RU2481396C1 - Способ выделения гемопоэтических стволовых клеток методом иммуномагнитной сепарации - Google Patents
Способ выделения гемопоэтических стволовых клеток методом иммуномагнитной сепарации Download PDFInfo
- Publication number
- RU2481396C1 RU2481396C1 RU2011137686/10A RU2011137686A RU2481396C1 RU 2481396 C1 RU2481396 C1 RU 2481396C1 RU 2011137686/10 A RU2011137686/10 A RU 2011137686/10A RU 2011137686 A RU2011137686 A RU 2011137686A RU 2481396 C1 RU2481396 C1 RU 2481396C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- minutes
- hsc
- separation
- fbs
- pbs
- Prior art date
Links
Abstract
Изобретение относится к области клеточной биологии, в частности к способу выделения гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) из пуповинной крови лабораторных животных. Способ заключается в выделении ГСК за счет удаления из суспензии, содержащей различные гемопоэтические клетки, элементов, не являющихся ГСК. В качестве буфера для иммуномагнитной сепарации (БИМС) используют коктейль для сепарации (КС) следующего состава: PBS+2% раствор незаменимых аминокислот +2% FBS+1% раствор антибиотиков на 100 мл КС: пенициллин 100 ед./мл + стрептомицин 100 мкг/м, инкубирование клетки с частицами для сепарации Streptavidin Particles Plus - DM производят при - 20°С в течение 3 мин. Способ позволяет получить существенное увеличение жизнеспособности выделенных ГСК. Изобретение может быть использовано в клеточной терапии различных заболеваний. 3 пр.
Description
Изобретение относится к области клеточной биологии, в частности к способу выделения гемопоэтических стволовых клеток из пуповинной крови лабораторных животных (мыши), что может быть использовано в клеточной терапии различных заболеваний.
На сегодняшний день существуют различные способы выделения гемопоэтических стволовых клеток (ГСК).
Наиболее близким способом выделения ГСК мыши к заявляемому способу можно считать способ выделения ГСК мыши методом непрямой иммуномагнитной сепарации с использованием набора антител: EasySep Mouse hematopoietic Progenitor Cell Enrichment Cocktail, а также EasySep Biotin Selection Cocktail (Catalog 2010 StemCell Technologies, Канада. Р.244). Данный метод предполагает выделение ГСК за счет удаления из суспензии, содержащей различные гемопоэтические клетки, элементов, не являющихся ГСК. Недостатком прототипа является то, что согласно протоколу производителя жизнеспособность выделенных клеток (ГСК) составляет 80-85%.
Изменение методики выделения ГСК методом непрямой иммуномагнитной сепарации заключается в замене предлагаемого производителем буфера для иммуномагнитной сепарации (БИМС) на разработанный заявителем коктейль для сепарации (КС). Состав рекомендованного производителем БИМС: PBS+0,5% FBS+2 мМ ЭДТА. Состав разработанного заявителем КС: PBS+2% раствор незаменимых аминокислот +2% FBS+1% раствор антибиотиков (на 100 мл КС: пенициллин 100 ед./мл + стрептомицин 100 мкг/мл). Также изменено время и условия инкубирования клеток с частицами для сепарации Streptavidin Particles Plus - DM. Согласно методике производителя клетки необходимо инкубировать 30 мин при 6-12°С. Заявитель рекомендует инкубирование клетки с частицами для сепарации Streptavidin Particles Plus - DM при -20°C в течение 3 мин. Изменение методики: замена БИМС на КС, а также изменение времени (уменьшение на порядок) и условий инкубирования приводит к существенному увеличению жизнеспособности выделенных ГСК. Содержание ГСК определялось с использованием антител к специфическим для ГСК антигенам на поверхности клеток. Положительные маркеры к ГСК мыши: CD 38; Sca 1+; CD 117; CD 90 (низкий уровень). Отрицательные маркеры к ГСК мыши: Lin-; CD34. Жизнеспособность определялась с использованием стандартного красителя трипановый синий.
Технический результат заключается в существенном увеличении жизнеспособности выделенных ГСК.
Способ выполняют следующим образом:
После получения пуповинной крови лабораторных мышей объем выделенной крови доводится до 1 мл с помощью буфера для окрашивания. При этом состав буфера для окрашивания следующий: фосфатный буфер без ионов Са2+ и Mg2+ с добавлением 3% инактивированной фетальной бычьей сыворотки (FBS) и с добавлением 0,1% азидом натрия. Производится подсчет клеток в камере Горяева. К полученной таким образом суспензии клеток добавляются мышиные антитела к CD16C/CD32 в соотношении 0,25 мкг/млн кл. Инкубируется 15 мин на льду. После чего добавляется коктейль антител в концентрации 5 мкл/млн кл. Повторно инкубируется 15 мин на льду. Ресуспендируется полученная суспензия клеток в КС (7 мл). Центрифугироние при 300 g в течение 7 минут. Полученный осадок клеток ресуспендируется в КС до объема 1 мл. Добавляются частицы для сепарации Streptavidin Particles Plus - DM 5 мкл/млн кл. Охлаждение 3 мин при -20°С.
Меченые клетки переносятся в 5 мл пробирку Falcon. Инкубирование 12 мин на иммуномагнитном сепараторе (ИМС). Супернатант удаляется в новую пробирку Falcon (суспензия, полученная с помощью негативной селекции, - содержит обогащенную фракцию ГСК). Добавляется 1 мл КС и ресуспендируется 10-15 раз. Повторное инкубирование 12 мин на ИМС. Удаление супернатанта в прежнюю пробирку Falcon (суспензия, полученная с помощью негативной селекции, - содержит обогащенную фракцию ГСК). Пробирку с суспензией клеток после негативной селекции инкубируют 12 минут на ИМС. Удалить супернатант - это и будет конечная фракция, обогащенная ГСК методом ИМС. Используя набор антител, определяют содержание гемопоэтических стволовых клеток в полученной суспензии. Положительные маркеры к ГСК мыши: CD 38; Sca 1+; CD 117; CD 90 (низкий уровень). Отрицательные маркеры к ГСК мыши: Lin-; CD34. Для определения количества живых клеток аликвоту суспензии (40 мкл) смешивают с равным количеством 0,4% раствора трипановый синий в PBS (без Ca2+ и Mg2+). Исходная концентрация клеток рассчитывается по формуле:
С (cell/ml)=5*105* (количество клеток в одном большом квадрате).
Живые клетки непроницаемы для трипанового синего, а мертвые проницаемы и окрашиваются.
Пример №1
А: (Действие согласно протоколу производителя).
1. Забой лабораторных животных осуществляется методом шейной дистракции.
1'. Стерилизация лабораторного животного проводится путем помещения мыши на 5 минут в 90% раствор этилового спирта.
2. В стерильных условиях осуществляется получение пуповинной крови.
3. Доводится объем крови до 1 мл, используя буфер для окрашивания, рекомендованный производителем (PBS+3% FBS+0,1% NaN3).
4. Подсчет клеток в камере Горяева: В маленькую пробирку (объемом 2-3 мл), содержащую 400 мкл 3% уксусной кислоты, добавляется 20 мкл (разведение 1:20) суспензии клеток костного мозга и перемешивается.
5. Получена суспензию клеток, содержащая 30 млн кл/мл (в буфере для окрашивания: PBS+3% FBS+0,1% NaN3).
6. Добавить мышиные антитела к CD16C/CD32 в соотношении 0,25 мкг/млн кл. (т.о. всего 7,5 мкг CD16C/CD32).
7. Инкубировать 15 мин на льду.
8. Добавить коктейль антител в концентрации 5 мкл/млн кл. (т.о. всего 150 мкл коктейля антител).
9. Инкубировать 15 мин на льду.
10. Добавить 10-кратный избыточный объем однократный буфер для иммуномагнитной сепарации БИМС (PBS+0,5% FBS+2 мМ ЭДТА) в соотношении 1:10.
11. Центрифугировать при 300 g в течение 7 минут.
12. Полученный осадок клеток ресуспендировать в БИМС (PBS+0,5% FBS+2 мМ ЭДТА) до объема 1 мл.
13. Добавить частицы для сепарации Streptavidin Particles Plus - DM 5 мкл/млн кл. (т.о. всего 150 мкл частиц для сепарации).
14. Охлаждать 30 мин при 6-12°С.
15. Перенести меченые клетки в 5 мл пробирку Falcon.
16. Инкубировать 8 мин на ИМС.
17. Удалить супернатант в новую пробирку Falcon (суспензия, полученная с помощью негативной селекции, - содержит обогащенную фракцию ГСК).
18. Добавить 1 мл БИМС (PBS+0,5% FBS+2 мМ ЭДТА).
19. Инкубировать 8 мин на ИМС.
20. Удалить супернатант в прежнюю пробирку Falcon (суспензия, полученная с помощью негативной селекции, - содержит обогащенную фракцию ГСК).
21. Пробирку с суспензией клеток после негативной селекции инкубировать 8 минут.
22. Удалить супернатант - это и будет конечная фракция обогащенная ГСК методом ИМС.
ГСК мыши: на проточном цитометре уточняется содержание ГСК в полученной суспензии.
Отрицательные маркеры: Lin-; CD34.
Положительные маркеры: CD 38; Sca 1+; CD 117; CD 90 (низкий уровень).
Содержание ГСК 350 тыс. (1,2% от исходного содержания всех клеток крови). Жизнеспособность ГСК с использованием красителя трипанового синего составляет 78%.
Б. Действие согласно заявляемому способу.
Используя следующий состав коктейля для сепарации (PBS+2% раствор незаменимых аминокислот +2% FBS+1% раствор антибиотиков (пенициллин 100 ед./мл + стрептомицин 100 мкг/мл) вместо БИМС (PBS+0,5% FBS+2 мМ ЭДТА):
1. Забой лабораторных животных осуществляется методом шейной дистракции.
2. Стерилизация лабораторного животного проводится путем помещения мыши на 5 минут в 90% раствор этилового спирта.
3. В стерильных условиях осуществляется получение пуповинной крови.
4. Доводится объем крови до 1 мл, используя буфер для окрашивания, рекомендованный производителем (PBS+3% FBS+0,1% NaN3).
5. Подсчет клеток в камере Горяева: В маленькую пробирку (объемом 2-3 мл), содержащую 400 мкл 3% уксусной кислоты, добавляется 20 мкл (разведение 1:20) суспензии клеток костного мозга и перемешивается.
6. Получена суспензию клеток, содержащая 30 млн кл./мл (В буфере для окрашивания: PBS+3% FBS+0,1% NaN3).
7. Добавить мышиные антитела к CD16C/CD32 в соотношении 0,25 мкг/млн кл. (т.о. всего 7,5 мкг CD16C/CD32).
8. Инкубировать 15 мин на льду.
9. Добавить коктейль антител в концентрации 5 мкл/млн кл. (т.о. всего 150 мкл коктейля антител).
10. Инкубировать 15 мин на льду.
11. Добавить коктейль для сепарации: (PBS+2% раствор незаменимых аминокислот +2% FBS+1% раствор антибиотиков (пенициллин 100 ед./мл + стрептомицин 100 мкг/мл).
12. Центрифугировать при 300 g в течение 7 минут.
13. Полученный осадок клеток ресуспендировать в КС (PBS+2% раствор незаменимых аминокислот +2% FBS+1% раствор антибиотиков (пенициллин 100 ед./мл + стрептомицин 100 мкг/мл) до объема 1 мл.
14. Добавить частицы для сепарации Streptavidin Particles Plus - DM 5 мкл/млн кл. (т.о. всего 150 мкл частиц для сепарации).
15. Охлаждать 3 мин при -20°С
16. Перенести меченые клетки в 5 мл пробирку Falcon.
17. Инкубировать 12 мин на ИМС.
18. Удалить супернатант в новую пробирку Falcon (суспензия, полученная с помощью негативной селекции, - содержит обогащенную фракцию ГСК).
19. Добавить 1 мл КС (PBS+2% раствор незаменимых аминокислот +2% FBS+1% раствор антибиотиков (пенициллин 100 ед./мл + стрептомицин 100 мкг/мл).
20. Инкубировать 12 мин на ИМС.
21. Удалить супернатант в прежнюю пробирку Falcon (суспензия, полученная с помощью негативной селекции, - содержит обогащенную фракцию ГСК).
22. Пробирку с суспензией клеток после негативной селекции инкубировать 12 минут.
23. Удалить супернатант - это и будет конечная фракция обогащенная ГСК методом ИМС.
ГСК мыши: на проточном цитометре уточняется содержание ГСК в полученной суспензии.
Отрицательные маркеры: Lin-; CD34.
Положительные маркеры: CD 38; Sca 1+; CD 117; CD 90 (низкий уровень).
Содержание ГСК 500 тыс. (1,7% от исходного содержания всех клеток крови). Жизнеспособность ГСК с использованием красителя трипанового синего составляет 95%.
Пример №2
А: (Действие согласно протоколу производителя).
1. Забой лабораторных животных осуществляется методом шейной дистракции.
2. Стерилизация лабораторного животного проводится путем помещения мыши на 5 минут в 90% раствор этилового спирта.
3. В стерильных условиях осуществляется получение пуповинной крови.
4. Доводится объем крови до 1 мл, используя буфер для окрашивания, рекомендованный производителем (PBS+3% FBS+0,1% NaN3).
5. Подсчет клеток в камере Горяева: В маленькую пробирку (объемом 2-3 мл), содержащую 400 мкл 3% уксусной кислоты, добавляется 20 мкл (разведение 1:20) суспензии клеток костного мозга и перемешивается.
6. Получена суспензию клеток, содержащая 15 млн кл./мл (в буфере для окрашивания: PBS+3% FBS+0,1% NaN3).
7. Добавить мышиные антитела к CD16C/CD32 в соотношении 0,25 мкг/млн кл. (т.о. всего 3,75 мкг CD16C/CD32).
8. Инкубировать 15 мин на льду.
9. Добавить коктейль антител в концентрации 5 мкл/млн кл. (т.о. всего 75 мкл коктейля антител).
10. Инкубировать 15 мин на льду.
11. Добавить 10-кратный избыточный объем однократный буфер для иммуномагнитной сепарации БИМС (PBS+0,5% FBS+2 мМ ЭДТА) в соотношении 1:10.
12. Центрифугировать при 300 g в течение 7 минут.
13. Полученный осадок клеток ресуспендировать в БИМС (PBS+0,5% FBS+2 мМ ЭДТА) до объема 1 мл.
14. Добавить частицы для сепарации Streptavidin Particles Plus - DM 5 мкл/млн кл. (т.о. всего 75 мкл частиц для сепарации).
15. Охлаждать 30 мин при 6-12°С.
16. Перенести меченые клетки в 5 мл пробирку Falcon.
17. Инкубировать 8 мин на ИМС.
18. Удалить супернатант в новую пробирку Falcon (суспензия, полученная с помощью негативной селекции, содержит обогащенную фракцию ГСК).
19. Добавить 1 мл БИМС (PBS+0,5% FBS+2 мМ ЭДТА).
20. Инкубировать 8 мин на ИМС.
21. Удалить супернатант в прежнюю пробирку Falcon (суспензия, полученная с помощью негативной селекции, - содержит обогащенную фракцию ГСК).
22. Пробирку с суспензией клеток после негативной селекции инкубировать 8 минут.
23. Удалить супернатант - это и будет конечная фракция обогащенная ГСК методом ИМС.
ГСК мыши: на проточном цитометре уточняется содержание ГСК в полученной суспензии.
Отрицательные маркеры: Lin-; CD34.
Положительные маркеры: CD 38; Sca 1+; CD 117; CD 90 (низкий уровень).
Содержание ГСК 130 тыс. (0,87% от исходного содержания всех клеток крови). Жизнеспособность ГСК с использованием красителя трипанового синего составляет 83%.
Б. Действие согласно заявляемому способу.
Используя следующий состав коктейля для сепарации (PBS+2% раствор незаменимых аминокислот +2% FBS+1% раствор антибиотиков (пенициллин 100 ед./мл + стрептомицин 100 мкг/мл) вместо БИМС (PBS+0,5% FBS+2 мМ ЭДТА):
1. Забой лабораторных животных осуществляется методом шейной дистракции.
2. Стерилизация лабораторного животного проводится путем помещения мыши на 5 минут в 90% раствор этилового спирта.
3. В стерильных условиях осуществляется получение пуповинной крови.
4. Доводится объем крови до 1 мл, используя буфер для окрашивания, рекомендованный производителем (PBS+3% FBS+0,1% NaN3).
5. Подсчет клеток в камере Горяева: В маленькую пробирку (объемом 2-3 мл), содержащую 400 мкл 3% уксусной кислоты, добавляется 20 мкл (разведение 1:20) суспензии клеток костного мозга и перемешивается.
6. Получена суспензию клеток, содержащая 24 млн кл./мл (в буфере для окрашивания: PBS+3% FBS+0,1% NaN3).
7. Добавить мышиные антитела к CD16C/CD32 в соотношении 0,25 мкг/млн кл. (т.о. всего 6 мкг CD16C/CD32).
8. Инкубировать 15 мин на льду.
9. Добавить коктейль антител в концентрации 5 мкл/млн кл. (т.о. всего 120 мкл коктейля антител).
10. Инкубировать 15 мин на льду.
11. Добавить коктейль для сепарации: (PBS+2% раствор незаменимых аминокислот +2% FBS+1% раствор антибиотиков (пенициллин 100 ед./мл + стрептомицин 100 мкг/мл).
12. Центрифугировать при 300 g в течение 7 минут.
13. Полученный осадок клеток ресуспендировать в КС (PBS+2% раствор незаменимых аминокислот +2% FBS+1% раствор антибиотиков (пенициллин 100 ед./мл + стрептомицин 100 мкг/мл) до объема 1 мл.
14. Добавить частицы для сепарации Streptavidin Particles Plus - DM 5 мкл/млн кл. (т.о. всего 120 мкл частиц для сепарации).
15. Охлаждать 3 мин при -20°С.
16. Перенести меченые клетки в 5 мл пробирку Falcon.
17. Инкубировать 12 мин на ИМС.
18. Удалить супернатант в новую пробирку Falcon (суспензия, полученная с помощью негативной селекции, - содержит обогащенную фракцию ГСК).
19. Добавить 1 мл КС (PBS+2% раствор незаменимых аминокислот +2% FBS+1% раствор антибиотиков (пенициллин 100 ед./мл + стрептомицин 100 мкг/мл).
20. Инкубировать 12 мин на ИМС.
21. Удалить супернатант в прежнюю пробирку Falcon (суспензия, полученная с помощью негативной селекции, - содержит обогащенную фракцию ГСК).
22. Пробирку с суспензией клеток после негативной селекции инкубировать 12 минут.
23. Удалить супернатант - это и будет конечная фракция обогащенная ГСК методом ИМС.
ГСК мыши: на проточном цитометре уточняется содержание ГСК в полученной суспензии.
Отрицательные маркеры: Lin-; CD34.
Положительные маркеры: CD 38; Sca 1+; CD 117; CD 90 (низкий уровень).
Содержание ГСК 320 тыс. (1,3% от исходного содержания всех клеток крови). Жизнеспособность ГСК с использованием красителя трипанового синего составляет 98%.
Пример №3
А: (Действие согласно протоколу производителя).
1. Забой лабораторных животных осуществляется методом шейной дистракции.
2. Стерилизация лабораторного животного проводится путем помещения мыши на 5 минут в 90% раствор этилового спирта.
3. В стерильных условиях осуществляется получение пуповинной крови.
4. Доводится объем крови до 1 мл, используя буфер для окрашивания, рекомендованный производителем (PBS+3% FBS+0,1% NaN3).
5. Подсчет клеток в камере Горяева: В маленькую пробирку (объемом 2-3 мл), содержащую 400 мкл 3% уксусной кислоты, добавляется 20 мкл (разведение 1:20) суспензии клеток костного мозга и перемешивается.
6. Получена суспензия клеток, содержащая 10 млн кл/мл (в буфере для окрашивания: PBS+3% FBS+0,1% NaN3).
7. Добавить мышиные антитела к CD16C/CD32 в соотношении 0,25 мкг/млн кл. (т.о. всего 2,5 мкг CD16C/CD32).
8. Инкубировать 15 мин на льду.
9. Добавить коктейль антител в концентрации 5 мкл/млн кл. (т.о. всего 50 мкл коктейля антител).
10. Инкубировать 15 мин на льду.
11. Добавить 10-кратный избыточный объем однократный буфер для иммуномагнитной сепарации БИМС (PBS+0,5% FBS+2 мМ ЭДТА) в соотношении 1:10.
12. Центрифугировать при 300 g в течение 7 минут.
13. Полученный осадок клеток ресуспендировать в БИМС (PBS+0,5% FBS+2 мМ ЭДТА) до объема 1 мл.
14. Добавить частицы для сепарации Streptavidin Particles Plus - DM 5 мкл/млн кл. (т.о. всего 50 мкл частиц для сепарации).
15. Охлаждать 30 мин при 6-12°С.
16. Перенести меченые клетки в 5 мл пробирку Falcon.
17. Инкубировать 8 мин на ИМС.
18. Удалить супернатант в новую пробирку Falcon (суспензия, полученная с помощью негативной селекции, - содержит обогащенную фракцию ГСК).
19. Добавить 1 мл БИМС (PBS+0,5% FBS+2 мМ ЭДТА).
20. Инкубировать 8 мин на ИМС.
21. Удалить супернатант в прежнюю пробирку Falcon (суспензия, полученная с помощью негативной селекции, - содержит обогащенную фракцию ГСК).
22. Пробирку с суспензией клеток после негативной селекции инкубировать 8 минут.
23. Удалить супернатант - это и будет конечная фракция обогащенная ГСК методом ИМС.
ГСК мыши: на проточном цитометре уточняется содержание ГСК в полученной суспензии.
Отрицательные маркеры: Lin-; CD34.
Положительные маркеры: CD 38; Sca 1+; CD 117; CD 90 (низкий уровень).
Содержание ГСК 60 тыс. (0,6% от исходного содержания всех клеток крови). Жизнеспособность ГСК с использованием красителя трипанового синего составляет 81%.
Б. Действие согласно заявляемому способу.
Используя следующий состав коктейля для сепарации (PBS+2% раствор незаменимых аминокислот +2% FBS +1% раствор антибиотиков (пенициллин 100 ед./мл + стрептомицин 100 мкг/мл) вместо БИМС (PBS+0,5% FBS+2 мМ ЭДТА):
1. Забой лабораторных животных осуществляется методом шейной дистракции.
2. Стерилизация лабораторного животного проводится путем помещения мыши на 5 минут в 90% раствор этилового спирта.
3. В стерильных условиях осуществляется получение пуповинной крови.
4. Доводится объем крови до 1 мл, используя буфер для окрашивания, рекомендованный производителем (PBS+3% FBS+0,1% NaN3).
5. Подсчет клеток в камере Горяева: В маленькую пробирку (объемом 2-3 мл), содержащую 400 мкл 3% уксусной кислоты, добавляется 20 мкл (разведение 1:20) суспензии клеток костного мозга и перемешивается.
6. Получена суспензию клеток, содержащая 28 млн кл/мл (в буфере для окрашивания: PBS+3% FBS+0,1% NaN3).
7. Добавить мышиные антитела к CD16C/CD32 в соотношении 0,25 мкг/млн кл. (т.о. всего 7 мкг CD16C/CD32).
8. Инкубировать 15 мин на льду.
9. Добавить коктейль антител в концентрации 5 мкл/млн кл. (т.о. всего 140 мкл коктейля антител).
10. Инкубировать 15 мин на льду.
11. Добавить коктейль для сепарации: (PBS+2% раствор незаменимых аминокислот +2% FBS+1% раствор антибиотиков (пенициллин 100 ед./мл + стрептомицин 100 мкг/мл).
12. Центрифугировать при 300 g в течение 7 минут.
13. Полученный осадок клеток ресуспендировать в КС (PBS+2% раствор незаменимых аминокислот +2% FBS+1% раствор антибиотиков (пенициллин 100 ед./мл + стрептомицин 100 мкг/мл) до объема 1 мл.
14. Добавить частицы для сепарации Streptavidin Particles Plus - DM 5 мкл/млн кл. (т.о. всего 140 мкл частиц для сепарации).
15. Охлаждать 3 мин при -20°С.
16. Перенести меченые клетки в 5 мл пробирку Falcon.
17. Инкубировать 12 мин на ИМС.
18. Удалить супернатант в новую пробирку Falcon (суспензия, полученная с помощью негативной селекции, - содержит обогащенную фракцию ГСК).
19. Добавить 1 мл КС (PBS+2% раствор незаменимых аминокислот +2% FBS+1% раствор антибиотиков (пенициллин 100 ед./мл + стрептомицин 100 мкг/мл).
20. Инкубировать 12 мин на ИМС.
21. Удалить супернатант в прежнюю пробирку Falcon (суспензия, полученная с помощью негативной селекции, - содержит обогащенную фракцию ГСК).
22. Пробирку с суспензией клеток после негативной селекции инкубировать 12 минут.
23. Удалить супернатант - это и будет конечная фракция обогащенная ГСК методом ИМС.
ГСК мыши: на проточном цитометре уточняется содержание ГСК в полученной суспензии.
Отрицательные маркеры: Lin-; CD34.
Положительные маркеры: CD 38; Sca 1+; CD 117; CD 90 (низкий уровень).
Содержание ГСК 350 тыс. (1,25% от исходного содержания всех клеток крови). Жизнеспособность ГСК с использованием красителя трипанового синего составляет 95%.
Claims (1)
- Способ выделения гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) методом иммуномагнитной сепарации, заключающийся в выделении ГСК за счет удаления из суспензии, содержащей различные гемопоэтические клетки, элементов, не являющихся ГСК, отличающийся тем, что в качестве буфера для иммуномагнитной сепарации (БИМС) используют коктейль для сепарации (КС) следующего состава: PBS+2% раствор незаменимых аминокислот +2% FBS+1% раствор антибиотиков на 100 мл КС: пенициллин 100 ед./мл + стрептомицин 100 мкг/м, инкубирование клетки с частицами для сепарации Streptavidin Particles Plus - DM производят при - 20°С в течение 3 мин.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011137686/10A RU2481396C1 (ru) | 2011-09-13 | 2011-09-13 | Способ выделения гемопоэтических стволовых клеток методом иммуномагнитной сепарации |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011137686/10A RU2481396C1 (ru) | 2011-09-13 | 2011-09-13 | Способ выделения гемопоэтических стволовых клеток методом иммуномагнитной сепарации |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2011137686A RU2011137686A (ru) | 2013-03-20 |
| RU2481396C1 true RU2481396C1 (ru) | 2013-05-10 |
Family
ID=48789502
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011137686/10A RU2481396C1 (ru) | 2011-09-13 | 2011-09-13 | Способ выделения гемопоэтических стволовых клеток методом иммуномагнитной сепарации |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2481396C1 (ru) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0142438A2 (fr) * | 1983-11-09 | 1985-05-22 | CertainTeed Corporation | Méthode et appareillage pour l'ensachage de matières fibreuses |
-
2011
- 2011-09-13 RU RU2011137686/10A patent/RU2481396C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0142438A2 (fr) * | 1983-11-09 | 1985-05-22 | CertainTeed Corporation | Méthode et appareillage pour l'ensachage de matières fibreuses |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2011137686A (ru) | 2013-03-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Waters et al. | Initial B cell activation induces metabolic reprogramming and mitochondrial remodeling | |
| Zhao et al. | Conversion of danger signals into cytokine signals by hematopoietic stem and progenitor cells for regulation of stress-induced hematopoiesis | |
| Mrozik et al. | Proteomic characterization of mesenchymal stem cell-like populations derived from ovine periodontal ligament, dental pulp, and bone marrow: analysis of differentially expressed proteins | |
| Sun et al. | A proteomic analysis during serial subculture and osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cell | |
| Marinaro et al. | Unraveling the molecular signature of extracellular vesicles from endometrial-derived mesenchymal stem cells: potential modulatory effects and therapeutic applications | |
| Gundry et al. | The mouse C2C12 myoblast cell surface N-linked glycoproteome: identification, glycosite occupancy, and membrane orientation | |
| Prideaux et al. | Isolation of osteocytes from human trabecular bone | |
| Yin et al. | An optimized protocol for the generation and functional analysis of human mast cells from CD34+ enriched cell populations | |
| Allahverdiyev et al. | Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a new host cell in latent leishmaniasis | |
| van der Vlugt et al. | Toll-like receptor ligation for the induction of regulatory B cells | |
| Ghebes et al. | Extracellular vesicles derived from adult and fetal bone marrow mesenchymal stromal cells differentially promote ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells | |
| Johnson et al. | Beyond “to divide or not to divide”: kinetics matters in hematopoietic stem cells | |
| Jiang et al. | In vitro demonstration and quantification of neutrophil extracellular trap formation | |
| Lorentz et al. | Isolation and characterization of human intestinal mast cells | |
| RU2481396C1 (ru) | Способ выделения гемопоэтических стволовых клеток методом иммуномагнитной сепарации | |
| McMurchy et al. | In vitro generation of human T regulatory cells: generation, culture, and analysis of FOXP3-transduced T cells | |
| Jia et al. | An optimized method for obtaining clinical‐grade specific cell subpopulations from human umbilical cord‐derived mesenchymal stem cells | |
| RU2474610C1 (ru) | Способ выделения гемопоэтических стволовых клеток | |
| Dang et al. | A Rapid Protocol for Direct Isolation of Osteoclast Lineage Cells from Mouse Bone Marrow | |
| CN111893091A (zh) | 一种诱导大鼠极小胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法 | |
| AU2018251829B2 (en) | New uses of mammalian muscle-derived stem cells | |
| Owen et al. | In vitro differentiation of thymic Treg cell progenitors to mature thymic Treg cells | |
| Dohr et al. | A novel method to efficiently isolate medullary thymic epithelial cells from murine thymi based on UEA-1 MicroBeads | |
| Alexandre et al. | Isolation and analysis of stromal cell populations from mouse lymph nodes | |
| Kyun et al. | Development of an In Vitro Model for Inflammation Mediated Renal Toxicity Using 3D Renal Tubules and Co-Cultured Human Immune Cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20130914 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20150710 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160914 |