RU2471437C2

RU2471437C2 - Применение синтезированных в плазме полимеров, являющихся производными пиррола для нейропротекции и восстановления соединения в центральной нервной системе

Info

Publication number: RU2471437C2
Application number: RU2009149682/14A
Authority: RU
Inventors: ГОНСАЛЕС Роберто ОЛАЙО; КОРОНА Хуан МОРАЛЕС; ЛОСАНО Родриго МОНДРАГОН; МЕХИА Ана Лаура АЛЬВАРЕС; ГВАДАРРАМА Хуан Карлос Аксаякатль МОРАЛЕС; КАСТАНЬЕДА Луис Камило РИОС; РУИС Мария де Лос Анхелес Арасели ДИАС; КРУС Гильермо Хесус КРУС; ГОНСАЛЕС Мария Гвадалупе ОЛАЙО; СЕБАЛЬОС Эрмелинда САЛЬГАДО
Original assignee: Универсидад Аутонома Метрополитана; Институто Насиональ Де Неуролохия И Неуросирухия Мануэль Веласко Суарес; Институто Мехикано Дель Сегуро Сосиаль; Институто Насиональ Де Инвестигасионес Нуклеарес
Priority date: 2007-06-01
Filing date: 2007-06-01
Publication date: 2013-01-10
Also published as: CN101821814A; US20100234488A1; US8563626B2; EP2164078B1; JP2010531674A; JP5587177B2; EP2164078A1; EP2164078A4; WO2008147166A1; CN101821814B; RU2009149682A

Abstract

Группа изобретений относится к нейрохирургии. Способ синтеза сополимера полипиррола и полиэтиленгликоля в плазме включает полимеризацию мономеров пиррола и этиленгликоля посредством смешивания слабого потока их пара в реакторе и приложения тлеющих электрических разрядов, отделение полученных сополимеров, подвергая их 2 или 3 циклам смачивания ацетоном, высушивание сополимеров, механический сбор полученных сополимеров. Данным способом может быть получен сополимер полипиррола и полиэтиленгликоля для производства имплантата, способствующего нейропротекции и восстановлению соединения в спинном мозге после повреждения. Группа изобретений позволяет улучшить условия для регенерации нервной ткани. 8 н.п. ф-лы, 7 ил.

Description

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении предлагается использовать синтезированные в плазме полимеры, являющиеся производными пиррола, и небиоразрушаемые вещества для производства имплантатов, которые способствуют нейропротекции и восстановлению соединения в спинном мозге после травмы.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Травматические повреждения спинного мозга (ПСМ) для здравоохранения являются трудностью, связанной с высокой смертностью (Dryden DM, Saunders LD, Rowe BH, May LA, Yiannakoulias N, Svenson LW, Schopflocher DP, Voaklander DC. The epidemiology of traumatic spinal cord injury in Alberta, Canada. Can. J. Neurol. Sci. 2003; 30: 113-121), и некоторые последствия приводят к инвалидности и длительному и дорогостоящему реабилитационному лечению.

Кроме того, обладая высоким социальным и экономическим влиянием, сообщалось, что в Соединенных Штатах, Канаде, Австралии, Италии и Мексике новые ежегодные случаи ПСМ встречаются в количестве от 18 до 55 на миллион человек (Woodruff BA, Baron RC. A description of nonfatal spinal cord injury using a hospital-based registry. Am. J. Prev. Med. 1994; 10: 10-14, Dryden DM, Saunders LD, Rowe BH, May LA, Yiannakoulias N, Svenson LW, Schopflocher DP, Voaklander DC. The epidemiology of traumatic spinal cord injury in Alberta, Canada. Can. J. Neurol. Sci. 2003; 30: 113-121, O'-Connor P. Incidence and patterns of spinal cord injury in Australia. Accid. Anal. Prev. 2002; 34: 405-415, Pagliacci MC, Celani MG, Zampolini M, Spizzichino L, Franceschini M, Baratta S, Finali G, Gatta G, Perdon L; Gruppo Italiano Studio Epidemiologico Mielolesioni. An Italian survey of traumatic spinal cord injury. The Gruppo Italiano Studio Epidemiologico Mielolesioni study. Arch Phys Med Rehabil. 2003; 84: 1266-1275, Pardini MC. La epidemiologia de la lesion medular traumatica en el Distrito Federal. PhD thesis of the Secretaria de Salubridad y Asistencia 1998).

Теперь жертвы, страдающие от ПСМ, имеют программы помощи и реабилитации, разработанные для того, чтобы препятствовать долгосрочному физическому истощению (Houle JD, Tessler A. Repair of chronic spinal cord injury. Exp Neurol. 2003; 182: 247-260). Однако эти индивидуумы ожидают лечения, которое восстановит их автономные функции, снизит нейропатическую боль и восстановит их способность ходить. По причине важности этого заболевания по всему миру было создано несколько институтов, которые ежегодно тратят несколько сотен миллионов долларов на поддержку исследований по этой теме, однако на сегодняшний день не существует эффективных способов лечения (Houle JD, Tessler A. Repair of chronic spinal cord injury. Exp Neurol. 2003; 182: 247-260).

При повреждении патофизиологические явления начинаются с процесса саморазрушения нервной ткани, абортивной регенерации и заживления вокруг места повреждения (Aldskogius H, Kozlova EN. Strategies for repair of the deafferented spinal cord. Brain Res Brain Res Rev. 2002; 40: 301-308). В течение острой стадии наблюдается ишемический процесс, вызванный нарушением микроциркуляции крови, которое создает недостаток энергии, который, в свою очередь, переходит в утрату ионной регуляции и отек, вызванный мобилизацией одновалентных катионов, таких как K⁺ и Na⁺, и двухвалентных катионов, таких как Ca²⁺, что приводит к спинальному шоку (Hulsebosch CE. Recent advances in patophysiology and treatment of spinal cord injury. Adv. Physiol. Educ. 2003; 26: 238-255).

Результатом всех этих процессов является крайне нежелательная для осуществления процесса заживления среда в поврежденной ткани, как в месте повреждения, так и в периферических областях (Beattie MS, Farooqui AA, Bresnahan JC. Review of current evidence for apoptosis after spinal cord injury. J Neurotrauma. 2000, 17: 915-925), образование полостей, окруженных астроглиальным шрамом, из которых образуются многодольчатые кистозные полости, функционирующие в качестве физического и химического барьера, который препятствует регенерации аксонов (Houle JD, Tessler A. Repair of chronic spinal cord injury. Exp Neurol. 2003; 182: 247-260; Profyris C, Cheema SS, Zang D, Azari MF, Boyle K, Petratos S. Degenerative and regenerative mechanisms governing spinal cord injury. Neurobiol Dis. 2004; 15: 415-436).

Многие годы, для того, чтобы после ПСМ поддержать аксональный рост, регенерацию спинного мозга и, следовательно, восстановление функции, выполняли трансплантацию ткани и клеток (Zompa EA, Cain LD, Everhart AW, Moyer MP, Hulsebosch CE. Transplant therapy: recovery of function after spinal cord injury. J Neurotrauma. 1997; 14: 479-506; Taoka Y, Okajima K. Spinal cord injury in the rat. Prog Neurobiol. 1998; 56: 341-358). Выполняли трансплантации в месте повреждения с использованием нервных стволовых клеток и поливалентных клеток-предшественников из зародыша или плода (Stokes ВТ, Reier PJ. Fetal grafts alter chronic behavioral outcome after contusion damage to the adult rat spinal cord. Exp Neurol. 1992, 116: 1-12, McDonald JW, Liu XZ, Qu Y, Liu S, Mickey SK, Turetsky D, Gottlieb Dl, Choi DW. Transplanted embryonic stem cells survive, differentiate and promote recovery in injured rat spinal cord. Nat Med 1999, 5: 1410-1412), трансплантацию эмбриональных клеток или эмбриональной ткани спинного мозга (Zompa EA, Cain LD, Everhart AW, Moyer MP, Hulsebosch CE. Transplant therapy: recovery of function after spinal cord injury. J Neurotrauma. 1997,14: 479-506, Coumans JV, Lin TT, Dai HN, MacArthur L, McAtee M, Nash C, Bregman BS. Axonal regeneration and functional recovery after complete spinal cord transection in rats by delayed treatment with transplants and neurotrophins. J Neurosci. 200; 21: 9334-9344) и трансплантации периферического нерва и Шванновских клеток (Menei P, Montero-Menei С, Whittemore SR, Bunge RP, Bunge MB. Schwann cell genetically modified to secrete human BDNF promote enhanced axonal regrowth across transected adult rat spinal cord. Eur J Neurosci 1998, 10: 607-621). Трансплантировали олигодендроциты для того, чтобы способствовать ремиелинизации (Jeffery ND, Crang AJ, O′Leary MT, Hodge SJ, Blakemore WF. Behavioral consequences of oligodendrocyte progenitor cell transplant into experimental demyelinating injury in the rat spinal cord. Eur J Neurosci 1999; 11: 1508-1514), результаты оказывали негативное влияние на регенерацию, так как они экспрессируют молекулы, ингибирующие аксональный рост (Tessier-Lavigne M, Goodman CS. Perspectives: neurobiology. Regeneration in the nogo zone. Science 2000 287: 813-814). Кроме того, выполняли трансплантацию с использованием незрелых или нереактивных астроцитов для того, чтобы способствовать регенерации и увеличивать ремиелинизацию и уменьшать образование глиального рубца (Franklin RJ, Crang AJ, Blakemore WF. Transplanted type-1 astrocytes facilitate repair of demyelinating injuries by host oligodendrocytes in adult rat spinal cord. J Neurocytol 1991, 20: 420-430). Трансплантировали клетки из микроглии (Rabchevsky AG, Weinitzen JM, Coulpier M, Fages C, Tinel M, Junier MP. A role for transforming growth factor as an inducer of astrogliosis. J Neurosci. 1998, 18: 10541-10552), глиальные клетки обонятельной луковицы для создания благоприятной среды для регенерации (Keyvan-Fouladi N, Li Y, Raisman G. How do transplanted olfactory ensheathing cells restore function? Brain Res Brain Res Rev. 2002; 40: 325-327) и даже использовали стволовые клетки, подвергавшиеся или не подвергавшиеся генно-инженерным манипуляциям, чтобы индуцировать синтез определенных белков, таких как нейротрофины, нейротрансмиттеры, ферменты, молекулы внеклеточного матрикса и поверхностные молекулы адгезии, без достижения хороших результатов в восстановлении функции (McDonald JW, Liu XZ, Qu Y, Liu S, Mickey SK, Turetsky D, Gottlieb DI, Choi DW. Transplanted embryonic stem cells survive, differentiate and promote recovery in injured rat spinal cord. Nat Med 1999, 5: 1410-1412; Barami K, Diaz FG. Cellular transplant and spinal cord injury. Neurosurgery. 2000; 47: 691-700).

Несмотря на эти терапевтические попытки, большинство трансплантаций, применявшихся при лечении ПСМ, потерпели неудачу, так как не были способны в значительной мере восстановить потерю функции нервов, что привело к разработке новых стратегий, таких как применение биоматериалов, чтобы попытаться восстановить спинной мозг. В первых распространенных по всему миру сообщениях говорится об использовании имплантатов из углеродных нитей в качестве мостика для прорастания поврежденных аксонов в спинном мозге крыс. Khan et al., (Khan T, Dauzvardis M, Sayers S. Carbon filament implants promote axonal growth across the transected rat spinal cord. Brain Res 1991; 541: 139-145) имплантировали углеродную нить крысам, на которых осуществляли модель с полным пересечением спинного мозга, и они наблюдали аксональный рост на нитях и между ними, заключив, углеродные нити могут служить в качестве поверхности, которая подходит для связывания растущих аксонов, а также, возможно, функционирует в качестве механической направляющей.

Использование микросфер с фактором роста нервов (NGF), инкапсулированного в овальбумин, соединенного с биоразрушаемыми полимерами, расположенные в месте повреждения, является биоинженерным способом, разработанным в 1999 г. авторами Cao и Shoichet (Cao X, Schoichet MS. Delivering neuroactive molecularles from biodegradable microspheres for application in central nervous system disorders. Biomaterials. 1999, 20: 329-339), чтобы способствовать процессу восстановления аксонов. Эту технологию тестировали на клетках PC12 для того, чтобы определить биоактивность высвобожденного NGF. Результаты показали, что NGF остается биоактивным вплоть до 91 дня.

Биосовместимый гидрогель из поли[N-(2-гидропропил)метакриламида] (ПГПМА) с областью клеточной адгезии фибронектина Arg-Gly и Asp синтезировали и описали его реологическую структуру и диэлектрические свойства Woerly et al., (Woerly S, Pinet E, de Robertis L, Van Diep D, Bousmina M. Spinal cord repair with PHPMA hydrogel containing RGD peptides (NeuroGel). Biomaterials. 2001; 22: 1095-1111). Этот биоматериал тестировали на модели травмы спинного мозга частичным рассечением на крысах Sprague-Dawley. Гидрогель вставляли внутрь спинного мозга. Результаты показали, что полимер гидрогеля предоставляет трехмерную структуру и обеспечивает целостность поврежденной области, облегчая миграцию и реорганизацию клеток. Также наблюдали ангиогенез и аксональный рост внутри микроструктуры и новую ткань на ней, а также аксональный рост, идущий к супраспинальной области внутри реконструируемого сегмента спинного мозга, кроме того, присутствие гидрогеля снижало некроз и образование полостей, по причине чего авторы отметили, что этот полимер может быть полезен при восстановлении поврежденного спинного мозга.

Применение полимеров в виде трубчатых структур, которые направляют растущие аксоны и служат в качестве мостика в области перехода, представляло собой способ, использованный авторами Oudega et al., (Oudega M, Gautier SE, Chapon P, Fragoso M, Bates ML, Parel JM, Bunge MB. Axonal regeneration into Schwann cell grafts within resorbable poly(alpha-hydroxyacid) guidance channels in the adult rat spinal cord. Bio-materials. 2001, 22: 1125-1136). Реабсорбируемые полимеры, состоящие из поли(D,L-молочной кислоты) (PLA50) с сополимером с высокой молекулярной массой поли(L-молочной кислоты), смешанные с 10% олигомеров поли(L-молочной кислоты) (PLA100/10), имплантировали в нервную ткань взрослых крыс штамма Fisher, которые подвергались полному пересечению спинного мозга, и в этом исследовании проводили 4-месячное наблюдение. Результаты показали, что после 2 недели трубки имели спинальную нервную ткань и кровеносные сосуды. Наибольшее количество миелинизированных аксонов обнаруживали через 1 месяц после имплантации. В этой публикации делают вывод о том, что имеет место рост миелинизированных волокон внутри имплантата, выполненного из PLA100/10 полимера, через 2 месяца после того, как его поместили в спинной мозг. Однако имело место значительное уменьшение этого феномена 4-мя месяцами позже, по причине чего авторы рекомендуют дальнейшие исследования для оптимизации этого способа.

Другой биоразрушаемый материал, изготовленный для облегчения процесса регенерации и направления роста аксонов после ПСМ, представляет собой нити, изготовленные из поли-P-гидроксибутират (ПГБ) и фибронектина альгината + гидрогеля. В исследовании, которое проводили авторы Novikov et al., (Novikov LN, Novikova LN, Mosahebi A, Wiberg M, Terenghi G, Kellerth JO. A novel biodegradable implant for neuronal rescue and regeneration after spinal cord injury. Biomaterials. 2002; 23: 3369-3376), выполняли рассечение руброспинального тракта на уровне позвонка L1 и наблюдали, что имплантация ПГБ снижает гибель клеток на 50%. Использование отдельных компонентов не проявило эффекта на выживание нейронов. Также в трансплантат из ПГБ добавляли неонатальные Шванновские клетки и наблюдали регенерацию аксонов внутри имплантата и на всем протяжении нервной ткани, что подсказало, что использование этих биоматериалов вместе со Шванновскими клетками может служить в качестве нейронной основы с увеличенной регенерацией после ПСМ.

Использование гидрогелевых трубок, состоящих из поли(2-гидроксиэтил метакрилат-со-метилметакрилат) (п(ГЭМА-со-ММА)), в качестве потенциальных каналов, направляющих аксональный рост в центральной нервной системе, представляет собой другой подход к восстановлению повреждений спинного мозга. Эти трубки обладают следующими характеристиками: мягкость и гибкость, схожие с гелем со взаимосвязанными макропорами между слоями, контролируемыми через химический состав (Dalton PD, Flynn L, Shoichet MS. Manufacture of poly(2-hydroxyethyl methacrylate-co-methyl methacrylate) hydrogel tubes for use as nerve guidance channels. Biomaterials. 2002, 23: 3843-3851).

Однако было показано, что разрушение этих полимеров может вызвать воспалительную реакцию, хотя некоторые из них являются иммунологически инертными и, в частности, устойчивыми в нервной системе (Marchant RE, Anderson JM, Dillingham EO In vivo biocompatibility studies. VII. Inflammatory response to polyethylene and to a cytotoxic polyvinylchloride. J Biomed Mater Res 1986, 20: 37-50; Gautier SE, Oudega M, Fragoso M, Chapon P, Plant GW, Bunge MB, Parel JM. Poly(alpha-hydroxyacids) for application in the spinal cord: resorbability and biocompatibility with adult rat Schwann cells and spinal cord. J Biomed Mater Res 1998, 42: 642-654). Другие авторы сообщали, что для некоторых полимеров, адгезия аксонов к этим соединениям является низкой, однако Rangappa et al. (Rangappa N, Romero A, Nelson KD, Eberhart RC, Smith GM. Laminin-coated poly(L-lactide) filaments induce robust neurite growth while providing directional orientation. J Biomed Mater Res 2000, 51: 625-634), используя сети, покрытые матрицей ламинина, смогли увеличить адгезию аксонов к матрице. Другая стратегия представляет собой разработку биоматериалов со способностью связывать инкапсулированные пептиды (трофические факторы, лекарственные средства и т.д.), которые медленно высвобождаются (Pechar M, Ulbrich K, Subr V, Seymour LW, Schacht EH. Poly(ethylene glycol) multiblock-copolymer as a carrier of anti-cancer drug doxirubicin. Bioconjug Chem 2000, 11: 131-139), но удовлетворительные результаты не были достигнуты. Коллагеновые волокна отдельно или в сочетании с другими материалами служат в качестве направляющих и в качестве основы для аксонального роста и для индуцирования регенерации (Heffner CD, Lumsden AG, O'Leary DD. Target control of collateral extension and directional axon growth in the mammalian brain. Science. 1990; 247: 217-220; Tong XJ, Hirai K, Shimada H, Mizutani Y, Izumi T, Toda N, Yu P. Sciatic nerve regeneration navigated by laminin-fibronectin double coated biodegradable collagen grafts in rats. Brain Res 1994, 663: 155-162). Быстро развивается использование биосовместимых материалов для восстановления поврежденной нервной ткани, разрабатываются материалы, которые выполняют функцию мостиков для восстановления спинного мозга, однако эти полимеры обычно синтезируются химическими способами или электрохимической полимеризацией (Wang J, Neoh KG, Kang ET. Comparative study of chemically synthesised and plasma polymerized pyrrole and thiophene thin films. Thin Solid Films 2004, 446: 205-217), которые могут препятствовать их положительному воздействию, поскольку было показано, что разрушение этих полимеров может вызывать воспалительную реакцию.

Биоразрушаемые полимеры, синтезированные из смеси, и сочетание сегментов пиррола и тиофена с гибкими цепями алифатических сложных эфиров для облегчения их расщепления описаны авторами Schmidt et al. (патент США №6696575 B2, 2004), эти полимеры были предложены в качестве альтернативной обработки в области технологии культивирования тканей, с учетом их химических и электрических свойств. Эти материалы являются гибкими и их химическая структура позволяет электронам свободно перемещаться между цепями, увеличивая их электропроводные свойства. В этом патенте, они предлагаются в качестве биоматериалов, способствующих регенерации периферической нервной ткани спинного мозга, а также в других тканях (кость, мышца и т.д.). Однако не представлены доказательства, подтверждающие возможность их использования.

Использование плазмы для получения проводящих полимерных пленок является другим способом, который используется для синтеза полимеров. В ходе процесса синтеза, мономеры реагируют в газовой фазе способа и не нуждаются в химическом посреднике в реакции. При этом способе, химическая структура полимеров отличается от таковой, наблюдаемой при химическом синтезе, проявляет повышенную чистоту, большую силу сцепления и увеличенные сшивание и наполнение (Wang J, Neoh KG, Kang ET. Comparative study of chemically synthesised and plasma polymerized pyrrole and thiophene thin films. Thin Solid Films 2004, 446: 205-217). Cruz et al. (Cruz GJ, Morales J, Olayo R. Films obtained by plasma polymerization of pyrrole. Thin Solid Films 1999, 342: 119-126) сообщают о способе синтеза в плазме материалов, являющихся производными пиррола, среди которых обнаружены материалы, легированные йодом. Эти материалы не являются биоразрушаемыми, по причине чего их использование в нервной системе будет снижать воспалительный ответ, что наделяет их повышенной эффективностью, так как некоторые исследования указывают на то, что воспалительный ответ является одним из механизмов вторичного повреждения, которое разрушает нервную ткань, расположенную на периферии повреждения.

Проводящие полимеры представляют собой такие материалы, образованные из длинных цепей углеводородов с чередующимися или сопряженными двойными связями, в которых встречаются электрические свойства металлов и механические свойства пластмасс. Их электропроводность обусловлена, в основном, добавлением определенных количеств других химических продуктов (легирование), но также присутствием сопряженных двойных связей, которые делают возможным прохождение тока электронов. Технология легирования включает в себя добавление атомов, обладающих электроотрицательными свойствами. Эти атомы могут предоставлять свободные электроны полимерным связям или отнимать электроны, что равняется образованию положительных зарядов. В обоих случаях, полимерная цепь становится электрически нестабильной, и если приложить разность потенциалов, электроны будут двигаться через полимер (Cruz GJ, Morales J, Olayo R. Films Obtained by plasma polymerization of pyrrole. Thin solid films 1999, 342: 119-126). Хотя физические механизмы, которые превращают полимеры в проводники, недостаточно изучены, похоже, что чистота и устройство полимерных цепей обладают большим значением. Таким образом, при изменении структурного устройства полимера электропроводность может быть улучшена. Полимеры, используемые в качестве проводников, состоят, в основном, из атомов углерода и водорода, собранных в повторяющиеся мономерные блоки, как и любой другой полимер. В основном, эти блоки обычно содержат гетероатом, такой как азот или сера. Атомы С соединены вместе с помощью чередующегося набора одинарных и двойных связей (…=C-C=C-C=C-…), т.е. они проявляют сверхсопряжение связей, которое является основной характеристикой всех проводящих полимеров. Прохождение электричества осуществляется благодаря движению электронов (e^-). Важно, чтобы e^-свободно проходили через материал. В твердых проводниках, движение e^- через дискретные энергетические состояния называется зонами (происходит от распространения Теории молекулярных орбиталей на целую твердокристаллическую сеть). Твердые вещества могут проводить электричество, только если их последняя зона наполовину заполнена (хороший проводник или металлический проводник) или, если пуста, она должна быть энергетически близка к последней заполненной зоне (полупроводник). Если прыжок: «заполненная-зона -> пустая-зона» является энергетически большим, это может рассматриваться как изолятор (Cruz GJ, Morales J, Olayo R. Films Obtained by plasma polymerization of pyrrole. Thin solid films 1999, 342: 119-126).

Полипиррол (PPy) представляет собой электропроводящий полимер с положительно заряженной химической структурой, к которой можно присоединять различные химические субстанции (допанты) для изменения ее электрических свойств. PPy используется в качестве биосенсора (Lopez-Crapez E, Livache T, Marchand J, Grenier J. K-ras mutation detection by hybridization to a polypyrrole DNA chip. Clin Chem 2001; 47: 186-194), для обнаружения глюкозы в крови по причине его биосовместимости. Кроме того, из-за его электропроводящих свойств, было показано, что PP обладает возможностью стимулировать пролиферацию нервных клеток (Kotwal A, Schmidt CE. Electrical stimulation alters protein adsorption and nerve cell interactions with electrically conducting biomaterials. Biomaterials. 2001; 22: 1055-1064), хромаффинных клеток (Aoki T, Tanino M, Sanui K, Ogata N, Kumakura K. Secretory function of adrenal chromaffin cells cultured on polypyrrole films. Biomaterials. 1996; 17: 1971-1974) и эндотелиальных клеток (Garner B, Georgevich A, Hodgson AJ, Liu L, Wallace GG. Polypyrrole-heparin composites as stimulus-responsive substrates for endothelial cell growth. J Biomed Mater Res 1999, 44: 121-129). Schmidt et al., (Schmidt CE, Shastri VR, Vacanti JP, Langer R. Stimulation of neurite outgrowth using an electrically conducting polymer. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1997; 94: 8948-8953) показали, что электрическая стимуляция увеличивает аксональный рост в клетках PC-12 на РР пленках. Недавние исследования продемонстрировали приемлемую биосовместимость для РР как in vitro (Zhang Z, Roy R, Dugre FJ, Tessier D, Dao LH. In vitro biocompatibility study of electrically conductive polypyrrole-coated polyester fabrics. J Biomed Mater Res 2001, 57: 63-71), так и in vivo (Jiang X, Marois Y, Traore A, Tessier D, Dao LH, Guidoin R, Zhang Z. Tissue reaction to polypyrrole-coated polyester fabrics: an in vivo study in rats. Tissue Eng. 2002; 8: 635-647), эти предпосылки обеспечивают основу для использования РРу и его производных в некоторых биомедицинских приложениях и технологии культивирования тканей. На основании этой информации было решено использовать два полупроводящих полимера, полипирроловый сополимер с полиэтиленгликолем (РРy/ПЭГ) и полимер легированного йодом полипиррола (РРy/I) в модели с полным пересечением спинного мозга крысы.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Синтез полипиррол/полиэтиленгликолевого сополимера и легированного йодом полипиррола

Полимеры синтезировали в виде тонких пленок с помощью тлеющих электрических разрядов в стеклянном трубчатом реакторе 9 см в диаметре и 30 см длиной с фланцами из нержавеющей стали. Давление составляло 1,5×10^-2 Торр чтобы инициировать полимеризацию и 5×10^-2 Торр для распространения химической реакции. Частота осцилляции электрического поля составляла 13,5 МГц. Электроды из нержавеющей стали обладали диаметром 7 см. Один из электродов соединяли с землей, и другой соединяли с радиосигналом, расстояние между ними составляло 9 см. Мономер и допант помещали в отдельные контейнеры, и слабый поток пара из них впускали в реактор благодаря разнице давлений между реактором и сосудами, и оба они смешивались в реакторе. Температура реактивов составляла приблизительно 20°C. Время полимеризации составляло 300 мин. Сначала реакции протекали в газовой фазе и затем в твердой фазе, когда молекулярная масса полимера увеличивалась. Брутто формула стартового реактива была: C₄H₅N.

Пирроловый мономер

Полимеры отделяли от поверхности реактора после того, как подвергали их нескольким циклам смачивания ацетоном и высушивания. После 2 или 3 циклов полимеры механически собирали с помощью шпателя, затем их перемалывали для изготовления таблеток, которые использовали в качестве имплантатов в спинной мозг объектов исследования. Для сравнения изготавливали таблетки из производных легированного йодом полипиррола (PPy/I) и сополимеров из полипиррола и полиэтиленгликоля (PPy/ПЭГ).

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛИМЕРОВ, СИНТЕЗИРОВАННЫХ В ПЛАЗМЕ.

Анализ структуры с помощью инфракрасной спектроскопии

На спектре на фиг.1A показаны 3 сложных полосы поглощения, соответствующие PPy/ПЭГ сополимеру. Первая находится между 400 и 1200 см^-1, вторая между 1200 и 2000 см^-1 и третья между 2400 и 3600 см^-1. Размытый максимум, покрывающий диапазон между 400 и 1200 см^-1, содержит много абсорбций, соответствующих алкенам. Ширина пика указывает на ветвление, сшивку и взаимодействие между кольцами PPy. Наиболее интенсивные пики соответствуют колебаниям PPy.

На фиг.1B показан спектр пропускания образца PPy/I, видны 2 сложных широких полосы колебания, характерные для полимеров, синтезированных в плазме. Один находится между 2400 и 3600 см^-1 и другой между 500 и 1800 см^-1. Область между 3600 и 2400 см^-1 показывает абсорбцию связей N-H, O-H и C-H в различных конфигурациях, указывая на колебания первичных аминов (C-N) в 3349 см^-1, а также на насыщение алифатических цепей, расположенное в 2932 см^-1. Во второй сложной полосе колебания соответствуют отмеченным первичным, вторичным и третичным аминам в 1639 см^-1. Деформация метила (C-H) находится в 1452 см^-1. В 747 см^-1 колебания соответствуют показанным C-C связям.

Электрические характеристики

PPy/ПЭГ проявлял сопротивление порядка Ом и рассматривался в качестве полупроводящего полимера. PPy/I проявлял сопротивление 1,3 MОм, при удельном электрическом сопротивлении 45,94 MОм·см и приблизительной удельной электропроводности 21 нСм/см.

Морфология

На фиг.2A приведено изображение поверхности PPy/ПЭГ сополимера, полученное с помощью сканирующей электронной микроскопии, при которой наблюдается гомогенная структура, поверхность которой обладает губчатой структурой. На фиг.2B приведено изображение, соответствующее PPy/I полимеру, на поверхности видны маленькие агрегаты материала с размером приблизительно от 5 до 10 мкм.

PPy/ПЭГ сополимер получали в виде тонких пленок с помощью микроскопа, тогда как PPy/I полимер измельчали и затем спрессовывали для образования таблеток.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1. (A) представляет собой спектр инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье полипиррол/полиэтиленгликолевого сополимера; (B) представляет собой спектр инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье легированного йодом полипирролового полимера.

Фиг.2. Микрофотографии, полученные с помощью сканирующей электронной микроскопии имплантированных биоматериалов. (A) Сополимер полипиррола и полиэтиленгликоля. (B) Легированный йодом полипиррол. Полоска соответствует 50 мкм.

Фиг.3. График, который показывает восстановление двигательной функции, которое оценивали по шкале BBB (Basso, Beattie и Bresnahan) от первого дня повреждения (D1) и до 4 недель (S) после полного пересечения спинного мозга.

Фиг.4. Продольные срезы спинного мозга животного с полным пересечением спинного мозга и без имплантата через один месяц после повреждения. (A) Зона повреждения и сохраненная ткань (2,5×); (B) Фрагмент зоны перехода (5×); (C) Утрата цитоархитектуры в зоне повреждения (20×); (D) Присутствие воспалительных клеток (40×). Окрашивание гематоксилином/эозином. SB: белое вещество, SG: серое вещество, ZL: зона повреждения, CI: воспалительные клетки.

Фиг.5. Продольные срезы спинного мозга животного с полным пересечением спинного мозга и с имплантатом полипиррол/полиэтиленгликолевого сополимера через один месяц после повреждения. (A) Изображение, которое показывает интеграцию имплантата в нервную ткань (2,5×); (B) Фрагмент зоны перехода (5×); (C) Зона повреждения (20×); (D) Присутствие воспалительных клеток (40×). SB: белое вещество, SG: серое вещество, ZL: зона повреждения, CI: воспалительные клетки. Окрашивание гематоксилином/эозином. SB: белое вещество, SG: серое вещество, ZL: зона повреждения, PPy/ПЭГ: трансплантат из сополимера полипиррола и полиэтиленгликоля, MM: модифицированные макрофаги.

Фиг.6. Продольные срезы спинного мозга животного с полным пересечением спинного мозга и имплантатом легированного галогеном полипиррола через один месяц после повреждения. (A) Изображение, которое показывает интеграцию имплантата в нервную ткань (2,5×); (B) Фрагмент зоны перехода (5×); (C) Зона повреждения (20×); (D) Присутствие воспалительных клеток (40×). SB: белое вещество, SG: серое вещество, ZL: зона повреждения, CI: воспалительные клетки. Окрашивание гематоксилином/эозином. SB: белое вещество, SG: серое вещество, ZL: зона повреждения, PPy/I: трансплантат из легированного йодом полипиррола, CGCE: гигантоциты, привлеченные инородным телом.

Фиг.7. На изображениях показано общее состояние и восстановление функции животных в конце исследования. (A) Контрольное животное без имплантата; (B) Животное с имплантатом из полипиррол/полиэтиленгликолевого сополимера и (C) Животное с имплантатом из полипиррола/йода.

ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Оценка влияния синтезированных в плазме полимеров, являющихся производными пиррола, на восстановление соединения нейронов

Синтезированные в плазме полимеры оценивали в качестве нейропротекторов и нейрорегенераторов нервной функции в модели с полным пересечением спинного мозга крыс.

Создавали три экспериментальные группы, по три животных в каждой, в соответствии со следующим: A) Контрольная группа. Животные с полным пересечением спинного мозга на уровне 9-го грудного позвонка (T9), B) группа PPy/ПЭГ. Животные с полным пересечением спинного мозга и с имплантатом из PPy/ПЭГ, C) Группа PPy/I, животные, которые проходили описанную выше хирургическую процедуру и которым имплантировали таблетки и PPy/I. В каждую экспериментальную группу входило по 3 крысы.

Животных анестезировали внутримышечно смесью из 77,5 мг кетамина и 12,5 мг ксилазина гидрохлорида на кг массы тела. После анестезирования животного и очистки оперируемой области на коже выполняли сагиттальный разрез с последующим рассечением паравертебральных мышц остистого отростка.

Два остистых отростка удаляли с T9-T10, чтобы видеть пластинчатые отростки этих позвонков. В конце проводили двухуровневую ламинэктомию, продлевая ее билатерально до фасетных отростков. Мозговые оболочки оставляли нетронутыми. После завершения ламинэктомии выполняли продольное рассечение в мозговых оболочках приблизительно 5 мм длиной, соединяя обе стороны разреза одним стежком шва нитью 9-0 (полиамидный монофиламент 6), затем выполняли полное поперечное пересечение спинного мозга, и поддерживали с помощью микрохирургического крюка, так что не осталось соединенных нервных путей.

Сразу после завершения процесса повреждения посредством полного пересечения спинного мозга крыс прямо в место пересечения в поперечном направлении вводили кусок полимерной таблетки приблизительно 3 мм в диаметре. После имплантации шовной нитью 9-0 был проведен через мозговые оболочки прерывистым способом. В конце хирургический разрез сшивали в 2 плоскостях, мышечные фасции и кожу при помощи прерывистого и непрерывного шва, соответственно, нитью 5-0 (полипропиленовый монофиламент).

После хирургической операции животные находились под наблюдением при комнатной температуре в одной клетке с диетой из промышленной еды и воды в свободном доступе, которые смешивали с парацетамолом в концентрации 3,2 г/100 мл (10 мл разводили в 2 л воды, вводили с питьевой водой в течение 72 часов), а также 250 мкл/250 г по массе бензатинпенициллина вводили внутримышечно (1200000 МЕ одной дозой).

Оценка регенеративного эффекта полимеров

Для определения индуцирующего влияния биоматериалов на регенерацию восстановление двигательной функции животных оценивали в течение 4 недель после рассечения спинного мозга, используя шкалу BBB (Basso, Bettie и Bresnahan) (Basso DM, Beattie MS, Bresnahan JC. Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight-drop device versus transection. Exp Neurol. 1996; 139: 244-256), как описано ниже:

Шкала BBB

Степень 0

Основная подвижность в задних конечностях (EP) не наблюдается.

Степень 1

Ограниченная подвижность (изгиб <50%) в одном или двух суставах, обычно бедро и/или колено.

Степень 2

Свободная подвижность (изгиб >50%) в суставе с ограниченной подвижностью в других суставах или без нее.

Степень 3

Свободная подвижность в двух суставах.

Степень 4

Ограниченная подвижность в трех суставах задней конечности (бедро, колено и голеностоп).

Степень 5

Ограниченная подвижность двух суставов и свободная подвижность третьего сустава.

Степень 6

Свободная подвижность двух суставов и ограниченная подвижность третьего сустава.

Степень 7

Свободная подвижность трех суставов задней конечности (бедро, колено и голеностоп).

Степень 8

Ритмичные движения (скоординированные) обеих задних ног без удержания веса или подошвенное размещение без удержания веса.

Степень 9

Подошвенное размещение с удержанием веса при отсутствии ходьбы или случайных шагов (<0= 50%), частых (от 51% до 94%) или постоянных

(от 95% до 100%) при удержании дорзального веса, без подошвенного удержания.

Степень 10

Случайные шаги с подошвенным удержанием веса, без координации между передними конечностями (EA) и задними конечностями.

Степень 11

Частые или постоянные шаги с подошвенным удержанием веса, без координации между передними и задними конечностями.

Степень 12

Частые или постоянные шаги с подошвенным удержанием веса и случайной координацией между передними и задними конечностями.

Степень 13

Частые или постоянные шаги с подошвенным удержанием веса и частой координацией между передними и задними конечностями.

Степень 14

Постоянные шаги с подошвенным удержанием веса, постоянная координация между ES и EI, и внутреннее или наружное вращение ног, в основном при контакте с полом или при отрыве от пола. Также частые подошвенные шаги, постоянная координация между передними и задними конечностями и случайные дорзальные шаги.

Степень 15

Постоянные подошвенные и координированные шаги между передними и задними конечностями. Животное не растопыривает пальцы или делает это только случайно, когда выдвигает ногу вперед. При контакте с полом преобладает параллельное выравнивание ног по отношению к телу.

Степень 16

Подошвенные и координированные шаги между передними и задними конечностями, постоянные в процессе маршировки. Растопыривание пальцев часто происходит, когда животное выдвигает ногу вперед. При контакте с полом параллельное выравнивание ноги по отношению к телу преобладает, но животное вращает ногу, когда оно ее поднимает.

Степень 17

Подошвенные и координированные шаги между передними и задними конечностями, постоянные в процессе маршировки. Растопыривание пальцев часто происходит, когда животное выдвигает ногу вперед. При контакте с полом параллельное выравнивание ноги по отношению к телу преобладает, но когда животное поднимает ногу, оно сохраняет ее выровненной (без вращения).

Степень 18

Растопыривание пальцев происходит постоянно в процессе маршировки. При контакте с полом параллельное выравнивание ноги по отношению к телу преобладает, но животное вращает ей, когда оно поднимает ногу.

Степень 19

Подошвенные и координированные шаги между передними и задними конечностями, постоянные в процессе маршировки. Растопыривание пальцев постоянно происходит в процессе маршировки. При контакте с полом и подъеме ноги параллельное выравнивание ноги по отношению к телу преобладает. Часть времени или постоянно волочит хвост.

Степень 20

Подошвенные шаги, координированная походка и постоянное растопыривание пальцев. При контакте с полом и подъеме ноги параллельное выравнивание ноги по отношению к телу преобладает, хвост постоянно поднят и торс нестабилен.

Степень 21

То же самое, но торс стабилен.

Оценка нейропротективного влияния полимеров

Нейропротективное влияние и встраивание полимеров можно видеть на гистологических срезах через один месяц после повреждения. Животных перфузировали через внутрисердечный путь. После перфузии спинной мозг удаляли для того, чтобы получить сегмент в 1,5 см от эпицентра области повреждения до хвостового сегмента и до головного сегмента позвоночника. Ткань помещали в фиксатор на 5 дней, после которых следовала процедура заливки в парафин. На микротоме изготавливали последовательные продольные срезы толщиной 10 мкм, отбирали срезы в диапазоне 10 разрезов, получая 4 образца. Отобранные срезы пускали в плавающую водяную баню при 45°C, их помещали на стеклянные пластины для окрашивания способом Харриса с гематоксилином и эозином.

Статистический анализ

Результаты анализировали с использованием параметрических статистических способов, которые показали нормальное распределение и однородность отклонений. После теста ANOVA с повторяющимися измерениями использовали тест Даннетта.

Значения брали при p<0,05 для определения предела статистической значимости.

Результаты

Результаты функциональной оценки приведены на фиг.3. В этом исследовании восстановление наблюдалось в 5 раз чаще у животных с имплантированным PPy/ПЭГ по отношению к контрольной группе, также восстановление в группе с PPy/I было в 10 раз выше по сравнению с контрольной группой (p<0,05). В обеих группах, получивших имплантаты, восстановление функции указывает на то, что животные обладали произвольной нервной функцией, поскольку степень 4 по шкале BBB, наблюдавшаяся у животных с PPy/ПЭГ, говорит о наличии ограниченной подвижности в трех суставах в задних конечностях (бедро, колено и голеностоп), тогда как животными с PPy/I достигалась степень 7, что указывает на развитие свободных движений в трех суставах задних конечностей (бедро, колено и голеностоп). Сокращения на графике соответствуют следующему: Рассечение: полное пересечение спинного мозга без трансплантата, Рассечение + РР/ПЭГ: полное пересечение спинного мозга плюс трансплантат из сополимера полипиррола и полиэтиленгликоля, полное пересечение спинного мозга плюс трансплантат из легированного йодом полипиррола. Результаты выражены в виде среднего значения ±SE для 3 животных на группу. Эти результаты анализировали с помощью ANOVA с повторяющимися измерениями с последующим тестом Даннетта. (*р<0,05).

Результаты гистологического исследования приведены на фиг.4, 5 и 6. В контрольной группе наблюдали экстенсивное разрушение нервной ткани и увеличенное присутствие воспалительных клеток. В группе с РРy/ПЭГ наблюдали сниженное разрушение нервной ткани, отсутствовали привлеченные инородным телом гигантоциты, однако присутствовали губчатые макрофаги, воспалительные клетки и Т-лимфоциты. В группе с РРy/I имплантированный полимер соединял нервную ткань спинного мозга, воспалительные клетки также наблюдались, Т-лимфоциты и макрофаги превращались в так называемые гигантоциты, привлеченные инородным телом. Сокращения, приведенные на изображениях, обозначают: Фиг.4, (А) Зона повреждения и сохраненная ткань (2,5×); (В) Фрагмент зоны перехода (5×); (С) Утрата цитоархитектуры в зоне повреждения (20×); (D) Присутствие воспалительных клеток (40×). SB: белое вещество, SG: серое вещество, ZL: зона повреждения, CI: воспалительные клетки. Фиг.5, (А) Изображение, на котором можно наблюдать интеграцию имплантата в нервную ткань (2,5×); (В) Фрагмент зоны перехода (5×); (С) Зона повреждения (20×); (D) Присутствие воспалительных клеток (40×). SB: белое вещество, SG: серое вещество, ZL: зона повреждения, CI: воспалительные клетки. Окрашивание гематоксилином/эозином. SB: белое вещество, SG: серое вещество, ZL: зона повреждения, PPy/ПЭГ: Трансплантат из сополимера полипиррола и полиэтиленгликоля, MM: модифицированные макрофаги. Фиг.6, (A) Изображение, на котором можно наблюдать встраивание имплантата в нервную ткань (2,5×); (B) Фрагмент зоны перехода (5×); (C) Зона повреждения (20×); (D) Присутствие воспалительных клеток (40×). SB: белое вещество, SG: серое вещество, ZL: зона повреждения, CI: воспалительные клетки. Окрашивание гематоксилином/эозином. SB: белое вещество, SG: серое вещество, ZL: зона повреждения, PPy/I: Трансплантат из легированного йодом полипиррола, CGCE: Гигантоциты, привлеченные инородным телом.

Результаты недельного наблюдения за общим состоянием здоровья животных приведены на фиг.7. На этих изображениях можно наблюдать отсутствие кожных инфекций. Подобным образом, при исследовательском анализе было подтверждено то, что в процессе мониторинга не наблюдалось респираторных и почечных инфекций. В конце, в этом исследовании не было обнаружено неблагоприятного воздействия или отторжения биоматериалов при выживании 100%. Изображения, приведенные на фиг.7, соответствуют следующему: (A), Контрольное животное без имплантата, (B) Животное с имплантатом из полипиррол/полиэтиленгликолевого сополимера и (C), Животное с имплантатом из полипиррола/йода.

Результаты указывают на то, что синтезированные в плазме полимеры эффективны в качестве нейропротекторов и нейрорегенераторов спинного мозга крысы после повреждения из-за полного пересечения, без серьезных побочных эффектов.

Claims

1. Способ синтеза сополимера полипиррола и полиэтиленгликоля в плазме, включающий этапы:
а) полимеризации мономеров пиррола и этиленгликоля посредством смешивания слабого потока их пара в реакторе и приложения тлеющих электрических разрядов, при этом полимеризация проводится при давлении 1,5·10^-2 торр чтобы инициировать полимеризацию и при давлении 5·10^-2 торр для распространения химической реакции; при частоте осцилляции электрического поля 13,5 МГц; при температуре реактивов приблизительно 20°С; при этом время полимеризации составляет 300 мин;
б) отделения полученных сополимеров, подвергая их 2 или 3 циклам смачивания ацетоном;
в) высушивания сополимеров; и
г) механического сбора полученных сополимеров.

2. Сополимер полипиррола и полиэтиленгликоля, полученный способом синтеза в плазме по п.1.

3. Имплантат, содержащий сополимер полипиррола и полиэтиленгликоля, полученный способом синтеза в плазме по п.1.

4. Применение сополимера полипиррола и полиэтиленгликоля, полученного способом синтеза в плазме по п.1, для производства имплантата, способствующего нейропротекции и восстановлению соединения в спинном мозге после повреждения.

5. Применение сополимера полипиррола и полиэтиленгликоля, полученного способом синтеза в плазме по п.1, для производства имплантата, предназначенного для интеграции в нервную ткань спинного мозга.

6. Имплантат, содержащий легированный йодом полипиррол, полученный способом синтеза в плазме.

7. Применение легированного йодом полипиррола, полученного способом синтеза в плазме, для производства имплантата, способствующего нейропротекции и восстановлению соединения в спинном мозге после повреждения.

8. Применение легированного йодом полипиррола, полученного способом синтеза в плазме, для производства имплантата, предназначенного для интеграции в нервную ткань спинного мозга.