RU2490267C2

RU2490267C2 - Method for preparing conjugate of (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-yl)acetaldehyde and 20-hydroxyecdysone and using it as antioxidant agent inhibiting lipid peroxidation process

Info

Publication number: RU2490267C2
Application number: RU2010121965/04A
Authority: RU
Inventors: Виктор Николаевич Одиноков; Римма Гафуровна Савченко; Яна Рустамовна Уразаева; Светлана Разифовна Афонькина; Владимир Николаевич Сыров; Зайнаб Абдурахмановна Хушбактова; Анастасия Викторовна Царук
Original assignee: Учреждение Российской Академии Наук Институт Нефтехимии И Катализа Ран; ИНСТИТУТ ХИМИИ РАСТИТЕЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ им. академика М.С. Юнусова АН РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН
Priority date: 2010-05-28
Filing date: 2010-05-28
Publication date: 2013-08-20
Also published as: RU2010121965A

Abstract

FIELD: medicine, pharmaceutics.

SUBSTANCE: invention refers to organic chemistry and chemistry of natural products, more specifically to a method for preparing a new compound, a 20-hydroxyecdysone derivate conjugated with a short-chain vitamin E analogue, promising for medicine and pharmacology, namely to a method for preparing a 20-hydroxyecdysone conjugate by a reaction thereof with (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-yl)acetaldehyde in ethyl acetate at room temperature in the absence of an acid catalyst (TsOH or phosphonomolybdic acid) for 24 h, debenzylation of the prepared intermediate conjugate in the ethanol solution in the presence of the catalyst Pd-C. The invention also refers to using such compound as an antioxidant agent inhibiting the lipid peroxidation process.

EFFECT: prepared hybride compounds appears to be promising in medicine and pharmacology as the new geroprotective antioxidants.

3 cl, 3 tbl, 3 ex

Description

Изобретение относится к органической химии и химии природных соединений, конкретно, способу получения нового соединения, производного 20-гидроксиэкдизона, конъюгированного с короткоцепочечным аналогом витамина Е, перспективного для медицины и фармакологии.The invention relates to organic chemistry and the chemistry of natural compounds, in particular, to a method for producing a new compound derived from 20-hydroxyecdysone conjugated with a short-chain analogue of vitamin E, promising for medicine and pharmacology.

Экдистероиды - гормоны линьки и метаморфоза насекомых - составляют распространенный и разнообразный класс стероидных соединений в природе. Обнаружение гормонов насекомых во многих растениях, а в некоторых видах до 2-3% от сухой массы, позволило выделять эти соединения для изучения их свойств и проведения химических трансформаций [Ахрем А.А., Ковганко Н.В. Экдистероиды: химия и биологическая активность II Минск: Наука и техника, 1989, 327 с.].Ecdysteroids - the hormones of molting and metamorphosis of insects - make up a widespread and diverse class of steroid compounds in nature. The detection of insect hormones in many plants, and in some species up to 2–3% of dry weight, made it possible to isolate these compounds to study their properties and conduct chemical transformations [Akhrem AA, Kovganko N.V. Ecdysteroids: chemistry and biological activity II Minsk: Science and technology, 1989, 327 pp.].

Установлено, что экдистероиды обладают широким спектром биологических свойств, представляющим практический интерес для медицины, и относятся к малотоксичным соединениям [Сыров В.Н., Хушбактова З.А. Фармакотерапевтический эффект фитоэкдистероидов и неробола при токсическом поражении почек в эксперименте // Эксперим. и клин. фармакол., 2001, №4, с.56-58; Сыров В.Н., Шахмурова Г.А., Хушбактова З.А. Влияние фитоэкдистероидов и бемитила на функциональные, метаболические и иммунобиологические показатели работоспособности в эксперименте. // Эксперим. и клин. фармакол., 2008, №5, с.40-43; Шахмурова Г.А., Сыров В.Н., Хушбактова З.А. Иммуномодулирующая и стресс-протективная активность фитоэкдистероидов экдистерона и туркестерона при иммобилизационном стрессе у мышей. // Химико-фармацевтический журнал, 2010, т.44, №1, с.9-11]. В ряде модельных экспериментов показано, что 20-гидроксиэкдизон (наиболее распространенный и доступный экдистероид) и его производные проявляет выраженные антиоксидантные свойства, сопоставимые с гидрохиноном и бутилгидрокситолуолом [Кузьменко А.И., Морозова Р.П., Николаенко И.А., Донченко Г.В. // Военно-медиц. журнал., 1999, №3, с.35; Володин В.В., Ширшова Т.И., Бурцева С.А., Мельник М.В. // Раст. Ресурсы., 1999, т. 35, №2, с.76; Кузьменко А.И., Морозова Р.П., Николаенко И.А., Донченко Г.В. // Укр. биохим. журнал., 1999, т.71, №2, с.69; Коновалова Н.П., Митрохин Ю.И., Волкова Л.М., Сидоренко Л.И., Тодоров И.Н. // Изв. АН. Сер. биол., 2002, №6, с.650; Кузьменко А.И., Морозова Р.П., Николаенко И.А., Корнилец Г.В., Холодова Ю.Д. // Биохимия, 1997, т.62, №6, с.712]. Описано использование в практической медицине лекарственного средства, разработанного на основе 20-гидроксиэкдизона («экдистен») в качестве препарата коррекции нарушенных метаболических процессов в организме человека при лечении различных заболеваний [Сыров В.Н., Хушбактова ЗА., Комарин А.С. и др. Экспериментально-клиническая оценка эффективности применения экдистена при лечении гепатита // Эксперим. и клин. фармакол., 2004, №5, с.56-59; Сыров В.Н. Фитоэкдистероиды: биологические эффекты в организме высших животных и перспективы использования в медицине. // Эксперим. и клин. фармакол., 2008, №5, с.40-43].It has been established that ecdysteroids have a wide range of biological properties that are of practical interest for medicine and belong to low-toxic compounds [Syrov V.N., Khushbaktova Z.A. Pharmacotherapeutic effect of phytoecdysteroids and nerobol in toxic kidney damage in the experiment // Experiment. and wedge. pharmacol., 2001, No. 4, p. 56-58; Syrov V.N., Shakhmurova G.A., Khushbaktova Z.A. The effect of phytoecdysteroids and bemitil on functional, metabolic and immunobiological performance indicators in the experiment. // Experiment. and wedge. pharmacol., 2008, No. 5, pp. 40-43; Shakhmurova G.A., Syrov V.N., Khushbaktova Z.A. Immunomodulatory and stress-protective activity of phytoecdysteroids ecdysterone and Turkesterone with immobilization stress in mice. // Chemical and Pharmaceutical Journal, 2010, v. 44, No. 1, pp. 9-11]. In a number of model experiments, it was shown that 20-hydroxyecdysone (the most common and affordable ecdysteroid) and its derivatives exhibits pronounced antioxidant properties comparable to hydroquinone and butylhydroxytoluene [Kuzmenko AI, Morozova RP, Nikolayenko IA, Donchenko G.V. // Military Medic. Journal., 1999, No. 3, p. 35; Volodin V.V., Shirshova T.I., Burtseva S.A., Melnik M.V. // Rast. Resources., 1999, v. 35, No. 2, p. 76; Kuzmenko A.I., Morozova R.P., Nikolaenko I.A., Donchenko G.V. // Ukr. biochem. Journal., 1999, vol. 71, No. 2, p. 69; Konovalova N.P., Mitrokhin Yu.I., Volkova L.M., Sidorenko L.I., Todorov I.N. // Izv. AN Ser. Biol., 2002, No. 6, p. 650; Kuzmenko A.I., Morozova R.P., Nikolaenko I.A., Kornilets G.V., Kholodova Yu.D. // Biochemistry, 1997, v. 62, No. 6, p. 712]. The use of a medicine developed on the basis of 20-hydroxyecdysone (“ecdysten”) as a preparation for correcting metabolic disorders in the human body in the treatment of various diseases is described in practical medicine [Syrov V.N., Khushbaktova ZA., Komarin A.S. et al. Experimental and clinical evaluation of the effectiveness of ecdisten in the treatment of hepatitis // Experiment. and wedge. pharmacol., 2004, No. 5, p. 56-59; Syrov V.N. Phytoecdysteroids: biological effects in the body of higher animals and prospects for use in medicine. // Experiment. and wedge. pharmacol., 2008, No. 5, pp. 40-43].

В последнее время в медицинской химии передовым направлением в создании лекарственных средств является синтез конъюгатов путем химических комбинаций разных молекул с определенными свойствами. Полученные конъюгаты (гибридные молекулы) проявляют либо синергетический эффект, либо обладают эффектом пролонгированного действия в организме, либо строго воздействуют на орган-мишень.Recently, in medical chemistry, the forefront in the development of medicines has been the synthesis of conjugates by chemical combinations of different molecules with certain properties. The resulting conjugates (hybrid molecules) exhibit either a synergistic effect, or have a prolonged effect in the body, or strictly affect the target organ.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является метод молекулярной конъюгации витаминов C и аналога витамина E, признанных природных антиоксидантов, взаимодействием вицинальной диольной группы аскорбиновой кислоты с альдегидной функцией хроманильного компонента (аналога витамина E) при катализе n-TsOH. Реакция проводилась в бензоле при нагревании в течение 8 часов, при этом выход образующегося коньюгата составил 55%. Полученный таким образом синтетический конъюгат показал интересные свойства. Обладая антиоксидантной активностью, соизмеримой с природными а-токоферолом или L-аскорбиновой кислотой, он способен улавливать свободные радикалы как в гидрофильной, так и в липофильной тканях организма, повышая иммунный статус [Manfredini S., Vertuani S., Manfredi B., Rossoni G., Calviello G., Palozza P Novel antioxidant agents deriving from molecular combinations of vitamins C and E analogues.// Biorganic and Medicinal Chem., 2000, 8, p.2791-2801].Closest to the proposed invention is a method of molecular conjugation of vitamins C and a vitamin E analogue, recognized as natural antioxidants, by the interaction of the vicinal diol group of ascorbic acid with the aldehyde function of the chromanyl component (vitamin E analogue) in n-TsOH catalysis. The reaction was carried out in benzene with heating for 8 hours, while the yield of the resulting conjugate was 55%. The synthetic conjugate thus obtained showed interesting properties. Possessing antioxidant activity comparable with natural α-tocopherol or L-ascorbic acid, it is able to trap free radicals in both hydrophilic and lipophilic tissues of the body, increasing the immune status [Manfredini S., Vertuani S., Manfredi B., Rossoni G ., Calviello G., Palozza P Novel antioxidant agents deriving from molecular combinations of vitamins C and E analogues. // Biorganic and Medicinal Chem., 2000, 8, p. 2791-2801].

Конъюгаты экдистероидов с аналогами витамина E или другими фармакофорами неизвестны. Задачей изобретения явился способ получения нового гибридного антиоксиданта на основе синтетической комбинации природного экдистероида - 20-гидроксиэкдизона и C₂-аналога α-токоферола.Conjugates of ecdysteroids with vitamin E analogues or other pharmacophores are unknown. The objective of the invention was a method for producing a new hybrid antioxidant based on a synthetic combination of a natural ecdysteroid - 20-hydroxyecdysone and a C ₂ analog of α-tocopherol.

Решение поставленной задачи было достигнуто взаимодействием 20-гидроксиэкдизона (1) со стехиометрическим количеством (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-ил)ацетальдегида (2) в этилацетате в присутствии каталитического количества пара-толулсульфокислоты TsOH (10% от веса экдистероида) при комнатной температуре (~20°C) течение 24 часов. При этом с выходом 62% образуется бис-конъюгированный аддукт (3). Если n-TsOH заменить на другой катализатор, например, фосфорномолибденовую кислоту (ФМК), то время реакции увеличивается.The solution of this problem was achieved by the interaction of 20-hydroxyecdysone (1) with a stoichiometric amount of (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-yl) acetaldehyde (2) in ethyl acetate in the presence of a catalytic amount of para-toluenesulfonic acid TsOH (10 % by weight of ecdysteroid) at room temperature (~ 20 ° C) for 24 hours. In this case, with a yield of 62%, a bis-conjugated adduct is formed (3). If n-TsOH is replaced by another catalyst, for example phosphoromolybdenum acid (PMA), then the reaction time increases.

6-Дебензилирование конъюгата (3) гладко протекает при гидрировании в растворе этанола в присутствии катализатора Pd-C и приводит к соответствующему соединению (4) со свободными фенольными группами.6-Debenzylation of conjugate (3) proceeds smoothly upon hydrogenation in an ethanol solution in the presence of a Pd-C catalyst and leads to the corresponding compound (4) with free phenolic groups.

Соединения 3, 4 являются новыми. Их структура доказана методами ЯМР ¹H и ¹³C. Для соединения 4 был снят масс-спектр MALDI TOF и зарегистрирован ион [M+H]⁺. В спектрах ЯМР ¹H и ¹³C полученных гибридных соединений 3, 4 зарегистрированы сигналы всех атомов углерода и водорода экдистероидного и хроманильного фрагментов молекул.Compounds 3, 4 are new. Their structure was proved by ¹ H and ¹³ C NMR. For compound 4, the MALDI TOF mass spectrum was recorded and the [M + H] ⁺ ion was detected. In the ¹ H and ¹³ C NMR spectra of the obtained hybrid compounds 3, 4, signals of all carbon and hydrogen atoms of the ecdysteroid and chromanyl moieties were recorded.

Полученный экдистероидсодержащий конъюгат с C₂-аналогом витамина E 4 перспективен для использования в качестве адаптогенного и геропротекторного препарата при заболеваниях, связанных с активацией процессов перекисного окисления в организме.The resulting ecdysteroid-containing conjugate with a C ₂ analogue of vitamin E 4 is promising for use as an adaptogenic and geroprotective drug for diseases associated with activation of peroxidation processes in the body.

Сущность метода продемонстрирована на следующих примерах.The essence of the method is demonstrated in the following examples.

Пример 1. 2,3:20,22-Бис-O-[2-(6-бензилокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-ил)этилиден]-20-гидроксиэкдизон (3). К раствору 0.20 г (0.42 ммоль) соединения 1 в 3 мл EtOAc прилили раствор 0.28 г (0.83 ммоль) альдегида 2 в 3 мл EtOAc и добавили 0.02 г TsOH, реакционную смесь перемешивали 24 ч при комнатной температуре и упарили. Остаток хроматографировали на колонке (20 г SiO₂, элюент - CHCl₃). Получили 0.29 г (62%) соединения 3, R_f 0.56 (CHCl₃-MeOH, 20:1), т.пл. 128-130°C, [α]_D ²⁰+20.7° (с 2.03, CHCl₃). Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃), δ, м.д., J, Гц: 0.90 с (3Н, H₃C¹⁸), 1.00 с (3Н, Н₃С¹⁹), 1.17 с (3Н, Н₃С²¹), 1.27 с (3Н, H₃C²⁶), 1.28 с (3Н, H₃C²⁷), 1.37 с (6Н, СН₃-С^2' и CH₃-C^2''), 2.11 с, 2.18 с и 2.24 с (18Н, 6 СН₃-Ar), 2.63 м (4Н, H₂C^4' и H₂C^4''), 3.62 м (1Н, HC²²), 4.10 м (1Н, HC²), 4.14 м (1Н, НС³), 4.71 с (4Н, OCH₂Ph), 5.18 уш.с. (1Н, НС^2'''', w_1/2=13.0 Гц), 5.24 уш.с. (1Н, НС^2''', w_1/2=13.0 Гц), 5.85 с (1Н, НС⁷), 7.35-7.50 м (10Н, Н-Ar). Спектр ЯМР ¹³С (CDCl₃), δ, м.д.: 11.92, 12.01 и 12.89 (6 Ме-Ar), 17.00 (С¹⁸), 20.56 (С¹⁹), 20.56 (С^4' и С^4''), 21.50 (C¹¹), 23.04 (C¹⁶), 23.61 (C²¹), 24.80 (MeC^2'), 24.97 (MeC^2''), 26.68 (С²³), 29.47 (С²⁶ и С²⁷), 30.86 (С¹⁵), 30.94 (C⁴), 31.74 (С^3'), 31.85 (С^3'') 34.00 (С¹²), 34.71 (С⁹), 37.82 (С¹), 38.40 (С¹⁰), 41.41 (С²⁴), 45.53 (С¹³), 47.36 (С⁵), 49.74 (С^1''', С¹⁷), 50.83 (С^1''''), 70.48 (С²⁵), 73.36 (С^2' и С^2''), 74.75 (OCH₂Ph), 76.75 (С³), 77.07 (C²), 83.55 (С²⁰), 83.85 (С²²), 84.86 (С¹⁴), 101.41 и 101.63 (С^2''''), 102.00 (С^2'''), 117.41 (C^8a'), 117.49 (C^8a''), 121.43 (С⁷), 123.04 (С^8' и С^8''), 126.06 (С^7', С^7''), 127.74, 127.76 и 128.47 (Ph), 128.055 (С^5', С^5''), 137.97 (ОСН₂-С), 147.48 (C^4a'), 147.60 (C^4a''), 148.39 (С^6' и С^6''), 163,23 (С⁸), 202.62 (С⁶).Example 1. 2,3: 20,22-Bis-O- [2- (6-benzyloxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-yl) ethylidene] -20-hydroxyecdysone (3). To a solution of 0.20 g (0.42 mmol) of compound 1 in 3 ml of EtOAc was added a solution of 0.28 g (0.83 mmol) of aldehyde 2 in 3 ml of EtOAc and 0.02 g of TsOH was added, the reaction mixture was stirred for 24 h at room temperature and evaporated. The residue was chromatographed on a column (20 g SiO ₂ , eluent — CHCl ₃ ). Received 0.29 g (62%) of compound 3, R _f 0.56 (CHCl _3- MeOH, 20: 1), so pl. 128-130 ° C, [α] _D ²⁰ + 20.7 ° (s 2.03, CHCl ₃ ). ¹ H NMR (CDCl _3), δ, ppm, J, Hz: 0.90 (3H, H ₃ C ^18), 1.00 s (3H, C ¹⁹ H _3), 1.17 s (3H, H ₃ C ²¹ ), 1.27 s (3H, H ₃ C ²⁶ ), 1.28 s (3H, H ₃ C ²⁷ ), 1.37 s (6H, CH ₃ -C ^{2 '} and CH ₃ -C ^2'' ), 2.11 s, 2.18 s and 2.24 s (18H, 6 CH ₃ -Ar), 2.63 m (4H, H ₂ C ^{4 '} and H ₂ C ^4'' ), 3.62 m (1H, HC ²² ), 4.10 m (1H, HC ² ) , 4.14 m (1Н, НС ³ ), 4.71 s (4Н, OCH ₂ Ph), 5.18 br.s. (1Н, НС ^{2 ''''} , w _1/2 = 13.0 Hz), 5.24 br.s. (1Н, НС ^{2 '''} , w _1/2 = 13.0 Hz), 5.85 s (1Н, НС ⁷ ), 7.35-7.50 m (10Н, Н-Ar). ¹³ C NMR spectrum (CDCl ₃ ), δ, ppm: 11.92, 12.01 and 12.89 (6 Me-Ar), 17.00 (C ¹⁸ ), 20.56 (C ¹⁹ ), 20.56 (C ^{4 '} and C ^4'' ), 21.50 (C ¹¹ ), 23.04 (C ¹⁶ ), 23.61 (C ²¹ ), 24.80 (MeC ^{2 '} ), 24.97 (MeC ^2'' ), 26.68 (C ²³ ), 29.47 (C ²⁶ and C ²⁷ ), 30.86 (C ¹⁵ ), 30.94 (C ⁴ ), 31.74 (C ^{3 '} ), 31.85 (C ^3'' ) 34.00 (C ¹² ), 34.71 (C ⁹ ), 37.82 (C ¹ ), 38.40 (C ¹⁰ ), 41.41 (C ²⁴ ), 45.53 (C ¹³ ), 47.36 (C ⁵ ), 49.74 (C 1`` ^'' , C ¹⁷ ), 50.83 (C ^{1 ''''} ), 70.48 (C ²⁵ ), 73.36 (C ^{2 '} and С ^2'' ), 74.75 (OCH ₂ Ph), 76.75 (С ³ ), 77.07 (C ² ), 83.55 (С ²⁰ ), 83.85 (С ²² ), 84.86 (С ¹⁴ ), 101.41 and 101.63 (С ^{2 ''''} ), 102.00 (C ^{2 '''} ), 117.41 (C ^8a' ), 117.49 (C ^{8a ''} ), 121.43 (C ⁷ ), 123.04 (C ^{8 '} and C ^8'' ), 126.06 (C ^{7 ',} C ^7''), 127.74, 127.76 and 128.47 (Ph), 128.055 (C ^5', C ^{5 ''),} 137.97 (OCH ₂ ^{C), 147.48 (C 4a ')} , 147.60 (C ^{4a ''} ), 148.39 (C ^{6 '} and C ^6'' ), 163.23 (C ⁸ ), 202.62 (C ⁶ ).

Пример 2. К раствору 0.20 г (0.42 ммоль) соединения 1 в 3 мл EtOAc прилили раствор 0.28 г (0.83 ммоль) альдегида 2 в 3 мл EtOAc и добавили 0.02 г ФМК, реакционную смесь перемешивали 54 ч при комнатной температуре и упарили. Далее обрабатывали как описано в примере 1. Получили 0.29 г (61%) соединения 3, идентичного полученному в примере 1.Example 2. To a solution of 0.20 g (0.42 mmol) of compound 1 in 3 ml of EtOAc, a solution of 0.28 g (0.83 mmol) of aldehyde 2 in 3 ml of EtOAc was added and 0.02 g of PMA was added, the reaction mixture was stirred for 54 h at room temperature and evaporated. Then it was processed as described in example 1. Obtained 0.29 g (61%) of compound 3, identical to that obtained in example 1.

2,3:20,22-Бис-O-[2-(6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-ил)этилиден]-20-гидроксиэкдизон (4). Через суспензию 0.28 г (0.25 ммоль) соединения 3 и 0.07 г катализатора (10% Pd-C) в 5 мл абс. метанола пропускали водород (контроль ТСХ, ~3 ч). Катализатор отфильтровали, фильтрат упарили. Остаток хроматографировали на колонке (15 г SiO₂, элюент - CHCl₃). Получили 0.23 г (96%) соединения 4, т.пл. 130-134°С, [α]_D ²⁰+24.5° (с 1.82, CH₂Cl₂). Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃), δ, м.д., J, Гц: 0.81 с (3Н, H₃C¹⁸), 0.97 с (3Н, H₃C¹⁹), 1.15 с (3Н, Н₃С²¹), 1.26 с (6Н, Н₃С²⁶, Н₃С²⁷), 1.33 с (3Н, СН₃С^2'), 1.34 с (3Н, СН₃С^2''), 2.11 с, 2.16 с и 2.18 с (18Н, 6 СН₃-Ar), 2.62 с (4Н, CH₂ ^4' и CH₂ ^4''), 3.59 м (1Н, С²²), 4.12 м (1Н, HC²), 4.46 м (1Н, HC³), 5.14 уш.с. (1Н, HC^2''''), 5.21 уш.с. (1Н, HC^2'''), 5.82 с (1Н, HC⁷). Спектр ЯМР ¹³С (CDCl₃), δ, м.д.: 11.32, 11.85 и 12.26 (Me-Ar), 16.97 (С¹⁸), 20.63 (С¹⁹), 20.63 (С^4' и С^4''), 21.46 (С¹¹), 23.00 (С¹⁶), 23.53 (С²¹), 24.37 (МеС^2'), 24.64 (МеС^2''), 26.65 (С²³), 29.43 (С²⁶ и С²⁷), 30.82 (С¹⁵), 30.92 (С⁴), 31.65 (С^3'), 31.95 (С^3'') 33.16 (С¹²), 34.69 (С⁹), 37.80 (С¹), 38.37 (С¹⁰.), 41.38 (С²⁴), 45.42 (С¹³), 47.33 (С⁵), 49.71 (С¹⁷), 50.90 (С^1''' и С^1''''), 70.51 (С²⁵), 73.05 (С^2'), 73.32 (С^2''), 76.73 (С³), 77.05 (С²), 83.59 (С²⁰), 83.83 (С²²), 84.80 (С¹⁴), 101.44 и 101.66 (1Н, С^2'''') 102.01 (1Н, С^2'''), 117.10 (C^8a' и C^8a''), 118.71(C^5' и C^5''), 121.38 (С^8', С^8'', С⁷), 122.64 (С^7'и С^7''), 144.81 (C^4a' и C^4a''), 145.11 (С^6'), 163.21 (С⁸), 203.01 (С⁶). MALDI-TOF MS: m/z 942.360 [М+Н]⁺. Вычислено для (C₅₇H₈₀O₁₁+H) 942.248.2,3: 20,22-Bis-O- [2- (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-yl) ethylidene] -20-hydroxyecdysone (4). Through a suspension of 0.28 g (0.25 mmol) of compound 3 and 0.07 g of catalyst (10% Pd-C) in 5 ml of abs. hydrogen was passed through methanol (TLC control, ~ 3 h). The catalyst was filtered off and the filtrate was evaporated. The residue was chromatographed on a column (15 g SiO ₂ , eluent — CHCl ₃ ). Received 0.23 g (96%) of compound 4, so pl. 130-134 ° C, [α] _D ²⁰ + 24.5 ° (c 1.82, CH ₂ Cl ₂ ). ¹ H NMR (CDCl _3), δ, ppm, J, Hz: 0.81 s (3H, H ₃ C ^18), 0.97 s (3H, H ₃ C ^19), 1.15 s (3H, H ₃ C ²¹ ), 1.26 s (6H, H ₃ C ²⁶ , H ₃ C ²⁷ ), 1.33 s (3H, CH ₃ C ^{2 '} ), 1.34 s (3H, CH ₃ C ^2'' ), 2.11 s, 2.16 s and 2.18 s (18H, 6 CH ₃ -Ar), 2.62 s (4H, CH ₂ ^{4 ',} CH ₂ ^4''), 3.59 m (1H, C ^22), 4.12 m (1H, HC ^2), 4.46 m ( 1H, HC ³ ), 5.14 br.s. (1H, HC ^{2 ''''} ), 5.21 br.s. (1H, HC ^{2 '''),} 5.82 s (1H, HC ^7). ¹³ C NMR spectrum (CDCl ₃ ), δ, ppm: 11.32, 11.85 and 12.26 (Me-Ar), 16.97 (C ¹⁸ ), 20.63 (C ¹⁹ ), 20.63 (C ^{4 '} and C ^4'' ) 21.46 (C ¹¹ ), 23.00 (C ¹⁶ ), 23.53 (C ²¹ ), 24.37 (MeC ^{2 '} ), 24.64 (MeC ^2'' ), 26.65 (C ²³ ), 29.43 (C ²⁶ and C ²⁷ ), 30.82 (C ¹⁵ ), 30.92 (C ⁴ ), 31.65 (C ^{3 '} ), 31.95 (C ^3'' ) 33.16 (C ¹² ), 34.69 (C ⁹ ), 37.80 (C ¹ ), 38.37 (C ^10. ), 41.38 (С ²⁴ ), 45.42 (С ¹³ ), 47.33 (С ⁵ ), 49.71 (С ¹⁷ ), 50.90 (С ^{1 '''} and С ^1'''' ), 70.51 (С ²⁵ ), 73.05 (С ^{2 '),} 73.32 (C ^2''), 76.73 (C ^3), 77.05 (C ^2), 83.59 (C ^20), 83.83 (C ^22), 84.80 (C ^14), 101.44 and 101.66 (1H, C ^2'''') 102.01 (1H, C ^{2'''), 117.10 (C} 8a ' and C ^8a'), 118.71 (C ^{5 'and} C ^5''), 121.38 (C ^8', C ^{8 '',} C ⁷ ), 122.64 (C ^{7 '} and C ^7'' ), 144.81 (C ^4a' and C ^{4a ''} ), 145.11 (C ^{6 '} ), 163.21 (C ⁸ ), 203.01 (C ⁶ ). MALDI-TOF MS: m / z 942.360 [M + H] ⁺ . Calculated for (C ₅₇ H ₈₀ O ₁₁ + H) 942.248.

Для бисаддукта (4) было изучено влияние на процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) в экспериментах in vitro на гомогенате печени. В опытах т vivo на интактных животных определяли степень накопления малонового диальдегида (МДА) в печени и активность ферментов антиоксидантной системы - каталазы и супероксиддисмутазы. У животных с острым экспериментальным гепатитом в гомогенате печени определяли содержание диеновых коньюгатов (ДН), малонового диальдегида и восстановленного глютатиона.For bisadduct (4), the effect on lipid peroxidation (LPO) in in vitro experiments on liver homogenate was studied. In t vivo experiments on intact animals, the degree of accumulation of malondialdehyde (MDA) in the liver and the activity of enzymes of the antioxidant system — catalase and superoxide dismutase — were determined. In animals with acute experimental hepatitis, the content of diene conjugates (MD), malondialdehyde, and reduced glutathione were determined in the liver homogenate.

Биологическая активность препарата (4) продемонстрирована следующими примерами.The biological activity of the drug (4) is demonstrated by the following examples.

Пример 1. Опыты проводили в системе in vitro на гомогенатах печени нормальных животных (крысы-самцы - 160-180 г). Процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) активировали путем добавления сульфата железа (II) (1·10^-4 М) и аскорбиновой кислоты (2·10^-4 М). Один из конечных продуктов ПОЛ - малоновый диальдегид (МДА) определяли в реакции с тиобарбитуровой кислотой.Example 1. The experiments were carried out in an in vitro system on the homogenates of the liver of normal animals (male rats - 160-180 g). The processes of lipid peroxidation (LP) were activated by the addition of iron (II) sulfate (1 · 10 ^-4 M) and ascorbic acid (2 · 10 ^-4 M). One of the end products of POL - malondialdehyde (MDA) was determined in the reaction with thiobarbituric acid.

Проведенные эксперименты показали выраженное ингибирующее влияние соединения 4 на процессы ПОЛ, что проявляется подавлением реакции образования МДА на 94.2%. Соответствующий эффект витамина Е (использовали аптечный препарат токоферола в конечной концентрации 1·10^-4 г/мл) и экдистерона составлял 83.3 и 27.8% соответственно (табл.1).The experiments showed a pronounced inhibitory effect of compound 4 on the LPO process, which is manifested by the inhibition of the MDA formation reaction by 94.2%. The corresponding effect of vitamin E (the pharmacy drug tocopherol was used in a final concentration of 1 · 10 ^-4 g / ml) and ecdysterone were 83.3 and 27.8%, respectively (Table 1).

Таблица 1Table 1 Сравнительное действие соединения 4, экдистерона и витамина Е на содержание МДА в гомогенате печени крыс в опытах in vitro (M±m, n=6).Comparative effect of compound 4, ecdysterone and vitamin E on the MDA content in rat liver homogenate in in vitro experiments (M ± m, n = 6). Испытуемое веществоTest substance МДА в пробе, нмоль/мг белкаMDA in the sample, nmol / mg protein Эффект, в % Effect, in% Соединение 4Compound 4 0.107±0.017^1,2,3 0.107 ± 0.017 ^1,2,3 -94.2-94.2 ЭкдистеронEcdysterone 1.320±0.042¹ 1.320 ± 0.042 ¹ -27.8-27.8 Витамин ЕVitamin E 0.306±0,024¹ 0.306 ± 0.024 ¹ -83.3-83.3 КонтрольThe control 1.826±0.0791.826 ± 0.079 Примечание. Концентрация всех образцов составляла 1·10^-4 г/мг (именно в этой концентрации в условиях нашего опыта проявлялась их максимально выраженное антиоксидантное действие). ¹ - достоверно по отношению к контролю, ² - по отношению к результатам пробы с экдистероном, ³ - по отношению к результатам пробы с витамином Е.Note. The concentration of all samples was 1 · 10 ^-4 g / mg (it was in this concentration that, under the conditions of our experiment, their most pronounced antioxidant effect was manifested). ¹ - reliably in relation to the control, ² - in relation to the test results with ecdysterone, ³ - in relation to the results of the test with vitamin E.

Пример 2. Крысам самцам (160-180 г) орально в течение 7 дней вводили соединение 4 (5 мг/кг), экдистерон (5 мг/кг) и витамин Е (50 мг/кг). (Дозы предварительно определили как наиболее оптимальные). После окончания эксперимента животных забивали декапитацией (под легким эфирным наркозом). В печени животных определяли содержания МДА [Стальная И.Д., Гариашвили Т.Г. Методы определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Современные методы в биохимии, под ред. В.Н. Ореховича, М., 1977, с.66-68] и активность ферментов антиоксидантной системы: каталазы и супероксиддисмутазы (СОД) по методам [Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Т. и др. Метод определения активности каталазы // Лаб. дело, 1988, №1, с.16-19] и [Дубинина Е.Е., Сальникова Л.А., Ефимова Л.Ф. Активность и изоферментный спектр супероксиддисмутазы эритроцитов и плазмы крови человека // Лаб. дело, 1983, №10, с.30-33].Example 2. To rats males (160-180 g) were orally administered for 7 days, compound 4 (5 mg / kg), ecdysterone (5 mg / kg) and vitamin E (50 mg / kg). (Doses previously determined as the most optimal). After the experiment, the animals were killed by decapitation (under light ether anesthesia). The content of MDA was determined in the liver of animals [Steel I.D., Gariashvili T.G. Methods for the determination of malondialdehyde using thiobarbituric acid // Modern Methods in Biochemistry, ed. V.N. Orekhovich, M., 1977, p.66-68] and the activity of enzymes of the antioxidant system: catalase and superoxide dismutase (SOD) according to the methods [Korolyuk MA, Ivanova LI, Mayorova I.T. et al. Method for the determination of catalase activity // Lab. case, 1988, No. 1, pp. 16-19] and [Dubinina E.E., Salnikova L.A., Efimova L.F. Activity and isoenzyme spectrum of erythrocyte and human blood plasma superoxide dismutase // Lab. business, 1983, No. 10, p.30-33].

Проведенные исследования показали, что как и в опытах in vitro, введение соединения 4 в организм животных приводит к угнетению процессов ПОЛ, о чем свидетельствовало понижение содержания в печени МДА на 42% по сравнению с показателями интактной группы. При введении экдистерона и витамина Е содержание МДА в печени понижалось только на 17.9 и 30% (табл.2). При этом в случае введения соединения 4 отмечено также более выраженное повышение активности ферментов, определяющих состояние антиоксидантной защиты организма (табл.2).Studies have shown that, as in in vitro experiments, the introduction of compound 4 into animals leads to inhibition of lipid peroxidation processes, as evidenced by a decrease in the content of MDA in the liver by 42% compared with indices of the intact group. With the introduction of ecdysterone and vitamin E, the content of MDA in the liver decreased only by 17.9 and 30% (Table 2). Moreover, in the case of the introduction of compound 4, a more pronounced increase in the activity of enzymes that determine the state of the antioxidant defense of the body was also noted (Table 2).

Таблица 2table 2 Сравнительное действие соединения 4, экдистерона и витамина Е на некоторые показатели антиоксидантной системы, уровень МДА в печени крыс (М±m, n=8).Comparative effect of compound 4, ecdysterone and vitamin E on some indicators of the antioxidant system, the level of MDA in rat liver (M ± m, n = 8). Испытуемое веществоTest substance Каталаза, ммоль/мин/г белка Catalase, mmol / min / g protein Эффект, в %Effect, in% СОД, УЕ/мин/мг белкаSOD, UE / min / mg protein Эффект, в %Effect, in% МДА, нмоль/мг белкаMDA, nmol / mg protein Эффект, в %Effect, in% Витамин ЕVitamin E 16.8±0.7416.8 ± 0.74 +6.3+6.3 1.78±0.161.78 ± 0.16 +12.6+12.6 0.562±0.028¹ 0.562 ± 0.028 ¹ -30-thirty Соединение 4Compound 4 19.4±1.04¹ 19.4 ± 1.04 ¹ +22.07+ 22.07 2.10±0.20¹ 2.10 ± 0.20 ¹ +32.9+32.9 0.424±0.022^1,2,3 0.424 ± 0.022 ^1.2.3 -42-42 ЭкдистеронEcdysterone 17.11±0.9817.11 ± 0.98 +8.3+8.3 1.91±0.181.91 ± 0.18 +20.9+20.9 0.600±0.030¹ 0.600 ± 0.030 ¹ -17,9-17.9 КонтрольThe control 15.8±0.9815.8 ± 0.98 -- 1.58±0.121.58 ± 0.12 -- 0.731±0.040.731 ± 0.04 -- Примечание. Обозначения достоверности те же, что и в таблице 1.Note. Signs of reliability are the same as in table 1.

Пример 3. Опыты проводили на крысах-самцах массой 180-200 г. Поражение печени у них вызывали путем введения ССЦ (по 0.4 мл 50% масляного раствора на 100 г массы ежедневно в течение 4-х дней) [Левшин Б.И, Экспериментальная фармакотерапия препаратами селена и тиазолидина токсического повреждения печени: Автореф. дис. д-ра мед. наук., Харьков, 1973]. Известно, что CCl₄ является сильным прооксидантом. Начиная со 2-го дня введения CCl₄, крысам орально при помощи специального зонда вводили внутрь экдистерон (5 мг/кг), соединение 4 (5 мг/кг) и витамин Е (50 мг/кг) (дозы подобрали как наиболее эффективные в предварительных экспериментах).Example 3. The experiments were carried out on male rats weighing 180-200 g. The liver damage was caused by the introduction of SCC (0.4 ml of a 50% oil solution per 100 g of weight daily for 4 days) [B. Levshin, Experimental Pharmacotherapy with selenium and thiazolidine toxic liver damage: Abstract. dis. Dr. med. Sciences., Kharkov, 1973]. CCl ₄ is known to be a strong prooxidant. Starting from the 2nd day of CCl ₄ administration, rats were orally treated with ecdysterone (5 mg / kg), compound 4 (5 mg / kg) and vitamin E (50 mg / kg) orally using a special probe (the doses were chosen as the most effective in preliminary experiments).

По истечении 3-х дней после повторного введения препаратов животным (через 2 часа после последнего введения) крыс забивали декапитацией (под легким эфирным наркозом). О выраженности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) судили по содержанию диеновых коньюгатов (ДК), малонового диальдегида (МДА) и восстановленного глютатиона в гомогенате печени. Содержание диеновых коньюгатов и восстановленного глютатиона определяли по методу [Стальная И.Д. Метод определения диеновой конъюгации ненасыщенных высших жирных кислот // Современные методы в биохимии, под ред. В.Н. Ореховича, М., 1977, с.63-64] и [Смирнов В.В. Глютатион - зависимая антиоксидантная система головного мозга при черепно-мозговой травме // Дис. канд. мед. наук., СПб, 1995, 153 с.]. Проведенные эксперименты показали, что введение крысам CCl₄ приводило к резкой активации ПОЛ, о чем свидетельствовало увеличение количества ДК, МДА (на 164.8-69.7%) и снижение восстановленного глютатиона (на 51.4%) в гомогенатах печени. Соединение 4 и в этих опытах проявило выраженное антиоксидантное действие, заметно более превосходящее действие экдистерона и витамина Е. Под действием соединения 4 содержание ДК и МДА в печени крыс с CCl₄ - гепатитом было ниже на 53.5 и 36.9% и всего на 23.1 и 7.1% (p>0.05) выше, чем у интактных животных. Экдистерон понижал содержание ДК и МДА только на 29.5 и 20.9%. Витамин Е оказывал тоже выраженный эффект, но и в этом случае содержание ДК и МДА снизилось только на 41.5 и 26.8%. Соединение 4 проявило также выраженный глютатионстабилизирующий эффект. И в этом случае соединение 4 действовало более выражено, чем собственно экдистерон и витамин Е (табл.3).After 3 days after the repeated administration of the preparations to the animals (2 hours after the last administration), the rats were killed by decapitation (under light ether anesthesia). The severity of lipid peroxidation (LP) processes was judged by the content of diene conjugates (DC), malondialdehyde (MDA) and reduced glutathione in the liver homogenate. The content of diene conjugates and reduced glutathione was determined by the method of [Steel I.D. Method for the determination of diene conjugation of unsaturated higher fatty acids // Modern Methods in Biochemistry, ed. V.N. Orekhovich, M., 1977, p. 63-64] and [Smirnov V.V. Glutathione - a dependent antioxidant system of the brain in traumatic brain injury // Dis. Cand. honey. Sciences., St. Petersburg, 1995, 153 pp.]. The experiments showed that the administration of CCl ₄ to rats led to a sharp activation of LP, as evidenced by an increase in the number of DCs, MDA (by 164.8-69.7%) and a decrease in reduced glutathione (by 51.4%) in liver homogenates. Compound 4 also showed a pronounced antioxidant effect in these experiments, significantly superior to the action of ecdysterone and vitamin E. Under the action of compound 4, the content of DC and MDA in the liver of rats with CCl ₄ hepatitis was lower by 53.5 and 36.9% and only by 23.1 and 7.1% (p> 0.05) higher than in intact animals. Ecdysterone lowered the content of DC and MDA only by 29.5 and 20.9%. Vitamin E also had a pronounced effect, but even in this case the content of DC and MDA decreased only by 41.5 and 26.8%. Compound 4 also showed a pronounced glutathione-stabilizing effect. And in this case, compound 4 acted more pronounced than ecdysterone and vitamin E proper (Table 3).

Таким образом, соединение 4 обладает выраженным антиоксидантным действием, что открывает перспективу его использования при целом ряде заболеваний, в основе которых лежит активация процессов перекисного окисления липидов.Thus, compound 4 has a pronounced antioxidant effect, which opens up the prospect of its use in a number of diseases, which are based on the activation of lipid peroxidation processes.

Таблица 3Table 3 Антиоксидантная активность соединения 4 в сравнении с экдистероном и витамином Е при поражении печени крыс CCl₄ (М±m, n=8).The antioxidant activity of compound 4 in comparison with ecdysterone and vitamin E in rat liver damage of CCl ₄ (M ± m, n = 8). Условия экспериментаExperiment Conditions ДК, мкмоль/гDC, μmol / g Эффект, в %Effect, in% МДА, нмоль/мг белкаMDA, nmol / mg protein Эффект, в %Effect, in% Глютатион-SH, мкмоль/мгGlutathione-SH, mcmol / mg Эффект, в %Effect, in% Интактные животныеIntact animals 0.182±0.0120.182 ± 0.012 0.700±0.0320.700 ± 0.032 8.76±0.328.76 ± 0.32 Контроль (CCl₄ - гепатит)Control (CCl ₄ - hepatitis) 0.482±0.036¹ 0.482 ± 0.036 ¹ 1.188±0.094¹ 1.188 ± 0.094 ¹ 4.26±0.22¹ 4.26 ± 0.22 ¹ CCl₄+ препарат (4)CCl ₄ + preparation (4) 0.224±0.014^1,2 0.224 ± 0.014 ^1.2 -53.5-53.5 0.750±0.034² 0.750 ± 0.034 ² -36.9-36.9 8.24±0.30² 8.24 ± 0.30 ² +93.4+93.4 CCl₄+ экдистеронCCl ₄ + Ecdysterone 0.340±0.020^1,2,3 0.340 ± 0.020 ^1,2,3 -29.5-29.5 0.940±0.052^1,2,3 0.940 ± 0.052 ^1,2,3 -20.9-20.9 6,94±0.32 ^1,2,3 6.94 ± 0.32 ^1.2.3 +62-9+ 62-9 CCl₄ + витамин ЕCCl ₄ + Vitamin E 0.282±0.018^1,2,3 0.282 ± 0.018 ^1,2,3 -41.5-41.5 0.870±0.038 ^1,2,3 0.870 ± 0.038 ^1,2,3 -26.8-26.8 6.30±0.24^1,2,3 6.30 ± 0.24 ^1.2.3 +47.8+47.8 Примечание. ¹ - достоверно по отношению к интактным животным, ²- по отношению к контролю, ³ - по отношению к группе животных получавших на фоне CCl₄ соединение 4 (p>0.05).Note. ¹ - significantly with respect to intact animals, ² - relative to control, ³ - with respect to the group of animals treated with CCl ₄ at the background of compound 4 (p> 0.05).

В результате проведенного тестирования соединение 4 показало более высокую антиоксидантную активность в сравнении с витамином Е и 20-гидроксиэкдизоном (экдистерон).As a result of the test, compound 4 showed a higher antioxidant activity compared to vitamin E and 20-hydroxyecdysone (ecdysterone).

Claims

1. A method of obtaining a conjugate of (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-yl) acetaldehyde with 20-hydroxyecdysone, characterized in that 20-hydroxyecdysone interacts with a stoichiometric amount of 6-hydroxy-2,5,7 , 8-tetramethylchroman-2-yl) acetaldehyde in ethyl acetate in the presence of an acid catalyst at a temperature of ~ 20 ° C for 24 hours, followed by debenzylation of the obtained intermediate conjugate in an ethanol solution in the presence of a Pd-C catalyst.

2. The method according to claim 1, characterized in that para-toluenesulfonic acid (TsOH) or phosphoromolybdenum acid (PMA) is used as an acid catalyst in an amount of 10% by weight of ecdysteroid.

3. The use of conjugate (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-yl) acetaldehyde with 20-hydroxyecdysone as an antioxidant agent that inhibits lipid peroxidation.