RU2482182C1

RU2482182C1 - MULTIPOTENT MESENCHYMAL STEM CELL CULTURE RECOVERED FROM BOVINE FATTY TISSUE (Medulla ossium Bos taurus) FOR PURPOSES OF VETERINARY SCIENCE, CELL AND TISSUE ENGINEERING

Info

Publication number: RU2482182C1
Application number: RU2011149132/10A
Authority: RU
Inventors: Екатерина Владимировна Викторова; Ирина Михайловна Волкова; Ирина Петровна Савченкова; Михаил Иванович Гулюкин
Priority date: 2011-12-02
Filing date: 2011-12-02
Publication date: 2013-05-20

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention refers to veterinary medicine and biotechnology, and concerns a bovine multipotent mesenchymal stem cell (MMSC) culture. The presented culture is recovered from the bovine fatty tissue, possesses the properties and characteristics of the mammalian multipotent mesenchymal stem cell, contains no impurities of hematopoietic and endothelial cells; it is able to be preserved in the culture for a long time and to form the cells of other tissues in induction in vitro: bone, muscle and fatty ones. The described cell culture is deposited in the Special Collection of passaged somatic cell cultures of agricultural and food animals of Kovalenko All-Russian Research Institute of Experimental Veterinary Science (SHZh RASXN), No. 80.

EFFECT: culture may be used in regeneration and repair of tissues and organs of agricultural animals, in studying of the infectious mechanisms at the cellular and tissue levels in vitro; furthermore, the presented cell culture may be used for pathogen growth in vitro.

1 tbl

Description

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной и сельскохозяйственной биотехнологии, в частности к получению культуры мультипотентных мезенхимных стволовых клеток (ММСК) жировой ткани (ЖТ) крупного рогатого скота (крс).The present invention relates to the field of veterinary and agricultural biotechnology, in particular to obtaining a culture of multipotent mesenchymal stem cells (MMSC) adipose tissue (VT) of cattle (cattle).

В биотехнологии промышленного производства до сих пор остается острая необходимость в разработке эффективных способов культивирования и наращивания патогенов in vitro на чувствительных биологических объектах. Известно, что для многих вирусов, например коронавирусов, существует ряд проблем, связанных с отсутствием культур клеток, эффективно обеспечивающих их размножение in vitro. Отсутствие адекватных модельных клеточных систем существенно сдерживает исследования по производству антигенов, диагностических препаратов и вакцин. Перевиваемые культуры клеток, которые используются в этих целях, как правило, иммортализированы и в результате длительного культивирования теряют свою не только тканевую, но и видовую специфичность. Диплоидные культуры клеток, полученные из тканей и органов млекопитающих, сохраняют свою видовую и тканевую специфичность, однако имеют ограниченный период пролиферации in vitro вследствие старения. Известно, что такие клетки не могут in vitro преодолеть более 50 цитогенераций. В связи с этим использование для этих целей стволовых клеток (СК), выделенных из тканей и органов взрослой особи, является актуальным. Особенно перспективными в данном направлении являются ММСК. Эти клетки, как известно, являются структурными и функциональными стержнями различных видов тканей. Известно, что такие клетки способны к самообновлению. ММСК доступны, просты в культивировании, при определенных условиях способны дифференцироваться в различные типы и виды тканей и органов и самое главное не вызывают реакцию иммунного отторжения. Стоит особо отметить еще одно достоинство ММСК - возможность их культивирования в трехмерной структуре. Они могут заселять матрицу-носитель, дифференцироваться в заданном направлении и формировать трехмерные структуры, которые позволяют моделировать ту или иную ткань in vitro. Поэтому ММСК являются перспективным материалом для понимания сложных инфекционных механизмов, происходящих на клеточном и тканевом уровнях in vitro. Также это делает их уникальным материалом для создания новых клеточных систем в сельскохозяйственной биотехнологии и ветеринарии.In the biotechnology of industrial production, there is still an urgent need to develop effective methods for culturing and building up pathogens in vitro on sensitive biological objects. It is known that for many viruses, for example coronaviruses, there are a number of problems associated with the lack of cell cultures that effectively ensure their propagation in vitro. The lack of adequate model cell systems significantly inhibits research on the production of antigens, diagnostic drugs and vaccines. The transplanted cell cultures that are used for this purpose are usually immortalized and, as a result of prolonged cultivation, lose not only tissue, but also species specificity. Diploid cell cultures obtained from mammalian tissues and organs retain their species and tissue specificity, but have a limited period of in vitro proliferation due to aging. It is known that such cells cannot overcome more than 50 cytogenetics in vitro. In this regard, the use for these purposes of stem cells (SC), isolated from tissues and organs of an adult, is relevant. Particularly promising in this direction are MMSK. These cells are known to be structural and functional rods of various types of tissues. It is known that such cells are capable of self-renewal. MMSCs are accessible, easy to cultivate, under certain conditions they are able to differentiate into various types and types of tissues and organs and, most importantly, do not cause an immune rejection reaction. It is worth noting one more advantage of MMSK - the possibility of their cultivation in a three-dimensional structure. They can populate the carrier matrix, differentiate in a given direction and form three-dimensional structures that allow one or another tissue to be modeled in vitro. Therefore, MMSCs are a promising material for understanding the complex infectious mechanisms that occur at the cellular and tissue levels in vitro. It also makes them a unique material for creating new cell systems in agricultural biotechnology and veterinary medicine.

В настоящий момент ведутся разработки по созданию альтернативного источника мяса. Одним из таких подходов является создание пищевых продуктов животного происхождения на основе культивируемой in vitro мышечной ткани при помощи технологий клеточной инженерии, результатов исследований в области культур стволовых клеток, в частности ММСК, а также стремительное развитие нанотехнологий. Имеющиеся и полученные знания и опыт позволят культивировать клетки сельскохозяйственных животных in vitro с возможностью влияния на конечный физико-химический состав получаемой биомассы из данных клеток. Стоит также отметить, что несомненными преимуществами клеток животных, выращенных in vitro, являются отсутствие в их составе патогенных инфекционных агентов, что особенно актуально в современных условиях. Поэтому ММСК являются перспективным биологическим материалом для создания новых клеточных продуктов in vitro для пищевой биотехнологии.Currently, work is underway to create an alternative source of meat. One of these approaches is the creation of food products of animal origin based on in vitro cultured muscle tissue using cell engineering technologies, research results in the field of stem cell cultures, in particular MMSC, as well as the rapid development of nanotechnology. The available and acquired knowledge and experience will allow the cultivation of farm animal cells in vitro with the possibility of influencing the final physicochemical composition of the resulting biomass from these cells. It is also worth noting that the undoubted advantages of animal cells grown in vitro are the absence of pathogenic infectious agents in their composition, which is especially important in modern conditions. Therefore, MMSCs are a promising biological material for the creation of new in vitro cell products for food biotechnology.

Согласно общепринятому мнению КМ является самым подходящим источником для выделения ММСК. Однако использование ММСК КМ ограничено из-за сложности и болезненности забора костного мозга. Прижизненное взятие KM у взрослых особей крс технически сложно осуществить в условиях сельскохозяйственных предприятий. Послеубойное взятие КМ в сравнении с ЖТ также сложно осуществить технически в связи с требованиями ветеринарно-санитарной службы. В последние годы появились сообщения, что ЖТ взрослого организма содержит популяцию клеток с характеристиками, подобными ММСК КМ, которые способны при определенных условиях дифференцироваться в клетки других тканей и органов (Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H., Huang J.I. Futrell W.J., Katz A.J., Benhaim P., Lorenz H.P., Hedric M.H. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies // Tissue. Eng. 2001. V.7. P.211-226; Zuk P.A., Zhu M., Ashijian P., De Ugarte D.A., Huang J.I., Mizuno H., Alfonso Z.C., Fraser J.K., Benhaim P., Hedrick M.H. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells // Mol. Biol. Cell. 2002. V.13. P.4279-4295; Тепляшин А.С., Коржикова С.В., Шарифуллина С.З., Чупикова Н.И., Ростовская М.С., Савченкова И.П. Характеристика мезенхимальных стволовых клеток человека, выделенных из костного мозга и жировой ткани. // Цитология. 2005. Т.47 (2): с.130-135; Тепляшин А.С., Чупикова Н.И., Коржикова С.В., Шарифуллина С.З., Ростовская М.С., Топчиашвили З.А., Савченкова И.П. Сравнительный анализ двух клеточных популяций с фенотипом, подобным мезенхимным стволовым клеткам, выделенны из разных участков подкожно-жировой клетчатки. // Цитология. 2005. Т.47 (7): с.637-643; Савченкова И.П., Ростовская М.С., Чупикова Н.И., Шарифуллина С.З., Тепляшин А.С. Дифференцировка мультипотентных мезенхимных стромальных клеток, выделенных из костного мозга и подкожно-жировой клетчатки человека, в клетки костной ткани. // Цитология. 2008. Т.50 (10): с.855-860; Williams KJ, Picou AA, Kish SL, Giraldo AM, Godke RA, Bondioli KR. Isolation and characterization of porcine adipose tissue-derived adult stem cells. Cells Tissues Organs. 2008; 188(3): 251-8; Vidal MA, Kilroy GE, Lopez MJ, Johnson JR, Moore RM, Gimble JM. Characterization of equine adipose tissue-derived stromal cells: adipogenic and osteogenic capacity and comparison with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells // Vet Surg. 2007 Oct; 36 (7): 613-22; Cheung WK, Working DM, Galuppo LD, Leach JK. Osteogenic comparison of expanded and uncultured adipose stromal cells // Cytotherapy. 2010 Jul; 12(4): 554-62; Alicia A. Picou. The isilation AND CHARACTERIZATION OF BOVINE ADULT DERIVED ADIPOSE STEM CELLS FOR THE USE IN NUCLEAR TRANSFER. A Thesis Submitted to the Graduate Faculty of the Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College in partial fulfillment of the requirements for the degree of Master of Science In The Interdepartmental Program of the School of Animal Sciences. Louisiana State University, August 2009).According to the generally accepted opinion, CM is the most suitable source for the isolation of MMSCs. However, the use of MMSC KM is limited due to the complexity and pain of the bone marrow harvest. Intravital capture of KM in adult cattle is technically difficult to carry out in agricultural enterprises. Compared to VT, post-mortem capture of CM is also difficult to carry out technically in connection with the requirements of the veterinary-sanitary service. In recent years, there have been reports that the adipose tissue of an adult organism contains a population of cells with characteristics similar to MMSC CM, which under certain conditions can differentiate into cells of other tissues and organs (Zuk PA, Zhu M., Mizuno H., Huang JI Futrell WJ, Katz AJ, Benhaim P., Lorenz HP, Hedric MH Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies // Tissue. Eng. 2001. V.7. P.211-226; Zuk PA, Zhu M., Ashijian P., De Ugarte DA, Huang JI, Mizuno H., Alfonso ZC, Fraser JK, Benhaim P., Hedrick MH Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells // Mol. Biol. Cell. 2002. V.13. P.4279-4295; Teplyashin A.S., Korzhikova S.V., Sharifullina S.Z., Chupikova N.I., Rostov M .S., Savchenkova IP Characterization of human mesenchymal stem cells isolated from bone marrow and adipose tissue // Cytology. 2005. T.47 (2): p.130-135; Teplyashin AS, Chupikova N .I., Korzhikova S.V., Sharifullina S.Z., Rostovskaya M.S., Topchiashvili Z.A., Savchenkova I.P. A comparative analysis of two cell populations with a phenotype similar to mesenchymal stem cells isolated from different areas of subcutaneous fat. // Cytology. 2005.V. 47 (7): p. 637-643; Savchenkova I.P., Rostovskaya M.S., Chupikova N.I., Sharifullina S.Z., Teplyashin A.S. Differentiation of multipotent mesenchymal stromal cells isolated from human bone marrow and subcutaneous fat into bone cells. // Cytology. 2008.V.50 (10): p. 855-860; Williams KJ, Picou AA, Kish SL, Giraldo AM, Godke RA, Bondioli KR. Isolation and characterization of porcine adipose tissue-derived adult stem cells. Cells Tissues Organs. 2008; 188 (3): 251-8; Vidal MA, Kilroy GE, Lopez MJ, Johnson JR, Moore RM, Gimble JM. Characterization of equine adipose tissue-derived stromal cells: adipogenic and osteogenic capacity and comparison with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells // Vet Surg. 2007 Oct; 36 (7): 613-22; Cheung WK, Working DM, Galuppo LD, Leach JK. Osteogenic comparison of expanded and uncultured adipose stromal cells // Cytotherapy. 2010 Jul; 12 (4): 554-62; Alicia A. Picou. The isilation AND CHARACTERIZATION OF BOVINE ADULT DERIVED ADIPOSE STEM CELLS FOR THE USE IN NUCLEAR TRANSFER. A Thesis Submitted to the Graduate Faculty of the Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College in partial fulfillment of the requirements for the degree of Master of Science In The Interdepartmental Program of the School of Animal Sciences. Louisiana State University, August 2009).

Перспективность использования стволовых клеток ЖТ обусловлена, в первую очередь, доступностью биологического материала и легкостью наращивания в условиях культивирования in vitro. ЖТ, которую технически просто отобрать в первые минуты после убоя животного, представляет собой ценный материал для получения ММСК. Анализ литературных данных показал, что во всех анализированных работах получены клетки, имеющие разные морфофункциональные характеристики и принципиальные отличия по экспрессии поверхностных антигенов в зависимости от условий выделения и культивирования.The prospect of using VT stem cells is due, first of all, to the availability of biological material and the ease of growth under in vitro cultivation conditions. VT, which is technically easy to take in the first minutes after slaughtering an animal, is a valuable material for the production of MMSCs. An analysis of the literature data showed that in all the studies analyzed, cells were obtained that have different morphological and functional characteristics and fundamental differences in the expression of surface antigens depending on the conditions of isolation and cultivation.

В настоящее время в России ни в одной коллекции клеточных культур не имеются в доступе культуры клеток со свойствами и признаками ММСК, выделенные из жировой ткани взрослых особей крупного рогатого скота. Анализ литературных данных показал, что на сегодняшний момент существует единственная работа, в которой описывается выделение из ЖТ крс ММСК и изучены некоторые их свойства и признаки. Эту работу мы взяли в качестве прототипа.At present, in Russia, in no collection of cell cultures, cell cultures with the properties and characteristics of MMSCs isolated from the adipose tissue of adult cattle are available. The analysis of literature data showed that at the moment there is only one work that describes the isolation of MMS cattle from VT cattle and studied some of their properties and signs. We took this work as a prototype.

В связи с этим в задачу наших исследований входило получить клетки с фенотипом, подобным ММСК ЖТ крс.In this regard, the goal of our research was to obtain cells with a phenotype similar to MMS cattle of cattle.

ММСК ЖТ получили из послеубойного материала крс (трех животных в возрасте трех лет) в течение 30 минут после убоя на мясокомбинате. Для выделения использовали методические наставления, разработанные нами ранее (Савченкова И.П., Эрнст Л.К., Гулюкин М.И., Викторова Е.В. Методические наставления по выделению мультипотентных мезенхимных стволовых клеток из тканей взрослых особей млекопитающих, изучению их свойств и признаков. // М.: Издательство «Спутник+», 2010).MMSC ZhT received from cattle post-slaughter material (three animals at the age of three years) within 30 minutes after slaughter at a meat factory. Methodological instructions developed by us earlier were used for isolation (Savchenkova I.P., Ernst L.K., Gulukin M.I., Viktorova E.V. Methodological instructions for the isolation of multipotent mesenchymal stem cells from tissues of adult mammals, the study of their properties and signs. // M .: Publishing house "Sputnik +", 2010).

В качестве прототипа мы взяли ММСК, выделенные из ЖТ 9 взрослых особей крупного рогатого скота. Данная работа представляет собой кандидатскую диссертацию на соискание ученой степени магистра и была выполнена в Луизианском Государственном Университете, США (Alicia A. Picou. The isolation and characterization of bovine adult derived adipose stem cells for the use in nuclear transfer. A Thesis Submitted to the Graduate Faculty of the Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College in partial fulfillment of the requirements for the degree of Master of Science In The Interdepartmental Program of the School of Animal Sciences. Louisiana State University, August 2009).As a prototype, we took MMSCs isolated from adipose tissue in 9 adult cattle. This work is a Ph.D. thesis for a master's degree and was performed at Louisiana State University, USA (Alicia A. Picou. The isolation and characterization of bovine adult derived adipose stem cells for the use in nuclear transfer. A Thesis Submitted to the Graduate Faculty of the Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College in partial fulfillment of the requirements for the degree of Master of Science In The Interdepartmental Program of the School of Animal Sciences. Louisiana State University, August 2009).

Клетки прототипа имели следующие свойства и признаки:Prototype cells had the following properties and signs:

Выделение: Клетки с фенотипом ММСК были выделены у девяти взрослых особей крупного рогатого скота. На скотобойне: у послеубойного и прижизненного материала.Isolation: Cells with the MMSC phenotype were isolated in nine adult cattle. In a slaughterhouse: in post-mortem and in vivo material.

Морфологические признаки. Автором было показано, что ММСК адгезивны к пластику. Выделенные популяции клеток в течение первых пассажей имели гетерогенную морфологию, представленную двумя типами клеток. Первый тип клеток - это мелкие веретеновидной формы клетки с четко видимым ядром и гомогенной цитоплазмой. Второй, доминирующий, тип клеток был представлен более крупными клетками с фибробластоподобной морфологией. С длительностью культивирования и старения клеточной культуры все клетки приобретали фибробластоподобную морфологию.Morphological signs. The author has shown that MMSCs are adhesive to plastic. The isolated cell populations during the first passages had a heterogeneous morphology represented by two types of cells. The first type of cell is a small spindle-shaped cell with a clearly visible nucleus and homogeneous cytoplasm. The second, dominant, cell type was represented by larger cells with fibroblast-like morphology. With the duration of cultivation and aging of cell culture, all cells acquired fibroblast-like morphology.

Культуральные свойства. Основными средами для культивирования клеток, выделенных из ЖТ крс, являлась среда ДМЕМ с высоким содержанием глюкозы и смесь сред 1:1 ДМЕМ+HAMS F 12, дополненные 10% фетальной сыворотки плода коров (ФСПК), 1% раствором пенициллина, стрептомицина (P/S) и 1% раствором фунгизона. В результате исследований автор выявил, что при культивировании клеток в культуральной среде ДМЕМ с повышенным содержанием глюкозы клетки размножались лучше. Время удвоения клеток составляло 48 часа.Cultural properties. The main media for culturing cells isolated from cattle VT were DMEM with a high glucose content and a mixture of 1: 1 DMEM + HAMS F 12 media supplemented with 10% fetal bovine serum (FSPK), 1% penicillin solution, streptomycin (P / S) and 1% solution of fungicone. As a result of the studies, the author revealed that when cells were cultured in a DMEM culture medium with a high glucose content, the cells multiplied better. Cell doubling time was 48 hours.

Иммунофенотипирование. Не проводилось.Immunophenotyping. Not carried out.

Потенциал к дифференцировке. Автор показал, что выделенные из ЖТ клетки обладали мультипотентностью. При индукции к дифференцировке in vitro они показали способность формировать клетки костной, жировой и хрящевой тканей (таблица).Potential for differentiation. The author showed that cells isolated from VT had multipotency. When induced to in vitro differentiation, they showed the ability to form cells of bone, adipose, and cartilage (table).

Предложенная нами клеточная культура клеток с фенотипом, подобным ММСК, выделенная из ЖТ взрослой особи крупного рогатого скота, имеет ряд отличий от прототипа и обладает следующими свойствами и признаками: в отличие от прототипа ЖТ получали только из послеубойного материала крс (трех животных в возрасте трех лет) в течение 30 минут после убоя на мясокомбинате.Our proposed cell culture of cells with a MMSC-like phenotype isolated from the adult VT of cattle has a number of differences from the prototype and has the following properties and signs: in contrast to the prototype, VT was obtained only from post-mortem cattle (three animals aged three years old) ) within 30 minutes after slaughter at the meat factory.

Морфологические признаки. В отличие от прототипа клеточная популяция, выделенная нами из послеубойной ЖТ, состоит из 3-х сильно отличающихся друг от друга по морфологии клеток. Доминирующее положение занимали крупные распластанные клетки (до 60 мкм в диаметре) с фибробластоподобной морфологией, с повышенной гранулярностью, а также многочисленными вакуолями и выростами цитоплазмы. Небольшая популяция клеток была представлена клетками округлой формы с вытянутым с одной стороны плоским выростом цитоплазмы. Размер клеток достигал 40 мкм; отмечалось темное ядро, смещенное к одному краю, гетерогенная цитоплазма и повышенная гранулярность в ядерной области. Самая маленькая по численности популяция клеток была представлена субпопуляцией малых веретеновидных клеток диаметром 10-15 мкм, четко выделенным ядром и гомогенной цитоплазмой.Morphological signs. Unlike the prototype, the cell population that we isolated from the post-mortem VT, consists of 3 very different from each other in cell morphology. The dominant position was occupied by large flattened cells (up to 60 μm in diameter) with fibroblast-like morphology, with increased granularity, as well as numerous vacuoles and outgrowths of the cytoplasm. A small population of cells was represented by cells of a rounded shape with a flat outgrowth of the cytoplasm elongated on one side. The cell size reached 40 microns; there was a dark core displaced to one edge, a heterogeneous cytoplasm and increased granularity in the nuclear region. The smallest cell population was represented by a subpopulation of small spindle-shaped cells with a diameter of 10-15 μm, a clearly defined nucleus and homogeneous cytoplasm.

Культуральные свойства. Основной средой для культивирования клеток, выделенных из ЖТ, является среда Игла в модификации Дюльбекко (ДМЕМ) с низким содержанием глюкозы (1 г/л) фирмы Пан Эко, Россия, дополненная 10% сыворотки плода коров (СПК) фирмы Gibco, Hayclon, США, антибиотиками (Пан Эко, Россия). Конечная концентрация стрептомицина - 100 мкг/мл, а пенициллина - 100 ед./мл. Время удвоения клеток составляло 36 час, что свидетельствует о более быстром размножении клеток in vitro по сравнению с прототипом. Митотический индекс - 34%, эффективность клонообразования составила 88%, данные характеристики у прототипа не проводились.Cultural properties. The main medium for the cultivation of cells isolated from VT is Igla medium in the modification of Dyulbekko (DMEM) with a low glucose content (1 g / l) of Pan Eco, Russia supplemented with 10% serum of cow fetus (SEC) of Gibco, Hayclon, USA antibiotics (Pan Eco, Russia). The final concentration of streptomycin is 100 μg / ml, and penicillin is 100 units / ml. The cell doubling time was 36 hours, which indicates a more rapid propagation of cells in vitro compared to the prototype. Mitotic index - 34%, clone formation efficiency was 88%, these characteristics of the prototype were not carried out.

Иммунофенотипирование. Полученная культура не имеет примеси гематопоэтических CD34 (3,2%), CD45 (0,2%) и эндотелиальных клеток - CD31 (0.3%). Иммунофенотипирование прототипа не проводилось.Immunophenotyping. The resulting culture does not have an admixture of hematopoietic CD34 (3.2%), CD45 (0.2%) and endothelial cells - CD31 (0.3%). Immunophenotyping of the prototype was not carried out.

Экспрессия коллагена 1-го типа. В выделенной клеточной популяции с помощью РТ ПЦР обнаружен продукт мРНК гена коллагена 1-го типа, который является маркером ММСК. Данный параметр является одним из основных в характеристике ММСК. В описании прототипа данные по экспрессии данного маркера отсутствуют.Expression of type 1 collagen. Using RT-PCR, a mRNA product of the type 1 collagen gene, which is a marker of MMSC, was detected in the selected cell population by RT PCR. This parameter is one of the main in the characterization of MMSK. In the description of the prototype data on the expression of this marker are missing.

Потенции к дифференцировке. Также как и прототип, полученная нами популяция обладала высокой эффективностью к направленной дифференцировке в клетки костной и жировой тканей. В отличие от прототипа мы также направили наши клетки по пути дифференцировки в клетки мышечной ткани (таблица 1).Potencies for differentiation. As well as the prototype, our population was highly effective for directed differentiation into bone and adipose tissue cells. In contrast to the prototype, we also directed our cells along the path of differentiation into muscle tissue cells (table 1).

Так, при культивировании в среде, индуцирующей дифференцировку в клетки костной ткани, как наших клеток, так и прототипа на 12-14 сут были обнаружены клетки, положительно окрашенные на щелочную фосфатазу. В качестве основных индукторов мы использовали дексаметазон и аскорбиновую кислоту. При более продолжительном культивировании в этой же среде ММСК КМ формировали минеральные комплексы, которые подтверждались окраской экспериментальных образцов по von Kossa.So, when cultured in a medium that induces differentiation into bone tissue cells of both our cells and the prototype, cells positively stained for alkaline phosphatase were found on days 12-14. As the main inducers, we used dexamethasone and ascorbic acid. During a longer cultivation in the same medium, MMSC KM formed mineral complexes, which were confirmed by the color of the experimental samples according to von Kossa.

При индукции к дифференцировке в клетки жировой ткани (индуктор - дексаметазон и инсулин) у наших клеток на 21 сут наблюдали формирование кластеров адипоцитов с одинаковой эффективностью. Индукционная среда, используемая у прототипа, отличалась от нашей индукционной среды. Морфологическая оценка подтверждалась при окраске экспериментальных образцов специальными красителями (Oil-red-O).When inducing differentiation into adipose tissue cells (inducer dexamethasone and insulin), the formation of adipocyte clusters with the same efficiency was observed in our cells for 21 days. The induction medium used in the prototype was different from our induction medium. The morphological assessment was confirmed when the experimental samples were stained with special dyes (Oil-red-O).

Для индукции ММСК КМ крс в клетки мышечной ткани in vitro использовали среды, дополненные 5-азацитидином, 5-аза-2'-деоксицитидином и ретиноевой кислотой. На 30 сут наблюдали образование в экспериментальных культурах клеток мышечной ткани, в которых был обнаружен продукт мРНК экспрессии генов маркеров миогенеза: MyoD1 и миозин НС.In vitro media supplemented with 5-azacytidine, 5-aza-2'-deoxycytidine and retinoic acid were used to induce MMSC KM cattle in muscle tissue cells in vitro. On day 30, the formation of muscle tissue cells in experimental cultures was observed in which the product of mRNA expression of the genes of myogenesis markers: MyoD1 and myosin NS was found.

Сравнительный анализ эффективности дифференцировки ММСК при индукции в клетки жировой, костной и мышечной тканейComparative analysis of the effectiveness of MMSC differentiation upon induction of adipose, bone and muscle tissue into cells Культура клетокCell culture Эффективность дифференцировки клеток при индукцииThe efficiency of cell differentiation during induction остеогенезаosteogenesis адипогенезаadipogenesis хондрогенезаchondrogenesis миогенезаmyogenesis ПрототипPrototype ++++++ ++++++ ++++ Нет данныхThere is no data ПредложенныйProposed ++++++ ++++++ Нет данныхThere is no data ++++++

Чувствительность к вирусам. Предложенная нами культура ММСК, выделенная из ЖТ крс, чувствительна в вирусам: инфекционный ринотрахеит крс, герпес типа 4 крупного рогатого скота (ВПГ-4) и ринопневмония лошадей.Susceptibility to viruses. The MMSC culture we proposed, isolated from cattle VT, is sensitive to viruses: infectious cattle rhinotracheitis, cattle herpes type 4 (HSV-4) and equine rhinopneumonia.

Сектором «Стволовая клетка» ГНУ ВИЭВ им.Я.Р.Коваленко в лице зав. сектором д.б.н. профессором И.П.Савченковой была депонирована в Специализированную Коллекцию постоянных соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко (СХЖ РАСХН) под №80. Следующая культура клеток хранится в жидком азоте (-196°С): мультипотентные мезенхимные стволовые клетки крупного рогатого скота, выделенные из жировой ткани - ММСК крс ЖТ (четырнадцать ампул). Одновременно передан паспорт на указанную культуру клеток и протокол №3 от 06.06.2011 г.Sector "Stem cell" GNU VIEV them.Ya. R. Kovalenko represented by the head. sector Professor I.P. Savchenkova was deposited in the Specialized Collection of Permanent Somatic Cell Cultures of Agricultural and Commercial Animals at VIEV named after Ya.R. Kovalenko (SHKH RAAS) under number 80. The following cell culture is stored in liquid nitrogen (-196 ° C): multipotent mesenchymal cattle stem cells isolated from adipose tissue - MMSC cattle VT (fourteen ampoules). At the same time, a passport to the specified cell culture and protocol No. 3 dated 06/06/2011 were transferred.

Технико-экономическая эффективность. Таким образом было установлено, что в жировой ткани взрослых особей крупного рогатого скота содержится популяция клеток с фенотипом, подобным ММСК, которые можно выделить и культивировать in vitro.Feasibility study. Thus, it was found that the adipose tissue of adult cattle contains a population of cells with a phenotype similar to MMSC, which can be isolated and cultured in vitro.

Предложенная культура ММСК, выделенная из ЖТ крс, найдет применение в лабораториях, занимающихся новыми клеточными технологиями с целью регенерации и репарации тканей и органов сельскохозяйственных животных. ММСК, выделенные из ЖТ, являются перспективным материалом для создания моделей с целью изучения сложных инфекционных механизмов, происходящих на клеточном и тканевом уровнях in vitro. Предложенная культура ММСК крс из ЖТ найдет применение для наращивания патогенов in vitro. Эти клетки способны под действием индукторов формировать в культуре клетки мышечной ткани, что даст возможность получать из них в перспективе биомассу, по составу близкую к мышечной ткани животных, с целью создания альтернативных источников продуктов питания. Кроме того, наличие в Коллекции культур стволовых клеток сельскохозяйственных животных даст возможность сохранить генетические ресурсы в экстремальных условиях.The proposed MMSC culture isolated from livestock of cattle will find application in laboratories involved in new cellular technologies for the regeneration and repair of tissues and organs of farm animals. MMSCs isolated from VT are promising materials for creating models for the study of complex infectious mechanisms that occur at the cellular and tissue levels in vitro. The proposed culture of MMSC cattle from VT will find application for the growth of pathogens in vitro. These cells are capable of forming muscle tissue cells in culture under the action of inductors, which will make it possible to obtain biomass from them in the future, similar in composition to animal muscle tissue, in order to create alternative food sources. In addition, the availability of farm animal stem cell cultures will make it possible to preserve genetic resources in extreme conditions.

Claims

A culture of multipotent mesenchymal stem cells of cattle isolated from adipose tissue (texstus adiposus Bos taurus), deposited in the Specialized Collection of Permanent Somatic Cell Cultures of Agricultural and Commercial Animals at VIEV named after Ya.R. Kovalenko (SCW RASHN) under No. 80 for veterinary medicine, cell and tissue engineering.