RU2486238C1 - METHOD OF LOADING DENDRITIC CELLS WITH ANTIGEN OF INFECTIOUS ORIGIN Opistorchis felineus - Google Patents
METHOD OF LOADING DENDRITIC CELLS WITH ANTIGEN OF INFECTIOUS ORIGIN Opistorchis felineus Download PDFInfo
- Publication number
- RU2486238C1 RU2486238C1 RU2011154555/10A RU2011154555A RU2486238C1 RU 2486238 C1 RU2486238 C1 RU 2486238C1 RU 2011154555/10 A RU2011154555/10 A RU 2011154555/10A RU 2011154555 A RU2011154555 A RU 2011154555A RU 2486238 C1 RU2486238 C1 RU 2486238C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dendritic cells
- antigen
- monocytes
- cultivation
- cells
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, конкретно к иммунологии, и может быть использовано для получения активированных дендритных клеток, способных инициировать антиген-специфический иммунный ответ.The invention relates to medicine, specifically to immunology, and can be used to obtain activated dendritic cells capable of initiating an antigen-specific immune response.
Предложенная доза гельминтного антигена Opisthorchis felineus является оптимальной для моделирования иммунного ответа на основе культуры дендритных клеток в ответ на инфекционный стимул с целью разработки подходов для терапии аллергических заболеваний на основе клеточных технологий.The proposed dose of the helminth antigen Opisthorchis felineus is optimal for modeling the immune response based on the culture of dendritic cells in response to an infectious stimulus in order to develop approaches for the treatment of allergic diseases based on cell technologies.
Многочисленные факты свидетельствуют о способности гельминтных инфекций модифицировать иммунный ответ хозяина, что оказывает существенное влияние на риск развития и клиническое течение аллергии. Характер и степень этого модифицирующего влияния зависят от конкретных условий, в том числе генетических свойств индивидуумов. Существующие на сегодняшний день сведения об иммунных механизмах моделирования риска аллергических заболеваний у лиц с паразитарными заболеваниями недостаточны и требуют глубокого анализа их молекулярных основ. Изучение модифицирующего влияния гельминтных антигенов на формирование иммунного ответа у больных аллергическими заболеваниями особенно актуально для регионов с высокой распространенностью паразитарных инвазий [1].Numerous facts indicate the ability of helminth infections to modify the host's immune response, which has a significant impact on the risk of development and the clinical course of allergies. The nature and extent of this modifying effect depends on specific conditions, including the genetic properties of individuals. The current information on the immune mechanisms of modeling the risk of allergic diseases in individuals with parasitic diseases is insufficient and requires an in-depth analysis of their molecular basis. The study of the modifying effect of helminth antigens on the formation of the immune response in patients with allergic diseases is especially important for regions with a high prevalence of parasitic infestations [1].
Согласно иммуно-эпидемиологическому исследованию, осуществленному Л.М.Огородовой и соавт. в природных очагах описторхоза Томской области, у больных бронхиальной астмой на фоне хронического описторхоза регистрируется относительное снижение уровня патогенетически значимых провоспалительных цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-5) и снижение уровней специфических IgE по сравнению с больными бронхиальной астмой без описторхоза [2]. Выявленные признаки снижения напряженности реакций гиперчувствительности немедленного типа на фоне описторхозной инвазии представляют значительный интерес в плане исследования молекулярных иммунных механизмов, контролирующих различные звенья патогенеза аллергии.According to the immuno-epidemiological study carried out by L.M. Ogorodova et al. in natural foci of opisthorchiasis of the Tomsk region, in patients with bronchial asthma against the background of chronic opisthorchiasis, a relative decrease in the level of pathogenetically significant pro-inflammatory cytokines (IL-4, IL-5) and a decrease in specific IgE levels compared with patients with bronchial asthma without opisthorchiasis are recorded [2]. The revealed signs of a decrease in the tension of immediate hypersensitivity reactions against the background of opisthorchiasis invasion are of considerable interest in terms of studying the molecular immune mechanisms that control various parts of the pathogenesis of allergies.
В настоящее время не существует эффективных методов профилактики аллергических заболеваний. Единственным патогенетическим методом лечения и ограничения расширения спектра причинно-значимых аллергенов у больных аллергическими заболеваниями является аллерген-специфическая иммунотерапия (АСИТ). Одним из основных недостатков этого метода является его специфичность только в отношении конкретных аллергенов, что затрудняет лечение больных с поливалентной сенсибилизацией. Побочные реакции при проведении АСИТ являются основной проблемой при использовании экстрактов аллергенов. Наиболее тяжелые нежелательные эффекты включают анафилаксию, вызванную IgE опосредованной дегрануляцией тучных клеток, приводящей к выбросу вазоактивных медиаторов и IgE опосредованному захвату антигенов дендритными клетками. Более усовершенствованным направлением АСИТ являются аллерген-специфические вакцины на основе дендритных клеток, создание которых находится на стадии клинических испытаний.Currently, there are no effective methods for the prevention of allergic diseases. The only pathogenetic method of treatment and limiting the expansion of the spectrum of causally significant allergens in patients with allergic diseases is allergen-specific immunotherapy (ASIT). One of the main disadvantages of this method is its specificity only for specific allergens, which complicates the treatment of patients with polyvalent sensitization. Adverse reactions during ASIT are the main problem when using allergen extracts. The most severe adverse effects include anaphylaxis caused by IgE-mediated mast cell degranulation leading to the release of vasoactive mediators and IgE-mediated capture of antigens by dendritic cells. A more advanced area of ASIT is allergen-specific vaccines based on dendritic cells, the creation of which is at the stage of clinical trials.
В связи с этим является актуальным изучение антигенных, иммуногенных и аллергенных свойств Opisthorchis felineus и исследование молекулярных и клеточных механизмов модификации реакций гиперчувствительности немедленного типа под влиянием антигена Opisthorchis felineus. Впервые проведенная активация (нагрузка) дендритных клеток с помощью гельминтного антигена Opisthorchis felineus позволит изучить иммунногенные, антигенные и аллергенные свойства возбудителя для разработки подходов к созданию антиаллергических вакцин на основе дендритных клеток.In this regard, the study of the antigenic, immunogenic, and allergenic properties of Opisthorchis felineus and the molecular and cellular mechanisms for modifying immediate hypersensitivity reactions under the influence of the Opisthorchis felineus antigen are relevant. The first activation (loading) of dendritic cells using the helminth antigen Opisthorchis felineus will allow us to study the immunogenic, antigenic and allergenic properties of the pathogen to develop approaches to the creation of anti-allergic vaccines based on dendritic cells.
В ряде научных центров ведутся исследования по созданию вакцин на основе дендритных клеток для иммунотерапии онкологических, инфекционных и аутоиммунных заболеваний. Изучается влияние дендритных клеток, активированных различными инфекционными антигенами на функциональные свойства клеток иммунной системы, и дальнейшее формирование иммунного ответа.A number of research centers are conducting research on the creation of vaccines based on dendritic cells for the immunotherapy of oncological, infectious and autoimmune diseases. The effect of dendritic cells activated by various infectious antigens on the functional properties of cells of the immune system, and the further formation of the immune response are studied.
Возможность создания таких вакцин обусловлена тем, что дендритные клетки являются наиболее эффективными антиген-представляющими клетками, обладающими специфической способностью презентировать антигены наивным Т-клеткам и вызывать последующую дифференцировку иммунного ответа. Изолированные из периферической крови дендритные клетки после обработки in vitro выбранным антигеном становятся зрелыми и in vivo после их возврата в организм с помощью внутривенного введения могут инициировать иммунный ответ.The possibility of creating such vaccines is due to the fact that dendritic cells are the most effective antigen-presenting cells with a specific ability to present antigens to naive T cells and cause subsequent differentiation of the immune response. Dendritic cells isolated from peripheral blood, after in vitro treatment with the selected antigen, become mature and, in vivo, after returning to the body via intravenous administration, they can initiate an immune response.
Значительное количество исследований зарубежных коллег посвящено изучению структурных и функциональных особенностей гельминтного антигена Shistosoma mansoni, а также его влияния на инициирование иммунного ответа дендритными клетками, полученными из периферической крови человека. Рядом авторов показано, что Shistosoma mansoni индуцирует провоспалительный фенотип дендритных клеток с последующей дифференцировкой Th2 пути иммунного ответа [8]. Антиген, выделенный из трематоды Fasciola hepatica, способен супрессировать созревание и дальнейшее функционирование дендритных клеток [7].A significant amount of research by foreign colleagues is devoted to the study of the structural and functional features of the helminth antigen Shistosoma mansoni, as well as its effect on the initiation of the immune response by dendritic cells obtained from human peripheral blood. A number of authors have shown that Shistosoma mansoni induces a pro-inflammatory phenotype of dendritic cells with subsequent differentiation of the Th2 immune response pathway [8]. Antigen isolated from Fasciola hepatica trematode is able to suppress the maturation and further functioning of dendritic cells [7].
По данным научной литературы антиген М. tuberculosis изучен достаточно подробно, проанализированы фенотипические характеристики дендритных клеток, нагруженных данным антигеном, проведены работы по определению эффективности иммунного ответа на М. tuberculosis [5].According to the scientific literature, the M. tuberculosis antigen has been studied in sufficient detail, the phenotypic characteristics of dendritic cells loaded with this antigen have been analyzed, and work has been done to determine the effectiveness of the immune response to M. tuberculosis [5].
Известен способ получения стимулированных дендритных клеток для индукции иммунного ответа против туберкулеза человека. Способ основан на заборе у пациента незрелых дендритных клеток, их культивировании ex vivo для созревания и формирования аллостимуляторной активности. Клетки дополнительно собирают антигеном и вводят их тому же пациенту для формирования адаптивного иммунитета. При культивировании ех vivo незрелых дендритных клеток в культуральную среду вводят фрагментированную аллогенную двуцепочечную геномную ДНК с фрагментами, размером 200-6000 п.о. в количестве 5 мкг/мл среды [3].A known method of producing stimulated dendritic cells for the induction of an immune response against human tuberculosis. The method is based on the collection of immature dendritic cells from the patient, their cultivation ex vivo for maturation and the formation of allostimulatory activity. Cells are additionally harvested by antigen and administered to the same patient to form adaptive immunity. When ex vivo is cultured, immature dendritic cells are introduced into the culture medium with fragmented allogeneic double-stranded genomic DNA with fragments 200-6000 bp in size. in the amount of 5 μg / ml of medium [3].
Что касается гельминтной инвазии, вызванной описторхисами, то всего в мире ею поражено не менее 20 млн. человек. В России более 60% от всех зарегистрированных биогельминтозов приходится на долю описторхоза, вызванного трематодой семейства Opisthorhidae (Opisthorchis felineus). В Юго-Восточной Азии имеется родственный вид - Opisthorchis viverrini, а на Дальнем Востоке - Clonorchis sinensis [13]. На экспериментальных клеточных моделях in vitro достаточно изученными являются иммунологические аспекты и молекулярная биология инфекций, вызванных Opisthorchis viverrini и Clonorchis sinensis [6, 9].As for helminth infestation caused by opisthorchisis, in all, at least 20 million people are affected by it in the world. In Russia, more than 60% of all recorded biohelminthoses are accounted for by opisthorchiasis caused by the trematode of the family Opisthorhidae (Opisthorchis felineus). In Southeast Asia, there is a related species, Opisthorchis viverrini, and in the Far East, Clonorchis sinensis [13]. In experimental in vitro cell models, the immunological aspects and molecular biology of infections caused by Opisthorchis viverrini and Clonorchis sinensis are well understood [6, 9].
Однако в доступной для анализа литературе не встречается ни одного исследования, в котором описан способ нагрузки дендритных клеток гельминтным антигеном, приготовленным из Opisthorchis felineus.However, in the literature available for analysis, not a single study is found that describes a method for loading dendritic cells with a helminth antigen prepared from Opisthorchis felineus.
Наиболее близким к предлагаемому является способ получения зрелых дендритных клеток для индуцирования иммунного ответа. Известный способ позволяет получить зрелые дендритные клетки, экспрессирующие на своей поверхности CD1a, CD14low, CD83, CD86, IL-10low, CCR7 и IL-12p70 и имеющие стабильный фенотип низкого продуцирования IL-10. Для чего клетки-предшественники (моноциты) и незрелые дендритные клетки культивируют в присутствии факторов созревания и дифференцировки, таких как GM-CSF, IL-4 и TNF-a, при температуре от 31 до 37°С. Известный способ обладает ограниченной областью применения, так как полученные зрелые дендритные клетки используют для индуцирования иммунного ответа только против злокачественных образований и инфекционных болезней [4].Closest to the proposed is a method for producing mature dendritic cells to induce an immune response. The known method allows to obtain mature dendritic cells expressing on their surface CD1a, CD14 low , CD83, CD86, IL-10 low , CCR7 and IL-12p70 and having a stable phenotype of low IL-10 production. For this, precursor cells (monocytes) and immature dendritic cells are cultured in the presence of maturation and differentiation factors, such as GM-CSF, IL-4 and TNF-a, at a temperature of 31 to 37 ° C. The known method has a limited scope, since the obtained mature dendritic cells are used to induce an immune response only against malignant tumors and infectious diseases [4].
Новая техническая задача - разработка нового способа получения дендритных клеток активированных инфекционным антигеном Opisthorchis felineus.A new technical task is the development of a new method for producing dendritic cells activated by the infectious antigen Opisthorchis felineus.
Для решения поставленной задачи в способе нагрузки дендритных клеток антигеном инфекционного происхождения Opisthorchis felineus, включающем выделение фракции периферических мононуклеарных клеток (МНК) из венозной крови, процедуру выделения моноцитов из МНК, помещение выделенных моноцитов в полную питательную культуральную среду с цитокинами и ростовыми факторами, индукцию созревания дендритных клеток с использованием липополисахаридов E.coli, выделение моноцитов из МНК венозной крови проводят с использованием двойного градиента плотности перколла 47.5% SIP и 15% SIP соответственно, при охлаждении до +4°С, после чего выделенные моноциты помещают в полную питательную культуральную среду с добавлением 20 нг/мл ИЛ4 и 20 нг/мл ГМ-КСФ, при этом замену полной питательной культуральной среды с цитокинами и ростовыми факторами осуществляют на 3 стуки культивирования, дополнительно антиген инфекционного происхождения Opisthorchis felineus в дозе 40 мкг/мл добавляют на 4 сутки культивирования одновременно с липополисахаридом E.coli серотип 055:В5 в дозе 1 мкг/мл, после чего на 6 сутки культивирования дендритные клетки отмывают и анализируют методом проточной цитофлюориметрии.To solve the problem in a method of loading dendritic cells with an antigen of infectious origin Opisthorchis felineus, including the isolation of a fraction of peripheral mononuclear cells (MNCs) from venous blood, the procedure for isolating monocytes from MNCs, placing the isolated monocytes in a complete culture medium with cytokines and growth factors, induction of maturation dendritic cells using E.coli lipopolysaccharides; monocyte isolation from venous blood MNCs is performed using a double density gradient ne call 47.5% SIP and 15% SIP, respectively, when cooled to + 4 ° C, after which the isolated monocytes are placed in a complete culture medium with the addition of 20 ng / ml IL4 and 20 ng / ml GM-CSF, while replacing the full nutrient culture media with cytokines and growth factors are carried out on 3 knockings of cultivation, in addition, an antigen of infectious origin Opisthorchis felineus at a dose of 40 μg / ml is added on the 4th day of cultivation simultaneously with E. coli lipopolysaccharide serotype 055: B5 at a dose of 1 μg / ml, then 6 day cultivation dendritic cells The lathes are washed and analyzed by flow cytometry.
Результатом разработанного способа является получение активированных дендритных клеток, способных инициировать антиген-специфический иммунный ответ.The result of the developed method is the production of activated dendritic cells capable of initiating an antigen-specific immune response.
Способ осуществляют следующим образом.The method is as follows.
1) Выделение фракции периферических мононуклеарных клеток (МНК)1) Isolation of the fraction of peripheral mononuclear cells (MNC)
В стерильную пластиковую пробирку объемом 50 мл («Falcon», США) вносят периферическую венозную кровь, разбавленную в соотношении 1:4 с помощью бессывороточной среды RPMI-1640. На дно пробирки с кровью наслаивают 10 мл раствора фиколла плотностью 1,077 г/см3. Центрифугируют при 2000 об/мин на центрифуге «NF400R» (Турция) в течение 25 минут при комнатной температуре. Сбор клеток интерфазного кольца осуществляют с помощью пастеровской пластиковой трансфер-пипетки («Sigma-Aldrich», США). Собранные клетки переносят в стерильную пластиковую пробирку объемом 50 мл и дважды отмывают с помощью бессывороточной среды RPMI-1640, либо раствором Хэнкса («ПанЭко», Россия) при 2000 об/мин в течение 10 минут. После второй отмывки клетки ресуспендируют в полной среде RPMI-1640, содержащей эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС) («Sigma-Aldrich», США).Peripheral venous blood diluted 1: 4 with RPMI-1640 serum-free medium was added to a 50 ml sterile plastic tube (Falcon, USA). At the bottom of the tube with blood layered 10 ml of ficoll solution with a density of 1.077 g / cm 3 . Centrifuged at 2000 rpm in a centrifuge "NF400R" (Turkey) for 25 minutes at room temperature. Interphase ring cells are harvested using a Pasteur plastic transfer pipette (Sigma-Aldrich, USA). The collected cells are transferred to a sterile 50 ml plastic tube and washed twice using serum-free medium RPMI-1640 or Hanks solution (PanEco, Russia) at 2000 rpm for 10 minutes. After a second wash, the cells were resuspended in complete RPMI-1640 medium containing fetal calf serum (ETS) (Sigma-Aldrich, USA).
2) Процедура выделения моноцитов из МНК венозной крови.2) The procedure for isolating monocytes from MNCs of venous blood.
Выделение моноцитов из МНК крови проводят с использованием двойного градиента плотности перколла (1,131 г/см3, рН=8.5-9.5, «Sigma», США). До начала процедуры выделения моноцитов готовят раствор стандартного изотонического перколла (Standart Isotone Percoll) (SIP). Для этого к 1 мл 10-кратного забуференного фосфатного раствора (25 гр NaCl, 0.25 гр Na2HPO4 и 4.2 гр KH2PO4 доводят дистилированной водой до 400 мл, рН=7,2-7,4) добавляют 9 мл перколла с плотностью 1,131 г/см3. С использованием SIP и неполной среды RPMI готовят 2 градиента плотности перколла: 47.5% SIP (5226 мкл SIP смешивают с 5776 мкл RPMI из расчета на 2 пробы) и 15% SIP (к 750 мкл SIP добавляют 4250 мкл RPMI из расчета на 2 пробы).The isolation of monocytes from blood MNCs is carried out using a double gradient of percoll density (1.131 g / cm 3 , pH = 8.5-9.5, Sigma, USA). Prior to the monocyte isolation procedure, a solution of standard Isotone Percoll (SIP) is prepared. For this, to 1 ml of a 10-fold buffered phosphate solution (25 g of NaCl, 0.25 g of Na 2 HPO4 and 4.2 g of KH 2 PO 4 is adjusted with distilled water to 400 ml, pH = 7.2-7.4) add 9 ml of percoll density 1,131 g / cm 3 . Two percoll density gradients are prepared using SIP and an incomplete RPMI medium: 47.5% SIP (5226 μl SIP mixed with 5776 μl RPMI per 2 samples) and 15% SIP (4250 μl RPMI per 2 samples added to 750 μl SIP) .
Измеряют объем полученного после двукратной отмывки осадка МНК и добавляют RPMI в таком количестве, чтобы общий объем клеточной суспензии в пробе составил 1 мл. К полученному объему клеток добавляют 1,5 мл SIP. Далее суспензию переносят в стерильные пробирки объемом 15 мл. На поверхность клеточной суспензии медленно по стенке пробирки наслаивают 5 мл 47.5% SIP, а затем сверху также по стенке вносят 2 мл 15% SIP. Пробы центрифугируют в течение 45 мин при 3500 об/мин и при охлаждении до 4°С. После центрифугирования получают 2 кольца: верхнее кольцо является моноцитарным, в нижнем кольце находятся МНК, эритроциты осаждаются на дно пробирки. Моноцитарное кольцо собирают в отдельную стерильную пробирку пастеровской трансфер-пипеткой и дважды отмывают с помощью бессывороточной RPMI-1640 при 2000 об/мин в течение 10 минут.The volume of the MNC precipitate obtained after washing twice was measured and RPMI was added in such an amount that the total volume of the cell suspension in the sample was 1 ml. 1.5 ml of SIP is added to the resulting cell volume. The suspension is then transferred to sterile 15 ml tubes. 5 ml of 47.5% SIP are slowly layered on the surface of the cell suspension along the wall of the tube, and then 2 ml of 15% SIP are also deposited on top of the wall. Samples are centrifuged for 45 min at 3500 rpm and upon cooling to 4 ° C. After centrifugation, 2 rings are obtained: the upper ring is monocytic, the MNCs are in the lower ring, red blood cells are deposited on the bottom of the tube. The monocytic ring is collected in a separate sterile tube with a Pasteur transfer pipette and washed twice with serum-free RPMI-1640 at 2000 rpm for 10 minutes.
Собранные моноциты используют для приготовления суспензии с концентрацией 5×105 клеток/мл. Суспензию готовят на основе среды RPMI-1640, содержащей 10% ЭТС, 50 мкМ β-меркаптоэтанола («Sigma-Aldrich», США), 2 мМ L-глутамина («Панэко», Россия), 50000 ед./литр пенициллина («Панэко», Россия), 50 г/л стрептомицина («Панэко», Россия), 11 мг/л пирувата натрия («Панэко», Россия).The collected monocytes are used to prepare a suspension with a concentration of 5 × 10 5 cells / ml. The suspension is prepared on the basis of RPMI-1640 medium containing 10% ETS, 50 μM β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich, USA), 2 mM L-glutamine (Paneko, Russia), 50,000 units / liter of penicillin (" Paneko ”, Russia), 50 g / l of streptomycin (Paneko, Russia), 11 mg / l of sodium pyruvate (Paneko, Russia).
3) Культивирование дендритных клеток из моноцитов3) Cultivation of dendritic cells from monocytes
Выделенные моноциты с концентрацией 5×105 клеток/мл помещают в 24-луночные пластиковые культуральные планшеты («Nunclon», Дания) в объеме 1 мл на лунку. Клетки инкубируют в течение 1 часа в СО2 инкубаторе во влажной атмосфере 5% СО2 при +37°С. Далее из каждой лунки отбирают по 1 мл среды, взамен добавляя по 1 мл полной среды RPMI, содержащей ИЛ-4 («ProSpec», США; 20 нг/мл) и ГМ-КСФ («ProSpec», США; 20 нг/мл). Замену питательной среды с цитокинами на свежую проводят на 3 день культивирования. На 4 день индуцируют созревание дендритных клеток с использованием липополисахарида бактериального происхождения (L2880 - 055:В5, «Sigma-Aldrich», США). Стимуляцию дендритных клеток инфекционным антигеном Opisthorchis felineus проводят также на 4 день согласно схеме на Фиг.1. Рабочая доза антигена Opisthorchis felineus в культуральной лунке составляет 40 мкг/мл. На Фиг 2. приведена схема культивирования дендритных клеток из моноцитов периферической крови в условиях активации Opisthorchis felineusIsolated monocytes with a concentration of 5 × 10 5 cells / ml are placed in 24-well plastic culture plates (Nunclon, Denmark) in a volume of 1 ml per well. Cells are incubated for 1 hour in a CO 2 incubator in a humid atmosphere of 5% CO 2 at + 37 ° C. Then, 1 ml of medium is taken from each well, and 1 ml of complete RPMI medium containing IL-4 (ProSpec, USA; 20 ng / ml) and GM-CSF (ProSpec, USA; 20 ng / ml) is added in exchange ) A nutrient medium with cytokines is replaced with a fresh one on the 3rd day of cultivation. On day 4, dendritic cell maturation was induced using a lipopolysaccharide of bacterial origin (L2880-055: B5, Sigma-Aldrich, USA). Stimulation of dendritic cells with the infectious antigen Opisthorchis felineus is also carried out on day 4 according to the scheme in figure 1. The working dose of the Opisthorchis felineus antigen in the culture well is 40 μg / ml. Figure 2. shows a diagram of the cultivation of dendritic cells from peripheral blood monocytes in the conditions of activation of Opisthorchis felineus
Предложенная доза гельминтного антигена Opisthorchis felineus является оптимальной для моделирования иммунного ответа на основе культуры дендритных клеток в ответ на инфекционный стимул с целью разработки подходов для терапии аллергических заболеваний на основе клеточных технологий.The proposed dose of the helminth antigen Opisthorchis felineus is optimal for modeling the immune response based on the culture of dendritic cells in response to an infectious stimulus in order to develop approaches for the treatment of allergic diseases based on cell technologies.
Перколл - сбалансированная среда для центрифугирования в градиенте плотности клеток и субклеточных структур. Центрифугирование приводит к гетерогенному распределению клеток и частиц разных размеров в среде. Концентрации градиентов плотности перколла (47,5% и 15%) для выделения моноцитов из МНК периферической крови подобраны авторами экспериментальным путем. Для выбора оптимальной плотности растворов SIP проводили измерение коэффициентов преломления приготовленных растворов на лабораторном рефрактометре по отношению к сахарозному градиенту. Экспериментальные работы с использованием концентрации SIP 47,5% и 34% соответственно приводили к меньшему выходу моноцитов после проведения центрифугирования, по сравнению с количеством клеток при заявленной плотности растворов SIP.Percoll is a balanced medium for centrifugation in a gradient of cell density and subcellular structures. Centrifugation leads to a heterogeneous distribution of cells and particles of different sizes in the medium. The concentrations of percoll density gradients (47.5% and 15%) for isolating monocytes from peripheral blood MNCs were selected experimentally by the authors. To select the optimal density of SIP solutions, we measured the refractive indices of the prepared solutions on a laboratory refractometer with respect to the sucrose gradient. Experimental work using SIP concentrations of 47.5% and 34%, respectively, resulted in a lower monocyte yield after centrifugation compared to the number of cells at the stated density of SIP solutions.
ЛПС - липополисахариды клеточной стенки бактерий E.coli (штамм L2880-055:В5) добавляются к антиген-активированным дендритным клетками для индукции созревания последних. Оптимальная для индукции созревания дендритных клеток доза ЛПС 1 мкг/мл подобрана авторами в эксперименте. Эта доза является достаточной по сравнению с использованием меньших концентраций ЛПС для стимулирования ДК в условиях активации антигеном Opisthorchis felineus и получения оптимального количества зрелых ДК.LPS - lipopolysaccharides of the bacterial cell wall of E. coli (strain L2880-055: B5) are added to antigen-activated dendritic cells to induce maturation of the latter. The optimal LPS dose of 1 μg / ml for the induction of dendritic cell maturation was selected by the authors in the experiment. This dose is sufficient in comparison with the use of lower concentrations of LPS to stimulate DC in the conditions of activation of the Opisthorchis felineus antigen and to obtain the optimal number of mature DCs.
Время культивации, концентрации используемых цитокинов, а также доза гельминтного антигена Opisthorchis felineus подобраны авторами экспериментально с целью получения максимального количества зрелых активированных дендритных клеток, способных вызвать антиген-специфический иммунный ответ. Культивирование моноцитов в течение 6 дней в полной питательной среде с цитокинами и ростовыми факторами приводило к получению зрелых ДК. При сокращении времени культивирования (4 дня) выход зрелых ДК снижался, большая часть клеток обладала свойствами незрелых ДК. Культивирование ДК более 6 дней приводило к появлению стареющих и нежизнеспособных клеток.The cultivation time, the concentration of cytokines used, as well as the dose of the helminth antigen Opisthorchis felineus were selected by the authors experimentally in order to obtain the maximum number of mature activated dendritic cells that can cause an antigen-specific immune response. The cultivation of monocytes for 6 days in a complete nutrient medium with cytokines and growth factors resulted in mature DCs. With a reduction in cultivation time (4 days), the yield of mature DCs decreased, most of the cells possessed the properties of immature DCs. Cultivation of DC for more than 6 days led to the appearance of aging and non-viable cells.
Добавление в культуральную питательную среду ИЛ4 и ГМ-КСФ в меньшей чем 20 нг/мл концентрации приводило к снижению дифференцировки моноцитов в ДК, и в целом, к получению меньшего количества ДК на 6 день культивирования. Подобранные дозы ИЛ4 и ГМ-КСФ являются достаточными для выращивания ДК. Использование больших доз ИЛ4 и ГМ-КСФ является нецелесообразным в связи с дороговизной этих реактивов.Adding to the culture medium IL4 and GM-CSF in a concentration of less than 20 ng / ml led to a decrease in the differentiation of monocytes in DC, and in general, to obtain a smaller amount of DC on the 6th day of cultivation. Selected doses of IL4 and GM-CSF are sufficient for growing DC. The use of large doses of IL4 and GM-CSF is impractical due to the high cost of these reagents.
Фенотип дендритных клеток подтвержден экспериментально методом проточной цитофлюориметрии на цитофлюориметре FacsCalibur (Becton Dickinson, США). Исследование экспрессии поверхностных кластеров детерминации дендритных клеток проведено при помощи соответствующих моноклональных антител. Определен уровень экспрессии CD209 (PerCP, «BD PharmingenTM», США), костимулирующей молекулы - CD86/B7-2 (FITC, «BD PharmingenTM», США); молекулы антигенного представления МНС I и II классов (HLA-DR, FITC, «BD Biosciences», США) и маркера терминальной дифференцировки дендритных клеток - CD83 (РЕ, «BD PharmingenTM», США). Анализ погибших клеток был проведен с использованием красителя для оценки жизнеспособности клеток 7-AAD (BD Bioscinces, США). Принцип действия 7-AAD заключается в окрашивании погибших клеток при проникновении только через поврежденную мембрану клетки и связывании с двухцепочечной ДНК.The phenotype of dendritic cells was experimentally confirmed by flow cytometry using a FacsCalibur cytofluorimeter (Becton Dickinson, USA). The study of the expression of surface clusters of dendritic cell determination was carried out using the appropriate monoclonal antibodies. The expression level of CD209 (PerCP, BD PharmingenTM, USA), costimulatory molecule CD86 / B7-2 (FITC, BD PharmingenTM, USA) was determined; molecules of the antigenic presentation of MHC classes I and II (HLA-DR, FITC, BD Biosciences, USA) and a marker for terminal differentiation of dendritic cells - CD83 (PE, BD PharmingenTM, USA). The analysis of dead cells was performed using a dye to assess the viability of 7-AAD cells (BD Bioscinces, USA). The principle of action of 7-AAD is to stain dead cells by penetrating only through the damaged cell membrane and binding to double-stranded DNA.
Время культивации, концентрации используемых цитокинов, а также доза гельминтного антигена Opisthorchis felineus 40 мкг/мл подобраны авторами эмпирически в результате проведения ряда экспериментов с целью получения максимального количества зрелых активированных дендритных клеток, способных вызвать антиген-специфический иммунный ответ.The cultivation time, the concentration of cytokines used, as well as the dose of the helminth antigen Opisthorchis felineus 40 μg / ml were selected empirically by the authors as a result of a series of experiments in order to obtain the maximum number of mature activated dendritic cells that can cause an antigen-specific immune response.
Способность Opisthorchis felineus модулировать иммунный ответ была проанализирована при совместном культивировании с дендритными клетками в течение 48 часов, являющимися ключевыми антиген-представляющими клетками, ответственными за генерацию и направленность иммунного ответа. Установление особенностей взаимодействия антигена Opisthorchis felineus и дендритных клеток по характеру изменения фенотипических характеристик дендритных клеток и их способности к созреванию необходимо для дальнейшего исследования поляризации иммунного ответа. Для культивирования в предлагаемом способе была подобрана и выбрана рабочая (конечная) доза гельминтного антигена Opisthorchis felineus - 40 мкг/мл, являющаяся оптимальной для моделирования иммунного ответа на основе дендритных клеток в ответ на инфекционный стимул.The ability of Opisthorchis felineus to modulate the immune response was analyzed by co-cultivation with dendritic cells for 48 hours, which are key antigen-presenting cells responsible for generating and directing the immune response. The determination of the interaction characteristics of the Opisthorchis felineus antigen and dendritic cells by the nature of the change in the phenotypic characteristics of dendritic cells and their ability to mature is necessary for further study of the polarization of the immune response. For cultivation in the proposed method, a working (final) dose of the helminth antigen Opisthorchis felineus - 40 μg / ml, which is optimal for modeling an immune response based on dendritic cells in response to an infectious stimulus, was selected and selected.
Отличием предлагаемого способа является методический подход, включающий осуществление последовательных этапов выделения МНК и моноцитов с использованием градиента плотности фиколла (1,077 г/см3) и двойного ступенчатого градиента плотности перколла (1,131 г/см3) соответственно, позволяющих получить достаточное количество моноцитов для последующего культивирования дендритных клеток.The difference of the proposed method is a methodological approach, which includes the implementation of successive stages of the selection of MNCs and monocytes using a density gradient of ficoll (1.077 g / cm 3 ) and a double step density gradient of percoll (1.131 g / cm 3 ), respectively, allowing to obtain a sufficient number of monocytes for subsequent cultivation dendritic cells.
В результате выделения на градиенте плотности фиколла (1,077 г/см) была получена фракция МНК периферической крови, представленная лимфоцитами и моноцитами. Для начальной характеристики клеточных популяций использовали показатели бокового (side scatter, SSC) и переднего (forward scatter, FSC) светорассеивания, полученные с помощью проточной цитофлуориметрии.As a result of isolation on a density gradient of ficoll (1.077 g / cm), a peripheral blood MNC fraction was obtained, represented by lymphocytes and monocytes. For the initial characterization of cell populations, side scatter (SSC) and forward scatter (FSC) scatterings obtained using flow cytometry were used.
Согласно результатам анализа по вышеперечисленным параметрам, моноциты составили порядка пятой части (14%-23%) от фракции МНК (Фиг.2а, область R1). Лимфоциты, характеризующиеся низкими сигналами SSC/FSC, представляли 70%-80% клеточной массы МНК (Фиг.2а, область R2). После разделения лимфоцитов и моноцитов с использованием двойного градиента плотности перколла (1,131 г/см3), клеточная фракция, собранная с раздела фаз, содержала 74,2±5,5% клеток, имеющих средние показатели SSC/FSC, характерные для моноцитов (Фиг.2б, область R1).According to the results of the analysis according to the above parameters, monocytes amounted to about one fifth (14% -23%) of the MNC fraction (Fig. 2a, region R1). Lymphocytes characterized by low SSC / FSC signals represented 70% -80% of the MNC cell mass (Fig. 2a, region R2). After separation of lymphocytes and monocytes using a double gradient of percoll density (1.131 g / cm 3 ), the cell fraction collected from the phase separation contained 74.2 ± 5.5% of cells having average SSC / FSC values characteristic of monocytes (Fig. .2b, region R1).
Пример на выполнение способаAn example of the method
Материалом для исследования служила венозная кровь здорового волонтера. В ходе выполнения центрифугирования с использованием градиента плотности фиколла (1,077 г/см3) и двойного ступенчатого градиента плотности перколла (1,131 г/см3) соответственно были получены моноциты периферической крови. Далее выделенные моноциты в концентрации 5×105 клеток/мл помещали в 24-луночные пластиковые культуральные планшеты и культивировали в полной среде RPMI, содержащей ИЛ-4 (20 нг/мл) и ГМ-КСФ (20 нг/мл) в CO2 инкубаторе во влажной атмосфере 5% CO2 при +37°С.The material for the study was the venous blood of a healthy volunteer. During centrifugation using a density gradient of ficoll (1.077 g / cm 3 ) and a double step gradient of density of percoll (1.131 g / cm 3 ), respectively, peripheral blood monocytes were obtained. Next, the isolated monocytes at a concentration of 5 × 10 5 cells / ml were placed in 24-well plastic culture plates and cultured in complete RPMI medium containing IL-4 (20 ng / ml) and GM-CSF (20 ng / ml) in CO 2 incubator in a humid atmosphere of 5% CO 2 at + 37 ° C.
На 3 день культивирования проводили замену питательной среды с цитокинами. На 4 день индуцировали созревание ДК в присутствии ЛПС. Для получения антиген-активированных ДК на 4 день проводили стимуляцию инфекционным антигеном Opisthorchis felineus. Для фенотипической характеристики ДК исследовали уровень экспрессии CD209 (PerCP); костимулирующей молекулы - CD86/B7-2 (FITC); молекулы антигенного представления МНС I и II классов (HLA-DR, FITC) и маркера терминальной дифференцировки дендритных клеток - CD83 (РЕ) методом проточной цитофлюориметрии.On the 3rd day of cultivation, a nutrient medium with cytokines was replaced. On day 4, DC maturation was induced in the presence of LPS. To obtain antigen-activated DCs, stimulation with the infectious antigen Opisthorchis felineus was performed on day 4. For phenotypic characterization of DCs, the expression level of CD209 (PerCP) was studied; costimulatory molecule - CD86 / B7-2 (FITC); molecules of the antigenic presentation of MHC classes I and II (HLA-DR, FITC) and a marker of terminal differentiation of dendritic cells - CD83 (PE) by flow cytometry.
В рамках подбора дозы антигена использовали серийные разведения Opisthorchis felineus в трех рабочих концентрациях - 160, 40 и 10 мкг/мл, при этом конечная концентрация антигена в культуральной лунке составляла 40, 10 и 2.5 мкг/мл. Все выбранные концентрации антигена (40, 10, 2.5 мкг/мл) в присутствии ЛПС оказались достаточными для индукции созревания ДК, однако использование дозы антигена 40 мкг/мл приводило к наиболее выраженной экспрессии фенотипических маркеров на поверхности ДК. При этом клетки оставались жизнеспособными и обладали зрелым фенотипом. Анализ уровня жизнеспособности клеток проводили на основании измерения содержания ДНК с применением внутриядерного красителя 7AAD, уровень клеточного апотоза не превышал 15%. Экспрессия поверхностного маркера CD209 на полученных ДК составила 69%; выявлено 35% и 40% экспрессии маркера терминальной дифференцировки (CD83) и костимулирующей молекулы CD86 соответственно. Выраженность маркера HLA-DR оказалась наибольшей и составила 95% соответственно.As part of the selection of the antigen dose, serial dilutions of Opisthorchis felineus were used in three working concentrations - 160, 40 and 10 μg / ml, while the final concentration of antigen in the culture well was 40, 10 and 2.5 μg / ml. All selected antigen concentrations (40, 10, 2.5 μg / ml) in the presence of LPS were sufficient to induce DC maturation, however, the use of a dose of 40 μg / ml antigen led to the most pronounced expression of phenotypic markers on the surface of DCs. At the same time, the cells remained viable and possessed a mature phenotype. The analysis of cell viability was carried out on the basis of measuring the DNA content using intranuclear dye 7AAD, the level of cell apotosis did not exceed 15%. The expression of the surface marker CD209 on the obtained DC was 69%; 35% and 40% of expression of the terminal differentiation marker (CD83) and costimulatory molecule CD86 were detected, respectively. The severity of the HLA-DR marker was the highest and amounted to 95%, respectively.
Приложениеapplication
Фиг 1. Способ нагрузки дендритных клеток инфекционным антигеном (схема)Fig 1. The method of loading dendritic cells with an infectious antigen (scheme)
Фиг.2. Распределение клеток в зависимости от сигналов бокового (SSC) и переднего светорассеивания (FSC)Figure 2. The distribution of cells depending on the signals of the lateral (SSC) and front light scattering (FSC)
Примечание:Note:
а - популяции мононуклеарных клеток здоровых обследуемых (градиент фиколла 1,077 г/см3)a - populations of mononuclear cells of healthy subjects (ficoll gradient 1,077 g / cm 3 )
б - популяции мононуклеарных клеток здоровых обследуемых (двойной градиент перколла, 1,131 г/см3)b - populations of mononuclear cells of healthy subjects (double gradient of percoll, 1.131 g / cm 3 )
R1 - % моноцитов от мононуклеаров периферической кровиR1 -% of monocytes from peripheral blood mononuclear cells
R2 - % лимфоцитов от мононуклеаров периферической кровиR2 -% of lymphocytes from peripheral blood mononuclear cells
Список источников информацииList of sources of information
1. Ильинских Е.Н. Актуальные вопросы изучения проблемы описторхоза в Сибири. / Е.Н.Ильинских // Бюллетень сибирской медицины. - 2002. - №1. - с.63-69.1. Ilyinsky E.N. Actual questions of studying the problem of opisthorchiasis in Siberia. / E.N.Ilinsky // Bulletin of Siberian medicine. - 2002. - No. 1. - p. 63-69.
2. Огородова Л. Сравнительная характеристика содержания IgE у детей с атоническими заболеваниями, протекающими на фоне персистирующих инфекций. / Л.М.Огородова, О.В.Козина, В.Ф.Раенко и др. // Аллергология. - 2005. - №1. - с.13-17.2. Ogorodova L. Comparative characteristics of the content of IgE in children with atonic diseases occurring against the background of persistent infections. / L.M. Ogorodova, O.V. Kozina, V.F. Raenko and others // Allergology. - 2005. - No. 1. - p.13-17.
3. Способ получения стимулированных дендритных клеток для индукции иммунного ответа против туберкулеза человека: пат. 2401664 Рос.Федерация: МПК: А61К А61Р C12N / Е.А.Алямкина; заявл. 03.08.2009; опубл. 20.10.2010, Электрон, дан. - Режим доступа: http://bankpatentov.ru/node/461753. A method of obtaining stimulated dendritic cells for the induction of an immune response against human tuberculosis: US Pat. 2401664 Russian Federation: IPC: A61K A61P C12N / E.A. Alamkina; declared 08/03/2009; publ. 10/20/2010, Electron, dan. - Access mode: http://bankpatentov.ru/node/46175
4. Способ получения зрелых дендритных клеток для индуцирования иммунного ответа и применение полученных клеток: ЕР 200801385: МПК: C12N 5/00 А61К 39/00 А61Р 35/00 А61Р 31/12 / А. Киркин; заявитель и патентообладатель. - Дандрит Биотек А/С; заявл. 08.12.2005; опубл. 30.10.2008, Бюл. №3 http://www.eapo.org/rus/bulletin/ea201103/HTML/015266.html4. A method of producing mature dendritic cells to induce an immune response and the use of the obtained cells: EP 200801385: IPC: C12N 5/00 A61K 39/00 A61P 35/00 A61P 31/12 / A. Kirkin; Applicant and patent holder. - Dandrite Biotek A / C; declared 12/08/2005; publ. 10/30/2008, Bull. No. 3 http://www.eapo.org/eng/bulletin/ea201103/HTML/015266.html
5. Шевченко Ю.А. Влияние антиген-активированных дендритных клеток на функциональные свойства мононуклеарных клеток периферической крови больных туберкулезом: дис. … канд. биол. наук / Ю.А.Шевченко. - Новосибирск, 2008. - 108 с.5. Shevchenko Yu.A. The effect of antigen-activated dendritic cells on the functional properties of peripheral blood mononuclear cells of patients with tuberculosis: dis. ... cand. biol. Sciences / Yu.A. Shevchenko. - Novosibirsk, 2008 .-- 108 s.
6. Cai X.Q. Sequences and gene organization of the mitochondrial genomes of the liver flukes Opisthorchis viverrini and Clonorchis sinensis (Trematoda). / X.Q.Cai, G.H.Liu, H.Q.Song et al. // Parasitol. Res. - 2011. - May 31. [Epub ahead of print].6. Cai X.Q. Sequences and gene organization of the mitochondrial genomes of the liver flukes Opisthorchis viverrini and Clonorchis sinensis (Trematoda). / X.Q. Cai, G.H. Liu, H.Q.Song et al. // Parasitol. Res. - 2011. - May 31. [Epub ahead of print].
7. Hamilton C.M. The Fasciola hepatica tegumental antigen suppresses dendritic cell maturation and function. / C.M.Hamilton, D.J.Dowling, C.E.Loscher, R.M.Morphew et al // Infect. Immun. - 2009. - Vol.77(6). - P.2488-2498.7. Hamilton C.M. The Fasciola hepatica tegumental antigen suppresses dendritic cell maturation and function. / C. M. Hamilton, D. J. Dowling, C. E. Loscher, R. M. Morphew et al // Infect. Immun. - 2009 .-- Vol.77 (6). - P.2488-2498.
8. Stijn C.M. Schistosoma mansoni worm glycolipids induce an inflammatory phenotype in human dendritic cells by cooperation of TLR4 and DC-SIGN. / C.M.Stijn, S.Meyer, М.van den Broek, S.C.Bruijns, et al // Mol. Immunol. - 2010. - Vol.47 (7-8). - P.1544-1552.8. Stijn C.M. Schistosoma mansoni worm glycolipids induce an inflammatory phenotype in human dendritic cells by cooperation of TLR4 and DC-SIGN. / C. M. Stijn, S. Meyer, M. van den Broek, S. C. Bruijns, et al // Mol. Immunol. - 2010 .-- Vol. 47 (7-8). - P.1544-1552.
9. Wongratanacheewin, S. Immunology and molecular biology of Opisthorchis viverrni infection. / S.Wongratanacheewin, R.W.Sermswan, S.Sirisinha // Acta tropica. - 2003. - Vol.88. - P.195-207.9. Wongratanacheewin, S. Immunology and molecular biology of Opisthorchis viverrni infection. / S. Wongratanacheewin, R.W. Sermswan, S. Sirisinha // Acta tropica. - 2003. - Vol. 88. - P.195-207.
Claims (1)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2011154555/10A RU2486238C1 (en) | 2011-12-29 | 2011-12-29 | METHOD OF LOADING DENDRITIC CELLS WITH ANTIGEN OF INFECTIOUS ORIGIN Opistorchis felineus |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2011154555/10A RU2486238C1 (en) | 2011-12-29 | 2011-12-29 | METHOD OF LOADING DENDRITIC CELLS WITH ANTIGEN OF INFECTIOUS ORIGIN Opistorchis felineus |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2486238C1 true RU2486238C1 (en) | 2013-06-27 |
Family
ID=48702216
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2011154555/10A RU2486238C1 (en) | 2011-12-29 | 2011-12-29 | METHOD OF LOADING DENDRITIC CELLS WITH ANTIGEN OF INFECTIOUS ORIGIN Opistorchis felineus |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2486238C1 (en) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999033479A1 (en) * | 1997-12-31 | 1999-07-08 | University Of Iowa Research Foundation | Use of parasitic biological agents for prevention and control of autoimmune diseases |
US20040253574A1 (en) * | 2000-08-24 | 2004-12-16 | Gerold Schuler | Method for producing ready to use, antigen loaded or unloaded, cryconserved mature dendritic cells |
EA200801385A1 (en) * | 2005-12-08 | 2008-10-30 | Дандрит Биотек А/С | METHOD OF FORMATION OF DENDRITIC CELLS WITH APPLICATION OF REDUCED TEMPERATURE |
-
2011
- 2011-12-29 RU RU2011154555/10A patent/RU2486238C1/en active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999033479A1 (en) * | 1997-12-31 | 1999-07-08 | University Of Iowa Research Foundation | Use of parasitic biological agents for prevention and control of autoimmune diseases |
US20040253574A1 (en) * | 2000-08-24 | 2004-12-16 | Gerold Schuler | Method for producing ready to use, antigen loaded or unloaded, cryconserved mature dendritic cells |
EA200801385A1 (en) * | 2005-12-08 | 2008-10-30 | Дандрит Биотек А/С | METHOD OF FORMATION OF DENDRITIC CELLS WITH APPLICATION OF REDUCED TEMPERATURE |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10626371B2 (en) | Co-differentiation of monocytes from allogeneic donors | |
Zhang et al. | Plumbagin suppresses dendritic cell functions and alleviates experimental autoimmune encephalomyelitis | |
Pedersen et al. | Dendritic cells modified by vitamin D: future immunotherapy for autoimmune diseases | |
CN107365742B (en) | CD4+T cell-derived exosomes and use thereof | |
JPWO2014136845A1 (en) | Method for producing mature dendritic cell population | |
RU2486238C1 (en) | METHOD OF LOADING DENDRITIC CELLS WITH ANTIGEN OF INFECTIOUS ORIGIN Opistorchis felineus | |
AU2011260606B2 (en) | Novel interferon-alpha-producing bone marrow dendritic cells | |
Kim et al. | Generation of functionally mature dendritic cells from elutriated monocytes using polyinosinic: polycytidylic acid and soluble CD40 ligand for clinical application | |
Tan et al. | Stimulating surface molecules, Th1-polarizing cytokines, proven trafficking—a new protocol for the generation of clinical-grade dendritic cells | |
Jung et al. | CD8alpha+ dendritic cells enhance the antigen-specific CD4+ T-cell response and accelerate development of collagen-induced arthritis | |
Zhou et al. | The secretions products from invading cercariae of S. japonicum (0–3hRP) restrain mouse dendritic cells to mature | |
ES2927913B2 (en) | Composition comprising a combination of the furanocoumarins psoralen and angelicin and its use in therapy | |
Gabriela et al. | Phenotypical and functional characterization of non-human primate Aotus spp. dendritic cells and their use as a tool for characterizing immune response to protein antigens | |
Takei et al. | Cryptomerione induces Th1 cell polarization via influencing IL-10 production by cholera toxin-primed dendritic cells | |
Dáňová | The role of the immune system in the immunopathogenesis of autoimmune diseases and the therapeutic modulation of autoimmune reaction by tolerogenic dendritic cells | |
Nguyen et al. | Induction of Antitumor Immunity by Exosomes Isolated from Cryopreserved Cord Blood Monocyte-Derived Dendritic Cells | |
Gillet-Hladky et al. | Induction of high expression of CCR7 and high production of IL-12 in human monocyte-derived dendritic cells by a new bacterial component: LCOS 1013 | |
Heidegger | Tissue-specific migration: The effect of innate immune activation on lymphocyte homing to the gastrointestinal tract | |
Nizza | DC subsets have differing capabilities to stimulate proliferation and homing marker expression | |
Rigby | Intestinal dendritic cells: Characterisation of the colonic dendritic cell population and identification of potential precursors |