RU2486521C1 - Method of determining concentration of warfarin alcohol in blood plasma - Google Patents
Method of determining concentration of warfarin alcohol in blood plasma Download PDFInfo
- Publication number
- RU2486521C1 RU2486521C1 RU2012116812/15A RU2012116812A RU2486521C1 RU 2486521 C1 RU2486521 C1 RU 2486521C1 RU 2012116812/15 A RU2012116812/15 A RU 2012116812/15A RU 2012116812 A RU2012116812 A RU 2012116812A RU 2486521 C1 RU2486521 C1 RU 2486521C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- warfarin
- alcohol
- concentration
- calibration
- analysis
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области биохимии и касается способа определения концентрации варфаринового спирта - продукта метаболизма варфарина, антикоагулянта, используемого при профилактике и в лечении тромбозов.The invention relates to the field of biochemistry and relates to a method for determining the concentration of warfarin alcohol, a metabolic product of warfarin, an anticoagulant used in the prevention and treatment of thrombosis.
Острые артериальные и венозные тромбозы являются жизненно опасной патологией, угрожающей развитием тромбоэмболии легочной артерии и внезапной гибелью пациента. В России распространенность верифицированных тромбозов достигает 30%. Низкая эффективность проводимых лечебных мероприятий приводит к инвалидизации 40-70% больных в течение трех лет после манифестации заболеваний, а через 10 лет стойкая утрата трудоспособности отмечается у 80-100% пациентов. Базовой терапией тромбозов является антикоагулянтная терапия (в России в основном варфарином), нередко пожизненная. Однако количество осложнений приема варфарина, в первую очередь геморрагии различной степени тяжести, остается достаточно высоким - до 16%, при этом фатальные (жизнеугрожающие) кровотечения отмечаются у 2% пациентов. Одной из основных причин развития осложнений при приеме варфарина являются генетически обусловленные изменения скорости биотрансформации лекарственного агента и отсутствие данных о фармакокинетике препарата у людей с различными особенностями метаболизма.Acute arterial and venous thromboses are a life-threatening pathology that threatens the development of pulmonary embolism and sudden death of the patient. In Russia, the prevalence of verified thrombosis reaches 30%. The low effectiveness of the treatment measures leads to the disability of 40-70% of patients within three years after the manifestation of the disease, and after 10 years, permanent disability is noted in 80-100% of patients. The basic therapy for thrombosis is anticoagulant therapy (in Russia, mainly warfarin), often for life. However, the number of complications of taking warfarin, primarily hemorrhages of varying severity, remains quite high - up to 16%, while fatal (life-threatening) bleeding occurs in 2% of patients. One of the main reasons for the development of complications when taking warfarin is genetically determined changes in the rate of biotransformation of the drug agent and the lack of data on the pharmacokinetics of the drug in people with various metabolic characteristics.
В настоящее время продолжается разработка новых способов определения параметров метаболизма варфарина, в том числе с применением масс-спектрометрического анализа (Zuo Z. et al. Journal of pharmaceutical and biomedical analysis. Elsevier B.V., 2010. Vol.52, №2. P.305-310), позволяющего определять концентрацию варфарина, его R-, S-изомеров, и продуктов его метаболизма - гидроксиварфаринов, окисленных по различным положениям.Currently, the development of new methods for determining the parameters of warfarin metabolism, including using mass spectrometric analysis (Zuo Z. et al. Journal of pharmaceutical and biomedical analysis. Elsevier BV, 2010. Vol.52, No. 2. P.305, is ongoing. -310), which allows to determine the concentration of warfarin, its R-, S-isomers, and its metabolic products - hydroxyvarfarins, oxidized at different positions.
Наряду с 7-гидроксиварфарином, варфариновый спирт является одним из главных метаболитов варфарина, поэтому определение концентрации последнего в плазме крови и использование ее для характеризации метаболизма варфарина является актуальной задачей.Along with 7-hydroxyvarfarin, warfarin alcohol is one of the main metabolites of warfarin, therefore, determining the concentration of the latter in blood plasma and using it to characterize the metabolism of warfarin is an urgent task.
Известен способ определения концентрации варфаринового спирта флуометрическим методом (Lewis RJ. et al. Warfarin. The Journal of clinical investigation. American Society for Clinical Investigation, 1974. Vol.53, №6. Pp.1607-1617.), включающим разделение исходной смеси, содержащей варфарин и его метаболиты, методом многократной тонкослойной хроматографии. При этом качественно варфариновый спирт детектируют в ультрафиолетовом свете, а количественно концентрацию варфаринового спирта рассчитывают по отношению флуоресценции образца к флуоресценции стандарта с известной концентрацией.A known method for determining the concentration of warfarin alcohol by the fluometric method (Lewis RJ. Et al. Warfarin. The Journal of clinical investigation. American Society for Clinical Investigation, 1974. Vol.53, No. 6. Pp.1607-1617.), Including the separation of the initial mixture containing warfarin and its metabolites by multiple thin layer chromatography. In this case, warfarin alcohol is qualitatively detected in ultraviolet light, and the concentration of warfarin alcohol is quantified by the ratio of the fluorescence of the sample to the fluorescence of a standard with a known concentration.
Известен способ определения концентрации метаболитов варфарина путем флуометрического определения варфарина и его гидроксиварфаринов с использованием жидкостной хроматографии (Locatelli I. et al. Journal of chromatography. B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 2005. Vol.818, №2. P.191-198.). В этом способе используют внутренние стандарты, которые добавляют к образцам плазмы крови перед извлечением варфарина. Смесь определяемых веществ разделяют обращено-фазовой хроматографией на последовательно подключенных колонках. Детекцию образцов проводят в ультрафиолетовом свете на разных длинах волн в диапазоне 299-312 нм. Расчет концентрации проводят по соотношению площади пика флуоресценции вещества к площади пика флуоресценции внутреннего стандарта с известной концентрацией.A known method for determining the concentration of warfarin metabolites by fluometric determination of warfarin and its hydroxyvarfarin using liquid chromatography (Locatelli I. et al. Journal of chromatography. B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 2005. Vol.818, No. 2 P. 191-198.). This method uses internal standards that are added to blood plasma samples before warfarin is recovered. The mixture of analytes is separated by reverse phase chromatography on series-connected columns. The detection of samples is carried out in ultraviolet light at different wavelengths in the range of 299-312 nm. Calculation of concentration is carried out by the ratio of the peak area of the fluorescence of a substance to the peak area of the fluorescence of an internal standard with a known concentration.
Недостатками известных способов являются необходимость проведения многократной тонкослойной или жидкостной хроматографии, низкая воспроизводимость измерения, а также длительность и трудоемкость способов, связанная с флуориметрическим определением концентрации вещества.The disadvantages of the known methods are the need for multiple thin-layer or liquid chromatography, low reproducibility of the measurement, as well as the duration and complexity of the methods associated with the fluorimetric determination of the concentration of a substance.
Наиболее ближайшим к заявленному способу - прототипом, является способ определения концентрации варфарина и 7-гидроксиварфарина (Kwon M.-J. et al. The Korean journal of laboratory medicine. 2009. Vol.29, №6. P.515-523.), состоящий из следующих стадий. Для определения варфарина в плазме крови используют образец крови, полученный не менее чем через 12 ч после приема последней дозы варфарина. Белки плазмы крови отделяют путем их соосаждения с ZnSO4. Для этого 10 мкл плазмы крови добавляют к 40 мкл 0,1 М ZnSO4 и перемешивают в течение 30 сек. К смеси добавляют 100 мкл раствора внутреннего стандарта (10 нг/мл хлороварфарина в ацетонитриле). После встряхивая в течение 30 с, смесь центрифугируют в течение 3 мин при 20817 × g (14000 оборотов в минуту), затем 10 мкл супернатанта наносят непосредственно на аналитическую колонку.The closest to the claimed method, the prototype, is a method for determining the concentration of warfarin and 7-hydroxyvarfarin (Kwon M.-J. et al. The Korean journal of laboratory medicine. 2009. Vol.29, No. 6. P.515-523.) consisting of the following stages. To determine warfarin in blood plasma, a blood sample is used, obtained at least 12 hours after taking the last dose of warfarin. Proteins of blood plasma are separated by coprecipitation with ZnSO 4 . For this, 10 μl of blood plasma is added to 40 μl of 0.1 M ZnSO 4 and stirred for 30 seconds. To the mixture was added 100 μl of a solution of internal standard (10 ng / ml of chlorovarfarin in acetonitrile). After shaking for 30 s, the mixture is centrifuged for 3 min at 20817 × g (14000 rpm), then 10 μl of the supernatant is applied directly to the analytical column.
Разделение образцов проводят на ВЭЖХ системе 2795 Alliance фирмы Waters. После прохождения колонки мобильная фаза, содержащая определяемое вещество, подается на масс-спектрометр для проведения анализа.Separation of the samples is carried out on a Waters 2795 Alliance HPLC system. After passing through the column, the mobile phase containing the analyte is fed to the mass spectrometer for analysis.
Анализ проводят на масс-спектрометре Quattro Mikro API (Waters, Manchester, UK) в режиме обнаружения положительных ионов. Количественный масс-спектроскопический анализ проводят в режиме мониторинга множественных реакций (MRM) с разрушением исходных молекул на осколки: m/z 307,0 → 160.9 для варфарина, 322,9 → 176.8 для 7-гидроксиварфарина и 340.9 → 283.8 для внутреннего стандарта. Время проведения масс-спектрометрического анализа зависит от времени проведения хроматографического разделения и составляет, как минимум, 4 минуты.The analysis is carried out on a Quattro Mikro API mass spectrometer (Waters, Manchester, UK) in the mode of detection of positive ions. Quantitative mass spectroscopic analysis is carried out in the multiple-reaction monitoring mode (MRM) with the destruction of the initial molecules into fragments: m / z 307.0 → 160.9 for warfarin, 322.9 → 176.8 for 7-hydroxy warfarin and 340.9 → 283.8 for the internal standard. The time of the mass spectrometric analysis depends on the time of the chromatographic separation and is at least 4 minutes.
Количественное определение варфарина и 7-гидроксиварфарина производят по отношению площадей пиков ионной плотности, соответствующих варфарину и 7-гидроксиварфарину, к площади пика ионной плотности внутреннего стандарта. Расчеты проводят в программе Masslynx (Waters, Manchester, UK).Quantification of warfarin and 7-hydroxyvarfarin is performed by the ratio of the peak areas of ion density corresponding to warfarin and 7-hydroxyvarfarin to the peak area of the ion density of the internal standard. Calculations are carried out in the Masslynx program (Waters, Manchester, UK).
Точность измерения зависит от границ диапазона линейной зависимости концентрации образца от площади пика ионной плотности, полученной в процессе выполнения масс-спектрометрического анализа. Для этого отдельно готовят калибровочные растворы различной концентрации. По вышеописанному способу определяют концентрацию и находят линейный диапазон зависимости. Прототип обеспечивает линейность концентрации варфарина и 7-гидроксиварфарина в диапазоне 75-7500 нг/мл (r2>0.99).The measurement accuracy depends on the boundaries of the linear dependence of the sample concentration on the area of the peak ion density obtained in the process of performing mass spectrometric analysis. For this, calibration solutions of various concentrations are separately prepared. According to the above method, the concentration is determined and a linear range of dependence is found. The prototype provides a linear concentration of warfarin and 7-hydroxyvarfarin in the range of 75-7500 ng / ml (r2> 0.99).
Недостатками прототипа являются длительность способа из-за проведения хроматографического разделения образцов и недостаточная точность анализа из-за высокой нижней границы линейного диапазона зависимости концентрации от площади пика ионной плотности.The disadvantages of the prototype are the duration of the method due to chromatographic separation of the samples and the lack of accuracy of the analysis due to the high lower boundary of the linear range of the concentration dependence on the peak area of ion density.
Задачей изобретения является разработка более быстрого, точного и достоверного способа определения концентрации варфаринового спирта.The objective of the invention is to develop a faster, more accurate and reliable method for determining the concentration of warfarin alcohol.
Техническим результатом является повышение точности и сокращение длительности способа.The technical result is to increase the accuracy and reduce the duration of the method.
Поставленная задача достигается заявляемым способом, заключающимся в следующем.The problem is achieved by the claimed method, which consists in the following.
Предварительно готовят калибровочные растворы варфаринового спирта с концентрацией 0, 10, 25, 50, 75, 100 нг/мл.Pre-prepared calibration solutions of warfarin alcohol with a concentration of 0, 10, 25, 50, 75, 100 ng / ml.
Для определения варфаринового спирта в образце используют плазму крови, полученную в период 1-96 ч после приема последней дозы варфарина.To determine warfarin alcohol in a sample, blood plasma obtained in the period 1-96 hours after taking the last dose of warfarin is used.
Готовят пробы исследуемых образцов к анализу путем экстракции варфаринового спирта из образца с последующим упариванием и перерастворением стандартным методом. На фиг.1 представлен процесс извлечения варфарина из плазмы крови в ходе пробоподготовки для проведения количественного анализа, где: берут 1 мл плазмы крови человека (1), добавляют 1 мл 1 М H2SO4 до рН 1 (2), добавляют 5 мл диэтилового эфира и экстрагируют варфариновый спирт в течение 1 часа при перемешивании со скоростью 250 оборотов в минуту при 25°С (3), диэтиловый эфир, содержащий варфариновый спирт, переносят в чистые пробирки и упаривают органическую фазу досуха в водяной бане при температуре при 45-50°С и токе воздуха (4), полученный варфариновый спирт растворяют путем поэтапного добавления к сухому остатку по 150 мкл 50% ацетонитрила (5).Samples of the test samples are prepared for analysis by extraction of warfarin alcohol from the sample, followed by evaporation and re-dissolution by the standard method. Figure 1 shows the process of extracting warfarin from blood plasma during sample preparation for quantitative analysis, where: 1 ml of human blood plasma is taken (1), 1 ml of 1 M H 2 SO 4 is added to pH 1 (2), 5 ml is added diethyl ether and warfarin alcohol is extracted for 1 hour with stirring at a speed of 250 rpm at 25 ° C (3), diethyl ether containing warfarin alcohol is transferred to clean tubes and the organic phase is evaporated to dryness in a water bath at a temperature at 45- 50 ° С and air flow (4), obtained warfarin s IRT dissolved phase by adding to the dry residue of 150 .mu.l of 50% acetonitrile (5).
Далее из полученного образца или калибровочного раствора отбирают аликвоту объемом 50 мкл и добавляют 250 мкл 50% ацетонитрила. Полученный раствор используют для масс-спектрометрического анализа.Then, an aliquot of 50 μl was taken from the obtained sample or calibration solution and 250 μl of 50% acetonitrile was added. The resulting solution is used for mass spectrometric analysis.
Анализ проводят на масс-спектрометре Agilent 6410 QQQ (Agilent Technologies) в режиме обнаружения отрицательных ионов. Количественный масс-спектроскопический анализ проводят в режиме сканирования MS2 без разрушения исходных молекул на осколки: стандартный масс-спектр, получаемый в ходе определения варфаринового спирта в плазме крови, представлен на фиг.2, из которой видно, что варфариновому спирту соответствует первый пик с 309,2 m/z.The analysis is carried out on an Agilent 6410 QQQ mass spectrometer (Agilent Technologies) in the detection mode of negative ions. Quantitative mass spectroscopic analysis is performed in MS2 scanning mode without destroying the initial molecules into fragments: the standard mass spectrum obtained in the course of determination of warfarin alcohol in blood plasma is shown in Fig. 2, which shows that the first peak with 309 corresponds to warfarin alcohol , 2 m / z.
С помощью программного комплекса Masshunter фирмы Agilent Technologies задают положение флакона образца (для серии до 56 образов) и калибровочных растворов в планшете и параметры анализа: объем аликвоты 50 мкл, скорость потока элюента 0,8-1 мл/мин, подвижную фазу 50% ацетонитрил, время анализа 1-2 мин, диапазон измерения 100-1000 m/z.Using the Agilent Technologies Masshunter software package, the position of the sample vial (for a series of up to 56 images) and the calibration solutions in the tablet is set and the analysis parameters: aliquot volume of 50 μl, eluent flow rate 0.8-1 ml / min,
После проведения масс-спектрометрического анализа, производят количественное определение концентрации варфаринового спирта. Для этого по калибровочным растворам строят калибровочную зависимость: отношение площади пика ионной плотности варфаринового спирта к концентрации калибровочного раствора. Используя калибровочную зависимость, по определенной в образце площади пика ионной плотности с 309,2 m/z находят концентрацию варфаринового спирта в образце. Все расчеты производят в автоматическом режиме в программном комплексе Masshunter фирмы Agilent Technologies.After mass spectrometric analysis, the concentration of warfarin alcohol is quantified. For this, a calibration dependence is constructed from calibration solutions: the ratio of the peak area of the ion density of warfarin alcohol to the concentration of the calibration solution. Using the calibration dependence, the concentration of warfarin alcohol in the sample is found from the area of the peak ion density with 309.2 m / z determined in the sample. All calculations are performed automatically in the Masshunter software package of Agilent Technologies.
Определение точности измерения проводят в ходе выполнения анализа по использованным калибровочным растворам. При построении калибровочной зависимости автоматически проводят сопоставление определяемой концентрации варфаринового спирта в калибровочном растворе с заданной концентрацией. Способ обеспечивает линейность концентрации варфаринового спирта в диапазоне 1-100 нг/мл (r2>0.99).Determination of measurement accuracy is carried out during the analysis of the used calibration solutions. When constructing a calibration dependence, the determined concentration of warfarin alcohol in the calibration solution is automatically compared with a given concentration. The method provides a linear concentration of warfarin alcohol in the range of 1-100 ng / ml (r2> 0.99).
Определяющими отличиями заявленного способа от прототипа являются:The defining differences of the claimed method from the prototype are:
1. Предварительно готовят калибровочные растворы варфаринового спирта, что позволяет уменьшить время анализа за счет определения точности измерения в ходе анализа и возможности использования калибровочных растворов для серии образцов.1. Pre-prepare calibration solutions of warfarin alcohol, which reduces the analysis time by determining the measurement accuracy during analysis and the possibility of using calibration solutions for a series of samples.
2. Пробы исследуемых образцов анализируют на масс-спектрометре в режиме обнаружения отрицательных ионов со следующими параметрами анализа: объем аликвоты 50 мкл, скорость потока элюента 0,8-1,0 мл/мин, подвижная фаза 50% ацетонитрил, время анализа 1-2 мин, диапазон измерения 100-1000 m/z, что позволяет существенно сократить время анализа без разрушения исходной молекулы на осколки за счет отсутствия хроматографического разделения.2. Samples of the studied samples are analyzed on a mass spectrometer in the mode of detection of negative ions with the following analysis parameters:
3. По калибровочным растворам строят калибровочную зависимость по отношению площади пика ионной плотности варфаринового спирта к концентрации калибровочного раствора и, используя калибровочную зависимость, по определенной в образце площади пика ионной плотности с 309,2 m/z находят концентрацию варфаринового спирта в образце, что позволяет более точно определять концентрацию варфаринового спирта3. Using calibration solutions, a calibration dependence is constructed with respect to the ratio of the peak area of the ion density of warfarin alcohol to the concentration of the calibration solution and, using the calibration dependence, the concentration of warfarin alcohol in the sample is determined from the peak area of the ion density of 309.2 m / z, which allows more accurately determine the concentration of warfarin alcohol
Таким образом, существенные отличительные признаки заявляемого способа, вкупе с известными, позволяют сократить длительность способа в 2 раза за счет исключения стадии предварительного хроматографического разделения образцов на обращено-фазовой колонке, а также проведения масс-спектрометрического анализа в экспериментально подобранном оптимальном режиме, и повысить точность анализа за счет использования предварительно построенной калибровочной зависимости, изменения линейного диапазона измерения концентрации, использования программы Masshunter для расчета концентрации варфаринового спирта и расширения диапазона времени, прошедшего после приема варфарина.Thus, the essential distinguishing features of the proposed method, coupled with the known ones, allow to reduce the duration of the method by 2 times by eliminating the stage of preliminary chromatographic separation of samples on a reversed-phase column, as well as conducting mass spectrometric analysis in experimentally selected optimal mode, and to improve the accuracy analysis through the use of a pre-built calibration dependence, changing the linear range of concentration measurement, using Masshunter Ranma to calculate the concentration of warfarin alcohol and expanding the time span elapsed since receiving warfarin.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.The invention is illustrated by the following examples of specific performance.
Пример 1.Example 1
Определение концентрации варфаринового спирта в образце плазмы крови человека, полученном через 2 часа после приема 5 мг варфарина, с использованием заявленного способаDetermination of the concentration of warfarin alcohol in a sample of human blood plasma obtained 2 hours after taking 5 mg of warfarin using the claimed method
Готовят калибровочные растворы варфаринового спирта, путем добавления к 0,8 мл плазмы здоровых доноров, не принимающих варфарин, аликвот исходного раствора варфаринового спирта с концентрацией 1 мг/мл, так, чтобы конечная концентрация составляла 0, 10, 25, 50, 75, 100 нг/мл.Calibration solutions of warfarin alcohol are prepared by adding aliquots of the initial warfarin alcohol solution with a concentration of 1 mg / ml to 0.8 ml of plasma of healthy donors not taking warfarin, so that the final concentration is 0, 10, 25, 50, 75, 100 ng / ml
Готовят пробы исследуемых образцов. Для чего к 0,8 мл плазмы крови образца или калибровочного раствора добавляют 0,8 мл 1 М H2SO4 (pH 1), смесь перемешивают путем вращения пробирки вокруг ее вертикальной оси в течение 30 секунд и добавляют 4 мл диэтилового эфира. Варфариновый спирт экстрагируют в течение 1 часа при перемешивании со скоростью 250 оборотов в минуту при 25°С. После перемешивания диэтиловый эфир, содержащий варфариновый спирт, переносят в чистые пробирки. Органическую фазу упаривают досуха в водяной бане при V температуре при 45°С и токе воздуха (для повышения скорости упаривания) в течение 30 минут. Полученный варфариновый спирт растворяют путем поэтапного добавления к сухому остатку по 150 мкл 50% ацетонитрила. После этого пробирку омывают 150 мкл 100% ацетонитрила и растворы объединяют. Из образца или калибровочного раствора отбирают аликвоту объемом 50 мкл и добавляют 250 мкл 50% ацетонитрила. Полученный раствор используют для масс-спектрометрического анализа.Prepare samples of test samples. For this, 0.8 ml of 1 M H 2 SO 4 (pH 1) is added to 0.8 ml of the blood plasma of the sample or calibration solution, the mixture is stirred by rotating the tube around its vertical axis for 30 seconds, and 4 ml of diethyl ether is added. Warfarin alcohol is extracted for 1 hour with stirring at a speed of 250 rpm at 25 ° C. After stirring, diethyl ether containing warfarin alcohol was transferred to clean tubes. The organic phase is evaporated to dryness in a water bath at V temperature at 45 ° C and air flow (to increase the evaporation rate) for 30 minutes. The resulting warfarin alcohol is dissolved by the stepwise addition of 150 μl of 50% acetonitrile to the dry residue. After this, the tube is washed with 150 μl of 100% acetonitrile and the solutions are combined. An aliquot of 50 μl was taken from a sample or calibration solution and 250 μl of 50% acetonitrile was added. The resulting solution is used for mass spectrometric analysis.
Анализ проводят на масс-спектрометре Agilent 6410 QQQ (Agilent Technologies) в режиме обнаружения отрицательных ионов. В качестве десольватирующего газа используется азот (3,5 л/мин). Температура источника ионов и десольватирующего газа составляла 200 и 325°С соответственно. Диссоциацию, индуцированной столкновением, не производят. Напряжение на капилляре составляло 2500 В. Количественный масс-спектроскопический анализ проводят в режиме сканирования MS2 без разрушения исходных молекул на осколки.The analysis is carried out on an Agilent 6410 QQQ mass spectrometer (Agilent Technologies) in the detection mode of negative ions. Nitrogen (3.5 L / min) is used as desolvating gas. The temperature of the ion source and desolvating gas was 200 and 325 ° C, respectively. Collision-induced dissociation is not performed. The voltage at the capillary was 2500 V. A quantitative mass spectroscopic analysis was carried out in the MS2 scan mode without destroying the initial molecules into fragments.
С помощью программного комплекса Masshunter фирмы Agilent Technologies задают положение флакона образца и калибровочных растворов в планшете и параметры анализа: объем аликвоты 50 мкл, скорость потока элюента 0,8 мл/мин, подвижную фазу 50% ацетонитрил, время анализа 2 мин, диапазон измерения 100-1000 m/z.Using the Agilent Technologies Masshunter software package, the position of the sample vial and calibration solutions in the tablet and the analysis parameters are set: aliquots of 50 μl, eluent flow rate 0.8 ml / min,
На фиг.3 представлен пример пика ионной плотности, соответствующий отношению массы к заряду 309,2 m/z. Из фиг.3 видно, что время масс-спектрометрического анализа образца варфаринового спирта составляет 0,4 мин.Figure 3 presents an example of a peak ion density corresponding to the ratio of mass to charge 309.2 m / z. From figure 3 it is seen that the time of mass spectrometric analysis of a sample of warfarin alcohol is 0.4 minutes
После проведения масс-спектрометрического анализа, производят количественное определение варфаринового спирта. Для этого по калибровочным растворам строят калибровочную зависимость: отношение площади пика ионной плотности варфаринового спирта к концентрации калибровочного раствора. На фиг.4. представлена калибровочная зависимость площади ионной плотности от концентрации варфаринового спирта в диапазоне 0-100 нг/мл. Используя калибровочную зависимость, по определенной в образце площади пика ионной плотности с 309,2 m/z находят концентрацию варфаринового спирта в образце. Все расчеты производят в автоматическом режиме в программном комплексе Masshunter фирмы Agilent Technologies.After conducting mass spectrometric analysis, a quantitative determination of warfarin alcohol is performed. For this, a calibration dependence is constructed from calibration solutions: the ratio of the peak area of the ion density of warfarin alcohol to the concentration of the calibration solution. In figure 4. The calibration dependence of the ion density area on the concentration of warfarin alcohol in the range of 0-100 ng / ml is presented. Using the calibration dependence, the concentration of warfarin alcohol in the sample is found from the area of the peak ion density with 309.2 m / z determined in the sample. All calculations are performed automatically in the Masshunter software package of Agilent Technologies.
В результате определяют концентрацию варфаринового спирта - 32 нг/мл.As a result, the concentration of warfarin alcohol is determined - 32 ng / ml.
Пример 2.Example 2
Определение концентрации варфаринового спирта в серии образцов плазмы крови человека, полученных через 0-74 часа после приема 5 мг варфарина, с использованием заявляемого способаDetermination of the concentration of warfarin alcohol in a series of samples of human blood plasma obtained 0-74 hours after taking 5 mg of warfarin using the proposed method
Готовят калибровочные растворы варфаринового спирта, путем добавления к 1 мл плазмы здоровых доноров, не принимающих варфарин, аликвот исходного раствора варфаринового спирта, так, чтобы конечная концентрация составляла 0, 10, 25, 50, 75, 100 нг/мл.Calibration solutions of warfarin alcohol are prepared by adding aliquots of the initial warfarin alcohol solution to 1 ml of plasma of healthy donors not taking warfarin, so that the final concentration is 0, 10, 25, 50, 75, 100 ng / ml.
К 1 мл плазмы крови образца или калибровочного раствора добавляют 1 мл 1 М H2SO4 (pH 1), смесь перемешивают путем вращения пробирки вокруг ее вертикальной оси в течение 30 секунд и добавляют 5 мл диэтилового эфира. Варфариновый спирт экстрагируют в течение 1 часа при перемешивании со скоростью 250 оборотов в минуту при 25°С. После перемешивания диэтиловый эфир, содержащий варфариновый спирт, переносят в чистые пробирки. Органическую фазу упаривают досуха в водяной бане при температуре при 50°С и токе воздуха (для повышения скорости упаривания) в течение 25 минут. Для каждого образца полученный варфариновый спирт растворяют путем поэтапного добавления к сухому остатку по 150 мкл 50% ацетонитрила. После этого пробирку омывают 150 мкл 100% ацетонитрила и растворы объединяют. Из образца или калибровочного раствора отбирают аликвоту объемом 50 мкл и добавляют 250 мкл 50% ацетонитрила. Полученный раствор используют для масс-спектрометрического анализа.To 1 ml of blood plasma of the sample or calibration solution, 1 ml of 1 M H 2 SO 4 (pH 1) was added, the mixture was stirred by rotating the tube around its vertical axis for 30 seconds, and 5 ml of diethyl ether was added. Warfarin alcohol is extracted for 1 hour with stirring at a speed of 250 rpm at 25 ° C. After stirring, diethyl ether containing warfarin alcohol was transferred to clean tubes. The organic phase is evaporated to dryness in a water bath at a temperature at 50 ° C and air flow (to increase the evaporation rate) for 25 minutes. For each sample, the resulting warfarin alcohol is dissolved by the stepwise addition of 150 μl of 50% acetonitrile to the dry residue. After this, the tube is washed with 150 μl of 100% acetonitrile and the solutions are combined. An aliquot of 50 μl was taken from a sample or calibration solution and 250 μl of 50% acetonitrile was added. The resulting solution is used for mass spectrometric analysis.
Анализ проводят на масс-спектрометре Agilent 6410 QQQ (Agilent Technologies) в режиме обнаружения отрицательных ионов аналогично примеру 1.The analysis is carried out on an Agilent 6410 QQQ mass spectrometer (Agilent Technologies) in the negative ion detection mode, as in Example 1.
С помощью программного комплекса Masshunter фирмы Agilent Technologies задают положение флакона образца (до 112 образов) и калибровочных растворов в планшете и параметры анализа: объем аликвоты 50 мкл, скорость потока элюента 1,0 мл/мин, подвижную фазу 50% ацетонитрил, время анализа 1 мин, диапазон измерения 100-1000 m/z. Проводят масс-спектрометрический анализ.Using the Agilent Technologies Masshunter software package, the position of the sample vial (up to 112 images) and calibration solutions in the tablet and the analysis parameters are set: aliquots of 50 μl, eluent flow rate 1.0 ml / min,
После проведения масс-спектрометрического анализа, по калибровочным растворам строят калибровочную зависимость и находят концентрацию варфаринового спирта в образце аналогично примеру 1.After conducting mass spectrometric analysis, calibration dependencies are built using calibration solutions and the concentration of warfarin alcohol in the sample is found, as in example 1.
В таблице представлены полученные значения концентрации варфаринового спирта.The table shows the obtained values of the concentration of warfarin alcohol.
На фиг.5. представлен график изменения концентрации варфаринового спирта в процессе его метаболизма в организме человека.In Fig.5. a graph of the concentration of warfarin alcohol during its metabolism in the human body is presented.
Использование способа позволит повысить скорость, точность и достоверность определения концентрации варфаринового спирта в плазме крови, а также исключить наиболее часто встречающиеся ошибки определения. Полученные с помощью данного способа данные могут быть использованы в фармакокинетике для определения параметров метаболизма как варфаринового спирта, так и варфарина.Using the method will increase the speed, accuracy and reliability of determining the concentration of warfarin alcohol in blood plasma, as well as eliminate the most common determination errors. The data obtained using this method can be used in pharmacokinetics to determine the metabolic parameters of both warfarin alcohol and warfarin.
Claims (6)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012116812/15A RU2486521C1 (en) | 2012-04-25 | 2012-04-25 | Method of determining concentration of warfarin alcohol in blood plasma |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012116812/15A RU2486521C1 (en) | 2012-04-25 | 2012-04-25 | Method of determining concentration of warfarin alcohol in blood plasma |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2486521C1 true RU2486521C1 (en) | 2013-06-27 |
Family
ID=48702367
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012116812/15A RU2486521C1 (en) | 2012-04-25 | 2012-04-25 | Method of determining concentration of warfarin alcohol in blood plasma |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2486521C1 (en) |
-
2012
- 2012-04-25 RU RU2012116812/15A patent/RU2486521C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| BANFIELD С et al. Stereospecific fluorescence high-performance liquid chromatographic analysis of warfarin and its metabolites in plasma and urine // Journal of pharmaceutical sciences, 1984, 73(10), pages 1392-1396. * |
| KWON MIN-JUNG et al. Determination of Plasma Warfarin Concentrations in Korean Patients and Its Potential for Clinical Application // Korean journal of laboratory medicine, 2009, 29, pages 515-523. * |
| KWON MIN-JUNG et al. Determination of Plasma Warfarin Concentrations in Korean Patients and Its Potential for Clinical Application // Korean journal of laboratory medicine, 2009, 29, pages 515-523. BANFIELD С et al. Stereospecific fluorescence high-performance liquid chromatographic analysis of warfarin and its metabolites in plasma and urine // Journal of pharmaceutical sciences, 1984, 73(10), pages 1392-1396. OSMAN A. et al. A new high-performance liquid chromatographic method for determination of warfarin enantiomers // Journal of chromatography. B, Analitical technologies in the biomedical and life sciences, 5.11.2005, 826(1-2), pages 75-80. MAHASEN A. RADWAM et al. Determination of free and total warfarin concentrations in plasma using UPLC MS/MS and its application to a patient samples // Biomedical chromatography, 11.01.2011. * |
| MAHASEN A. RADWAM et al. Determination of free and total warfarin concentrations in plasma using UPLC MS/MS and its application to a patient samples // Biomedical chromatography, 11.01.2011. * |
| OSMAN A. et al. A new high-performance liquid chromatographic method for determination of warfarin enantiomers // Journal of chromatography. B, Analitical technologies in the biomedical and life sciences, 5.11.2005, 826(1-2), pages 75-80. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chen et al. | Quantitative profiling of major neutral lipid classes in human meibum by direct infusion electrospray ionization mass spectrometry | |
| BRPI0813954A2 (en) | analysis of amino acids in the body fluid through liquid chromatography-mass spectrometry | |
| Ginterová et al. | Determination of mushroom toxins ibotenic acid, muscimol and muscarine by capillary electrophoresis coupled with electrospray tandem mass spectrometry | |
| WO2004088309A2 (en) | Methods for diagnosing urinary tract and prostatic disorders | |
| WO2018176808A1 (en) | Screening and use of biomarker related to severe oligoasthenospermia | |
| CN112630311B (en) | Metabolic markers and kits for detecting affective disorders and methods of use | |
| US10502748B2 (en) | Method of differentiating stable angina pectoris from acute coronary syndrome and diagnostic kit thereof | |
| US20130177994A1 (en) | METHODS FOR QUANTITATIVE CHIRAL DETERMINATION OF THE d- AND l- ENANTIOMERS OF AMPHETAMINE AND METHAMPHETAMINE | |
| Mena-Bravo et al. | Study of blood collection and sample preparation for analysis of vitamin D and its metabolites by liquid chromatography–tandem mass spectrometry | |
| Świądro et al. | Development of a new method for drug detection based on a combination of the dried blood spot method and capillary electrophoresis | |
| CN112083111A (en) | Non-invasive diagnosis marker for chronic drug-induced liver injury related cirrhosis and application thereof | |
| JP2018169376A (en) | Method of testing for colorectal cancer | |
| Hsu et al. | Urinary exposure marker discovery for toxicants using ultra-high pressure liquid chromatography coupled with Orbitrap high resolution mass spectrometry and three untargeted metabolomics approaches | |
| CN115112776B (en) | Combined marker, application thereof in diagnosing atrial fibrillation and diagnostic reagent or kit | |
| WO2016049828A1 (en) | Obese population specific biomarker composition and use thereof | |
| Peña et al. | Determination of polyamines and related compounds in saliva via in situ derivatization and microextraction by packed sorbents coupled to GC-MS | |
| Sun et al. | Ultra-performance liquid-chromatography with tandem mass spectrometry performing pharmacokinetic and biodistribution studies of croomine, neotuberostemonine and tuberostemonine alkaloids absorbed in the rat plasma after oral administration of Stemonae Radix | |
| RU2486521C1 (en) | Method of determining concentration of warfarin alcohol in blood plasma | |
| Bigelow et al. | Quantitative proteome mapping of nitrotyrosines | |
| CN108680692A (en) | The diagnosis marker of inferior wall myocardial infarction and/or Anterior wall myocardial infarction | |
| KR20090027896A (en) | Method for analysis of polyamines in urine or plasma using liquid chromatography/electronspray ionization-tandem mass spectrometry along with amine carbamylated derivatization | |
| US20050106104A1 (en) | Methods for diagnosing cardiovascular disorders | |
| Gregersen et al. | Direct determination of serotonin in gut lavage fluid by liquid chromatographic ion trap tandem mass spectrometry | |
| KR100709555B1 (en) | Method for the determination of anti HIV drugs in plasma with high performance liquid chromatography-mass spectrometry | |
| Iqbal et al. | A simple and sensitive HILIC-based UHPLC-MS/MS method for quantifying of rivaroxaban in dried blood spots: Application in comparison with the plasma sample method |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180426 |