантных белков, вектор pDED», патент на изобретение №2380373), позволяющий проводить специфическую детекцию и очистку содержащих его белков с применением антител, специфически узнающих этот эпитоп.Various exogenous amino acid sequences are used as exogenous epitopes for the detection and purification of recombinant proteins. One of these sequences is the DED epitope (“DED peptide and its use for identification and / or purification of recombinant proteins, pDED vector”, patent for invention No. 2380373), which allows specific detection and purification of proteins containing it using antibodies that specifically recognize this epitope.

Помимо использования единичного эпитопа одним из хорошо известных способов увеличения эффективности взаимодействия антител с рекомбинантным белком, маркированным эпитопом, является тандемное включение нескольких эпитопов вместо его единичной копии. Это позволяет увеличить чувствительность детекции белка, маркированного эпитопом, а также улучшить параметры его аффинной очистки, как это было продемонстрировано, например, для FLAG-эпитопа [45]. Особенно существенным введение нескольких повторяющихся эпитопов может быть при необходимости очистки маркированного ими белка в нативных условиях, поскольку единичный эпитоп может быть недоступен из-за стерических препятствий, возникающих в результате фолдинга белка, а увеличение числа эпитопов увеличивает вероятность доступности хотя бы одного эпитопа для связывания антителами для белка в нативной конформации [46].In addition to using a single epitope, one of the well-known methods for increasing the efficiency of the interaction of antibodies with a recombinant protein labeled with an epitope is the tandem inclusion of several epitopes instead of a single copy. This allows one to increase the sensitivity of detection of a protein marked with an epitope, as well as to improve the parameters of its affinity purification, as was demonstrated, for example, for a FLAG epitope [45]. The introduction of several repeating epitopes may be especially significant if it is necessary to purify the protein labeled by them under native conditions, since a single epitope may not be available due to steric barriers resulting from protein folding, and an increase in the number of epitopes increases the likelihood of at least one epitope for antibody binding for a protein in the native conformation [46].

Раскрытие настоящего изобретенияDisclosure of the present invention

Сущностью настоящего изобретения является создание новой линии клеток хомяка CHO[V3D], продуцирующих рекомбинантный фактор роста эндотелия сосудов - белок VEGF-A165 человека - с тремя тандемно повторяющимися DED-эпитопами (3×DED) на С-конце полипептидной цепи (белок VEGF-A165-3×DED). Способность клеток CHO[V3D] секретировать рекомбинантный VEGF-A165-3×DED достигается при помощи генной модификации клеток хомяка линии СНО генной конструкцией - плазмидой pV3D, содержащей комплементарную ДНК (кДНК) VEGF-A165 человека (SEQ ID NO: 1), в которой удален кодон терминации транскрипции, а вместо него вставлен фрагмент ДНК, кодирующий в одной рамке считывания с кДНК VEGF-A165 три DED-эпитопа, разделенные последовательностями нуклеотидов 5'-GCTAGAGGAGGT-3', кодирующими тетрапептиды Ala-Arg-Gly-Gly, встроенную в вектор, предназначенный для экспрессии в клетках млекопитающих.The essence of the present invention is the creation of a new line of hamster cells CHO [V3D] producing a recombinant vascular endothelial growth factor - human VEGF-A165 protein - with three tandem repeating DED epitopes (3 × DED) at the C-terminus of the polypeptide chain (VEGF-A165 protein -3 × DED). The ability of CHO [V3D] cells to secrete recombinant VEGF-A165-3 × DED is achieved by genetically modifying CHO hamster cells with a gene construct, plasmid pV3D, containing human VEGF-A165 complementary DNA (cDNA) (SEQ ID NO: 1), in which the transcription termination codon was deleted, and instead of it a DNA fragment was inserted that encodes three DED epitopes separated by 5'-GCTAGAGGAGGGT-3 'nucleotide sequences encoding Ala-Arg-Gly-Gly tetrapeptides embedded in the VEGF-A165 cDNA encoded in one reading frame vector for expression in mammalian cells them.

Технический результат заключается в получении клеток линии CHO[V3D], стабильно трансфицированных плазмидой pV3D, предназначенной для экспрессии в клетках млекопитающих белка VEGF-A165 человека с С-концевым 3×DED-эпитопом, и секретирующих этот фактор в ростовую среду при культивировании in vitro.The technical result consists in obtaining cells of the CHO line [V3D] stably transfected with plasmid pV3D designed for expression of human VEGF-A165 protein with a C-terminal 3 × DED epitope in mammalian cells and secreting this factor into the growth medium during in vitro cultivation.

Целью настоящего изобретения является расширение коллекции уникальных клеточных штаммов, которые можно использовать для получения белка VEGF человека, изоформа А 165. Эта задача является особенно актуальной для современной фармакологической биотехнологии. Наработанный указанным штаммом белок VEGF-A165 может применяться во многих сферах биологических и медицинских исследований, в частности, при создании и изучении лекарственных средств и других соединений, являющихся агонистами или антагонистами VEGF, в области клеточной и тканевой инженерии. Помимо этого, в настоящее время уровень VEGF в крови все чаще рассматривается как биомаркер при различных патологических состояниях человека, что делает актуальным создание систем количественной детекции VEGF, для чего необходимо наличие референсного стандарта этого фактора роста [47].The aim of the present invention is to expand the collection of unique cell strains that can be used to obtain human VEGF protein, isoform A 165. This task is especially relevant for modern pharmacological biotechnology. The VEGF-A165 protein obtained by this strain can be used in many fields of biological and medical research, in particular, in the development and study of drugs and other compounds that are VEGF agonists or antagonists in the field of cellular and tissue engineering. In addition, at present, the level of VEGF in the blood is increasingly regarded as a biomarker for various pathological conditions of a person, which makes it important to create systems for quantitative detection of VEGF, which requires the presence of a reference standard for this growth factor [47].

Поставленная задача решается тем, что получена новая линия клеток CHO[V3D], несущая интегрированную в геном генную конструкцию, представляющую собой модифицированную кДНК VEGF-A165 человека (SEQ ID NO: 1), встроенную в вектор, предназначенный для экспрессии в клетках млекопитающих, и продуцирующих биологически активный рекомбинантный белок VEGF-A165 человека с С-концевым ЗхВЕО-эпитопом, позволяющего проводить одностадийную аффинную очистку белка и его высокочувствительную детекцию с использованием антител против DED-эпитопа, с пост-трансляционными модификациями гликозилирования, в количестве не менее 0.2 мг рекомбинатного белка на 1 л культуральной среды за 72 часа. Полученная клеточная линия обладает стабильными культуральными и морфологическими свойствами и в результате генной модификации обладает способностью секретировать рекомбинантный фактор роста эндотелия сосудов. Линия клеток CHO[V3D] депонирована во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ Н-123.The problem is solved by the fact that a new cell line CHO [V3D] was obtained that carries a gene construct integrated into the genome, which is a modified human VEGF-A165 cDNA (SEQ ID NO: 1), inserted into a vector designed for expression in mammalian cells, and producing a biologically active recombinant human VEGF-A165 protein with a C-terminal 3xBEO epitope allowing one-step affinity purification of the protein and its highly sensitive detection using antibodies against the DED epitope, with post-translational modes fication glycosylation of at least 0.2 mg of recombinant protein per 1 liter of culture medium for 72 hours. The resulting cell line has stable cultural and morphological properties and, as a result of gene modification, has the ability to secrete the recombinant vascular endothelial growth factor. The cell line CHO [V3D] was deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) under registration number VKPM N-123.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

На фиг.1 показан результат анализа культуральных сред немодифицированных клеток линии СНО (-), клеток линии СНО, транзиторно трансфицированных плазмидой pV3D (+), и клеток линий СНО, модифицированных плазмидой pV3D (pV3D), на присутствие в них белка VEGF-A165-3×DED человека. Монослойные культуры клеток инкубировали с бессывороточной культуральной средой в течение 48 часов, после чего аликовоты кондиционной среды разделяли в 12.5% ДСН-ПААГ в редуцирующих условиях. Приведены результаты Вестерн-блот анализа с антителами против DED-эпитопа. Линия клеток CHO[V3D] отмечена звездочкой (*) (А). Аналогичным образом приготовленные образцы культуральной среды клеток линии СНО и CHO[V3D] также разделяли в 12.5% ДСН-ПААГ в нередуцирующих условиях и параллельно проводили детекцию белков с антителами против DED-эпитопа (анти-DED) и с анти-VEGF антителами (Sigma, США, кат. №V-6621) (анти-VEGF). Стрелка указывает на положение в геле рекомбинантного белка VEGF-A165-3×DED человека, мигрирующего в ДСН-ПААГ как гомодимер в нередуцирующих условиях. Слева приведены положения полос маркера молекулярного веса (Bio-Rad, США, Prescision Plus Protein™ Standard) в килодальтонах (кДа) (Б).Figure 1 shows the result of the analysis of culture media of unmodified CHO (-) cells, CHO cells transiently transfected with pV3D (+), and CHO cells modified with pV3D (pV3D) plasmid for the presence of VEGF-A165- protein in them 3 × DED person. Monolayer cell cultures were incubated with serum-free culture medium for 48 hours, after which aliquots of the conditioned medium were separated in 12.5% SDS-PAGE under reducing conditions. The results of Western blot analysis with antibodies against the DED epitope are presented. The CHO [V3D] cell line is marked with an asterisk (*) (A). Similarly, prepared samples of the culture medium of CHO and CHO [V3D] cells were also separated in 12.5% SDS-PAGE under non-reducing conditions and, in parallel, proteins were detected with antibodies against the DED epitope (anti-DED) and with anti-VEGF antibodies (Sigma, United States Cat. No. V-6621) (anti-VEGF). The arrow indicates the position in the gel of the recombinant VEGF-A165-3 × DED protein of a person migrating to SDS-PAGE as a homodimer under non-reducing conditions. On the left are the positions of the molecular weight marker bands (Bio-Rad, USA, Prescision Plus Protein ™ Standard) in kilodaltons (kDa) (B).

На фиг.2 показан результат оценки количества белка VEGF-A165-3×DED в культуральной среде клеток CHO[V3D]. Белки, очищенные с помощью иммобилизованных на твердом носителе антител против DED-эпитопа из 500 мкл быссывороточной культуральной среды, инкубированной с монослойной культурой клеток CHO[V3D] или СНО в течение 72 часов, разделяли в 12% ДСН-ПААГ в редуцирующих условиях. Приведены результаты окраски геля красителем Кумасси R-250. Стрелка указывает на положение в геле рекомбинантного белка VEGF-A165-3×DED человека. Слева приведены положения полос маркера молекулярного веса (Bio-Rad, США, Prescision Plus Protein™ Standard) в килодальтонах (кДа).Figure 2 shows the result of evaluating the amount of VEGF-A165-3 × DED protein in the culture medium of CHO cells [V3D]. Proteins purified by solid-vehicle immobilized anti-DED epitope antibodies from 500 μl of serum-free culture medium incubated with a monolayer culture of CHO [V3D] or CHO cells for 72 hours were separated in 12% SDS-PAGE under reducing conditions. The results of gel staining with Coomassie R-250 dye are presented. The arrow indicates the position in the gel of the recombinant human VEGF-A165-3 × DED protein. On the left are the positions of the molecular weight marker bands (Bio-Rad, USA, Prescision Plus Protein ™ Standard) in kilodaltons (kDa).

На фиг.3 показан результат очистки рекомбинантного белка VEGF-A165-3×DED из культуральной среды клеток линии CHO[V3D]. Аликвоты очищенного рекомбинантного белка VEGF-A165-3×DED в указанных количествах человека разделяли в 10% ДСН-ПААГ в нередуцирующих условиях с последующим окрашиванием геля красителем Bio-Safe™ Coomassie (Bio-Rad). Для оценки молекулярной массы белков использовали маркер молекулярной массы (MW) Prescision Plus Protein™ Standard (Bio-Rad, США). Размеры полос маркера молекулярного веса приведены справа в килодальтонах. Слева показан денситометрический профиль дорожки геля с разделенными 5 мкг рекомбинантного белка VEGF-A165-3×DED.Figure 3 shows the result of purification of the recombinant protein VEGF-A165-3 × DED from the culture medium of the cells of the CHO line [V3D]. Aliquots of purified recombinant VEGF-A165-3 × DED protein in the indicated amounts of man were separated in 10% SDS-PAGE under non-reducing conditions, followed by gel staining with Bio-Safe ™ Coomassie (Bio-Rad). The molecular weight marker (MW) of Prescision Plus Protein ™ Standard (Bio-Rad, USA) was used to assess the molecular weight of proteins. The sizes of the molecular weight marker bands are shown on the right in kilodaltons. On the left is the densitometric profile of a gel track with 5 μg of recombinant VEGF-A165-3 × DED protein separated.

На фиг.4 приведены результаты анализа биологической активности очищенного рекомбинантного белка VEGF-A165-3×DED человека, продуцируемого клетками линии CHO[V3D], основанного на способности VEGF-A165 поддерживать пролиферацию клеток эндотелия HUVEC. Клетки HUVEC рассевали в лунки 96-луночного планшета (2000 клеток на лунку) в базальной среде для роста эндотелиальных клеток ЕВМ-2 (Lonza, США) с 2% фетальной бычьей сывороткой. После прикрепления клеток (через 4 часа) добавляли белок VEGF-A165-3×DED до указанных конечных концентраций. Пролиферацию клеток определяли через 96 часов с помощью набора CellTiter Glo™ Luminescent Cell Viability Assay (Promega, США). Данные представлены в виде графика зависимости люминесценции в относительных единицах, пропорциональной количеству клеток, как среднее значение для трех независимых лунок±стандартное отклонение, от концентрации рекомбинантного белка VEGF-A165-3×DED в среде.Figure 4 shows the results of the analysis of the biological activity of purified recombinant human VEGF-A165-3 × DED protein produced by CHO [V3D] cells, based on the ability of VEGF-A165 to support HUVEC endothelial cell proliferation. HUVEC cells were scattered into the wells of a 96-well plate (2000 cells per well) in a basal medium for the growth of EBM-2 endothelial cells (Lonza, USA) with 2% fetal bovine serum. After cell attachment (after 4 hours), VEGF-A165-3 × DED protein was added to the indicated final concentrations. Cell proliferation was determined after 96 hours using the CellTiter Glo ™ Luminescent Cell Viability Assay kit (Promega, USA). The data are presented as a graph of the dependence of luminescence in relative units, proportional to the number of cells, as the average of three independent wells ± standard deviation from the concentration of the recombinant protein VEGF-A165-3 × DED in the medium.

Примеры осуществления настоящего изобретенияExamples of the implementation of the present invention

Пример 1. Получение кДНК VEGF-A165 человека, встроенной в вектор, предназначенный для экспрессии в клетках млекопитающих (плазмида pVEGF-A165-3×DED)Example 1. Obtaining human VEGF-A165 cDNA inserted into a vector intended for expression in mammalian cells (plasmid pVEGF-A165-3 × DED)

Для получения фрагмента кДНК VEGF-A165 человека использовали полимеразную цепную реакцию с последующим клонированием амплифицированного фрагмента в плазмидный вектор с использованием методов и подходов, хорошо известных специалистам в этой области. кДНК VEGF человека амплифицировали с использованием в качестве матрицы первых цепей кДНК из плаценты человека. Праймеры подбирали таким образом, чтобы амплифицируемый фрагмент кДНК VEGF-A165 содержал полную открытую рамку считывания, кодирующую сигнальный пептид и зрелый полипептид, и последовательности инициации и терминации трансляции. Продукт амплификации использовался в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции с праймерами [5'-AGC TGA АТТ CGG GCC ТСС GAA АСС-3'] и [5'-ТАА ТСТ AGA CCG CCT CGG СТТ GTC АСА Т-3'] для (1) введения сайта узнавания рестрикционной эндонуклеазы EcoRI на 5'-конце фрагмента, (2) замены кодона терминации трансляции TGA на нетерминирующий кодон ТСТ, и (3) введения сайта узнавания рестрикционной эндонуклеазы Xbal на 3'-конце фрагмента. Амплифицированный фрагмент расщепляли с использованием рестрикционных эндонуклеаз EcoRI и XbaI и клонировали в вектор, полностью идентичный описанному ранее вектору pB1-DED («Пептид DED и его применение для идентификации и/или очистки рекомбинантных белков, вектор pDED», патент на изобретение №2380373), но содержащий вместо последовательности, кодирующей один DED-эпитоп, последовательность, кодирующую 3 DED-эпитопа в одной открытой рамке считывания. Полученный в результате клонирования фрагмент ДНК, кодирующий белок VEGF-A165 с 3×DЕD-эпитопом, вырезали с помощью рестрикционных эндонуклеаз EcoRI и NotI и клонировали в вектор, предназначенный для экспрессии в клетках млекопитающих, для получения плазмиды pV3D. Это помещает амплифицированный фрагмент ДНК, кодирующий белок VEGF-A165 человека с 3×DЕD-эпитопом, между конститутивным промотором и сигналом терминации транскрипции и полиаденилирования в использованном векторе для экспрессии в клетках млекопитающих таким образом, что 5'-конец фрагмента следует за промотором, а 3'-конец предшествует сигналу терминации транскрипции и полиаденилирования. Нуклеотидная последовательность фрагмента, кодирующего белок VEGF-A165 человека с 3×DED-эпитопом, клонированная в вектор для экспрессии в клетках млекопитающих, была определена и полностью идентична известной последовательности соответствующего фрагмента кДНК VEGF-A165 человека от 5'-конца фрагмента до последней аминокислоты белка VEGF-A165 человека включительно, доступной в базе данных нуклеотидный последовательностей GeneBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) под номером NM_001171626, с находящимся далее за ней в одной открытой рамке считывания последовательности, кодирующей 3×DЕD-эпитоп, предшетвующей кодону терминации трансляции. Помимо вышеописанных структурных элементов, вектор для экспрессии в клетках млекопитающих (а также его производная - плазмида pV3D) также содержит селективный маркер (кДНК неомицин-фосфотрансферазы II), позволяющий проводить селекцию в клетках E.coli в присутствии канамицина при проведении процедуры клонирования, а также в клетках млекопитающих в присутствии генетицина (антибиотик G418) при получении клонов клеток линии СНО, продуцирующих белок VEGF-A165-3×DED человека.To obtain a human VEGF-A165 cDNA fragment, a polymerase chain reaction was used, followed by cloning of the amplified fragment into a plasmid vector using methods and approaches well known to those skilled in the art. Human VEGF cDNAs were amplified using first strands of human placenta cDNA as a template. The primers were selected so that the amplified VEGF-A165 cDNA fragment contained a complete open reading frame encoding a signal peptide and a mature polypeptide, and translation initiation and termination sequences. The amplification product was used as a template in the polymerase chain reaction with primers [5'-AGC TGA ATT CGG GCC TCC GAA ACC-3 '] and [5'-TAA TST AGA CCG CCT CGG CTT GTC ACA T-3'] for (1 ) introducing an EcoRI restriction endonuclease recognition site at the 5'-end of the fragment, (2) replacing the TGA translation termination codon with a non-terminating TST codon, and (3) introducing an Xbal restriction endonuclease recognition site at the 3'-end of the fragment. The amplified fragment was digested using restriction endonucleases EcoRI and XbaI and cloned into a vector completely identical to the previously described vector pB1-DED ("DED peptide and its use for identification and / or purification of recombinant proteins, pDED vector", patent for invention No. 2380373), but containing instead of a sequence encoding one DED epitope, a sequence encoding 3 DED epitopes in one open reading frame. The cloned DNA fragment encoding a VEGF-A165 protein with a 3 × DED epitope was cut using restriction endonucleases EcoRI and NotI and cloned into a vector for expression in mammalian cells to obtain plasmid pV3D. This places the amplified DNA fragment encoding a human VEGF-A165 protein with a 3 × DED epitope between the constitutive promoter and the transcription and polyadenylation termination signal in the vector used for expression in mammalian cells so that the 5 ′ end of the fragment follows the promoter and The 3'-end is preceded by a transcription termination and polyadenylation signal. The nucleotide sequence of a fragment encoding a human VEGF-A165 protein with a 3 × DED epitope cloned into a vector for expression in mammalian cells was determined and completely identical to the known sequence of the corresponding human VEGF-A165 cDNA fragment from the 5'-end of the fragment to the last amino acid of the protein Human VEGF-A165, available in the GeneBank database of nucleotide sequences (www.ncbi.nlm.nih.gov) under the number NM_001171626, which is located next to it in one open reading frame of the sequence encoding 3 × DED epitope preceding the translation termination codon. In addition to the structural elements described above, the vector for expression in mammalian cells (as well as its derivative, plasmid pV3D) also contains a selective marker (neomycin phosphotransferase II cDNA) that allows selection in E. coli cells in the presence of kanamycin during the cloning procedure, as well as in mammalian cells in the presence of geneticin (antibiotic G418) upon receipt of clones of CHO cell lines producing human VEGF-A165-3 × DED protein.

Пример 2. Получение генно-модифицированных клеток линии СНО, секретирующих белок VEGF-A165-3×DED человекаExample 2. Obtaining gene-modified cells of the SNO line secreting human VEGF-A165-3 × DED protein

Для получения клонов клеток, продуцирующих рекомбинантный белок VEGF-A165-3×DED, кодируемый плазмидой pV3D, клетки линии СНО трансфицировали плазмидой pV3D и проводили отбор клонов клеток со стабильной интеграцией в геном плазмиды pV3D на основании их устойчивости к антибиотику G418.To obtain clones of cells producing the recombinant VEGF-A165-3 × DED protein encoded by the pV3D plasmid, CHO cells were transfected with the pV3D plasmid and cell clones were selected with stable integration into the pV3D plasmid genome based on their resistance to the G418 antibiotic.

Клетки линии СНО трансфицировали плазмидой pV3D с использованием реагента для трансфекции Unifetin-56 (UnifectGroup, Москва). Селекцию клонов проводили в полутвердой ростовой среде (среда DMEM/F12 (1:1) с 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина), содержащей 600 мкг/мл антибиотика G418, ClonMatrix (Genetix, Великобритания) и флуоресцентно меченные антитела против DED-эпитопа. После формирования резистентными клетками колоний проводился анализ продукции рекомбинантного белка на основании его взаимодействия с меченными антителами против DED-эпитопа с использованием роботизированного комплекса ClonePixFL (Genetix, Великобритания). Колонии клеток с максимальной экспрессией рекомбинантного белка переносили в 96-луночный планшет с помощью функции, реализованной в роботизированном комплексе ClonePixFL. После формирования клетками монослоя их переносили в 24-луночный планшет. После формирования монослоя в нем клетки рассевали в 6-луночный планшет для последующей заморозки и в лунку 24 луночного планшета для проведения анализа секреции белка VEGF-A165-3×DED в культуральную среду.CHO cells were transfected with pV3D plasmid using the Unifetin-56 transfection reagent (UnifectGroup, Moscow). Clones were selected in semisolid growth medium (DMEM / F12 medium (1: 1) with 10% fetal bovine serum, 100 units / ml penicillin and 100 μg / ml streptomycin) containing 600 μg / ml G418 antibiotic, ClonMatrix (Genetix, UK) and fluorescently labeled antibodies against the DED epitope. After the formation of colonies by resistant cells, a recombinant protein production was analyzed based on its interaction with labeled antibodies against the DED epitope using the ClonePixFL robotic complex (Genetix, UK). Colonies of cells with maximum expression of the recombinant protein were transferred to a 96-well plate using the function implemented in the ClonePixFL robotic complex. After the cells formed a monolayer, they were transferred to a 24-well plate. After the formation of a monolayer in it, the cells were scattered into a 6-well plate for subsequent freezing and into the well of a 24-well plate to analyze the secretion of VEGF-A165-3 × DED protein in the culture medium.

Пример 3. Анализ продукции рекомбинантного белка VEGF-A165-3×DED человека клонами клеток линии СНО, трансфицированных плазмидой pV3DExample 3. Analysis of the production of recombinant protein VEGF-A165-3 × DED human clones of cells of the Cho line transfected with plasmid pV3D

После достижения отобранными клонами клеток линии СНО, трансфицированных плазмидой pV3D, конфлюентности в лунках 24-луночного планшета, лунки промывали 1 мл ростовой среды без сыворотки и добавляли 1 мл той же среды. Среду собирали через 48 часов инкубации для анализа содержания рекомбинантного белка VEGF-A165-3×DED в ней. Для проведения анализа аликвоты культуральной среды, смешанные с 6-кратным буфером для нанесения на ДСН-ПААГ, разделяли в 12.5% ДСН-ПААГ и проводили Вестерн-блот анализ с использованием антител против DED-эпитопа. Для детекции иммобилизованных на мембране вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, использовали субстрат ECL+(GE Healthcare). В качестве контролей использовали процессированные кондиционные среды нетрансфицированных клеток лини СНО (отрицательный контроль) и клеток линии СНО, транзиторно трансфицированных плазмидой pV3D с помощью реагента для трансфекции Unifectin-56 (положительный контроль). По результатам Вестерн-блот анализа из полученных клонов клеток линии СНО, модифицированных плазмидой pV3D, был отобран клон, продуцирующий максимальное количество рекомбинантного белка VEGF-A165-3×DED в культуральную среду (линия CHO[V3D]). Рекомбинантный белок VEGF-A165-3×DED, секретируемый клетками линии СНО, модифицированных плазмидой pV3D, детектировался как белок с молекулярным весом немного более 25 кДа (фигура 1А). Это незначительно больше, чем ранее описанная подвижность белка VEGF-A165 человека, что определяется присутствием 3×DED-3nHTona.After the selected clones of the CHO cell line transfected with the pV3D plasmid reached confluency in the wells of the 24-well plate, the wells were washed with 1 ml of growth medium without serum and 1 ml of the same medium was added. The medium was collected after 48 hours of incubation to analyze the content of the recombinant protein VEGF-A165-3 × DED in it. For analysis, aliquots of the culture medium mixed with 6-fold buffer for application on SDS-PAGE were separated in 12.5% SDS-PAGE and Western blot analysis was performed using antibodies against the DED epitope. ECL + substrate (GE Healthcare) was used to detect secondary antibody immobilized on the membrane conjugated to horseradish peroxidase. Processed conditioned media of non-transfected CHO line cells (negative control) and CHO line cells transiently transfected with pV3D plasmid using the Unifectin-56 transfection reagent (positive control) were used as controls. According to the results of Western blot analysis, from the obtained CHO cell line clones modified with pV3D plasmid, a clone was selected that produced the maximum amount of recombinant VEGF-A165-3 × DED protein in the culture medium (CHO line [V3D]). The recombinant VEGF-A165-3 × DED protein secreted by CHO cells modified with plasmid pV3D was detected as a protein with a molecular weight of slightly more than 25 kDa (Figure 1A). This is slightly larger than the previously described mobility of the human VEGF-A165 protein, which is determined by the presence of 3 × DED-3nHTona.

Для подтверждения присутствия полипептида VEGF-A165 человека в составе рекомбинантного белка VEGF-A165-3×DED, аналогичный описанному выше эксперимент был проведен с детекцией белков при Вестерн блоттинге с антителами против белка VEGF-A165. Аликвоты культуральной среды разделялись в нередуцирующих условиях, поскольку в этом случае выше чувствиетельность детекции использованных антител против белка VEGF-A165 человека. Поскольку физиологически активная форма белка VEGF-A165-3×DED представляет собой гомодимер, формируемый за счет образования дисульфидных связей, в нередуцирующих условиях физиологически активный белок VEGF-A165 мигрирует в геле в виде димера с подвижностью около 50 кДа. Как видно на фигуре 1Б, антитела против белка VEGF-A165 узнают белок с той же подвижностью, что и детектируемый антителами против DED-эпитопа, в кондиционной среде клеток CHO[V3D], но не в кондиционной среде немодифицированных клеток линии СНО.To confirm the presence of the human VEGF-A165 polypeptide in the recombinant VEGF-A165-3 × DED protein, a similar experiment was performed above with the detection of proteins during Western blotting with antibodies against the VEGF-A165 protein. Aliquots of the culture medium were separated under non-reducing conditions, since in this case the detection sensitivity of the used antibodies against human VEGF-A165 protein is higher. Since the physiologically active form of the VEGF-A165-3 × DED protein is a homodimer formed by the formation of disulfide bonds, under non-reducing conditions, the physiologically active VEGF-A165 protein migrates in the gel as a dimer with a mobility of about 50 kDa. As can be seen in FIG. 1B, antibodies against the VEGF-A165 protein recognize a protein with the same mobility as detected by antibodies against the DED epitope in the conditioned medium of CHO [V3D] cells, but not in the conditioned medium of unmodified CHO cell line.

Пример 4. Оценка концентрации рекомбинантного белка VEGF-A165-3×DED в культуральной среде клеток линии CHO[pV3D]Example 4. Evaluation of the concentration of recombinant protein VEGF-A165-3 × DED in the culture medium of the cell line CHO [pV3D]

Клетки линии CHO[V3D] выращивали в 100 мм культуральных чашках до конфлюентности, после чего культуральную среду заменяли на свежую культуральную среду без добавления сыворотки (10 мл на чашку) и инкубировали в течение 72 часов. Собранную культуральную среду использовали для определения концентрации рекомбинантного белка VEGF-A165-3×DED.CHO [V3D] cells were grown in 100 mm culture dishes until confluent, after which the culture medium was replaced with fresh culture medium without serum (10 ml per dish) and incubated for 72 hours. The collected culture medium was used to determine the concentration of the recombinant protein VEGF-A165-3 × DED.

Концентрацию рекомбинатного белка VEGF-A165-3×DED оценивали по интенсивности окрашивания очищенного с помощью аффинной хроматографии за 3×DED эпитоп белка VEGF-A165-3×DED после разделения и окраски белков в геле красителем Кумасси R-250. Два мл культуральной среды с белком VEGF-A165-3×DED, приготовленной как описано в примере 4, инкубировали с 50 мкл носителя (Сефароза 4 В) с ковалентно иммобилизованными антителами, узнающими DED-эпитоп (7 мг на 1 мл носителя) при температуре 4°С в течение 3 часов. Носитель промывали 3 раза фосфатно-солевым буфером, и связавшиеся с носителем белки элюировали путем добавления 40 мкл буфера для нанесения на ДСН-ПААГ с последующим кипячением в течение 7 мин. Параллельно аналогичные манипуляции проводили с приготовленной с использованием немодифицированных клеток линии СНО культуральной средой. Десять мкл элюата (что соответствует очистке белков с DED-эпитопами из 500 мкл культуральной среды) разделяли в 12% ДСН-ПААГ в редуцирующих условиях и белки в геле окрашивали красителем Кумасси R-250. Как видно на фигуре 2, в элюате при очистке из культуральной среды клеток линии CHO[V3D], но не из культуральной среды немодифициорованных клеток линии СНО, детектируется белок с подвижностью около 27 кДа, соответствующей подвижности рекомбинантного белка VEGF-A165-3×DED. Поскольку предел детекции количества белков в геле после окраски красителем Кумасси составляет 100 нг, можно заключить, что в дорожке геля присутствует не менее 100 нг рекомбинантного белка VEGF-A165-3×DED. Поскольку это соответствует белку, находящемуся в 500 мкл культуральной среды, то количество рекомбинантного белка VEGF-A165-3×DED в 1 мл среды составляет не менее 0.2 мкг/мл, или не менее 0.2 мг/л.The concentration of the VEGF-A165-3 × DED recombinant protein was evaluated by the intensity of the staining of the purified by affinity chromatography for 3 × DED epitope of the VEGF-A165-3 × DED protein after separation and staining of the proteins in gel with Coomassie R-250 stain. Two ml of culture medium with VEGF-A165-3 × DED protein prepared as described in Example 4 was incubated with 50 μl of vehicle (Sepharose 4B) with covalently immobilized antibodies recognizing the DED epitope (7 mg per 1 ml of vehicle) at a temperature 4 ° C for 3 hours. The carrier was washed 3 times with phosphate-buffered saline, and the proteins bound to the carrier were eluted by adding 40 μl of the buffer for application on SDS-PAGE, followed by boiling for 7 min. In parallel, similar manipulations were carried out with the culture medium prepared using unmodified CHO cell lines. Ten μl of the eluate (which corresponds to the purification of proteins with DED epitopes from 500 μl of culture medium) was separated in 12% SDS-PAGE under reducing conditions and the proteins were gel stained with Coomassie R-250 stain. As can be seen in figure 2, in the eluate when cleaning from the culture medium of CHO [V3D] cells, but not from the culture medium of unmodified CHO cells, a protein with a mobility of about 27 kDa corresponding to the mobility of the recombinant VEGF-A165-3 × DED protein is detected. Since the detection limit of the amount of proteins in the gel after staining with Coomassie dye is 100 ng, it can be concluded that at least 100 ng of the recombinant VEGF-A165-3 × DED protein is present in the gel track. Since this corresponds to a protein in 500 μl of culture medium, the amount of recombinant VEGF-A165-3 × DED protein in 1 ml of medium is at least 0.2 μg / ml, or at least 0.2 mg / L.

Пример 5. Наработка среды культуры клеток линии CHO[V3D]Example 5. The accumulation of the culture medium of the cell line CHO [V3D]

Клетки линии CHO[V3D] растили в роллерах. В процессе и после достижения культурой клеток линии CHO[V3D] в роллерах монослойного состояния культуральная среда при ее замене собиралась следующим образом. После отбора среды из роллеров среда центрифугировалась в течение 5 мин при 1000 об/мин для осаждения возможно присутствующих в ней открепившихся клеток. Надосадок после центрифугирования переносился в чистую емкость и хранился замороженным при -20°С. В результате последовательной смены среды после достижения культурой монослоя в роллере было получено 2.6 литра культуральной среды клеток линии CHO[V3D] (объем культуральной среды в роллере - 250-300 мл в зависимости от срока инкубации до замены среды; смена среды раз в 2-3 дня) (с учетом собранной среды в процессе наращивания клеток для засева их в роллер и достижения монослойного состояния культурой в роллере).Cells of the CHO [V3D] line were grown in scooters. During and after the culture reaches the CHO [V3D] cell line in monolayer rollers, the culture medium was collected as follows when it was replaced. After selection of the medium from the rollers, the medium was centrifuged for 5 min at 1000 rpm to precipitate the detached cells possibly present in it. After centrifugation, the supernatant was transferred to a clean container and stored frozen at -20 ° C. As a result of the successive change of the medium after the culture reaches the monolayer in the scooter, 2.6 liters of the culture medium of the CHO [V3D] cell line were obtained (the volume of the culture medium in the scooter is 250-300 ml depending on the incubation period before changing the medium; medium change every 2-3 times days) (taking into account the collected medium in the process of cell growth for seeding them in a roller and achieving a monolayer state in a culture in a roller).

6. Очистка белка VEGF-A165-3×DED из культуральной среды клеток линии CHO[V3D]6. Purification of VEGF-A165-3 × DED Protein from the Culture Medium of CHO Cells [V3D]

Наработанная культуральная среда клеток линии CHO[V3D], содержащая белок VEGF-A165-3×DED, использовлась для очистки рекомбинантного белка VEGF-A165-3×DED.The accumulated culture medium of the CHO [V3D] cell line containing the VEGF-A165-3 × DED protein was used to purify the recombinant VEGF-A165-3 × DED protein.

Очистку белка VEGF-A165-3×DED из культуральной среды клеток линии CHO[V3D] проводили с помощью аффинной хроматографии. Культуральную среду фильтровали через фильтр с диаметром пор 0.2 мкм. Жидкость обезгаживали 20 мин под вакуумом и наносили на колонку, содержащую твердый носитель с ковалентно иммобилизованным на нем реагентом, аффинно связывающим белок VEGF-A165-3×DED (антитела, узнающие DED-эпитоп), при скорости потока 1 мл/мин. После нанесения среды колонку промывали фосфатно-солевым буфером, фосфатно-солевым буфером, содержащим 1 М хлористого натрия, и опять фосфатно-солевым буфером до достижения базового уровня поглощения при 280 нм. Контроль оптической плотности производили проточным денситометром. Элюцию белка VEGF-A165-3×DED производили 0.1 М раствором лимонной кислоты рН 2.2 до начала падения оптической плотности. После элюции 0.1 М цитратным буфером с рН 2.2 раствор белка был немедленно защелочен с использованием 1 M NaOH до конечного рН 7.5, к раствору белка был добавлен 5М раствор хлорида натрия до его конечной концентрации 150 мМ, а также детергент Твин20 до 0.1%. После этого препарат белка был диализован против буфера с составом 20 мМ фосфат натрия, рН 7.0, ×00 мМ хлорид натрия, 0.02% Твин 20. Полученный белок был стерилизован фильтрацией и хранился при температуре 4°С. Чистоту полученного препарата рекомбинантного белка контролировали по окраске разделенного препарата рекомбинантного белка в ДСН-ПААГ в нередуцирующих условиях. Как видно из фигуры 3, окраска 5 мкг препарата очищенного рекомбинантного белка VEGF-A165-3×DED выявила отсутствие посторонних белковых полос помимо полосы с преимущественной подвижностью около 50 кДа, соответствующей белку VEGF-A165-3×DED. Денситометрический анализ изображения геля с помощью программы Quantity One (BioRad, США) показал, что чистота полученного препарата составляет около 96% (фигура 3). Концентрацию белка VEGF-A165-3×DED определяли спектрофотометрически по поглощению при длине волны 280 нм, принимая расчетный коэффициент экстинкции на основании содержания остатков цистина и тирозина (определен с помощью программы ProtParam, ExPASy Proteomics Server, www.expasy.ch [48]).Purification of the VEGF-A165-3 × DED protein from the culture medium of the CHO [V3D] cell line was performed using affinity chromatography. The culture medium was filtered through a filter with a pore diameter of 0.2 μm. The liquid was degassed for 20 min under vacuum and applied to a column containing a solid support with a covalently immobilized reagent affinity for binding to VEGF-A165-3 × DED protein (antibodies recognizing the DED epitope) at a flow rate of 1 ml / min. After application of the medium, the column was washed with phosphate-buffered saline, phosphate-buffered saline containing 1 M sodium chloride, and again phosphate-buffered saline until the baseline absorbance was reached at 280 nm. The optical density was controlled by a flow densitometer. VEGF-A165-3 × DED protein was eluted with a 0.1 M citric acid solution, pH 2.2, before the optical density started to drop. After elution with 0.1 M citrate buffer at pH 2.2, the protein solution was immediately alkalized using 1 M NaOH to a final pH of 7.5, a 5M sodium chloride solution was added to the protein solution to a final concentration of 150 mM, as well as Tween20 detergent to 0.1%. After this, the protein preparation was dialyzed against a buffer with a composition of 20 mM sodium phosphate, pH 7.0, × 00 mM sodium chloride, 0.02% Tween 20. The resulting protein was sterilized by filtration and stored at 4 ° C. The purity of the obtained recombinant protein preparation was controlled by the color of the separated recombinant protein preparation in SDS-PAGE under non-reducing conditions. As can be seen from figure 3, the color of 5 μg of the preparation of purified recombinant VEGF-A165-3 × DED protein revealed the absence of extraneous protein bands in addition to the band with a preferential mobility of about 50 kDa corresponding to the VEGF-A165-3 × DED protein. Densitometric analysis of the gel image using the Quantity One program (BioRad, USA) showed that the purity of the obtained preparation was about 96% (figure 3). The concentration of VEGF-A165-3 × DED protein was determined spectrophotometrically by absorbance at a wavelength of 280 nm, taking the calculated extinction coefficient based on the content of cystine and tyrosine residues (determined using the ProtParam program, ExPASy Proteomics Server, www.expasy.ch [48]) .

Пример 7. Определения биологической активности очищенного белка VEGF-A165-3×DED.Example 7. Determination of the biological activity of the purified protein VEGF-A165-3 × DED.

Биологическую активность очищенного белка VEGF-A165-3×DED определяли по его способности поддерживать пролиферацию клеток эндотелия человека HUVEC. Эндотелиальные клетки HUVEC засевались в лунки 96-луночного планшета (2000 клеток/лунка) в базальной среде для роста эндотелиалных клеток ЕВМ-2 (Lonza). После прикрепления клеток (через 4 часа) добавляли белок VEGF-A165-3×DED до концентрации от 1 до 50 нг/мл. Количество клеток определяли через 96 часов. Видно (фигура 4), что полученный препарат белка VEGF-A165-3×DED способен доза-зависимо поддерживать пролиферацию клеток эндотелия.The biological activity of the purified VEGF-A165-3 × DED protein was determined by its ability to support the proliferation of HUVEC human endothelial cells. HUVEC endothelial cells were seeded into wells of a 96-well plate (2000 cells / well) in basal medium for the growth of EBM-2 endothelial cells (Lonza). After cell attachment (after 4 hours), VEGF-A165-3 × DED protein was added to a concentration of 1 to 50 ng / ml. The number of cells was determined after 96 hours. It is seen (figure 4) that the obtained protein preparation VEGF-A165-3 × DED is capable of dose-dependently supporting the proliferation of endothelial cells.

Основные характеристики клеток линии CHO[V3D] The main characteristics of CHO cell line [V3D]

Родословная клеточной линии:Cell lineage lineage:

Линия клеток CHO[V3D] получена из клеток линии CHOtk' путем трансформации их плазмидой pVEGF-A165-3×DED для продукции фактора роста эндотелия сосудов человека, изоформа А165, с 3×DЕD-эпитопом на С-конце полипептиной цепи рекомбинантного белка, и содержащей ген устойчивости к антибиотику G418. Клетки CHOtk' представляют собой клон клеток яичника китайского хомячка (СНО), дефектных по гену тимидинкиназы. Штамм депонирован в Российской коллекции культур клеток позвоночных (ИНЦ РАН) под номером 161Д, депозитор Институт Биомедицинских технологий Научный центр РАМН.The CHO [V3D] cell line was obtained from CHOtk 'cells by transforming them with the plasmid pVEGF-A165-3 × DED to produce human vascular endothelial growth factor, isoform A165, with the 3 × DED epitope at the C-terminus of the recombinant protein polypeptide chain, and containing the antibiotic resistance gene G418. CHOtk 'cells are a clone of Chinese hamster ovary (CHO) cells defective in the thymidine kinase gene. The strain was deposited in the Russian collection of vertebrate cell cultures (INC RAS) under number 161Д, depositor Institute of Biomedical Technologies Research Center of the Russian Academy of Medical Sciences.

Число пассажей:Passages:

К моменту составления паспорта клеточная линия прошла 10 пассажей.By the time the passport was drawn up, the cell line had passed 10 passages.

Стандартные условия культивирования:Standard cultivation conditions:

Питательная среда DMEM/F12 (1:1) (90%), фетальная бычья сыворотка 10%, содержащая антибиотики (пенициллин со стрептомицином в концентрации 100 ед/мл и 100 мкг/мл соответственно и G418 в концентрации 400 мкг/мл). Культивирование при 37^оС и 5% СО₂. Кратность рассева 1:4-1:15, оптимальная плотность 10000-20000 клеток/см². Метод снятия: 0.25% раствор трипсина и 0.02% раствор версена в соотношении 1:1.Nutrient medium DMEM / F12 (1: 1) (90%), 10% fetal bovine serum containing antibiotics (penicillin with streptomycin at a concentration of 100 u / ml and 100 μg / ml, respectively, and G418 at a concentration of 400 μg / ml). Culturing at ³⁷ ° C and 5% CO _2. The multiplicity of sieving 1: 4-1: 15, the optimal density of 10000-20000 cells / cm ² . Removal method: 0.25% trypsin solution and 0.02% solution versen in a 1: 1 ratio.

Культуральные свойства:Cultural properties:

Пассаж 1 раз в 3-4 суток. Клетки имеют преимущественно адгезионный, преимущественно монослойный характер роста в стандартных условиях культивации.Passage once every 3-4 days. Cells have a predominantly adhesive, predominantly monolayer growth pattern under standard cultivation conditions.

Маркерные признаки:Marker signs:

Секреция фактора роста эндотелия сосудов человека, изоформа А165 в количестве не менее 0.2 мг на 1 л среды за 48 часов при 1 мл ростовой среды на 5 см² монослойной культуры. Устойчивость к антибиотику G418 (минимум до 600 мкг/мл).The secretion of human vascular endothelial growth factor, isoform A165 in an amount of at least 0.2 mg per 1 liter of medium for 48 hours with 1 ml of growth medium per 5 cm ^{2 of} monolayer culture. Resistance to antibiotic G418 (at least 600 mcg / ml).

Контаминация:Contamination:

Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении. Тест на микоплазму отрицателенBacteria and fungi in the culture were not detected during prolonged observation. Mycoplasma test negative

Условия криоконсервации:Cryopreservation conditions:

Среда для замораживания: 80% ростовая среда, 10% эмбриональная телячья сыворотка, 10%DMSO, 1.0-2.0×10⁶ клеток/мл в ампуле.Freezing medium: 80% growth medium, 10% fetal calf serum, 10% DMSO, 1.0-2.0 × 10 ⁶ cells / ml in ampoule.

Хранение в жидком азоте при температуре -196°С.Storage in liquid nitrogen at a temperature of -196 ° C.

Размораживание быстрое, при 37°С. Клетки разводят в 5 мл ростовой среды и осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды, и переносят в культуральный флакон с площадью роста 25 см². Жизнеспособность клеток оценивают по включению трипанового синего. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет не менее 90%.Defrosting is quick at 37 ° C. Cells are diluted in 5 ml of growth medium and precipitated by centrifugation, resuspended in 5 ml of the same medium, and transferred to a culture bottle with a growth area of 25 cm ² . Cell viability is assessed by the inclusion of trypan blue. Cell viability after thawing is at least 90%.

Claims

The CHO [V3D] cell line transformed with pV3D plasmid encoding human vascular endothelial growth factor, isoform A165, with the C-terminal 3xDED epitope (SEQ ID NO: 1), and producing recombinant human VEGF-A165 protein with the C-terminal 3xDED- epitope deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) under registration number VKPM N-123.