RU2470301C2 - Method of diagnosing urinary bladder cancer by means of oncomarker kifc1 (versions) and set for its realisation - Google Patents

Method of diagnosing urinary bladder cancer by means of oncomarker kifc1 (versions) and set for its realisation Download PDF

Info

Publication number
RU2470301C2
RU2470301C2 RU2011109883/15A RU2011109883A RU2470301C2 RU 2470301 C2 RU2470301 C2 RU 2470301C2 RU 2011109883/15 A RU2011109883/15 A RU 2011109883/15A RU 2011109883 A RU2011109883 A RU 2011109883A RU 2470301 C2 RU2470301 C2 RU 2470301C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
kifc1
protein
gene
urine
bladder cancer
Prior art date
Application number
RU2011109883/15A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2011109883A (en
Inventor
Анастасия Александровна Заболотнева
Петр Викторович Шегай
Нуршат Минуллаевич Гайфуллин
Игорь Георгиевич Русаков
Борис Яковлевич Алексеев
Антон Александрович Буздин
Original Assignee
Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН filed Critical Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
Priority to RU2011109883/15A priority Critical patent/RU2470301C2/en
Publication of RU2011109883A publication Critical patent/RU2011109883A/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2470301C2 publication Critical patent/RU2470301C2/en

Links

Images

Abstract

FIELD: medicine.
SUBSTANCE: invention relates to field of medicine, in particular to oncology and molecular biology and deals with method of urinary bladder cancer (UBC) diagnostics. Invention includes method of urinary bladder cancer diagnostics, based on measurement of KIFC1 protein content by ELISA method. Higher content of KIFC1 protein in supposedly affected by cancer urinary bladder and/or urine in comparison with its level in healthy tissue and/or blood serves a diagnostic sign of urinary bladder cancer.
EFFECT: invention makes it possible to diagnose urinary bladder cancer with high reliability, including early stage of tumour transformation progression.
1 cl, 4 tbl, 4 dwg, 5 ex

Description

Изобретение относится к области медицины, в частности онкологии и молекулярной биологии, и касается способа диагностики рака мочевого пузыря (РМП) и набора для его осуществления.The invention relates to medicine, in particular oncology and molecular biology, and relates to a method for the diagnosis of bladder cancer (RMP) and a kit for its implementation.

Рак мочевого пузыря (РМП) является распространенной патологией. Ежегодно в мире диагностируется около 356000 новых случаев заболевания РМП [Ploeg, М., K.K. Aben and L.A. Kiemeney, The present and future burden of urinary bladder cancer in the world. World J Urol, 2009. 27 3): p.289-93]. Существующие методы диагностики РМП разделяют на две группы: инвазивные и неинвазивные. К инвазивным методам диагностики относятся цистоскопия, позволяющая визуализировать опухоль и провести биопсию мочевого пузыря, а также трансуретральное ультразвуковое исследование (трансуретральная ультрасонография) [Qu, X., X.Huang, L.Wu, et al., Comparison of virtual cystoscopy and ultrasonography for bladder cancer detection: A meta-analysis. Eur J Radiol, 2010]. Все инвазивные методы связаны с дискомфортом и риском для здоровья пациента, дороговизной и сложностью выполнения.Bladder cancer (RMP) is a common pathology. About 356,000 new cases of RMP are diagnosed annually in the world [Ploeg, M., K.K. Aben and L.A. Kiemeney, The present and future burden of urinary bladder cancer in the world. World J Urol, 2009.27 3): p. 289-93]. Existing methods for diagnosing RMP are divided into two groups: invasive and non-invasive. Invasive diagnostic methods include cystoscopy, which allows visualization of the tumor and biopsy of the bladder, as well as transurethral ultrasound (transurethral ultrasonography) [Qu, X., X. Huang, L. Wu, et al., Comparison of virtual cystoscopy and ultrasonography for bladder cancer detection: A meta-analysis. Eur J Radiol, 2010]. All invasive methods are associated with discomfort and risk to the patient’s health, high cost and complexity of execution.

К неинвазивным относятся обнаружение в физиологических жидкостях организма маркеров РМП, трансабдоминальная ультразвуковая томография, рентгеновская компьютерная томография, магнитно-резонансная томография, цитологическое исследование мочи или промывной жидкости [Kenney, D.M., R.D. Geschwindt, M.R. Kary, et al., Detection of newly diagnosed bladder cancer, bladder cancer recurrence and bladder cancer in patients with hematuria using quantitative rt-PCR of urinary survivin. Tumour Biol, 2007. 28 (2): p.57-62, Van Tilborg, A.A., C.H.Bangma and E.C.Zwarthoff, Bladder cancer biomarkers and their role in surveillance and screening. Int J Urol, 2009. 16 (1): p.23-30].Non-invasive include detection of RMP markers in physiological body fluids, transabdominal ultrasound tomography, X-ray computed tomography, magnetic resonance imaging, cytological examination of urine or wash fluid [Kenney, D.M., R.D. Geschwindt, M.R. Kary, et al., Detection of newly diagnosed bladder cancer, bladder cancer recurrence and bladder cancer in patients with hematuria using quantitative rt-PCR of urinary survivin. Tumour Biol, 2007.28 (2): p. 57-62, Van Tilborg, A.A., C.H. Bangma and E.C. Zwarthoff, Bladder cancer biomarkers and their role in surveillance and screening. Int J Urol, 2009.16 (1): p.23-30].

Биомаркеры РМП подразделяют на следующие группы.RMP biomarkers are divided into the following groups.

1. Маркеры, представляющие собой РНК генов, дифференциально экспрессирующихся в нормальных и опухолевых тканях.1. Markers, which are RNA genes differentially expressed in normal and tumor tissues.

2. Белковые маркеры, а также пептиды и продукты белковой деградации, специфично обнаруживаемые в моче или крови больного.2. Protein markers, as well as peptides and protein degradation products that are specifically found in the patient’s urine or blood.

Для оценки содержания РНК-маркеров РМП используют различные методы, прежде всего микрочиповую гибридизацию и метод ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) [Livak K.J., Flood S.J., Marmaro J., Giusti W., Deets K. 1995. Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Methods Appl.4, 357-362].Various methods are used to evaluate the content of RNA markers of RMP, primarily microarray hybridization and real-time PCR (PCR-RV) [Livak KJ, Flood SJ, Marmaro J., Giusti W., Deets K. 1995. Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Methods Appl. 4, 357-362].

В качестве РНК-маркеров РМП используют:As RNA markers of RMP use:

- сурвивин (повышенный уровень мРНК обнаруживается в опухолевых тканях, моче и промывной жидкости) [Kenney, D.M., R.D.Geschwindt, M.R.Kary, et al., Detection of newly diagnosed bladder cancer, bladder cancer recurrence and bladder cancer in patients with hematuria using quantitative rt-PCR of urinary survivin. Tumour Biol, 2007. 28 (2): p.57-621];- survivin (elevated mRNA levels are found in tumor tissues, urine, and lavage fluid) [Kenney, DM, RDGeschwindt, MRKary, et al., Detection of newly diagnosed bladder cancer, bladder cancer recurrence and bladder cancer in patients with hematuria using quantitative rt-PCR of urinary survivin. Tumour Biol, 2007. 28 (2): p. 57-621];

- цитокератин 20 (повышенный уровень мРНК в моче и промывной жидкости) [Guo, В., С.Luo, С.Xun, et al., Quantitative detection of cytokeratin 20 mRNA in urine samples as diagnostic tools for bladder cancer by real-time PCR. Exp Oncol, 2009. 31 (1): p.43-7];- cytokeratin 20 (elevated levels of mRNA in urine and wash fluid) [Guo, B., C. Luo, C. Xun, et al., Quantitative detection of cytokeratin 20 mRNA in urine samples as diagnostic tools for bladder cancer by real-time PCR Exp Oncol, 2009. 31 (1): p. 43-7];

- гиалуронидазы (уровень мРНК повышен в моче) [Van Tilborg, А.А., C.H.Bangma and Е.С.Zwarthoff, Bladder cancer biomarkers and their role in surveillance and screening. Int J Urol, 2009. 16 (1): p.23-30];- hyaluronidase (mRNA level is elevated in the urine) [Van Tilborg, A.A., C.H. Bangma and E.C. Zwarthoff, Bladder cancer biomarkers and their role in surveillance and screening. Int J Urol, 2009.16 (1): p.23-30];

- теломеразы (уровень мРНК повышен в моче) [Eissa, S., M. Swellam, R. Ali-Labib, et al., Detection of telomerase in urine by 3 methods: evaluation of diagnostic accuracy for bladder cancer. J Urol, 2007. 178 (3 Pt 1): p.1068-72].- telomerase (mRNA level is elevated in urine) [Eissa, S., M. Swellam, R. Ali-Labib, et al., Detection of telomerase in urine by 3 methods: evaluation of diagnostic accuracy for bladder cancer. J Urol, 2007. 178 (3 Pt 1): p.1068-72].

Однако же существенным недостатком всех существующих РНК-маркеров РМП является их низкая прогностическая ценность (менее 20% случаев РМП), что приводит к слабой воспроизводимости результатов и низкой клинической ценности таких тестов.However, a significant drawback of all existing RNA markers of RMP is their low prognostic value (less than 20% of cases of RMP), which leads to poor reproducibility of the results and low clinical value of such tests.

Для диагностики РМП с помощью белковых маркеров используют методы иммунохимического анализа, основанные на реакции взаимодействия специфических антител с белком-маркером. С помощью этих методов можно оценить количественное содержание белка-маркера РМП и его пространственное распределение в исследуемой ткани. Биологический образец, для которого проводится анализ белка, может быть иммобилизован на твердом носителе, например на полимерной мембране, на которой можно иммобилизовать клетки, части клеток или белки. Этот носитель в дальнейшем гибридизуют с мечеными антителами, специфичными к исследуемому белку. Затем оценивают количество связавшихся с носителем антител. Как правило, для этого используют первичные или вторичные антитела, меченные химически связанным с ними ферментом [Voller, A., The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (theory, technique and applications). Ric Clin Lab, 1978. 8 (4): p.289-98, de Savigny, D. and A.Voller, The communication of ELISA data from laboratory to clinician. J Immunoassay, 1980. 1 (1): p.105-28]. Фермент, связанный с антителом, реагирует с соответствующим субстратом, изменяющим свои спектральные характеристики в результате реакции, с образованием химической группировки или соединения, которое может быть обнаружено с помощью спектрометрических или флуореметрических методов или визуально. Кроме того, антитела также метят радиоизотопами, наночастицами металлов и другими веществами. На этом принципе основаны коммерчески доступные методы диагностики РМП, такие как NMP-22 (детекция в моче ядерного белка, высвобождаемого при апоптозе). Эта диагностическая тест-система может служить прототипом данного изобретения [Landman J, Chang Y, Kavaler E, Droller MJ, Liu ВС., Sensitivity and specificity of NMP-22, telomerase, and BTA in the detection of human bladder cancer, Urology. 1998 Sep; 52 (3): 398-402]. В качестве диагностических признаков в ней используют следующие критерии: 1) статистически значимое повышение уровня содержания маркера в образце РМП относительно верхней границы нормы; 2) выраженная динамика снижения уровня маркера при успешном лечении РМП не менее чем на 50%. Эта система также может быть использованы для обнаружения рецидивов и прогнозирования будущего течения болезни. Вместе с тем эта и другие доступные системы диагностики РМП, основанные на детекции белковых маркеров в физиологических жидкостях, обладают недостаточной чувствительностью (менее 25%) для эффективного применения в клинической практике.For the diagnosis of RMP using protein markers, immunochemical analysis methods based on the reaction of interaction of specific antibodies with a protein marker are used. Using these methods, one can evaluate the quantitative content of the marker protein RMP and its spatial distribution in the tissue under study. The biological sample for analysis of the protein can be immobilized on a solid carrier, for example on a polymer membrane, on which cells, parts of cells or proteins can be immobilized. This carrier is subsequently hybridized with labeled antibodies specific for the test protein. The amount of antibody bound to the carrier is then evaluated. As a rule, primary or secondary antibodies labeled with a chemically bound enzyme are used for this [Voller, A., The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (theory, technique and applications). Ric Clin Lab, 1978. 8 (4): p. 289-98, de Savigny, D. and A. Voller, The communication of ELISA data from laboratory to clinician. J Immunoassay, 1980. 1 (1): p.105-28]. The enzyme bound to the antibody reacts with the appropriate substrate, changing its spectral characteristics as a result of the reaction, to form a chemical moiety or compound that can be detected by spectrometric or fluoremetric methods or visually. In addition, antibodies are also labeled with radioisotopes, metal nanoparticles and other substances. This principle is based on commercially available methods for the diagnosis of RMP, such as NMP-22 (detection in the urine of a nuclear protein released during apoptosis). This diagnostic test system can serve as a prototype of the present invention [Landman J, Chang Y, Kavaler E, Droller MJ, Liu BC., Sensitivity and specificity of NMP-22, telomerase, and BTA in the detection of human bladder cancer, Urology. 1998 Sep; 52 (3): 398-402]. The following criteria are used as diagnostic features in it: 1) a statistically significant increase in the level of marker content in the RMP sample relative to the upper limit of the norm; 2) pronounced dynamics of a decrease in marker levels with successful treatment of RMP by at least 50%. This system can also be used to detect relapses and predict the future course of the disease. At the same time, this and other accessible diagnostic systems for RMP, based on the detection of protein markers in physiological fluids, have insufficient sensitivity (less than 25%) for effective use in clinical practice.

Изобретение решает задачу повышения чувствительности маркеров РМП и позволяет проводить диагностику РМП с чувствительностью 90%.The invention solves the problem of increasing the sensitivity of RMP markers and allows the diagnosis of RMP with a sensitivity of 90%.

Поставленная задача решается за счет вариантов способа диагностики рака мочевого пузыря:The problem is solved by the options for the diagnosis of bladder cancer:

методом ПЦР в режиме реального времени, включающим получение биоматериала и выделение РНК, синтез кДНК на матрице РНК, нормирование концентрации кДНК по контрольному гену, проведение количественной ПЦР-амплификации фрагмента гена KIFC1 и проведение диагностики путем определения количества амплифицированного фрагмента ДНК KIFC1 для образца биоматериала и набором для диагностики рака мочевого пузыря методом ПЦР в реальном времени, включающим праймеры с последовательностью SEQ ID NO: 1 и 2 при их молярном соотношении 1:1;real-time PCR, including biomaterial production and RNA isolation, cDNA synthesis on the RNA matrix, normalization of cDNA concentration by the control gene, quantitative PCR amplification of the KIFC1 gene fragment and diagnostics by determining the amount of the amplified KIFC1 DNA fragment for the biomaterial sample and a kit for the diagnosis of bladder cancer by real-time PCR, including primers with the sequence SEQ ID NO: 1 and 2 with a molar ratio of 1: 1;

методом иммуноферментного анализа, включающим получение образцов мочи и крови от пациента, выделение смеси белковых компонентов мочи и крови, проведение реакции иммуноферментного анализа с моноклональными и/или поликлональными антителами и/или их фрагментами против рекомбинантного белка KIFC1 и/или его уникальных фрагментов длиной свыше 8 аминокислот и проведение диагностики путем определения содержания белка KIFC1 в исследуемых образцах.enzyme-linked immunosorbent assay, including obtaining urine and blood samples from a patient, isolating a mixture of protein components of urine and blood, carrying out an enzyme-linked immunosorbent assay with monoclonal and / or polyclonal antibodies and / or their fragments against a recombinant protein KIFC1 and / or its unique fragments longer than 8 amino acids and diagnostics by determining the KIFC1 protein content in the studied samples.

В настоящем изобретении в качестве маркера РМП используют продукты гена KIFC1, обладающего высокой специфичностью экспрессии именно в клетках РМП, но не в нормальной ткани мочевого пузыря. До настоящего изобретения никаких опубликованных данных о повышенной экспрессии гена KIFC1 в раковых клетках, по сравнению с нормальными клетками мочевого пузыря, не имеется. В настоящем изобретении в качестве показателя наличия раковых и/или предраковых изменений для РМП служит изменение содержания белка или РНК гена KIFC1 у пациентов, больных РМП.In the present invention, products of the KIFC1 gene, which have high specificity of expression specifically in RMP cells, but not in normal bladder tissue, are used as a marker of RMP. Prior to the present invention, no published data on increased expression of the KIFC1 gene in cancer cells compared to normal bladder cells is available. In the present invention, as an indicator of the presence of cancerous and / or precancerous changes for RMP, there is a change in the protein or RNA content of the KIFC1 gene in patients with RMP.

В ходе проведенного авторами поиска дифференциальных транскриптов с помощью анализа на микрочипах и идентификации дифференциально экспрессирующихся генов в нормальных и опухолевых образцах тканей мочевого пузыря на разных этапах злокачественного перерождения обнаружено значительное повышение содержания мРНК гена KIFC1 уже на ранних стадиях злокачественной трансформации клеток мочевого пузыря. В дальнейшем, при помощи иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием моноклональных антител против белкового продукта гена KIFC1, обнаружено также и повышенное содержание белка KIFC1 в моче и в крови больных РМП. Всего, из 200 исследованных образцов тканей больных РМП, в 181 (90%) наблюдался уровень белкового продукта KIFC1, в два раза и более превышающий наивысшее значение по уровню KIFC1 для группы из 74 образцов тканей здоровых доноров.In the course of the authors' search for differential transcripts using microarray analysis and identification of differentially expressed genes in normal and tumor samples of bladder tissue at different stages of malignant transformation, a significant increase in the KIFC1 gene mRNA was detected already in the early stages of malignant transformation of bladder cells. Later, using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using monoclonal antibodies against the protein product of the KIFC1 gene, an increased content of KIFC1 protein in the urine and blood of patients with RMP was also found. In total, out of 200 examined tissue samples from patients with RMP, in 181 (90%) the level of protein product KIFC1 was observed, twice or more exceeding the highest value in terms of KIFC1 for a group of 74 tissue samples from healthy donors.

Настоящее изобретение относится к новому маркеру для диагностики рака мочевого пузыря (РМП), который представляет собой мРНК гена KIFC1 и/или белок KIFC1. Увеличение содержания мРНК гена в предположительно пораженных раком тканях мочевого пузыря человека по сравнению с его содержанием в нормальных/здоровых тканях, а также увеличение содержания белка KIFC1 (продукта гена KIFC1) в моче предположительно больного РМП человека по сравнению с содержанием белка в моче здорового человека служит диагностическим маркером РМП.The present invention relates to a new marker for the diagnosis of bladder cancer (RMP), which is a KIFC1 gene mRNA and / or a KIFC1 protein. An increase in the gene mRNA content in the tissues of the human bladder allegedly cancerous compared to normal / healthy tissues, as well as an increase in the KIFC1 protein (KIFC1 gene product) in the urine of a suspected human RMP compared to the protein content in the urine of a healthy person diagnostic marker RMP.

Настоящее изобретение относится к способу диагностики рака мочевого пузыря. Данный способ включает следующие стадии: получение исходных образцов биоматериала, например тканей от пациента; выделение и очистка препаратов РНК из образцов тканей; синтез кДНК на матрице РНК, определение концентрации мРНК гена KIFC1 при помощи количественной ПЦР-амплификации с использованием матрицы кДНК; нормирование концентрации мРНК гена KIFC1 по контрольному гену, содержание мРНК которого относительно постоянно в здоровых и раковых тканях человека, в том числе и в мочевом пузыре; проведение диагностики РМП. Например, показанием для обнаружения РМП служит уровень содержания мРНК гена KIFC1 в тканях мочевого пузыря, превышающий 0,5% от уровня содержания в этих тканях мРНК гена бета-актина человека (АСТВ).The present invention relates to a method for diagnosing bladder cancer. This method includes the following stages: obtaining initial samples of biomaterial, for example tissues from a patient; Isolation and purification of RNA preparations from tissue samples; synthesis of cDNA on an RNA matrix; determination of the KIFC1 gene mRNA concentration by quantitative PCR amplification using a cDNA matrix; normalization of the KIFC1 mRNA concentration by a control gene, the mRNA content of which is relatively constant in healthy and cancerous human tissues, including the bladder; diagnostics of RMP. For example, an indication for the detection of RMP is the level of the mIFNA of the KIFC1 gene in the tissues of the bladder in excess of 0.5% of the level of the human beta-actin gene (ASTV) mRNA in these tissues.

Олигонуклеотидные праймеры, используемые для синтеза одноцепочечной или двуцепочечной кДНК, выбирают из числа олиго(dT)-содержащих праймеров, случайных гексамеров или их комбинации, а также геноспецифичных праймеров.Oligonucleotide primers used for the synthesis of single-stranded or double-stranded cDNA are selected from oligo (dT) -containing primers, random hexamers or a combination thereof, as well as gene-specific primers.

Для амплификации кДНК используют олигонуклеотидные праймеры и зонд, подобранные таким образом, что они специфически гибридизуются с кДНК даже в присутствии в препарате примеси геномной ДНК. Возможная последовательность праймеров представлена SEQ ID NO 1-2.For amplification of cDNA, oligonucleotide primers and a probe are used that are selected in such a way that they specifically hybridize with cDNA even in the presence of an impurity of genomic DNA. A possible sequence of primers is presented by SEQ ID NO 1-2.

Количественная реакция амплификации фрагмента гена KIFC1 представляет собой ПЦР в реальном времени или ОТ-ПЦР.The quantitative amplification reaction of the KIFC1 gene fragment is real-time PCR or RT-PCR.

В качестве контрольного гена используют ген АСТВ, кодирующий актин бета. Возможная последовательность праймеров для определения концентрации контрольного гена представлена SEQ ID NO 3-4. Последовательность, кодирующая белок ДНК гена KIFC1, представлена на SEQ ID NO 5. Последовательность белка KIFC1 представлена на SEQ ID NO 6.The ASTV gene encoding actin beta is used as a control gene. A possible sequence of primers for determining the concentration of the control gene is presented by SEQ ID NO 3-4. The sequence encoding the KIFC1 gene DNA protein is shown in SEQ ID NO 5. The KIFC1 protein sequence is shown in SEQ ID NO 6.

Набор праймеров для осуществления полимеразной цепной реакции для определения содержания мРНК гена KIFC1 имеет последовательности SEQ ID NO 1-2.The set of primers for the implementation of the polymerase chain reaction for determining the content of mRNA of the KIFC1 gene has the sequence of SEQ ID NO 1-2.

Вариантом настоящего изобретения является способ диагностики РМП, включающий такие стадии: получение образца мочи и крови от пациента, для которого проводится исследование на наличие РМП; выделение смеси белковых компонентов мочи и крови; проведение реакции иммуноферментного или другого иммунологического анализа с моноклональными или поликлональными антителами или их фрагментами против рекомбинантного белка KIFC1 или его уникальных фрагментов длиной свыше 8 аминокислот; проведение диагностики РМП путем сравнения содержания белка KIFC1 в моче и/или крови исследуемого пациента с концентрацией содержания белка KIFC1 в моче и/или крови здоровых людей и больных РМП.An embodiment of the present invention is a method for diagnosing RMP, comprising the steps of: obtaining a urine and blood sample from a patient for whom a study is performed for the presence of RMP; the allocation of a mixture of protein components of urine and blood; conducting an enzyme immunoassay or other immunological analysis with monoclonal or polyclonal antibodies or their fragments against the recombinant protein KIFC1 or its unique fragments with a length of more than 8 amino acids; diagnosis of RMP by comparing the content of KIFC1 protein in the urine and / or blood of the patient under study with the concentration of KIFC1 protein in the urine and / or blood of healthy people and patients with RMP.

В данном варианте могут быть использованы химерные антитела, или антитела, состоящие из одной цепи, или Fab/F(ab')2-фрагменты, или антиидиотипические антитела, или эпитопсвязывающие фрагменты.In this embodiment, chimeric antibodies, or single chain antibodies, or Fab / F (ab ′) 2 fragments, or anti-idiotypic antibodies, or epitope-binding fragments, can be used.

В данном изобретении предложены варианты способа диагностики рака мочевого пузыря методами ПЦР в реальном времени и иммуноферментного анализа (ИФА), основанными на измерении содержания мРНК гена KIFC1 и/или его белкового продукта, а также набор для осуществления этого способа. Достоверно обнаруживаемое различие в содержании мРНК гена KIFC1 в нормальных и опухолевых тканях или белка KIFC1 в моче и/или крови больных РМП и здоровых людей может быть использовано для обнаружения РМП в исследуемых образцах.The present invention provides variants of a method for the diagnosis of bladder cancer by real-time PCR and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based on measuring the mRNA content of the KIFC1 gene and / or its protein product, as well as a kit for implementing this method. A reliably detectable difference in the content of KIFC1 mRNA in normal and tumor tissues or KIFC1 protein in the urine and / or blood of patients with RMP and healthy people can be used to detect RMP in the studied samples.

В качестве образцов для проведения анализа берут биоптаты, пунктаты, в том числе материал, полученный при цистоскопии с прямой биопсией, моча и периферическая кровь.Biopsy samples, punctate, including material obtained by cystoscopy with direct biopsy, urine and peripheral blood are taken as samples for analysis.

Для выделения РНК могут быть использованы различные методы. В классических методах выделения РНК используют сильные хаотропные агенты, такие как гуанидинхлорид и гуанидинизотиоцианат, растворяющие белки, и последовательные экстракции фенолом и хлороформом для денатурации и удаления белков [Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis Т., Molecular Cloning. A laboratory Manual. 2nd Edition ed. 1989, Cold Spring Harbour: CSHL Press]. Широко используют также метод с использованием реагента Trizol [GIBCO/Life Technologies].Various methods can be used to isolate RNA. In classical RNA isolation methods, strong chaotropic agents are used, such as guanidinochloride and guanidinisothiocyanate, dissolving proteins, and sequential extraction with phenol and chloroform to denature and remove proteins [Sambrook J., Fritsch EF, Maniatis T., Molecular Cloning. A laboratory manual. 2 nd Edition ed. 1989, Cold Spring Harbor: CSHL Press]. The Trizol reagent method [GIBCO / Life Technologies] is also widely used.

Для предотвращения разрушения РНК ферментами РНКазами используют ингибиторы, такие как ингибитор RNAsin плацентарного или рекомбинантного происхождения или, например, ванадил-рибозидный комплекс - неспецифический ингибитор РНКаз широкого спектра действия.In order to prevent RNA degradation by RNase enzymes, inhibitors are used, such as an RNAsin inhibitor of placental or recombinant origin or, for example, a vanadyl riboside complex, a non-specific broad-spectrum RNAse inhibitor.

Быстрое и качественное выделение РНК также проводят с использованием ряда коммерчески доступных наборов (Клоноген, Санкт-Петербург; RNeasy kits (Qiagen); SV Total RNA Isolation System, Promega (США) и т.д.). Использование различных приборов, например QuickGene-810 (Life Science, Япония), позволяет минимизировать работу с агрессивными агентами и средами, ускорить и упростить выделение РНК.Rapid and high-quality RNA isolation is also carried out using a number of commercially available kits (Clonogen, St. Petersburg; RNeasy kits (Qiagen); SV Total RNA Isolation System, Promega (USA), etc.). The use of various devices, for example, QuickGene-810 (Life Science, Japan), allows one to minimize work with aggressive agents and media, accelerate and simplify RNA isolation.

Реакция обратной транскрипции, в результате которой на РНК-матрице синтезируют одноцепочечную цепь кДНК, при необходимости, с достройкой второй цепи, позволяет перейти от нестабильных молекул РНК к более стабильным молекулам ДНК. ПЦР-амплификация позволяет использовать малые количества исходной РНК (на уровне нескольких нанограмм), что соответствует минимальным количествам исследуемой ткани. Реакцию обратной транскрипции проводят с использованием коммерчески доступных препаратов обратных транскриптаз, таких как обратная транскриптаза вируса лейкоза мышей Молони (M-MLV), вируса миелобластоза птиц (AMV), PowerScript (точечная мутация M-MLV-RT), C. Therm Polymerase, MINT-полимераза и др. Для обратной транскрипции используют различные праймеры.The reverse transcription reaction, as a result of which a single-stranded cDNA chain is synthesized on an RNA matrix, if necessary, with the completion of the second chain, allows us to switch from unstable RNA molecules to more stable DNA molecules. PCR amplification allows the use of small amounts of the original RNA (at the level of several nanograms), which corresponds to the minimum amounts of tissue under study. The reverse transcription reaction is carried out using commercially available reverse transcriptase preparations, such as Moloney mouse leukemia virus (M-MLV), avian myeloblastosis virus (AMV) reverse transcriptase, PowerScript (point mutation M-MLV-RT), C. Therm Polymerase, MINT -polymerase and others. For reverse transcription, various primers are used.

1. Олиго(dT)n-содержащие праймеры связываются с поли(А)-хвостом на 3'-конце мРНК (число n обычно равно 12-18, но может достигать и большей величины). Эти праймеры используют для получения полноразмерных кДНК.1. Oligo (dT) n-containing primers bind to the poly (A) tail at the 3'-end of the mRNA (the number n is usually 12-18, but can reach a larger value). These primers are used to obtain full-size cDNA.

2. Наборы случайных гексануклеотидных праймеров (статистические затравки) гибридизуются с РНК в многочисленных участках. При обратной транскрипции с этими праймерами получают кДНК, укороченные относительно размеров исходных РНК. Случайные гексамеры используют для преодоления трудностей, связанных с прохождением обратной транскриптазой вторичной структуры РНК, они более эффективны при обратной транскрипции 5'-областей мРНК.2. Sets of random hexanucleotide primers (statistical primers) hybridize with RNA in numerous sites. When reverse transcription with these primers receive cDNA, shortened relative to the size of the original RNA. Random hexamers are used to overcome the difficulties associated with reverse transcriptase passage of the secondary RNA structure; they are more effective in reverse transcription of 5'-regions of mRNA.

3. Гексамеры или другие короткие олигонуклеотиды случайного состава (до 12 нуклеотидов) могут быть использованы в комбинации с олигоdТ-содержащими праймерами.3. Hexamers or other short oligonucleotides of random composition (up to 12 nucleotides) can be used in combination with oligot-containing primers.

4. Специфические олигонуклеотидные праймеры используют для обратной транскрипции участка мРНК, представляющего интерес для исследования.4. Specific oligonucleotide primers are used for reverse transcription of the mRNA region of interest for the study.

Анализ транскрипции генов проводят, используя кДНК в качестве матрицы для количественной ПЦР.Gene transcription analysis is performed using cDNA as a template for quantitative PCR.

Для подбора специфических праймеров и зондов используют специальные программы, многие из которых находятся в свободном доступе в Интернете. Среди таких программ можно упомянуть Oligo (версия 6.42), PrimerSelect из пакета Lasergene (www.dnastar.com), Primer Express (Applied Biosystems, USA), Primer Designer (ИМБ), FastPCR (http://vvww.biocenter.helsinki.fi/bi/Programs/fastpcr.htm), PrimerQuest (http://scitools.idtdna.com/Primerquest/) и др., а также таких программ, как Vector NTI (Informax), Gene Runner и т.д. Кроме того, возможен подбор праймеров и без использования специального программного обеспечения.For the selection of specific primers and probes, special programs are used, many of which are freely available on the Internet. Such programs include Oligo (version 6.42), PrimerSelect from the Lasergene package (www.dnastar.com), Primer Express (Applied Biosystems, USA), Primer Designer (IMB), FastPCR (http://vvww.biocenter.helsinki. fi / bi / Programs / fastpcr.htm), PrimerQuest (http://scitools.idtdna.com/Primerquest/), etc., as well as programs such as Vector NTI (Informax), Gene Runner, etc. In addition, it is possible to select primers without using special software.

В предпочтительном воплощении используют праймеры с последовательностью SEQ ID NO 1-2.In a preferred embodiment, primers with the sequence SEQ ID NO 1-2 are used.

Все варианты детекции продуктов ПЦР можно разделить на специфичные и неспецифичные к определенной последовательности ДНК. Неспецифичные системы можно разделить на системы с использованием интеркалирующих красителей и системы с мечением праймеров флуоресцентными красителями.All variants of detection of PCR products can be divided into specific and non-specific to a specific DNA sequence. Non-specific systems can be divided into systems using intercalating dyes and systems with primer labeling with fluorescent dyes.

Наиболее недорогой, но в то же время высокочувствительной системой является ПЦР в присутствии интеркалирующих красителей, например бромистого этидия, YOYO [Srinivasan, K., S.C. Morris, J.E.Girard, et al., Enhanced detection of PCR products through use of TOTO and YOYO intercalating dyes with laser induced fluorescence-capillary electrophoresis. Appi Theor Electrophor, 1993. 3 (5): p.235-9], YO-PRO-1 [Ishiguro, Т., J.Saitoh, H.Yawata, et al., Homogeneous quantitative assay of hepatitis С virus RNA by polymerase chain reaction in the presence of a fluorescent intercalater. Anal Biochem, 1995. 229(2): p.207-13], SYBR Green I [Morrison, T.B., J.J.Weis and C.T.Wittwer, Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification. Biotechniques, 1998. 24 (6): p.954-8, 960, 962], SYBR Gold, Eva Green и др. Эти красители встраиваются в двуцепочечную молекулу ДНК, изменяют спектральные характеристики красителей, что выражается в изменении флуоресцентного сигнала, усиливающемся по мере накопления продукта ПЦР.The most inexpensive, but at the same time highly sensitive system is PCR in the presence of intercalating dyes, for example ethidium bromide, YOYO [Srinivasan, K., S.C. Morris, J. E. Girard, et al., Enhanced detection of PCR products through use of TOTO and YOYO intercalating dyes with laser induced fluorescence-capillary electrophoresis. Appi Theor Electrophor, 1993. 3 (5): p.235-9], YO-PRO-1 [Ishiguro, T., J. Saitoh, H. Yawata, et al., Homogeneous quantitative assay of hepatitis C virus RNA by polymerase chain reaction in the presence of a fluorescent intercalater. Anal Biochem, 1995. 229 (2): p.207-13], SYBR Green I [Morrison, T. B., J. J. Weis and C. T. Wittwer, Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification. Biotechniques, 1998. 24 (6): p.954-8, 960, 962], SYBR Gold, Eva Green and others. These dyes integrate into a double-stranded DNA molecule, change the spectral characteristics of the dyes, which is reflected in a change in the fluorescent signal, amplified by as PCR product accumulates.

Высокая специфичность ПЦР-РВ может быть достигнута за счет использования зонда (система TaqMan), содержащего на 5'-конце флуорофор или флуоресцентный краситель (например, FАМ - 6-carboxy-fluoroscein), а на 3'-конце - т.н. гаситель (например, DABCYL - 4-(dimethylammoazo)benzene-4-carboxylic acid). В процессе ПЦР взаимодействие FAM и DABCYL нарушается за счет расщепления зонда Taq ДНК полимеразой, благодаря ее 5'-экзонуклеазной активности, при этом происходит эмиссия флуоресценции, регистрируемая прибором [Holland, P.M., R.D. Abramson, R. Watson, et al., Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'----3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Proc Nati Acad Sci USA, 1991. 88 (16): p.7276-80]. Подбор зондов для проведения ПЦР-РВ осуществляется в соответствии со стандартными рекомендациями и требованиями метода (протоколы фирмы Applied Biosystems, http://docs.appliedbiosystems.com). Кроме того, могут быть использованы и другие модификации этого метода, такие как метод вытесняющих проб (displacing probes), молекулярных маячков (molecular beacons), метод примыкающих проб [Solinas, A., L.J. Brown, С.McKeen, et al., Duplex Scorpion primers in SNP analysis and FRET applications. Nucleic Acids Res, 2001. 29 (20): p.E96, Li, Q., G.Luan, Q.Guo, et al., A new class of homogeneous nucleic acid probes based on specific displacement hybridization. Nucleic Acids Res, 2002. 30(2): p.E5, Tyagi, S. and F.R. Kramer, Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nat Biotechnol, 1996.14(3); p.303-8, Didenko, V.V., DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications. Biotechniques, 2001. 31 (5): p.1106-16, 1118, 1120-1].High specificity of PCR-RV can be achieved by using a probe (TaqMan system) containing a fluorophore or fluorescent dye at the 5'-end (for example, FAM - 6-carboxy-fluoroscein), and the so-called 3'-end quencher (e.g. DABCYL - 4- (dimethylammoazo) benzene-4-carboxylic acid). During PCR, the interaction of FAM and DABCYL is disrupted due to the cleavage of the Taq probe with DNA polymerase due to its 5'-exonuclease activity, and fluorescence emission recorded by the device occurs [Holland, P.M., R.D. Abramson, R. Watson, et al., Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5 '---- 3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Proc Nati Acad Sci USA, 1991. 88 (16): p. 7276-80]. The selection of probes for PCR-RV is carried out in accordance with standard recommendations and the requirements of the method (protocols of Applied Biosystems, http://docs.appliedbiosystems.com). In addition, other modifications of this method can be used, such as the displacing probes method, molecular beacons, and the adjacent sample method [Solinas, A., L.J. Brown, C. McKeen, et al., Duplex Scorpion primers in SNP analysis and FRET applications. Nucleic Acids Res, 2001.29 (20): p.E96, Li, Q., G. Luan, Q. Guo, et al., A new class of homogeneous nucleic acid probes based on specific displacement hybridization. Nucleic Acids Res, 2002.30 (2): p.E5, Tyagi, S. and F.R. Kramer, Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nat Biotechnol 1996.14 (3); p.303-8, Didenko, V.V., DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications. Biotechniques, 2001. 31 (5): p. 1106-16, 1118, 1120-1].

Количественная оценка содержания мРНК достигается с помощью параллельного проведения ПЦР-РВ с тестируемым и контрольным образцами (Фиг.2). В качестве внутреннего контроля, относительно которого осуществляется нормирование продуктов амплификации исследуемого гена KIFC1, выбран «ген домашнего хозяйства» - АСТВ, кодирующий основной белок цитоскелета бета-актин. Согласно предпочтительной форме осуществления количественной оценки содержания мРНК, необходимо выбрать контрольный ген, имеющий низкую вариабельность содержания мРНК в опухолевых и нормальных тканях мочевого пузыря по сравнению с вариабельностью содержания мРНК исследуемых генов [Radonic A., Thuike S., Mackay I.M., Landt O., Siegert W., Nitsche A. 2004. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochem Biophys Res Commun. 313, 856-862]. Как правило, в качестве контрольных выбирают гены «домашнего хозяйства», экспрессирующиеся на высоком уровне в каждой клетке организма, хотя для этой цели может быть использован любой ген с относительно постоянным содержанием мРНК в исследуемых образцах. Решение о выборе того или иного гена в качестве контрольного зависит от степени выбранной/требуемой точности. В предпочтительном воплощении настоящего изобретения выбран традиционный и часто используемый контрольный ген АСТВ.A quantitative assessment of the mRNA content is achieved using parallel PCR-RV with the test and control samples (Figure 2). As an internal control, relative to which the amplification products of the studied KIFC1 gene are normalized, the “housekeeping gene”, ASTV, encoding the main beta-actin cytoskeleton protein, was selected. According to the preferred form of quantifying the mRNA content, it is necessary to select a control gene having a low variability of the mRNA content in tumor and normal tissues of the bladder compared with the variability of the mRNA content of the studied genes [Radonic A., Thuike S., Mackay IM, Landt O., Siegert W., Nitsche A. 2004. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochem Biophys Res Commun. 313, 856-862]. As a rule, “housekeeping” genes, expressed at a high level in each cell of the body, are chosen as control genes, although any gene with a relatively constant mRNA content in the studied samples can be used for this purpose. The decision to select a gene as a control depends on the degree of accuracy selected / required. In a preferred embodiment of the present invention, a traditional and frequently used control gene for ASTV is selected.

Оценка содержания мРНК генов может быть основана на абсолютном и относительном измерении количества копий исследуемых транскриптов - абсолютный метод (метод стандартной кривой) и метод относительных измерений (ΔΔCt - метод, http://docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/04303859.pdf). Согласно предпочтительной форме осуществления количественной оценки содержания мРНК генов, в качестве основного метода измерений выбран второй из них. Этот метод позволяет проводить двойное сравнение данных для исследуемого и контрольного генов в опухоли и норме и не требует выравнивания концентраций опухолевых и нормальных образцов РНК/кДНК, которое необходимо при использовании других методов, например ОТ-ПЦР.Assessment of the mRNA content of genes can be based on the absolute and relative measurement of the number of copies of the studied transcripts - the absolute method (standard curve method) and the relative measurement method (ΔΔCt - method, http://docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/04303859.pdf). According to a preferred form of quantifying the mRNA content of genes, the second of them is selected as the main measurement method. This method allows a double comparison of the data for the studied and control genes in the tumor and normal and does not require alignment of the concentrations of tumor and normal RNA / cDNA samples, which is necessary when using other methods, for example, RT-PCR.

Согласно предпочтительной форме осуществления количественной оценки содержания мРНК генов, важно проверить пригодность образцов сравнения, в данном случае условных норм. «Условной нормой» принято считать образец ткани мочевого пузыря с отсутствующими макро- и микроскопическими признаками опухолевого роста или образец венозной крови пациента. Кроме того, использованы дополнительные образцы сравнения, полученные от условно здоровых доноров после смерти (доноры, не страдавшие при жизни раком мочевого пузыря).According to the preferred form of quantification of the mRNA content of the genes, it is important to verify the suitability of the reference samples, in this case conditional norms. A “conventional norm” is considered to be a sample of bladder tissue with missing macro- and microscopic signs of tumor growth or a sample of venous blood of a patient. In addition, additional comparison samples obtained from conditionally healthy donors after death (donors who did not suffer bladder cancer during their lifetime) were used.

Поскольку не для всех опухолевых образцов имелись пригодные парные условные нормы, расчеты относительного содержания мРНК гена KIFC1 проводили, используя разные образцы сравнения - парные условные нормы, если они были, и нормы от условно здоровых доноров, если парных норм не было.Since not all tumor samples had suitable paired conditional norms, the relative KIFC1 mRNA content was calculated using different comparison samples — paired conditional norms, if any, and norms from conditionally healthy donors, if there were no paired norms.

В основе метода иммуноферментного анализа и его наиболее часто применяемой модификации (англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) лежит принцип специфического взаимодействия между антигеном и соответствующим ему антителом. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием конъюгата, который представляет собой комплекс вторичного антитела, соединенного с ферментной меткой (обычно используют пероксидазу хрена либо другие пероксидазы) или помеченного иным способом. Конъюгат может быть получен как с использованием поликлональных антител (например, кроличьи антитела против иммуноглобулинов человека), так и моноклональных антител, направленных против человеческих иммуноглобулинов определенного класса (М, G, А). В настоящем изобретении предполагается использование моноклональных и/или поликлональных антител и/или их фрагментов, полученных против рекомбинантного белка KIFC1 и/или его уникальных фрагментов длиной свыше 8 аминокислот.The enzyme immunoassay method and its most frequently used modification (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) are based on the principle of specific interaction between an antigen and its corresponding antibody. Identification of the resulting complex is carried out using a conjugate, which is a complex of a secondary antibody connected to an enzyme label (usually horseradish peroxidase or other peroxidases are used) or otherwise labeled. The conjugate can be obtained using polyclonal antibodies (for example, rabbit antibodies against human immunoglobulins) or monoclonal antibodies directed against human immunoglobulins of a certain class (M, G, A). The present invention contemplates the use of monoclonal and / or polyclonal antibodies and / or fragments thereof obtained against the recombinant protein KIFC1 and / or its unique fragments with a length of over 8 amino acids.

Существует несколько методов постановки реакции, однако в настоящее время наиболее часто для выявления специфических антител используется следующая схема (т.н. сэндвич-метод ИФА):There are several methods for setting the reaction, however, at present, the following scheme is most often used to detect specific antibodies (the so-called ELISA sandwich method):

1) на лунках тест-планшета фиксируют антиген, который инкубируется с испытуемой сывороткой или плазмой крови. При наличии в них специфических антител происходит связывание их с образованием комплекса антиген-антитело;1) the antigen is fixed on the wells of the test tablet, which is incubated with the test serum or blood plasma. In the presence of specific antibodies in them, they bind to form an antigen-antibody complex;

2) в дальнейшем, при инкубации этого комплекса с конъюгатом вторичного антитела и пероксидазы хрена, происходит присоединение анти-антител к имеющимся комплексам антиген-антитело. Ферментативная реакция (цветная реакция) проходит в присутствии перекиси водорода и субстрата, представленного неокрашенным соединением, которое в процессе пероксидазной реакции (или другой ферментативной реакции) окисляется до окрашенного продукта на заключительном этапе проведения исследования. Интенсивность окрашивания прямо коррелирует с количеством выявленных специфических антител;2) in the future, when this complex is incubated with a conjugate of a secondary antibody and horseradish peroxidase, the anti-antibodies attach to the existing antigen-antibody complexes. An enzymatic reaction (color reaction) takes place in the presence of hydrogen peroxide and a substrate represented by an unpainted compound, which, during the peroxidase reaction (or other enzymatic reaction), is oxidized to a colored product at the final stage of the study. Staining intensity directly correlates with the number of specific antibodies detected;

3) результат определения оценивают спектрофотометрически или визуально (Фиг.2).3) the result of the determination is evaluated spectrophotometrically or visually (Figure 2).

В настоящем изобретении в качестве маркера РМП выступает белок KIFC1, содержание которого повышено в моче больных РМП по сравнению со здоровыми донорами, не имеющими злокачественных новообразований.In the present invention, the KIFC1 protein acts as a marker of RMP, the content of which is increased in the urine of patients with RMP in comparison with healthy donors without malignant neoplasms.

Настоящее изобретение проиллюстрировано со ссылкой на конкретные примеры, представляющие собой наиболее предпочтительные воплощения изобретения. Изобретение не ограничивается описанными воплощениями, но включает любые альтернативы, модификации или эквиваленты, допустимые с учетом сущности и объема изобретения.The present invention is illustrated with reference to specific examples representing the most preferred embodiments of the invention. The invention is not limited to the described embodiments, but includes any alternatives, modifications, or equivalents that are acceptable given the nature and scope of the invention.

Изобретение иллюстрируют графические материалы.The invention is illustrated by graphic materials.

Фигура 1. Схематичное изображение структуры гена KIFC1, кДНК KIFC1 и получаемого продукта амплификации с помощью ПЦР и/или ПЦР-РВ.Figure 1. Schematic representation of the structure of the KIFC1 gene, KIFC1 cDNA and the resulting amplification product using PCR and / or PCR-RV.

Фигура 2. Схема иммунофлуоресцентного анализа.Figure 2. Scheme of immunofluorescence analysis.

Фигура 3. Электрофоретическое разделение в 1,5%-ном агарозном геле продукта ПЦР-РВ (35 циклов ПЦР) - транскрипта гена KIFC1 (размер 177 п.н.), 1-я дорожка-маркер молекулярных масс ДНК от 100 до 1500 п.н., 2-я дорожка - транскрипт гена KIFC1 ожидаемого размера в опухолевых тканях, 3-я дорожка - в нормальных тканях мочевого пузыря.Figure 3. Electrophoretic separation in a 1.5% agarose gel of the PCR-PB product (35 PCR cycles) of the KIFC1 gene transcript (size 177 bp), 1st pathway marker of DNA molecular weights from 100 to 1500 p .n., 2nd lane - a transcript of the KIFC1 gene of the expected size in tumor tissues, 3rd lane - in normal tissues of the bladder.

Фигура 4. Относительный уровень экспрессии гена KIFC1 в опухолевых и нормальных тканях мочевого пузыря, измеренный путем ПЦР-РВ после нормализации его экспрессии относительно экспрессии гена АСТВ в тех же образцах тканей. Образцы №№1-9 - опухолевые ткани мочевого пузыря, 10-12 - нормальные (не имеющие злокачественной трансформации) ткани мочевого пузыря.Figure 4. The relative level of expression of the KIFC1 gene in tumor and normal tissues of the bladder, measured by PCR-RV after normalizing its expression relative to the expression of the ASTV gene in the same tissue samples. Samples No. 1-9 - tumor tissue of the bladder, 10-12 - normal (without malignant transformation) tissue of the bladder.

Изобретение иллюстрируют примеры.The invention is illustrated by examples.

Пример 1. Определение уровня мРНК гена KIFC1 в нормальных и раковых тканях мочевого пузыря.Example 1. Determination of the mRNA level of the KIFC1 gene in normal and cancerous tissues of the bladder.

1) Образцы тканей1) Tissue samples

Образцы тканей различных гистологических типов ПРМП (Т), морфологически нормальные ткани, прилегающие к опухолям (т.н. условные нормы (N), а также нормальные ткани мочевого пузыря (NB) от скоропостижно скончавшихся доноров собраны и охарактеризованы независимо двумя различными группами сотрудников ФГУ МНИОИ им. П.А.Герцена Росмедтехнологии и факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В.Ломоносова). Клинический диагноз установлен с учетом данных ретроспективного анализа первичной медицинской документации больных, цито- и гистологических исследований биоптатов, полученных при цистоскопии, а также образцов тканей мочевого пузыря, полученных после трансуретральной резекции и операционного материала. Образцы тканей мочевого пузыря (опухоль, условно-нормальная ткань) получены непосредственно после удаления опухоли. Каждый образец хранят в растворе RNALater Reagent (QIAGEN), стабилизирующем молекулы РНК, при температуре -70°С. Все опухолевые образцы охарактеризованы согласно международной системе клинико-морфологической классификации опухолей ТНМ, где Т (tumor) - Т0-Т4 - категории, отражающие увеличение размера и/или местного распространения первичной опухоли, N (nodules) - N0-N3 - категории, отражающие различную степень поражения метастазами регионарных лимфатических узлов; M (metastasis) - М0-М1 - характеризует отдаленные метастазы. Все возможные комбинации ТНМ объединяют в более крупные группы - стадии, отражающие течение опухолевого процесса.Tissue samples of different histological types of PRMP (T), morphologically normal tissues adjacent to tumors (the so-called conditional norms (N), as well as normal tissues of the bladder (NB) from suddenly died donors were collected and characterized independently by two different groups of FSI employees MNIII named after P.A. Herzen of Rosmedtechnology and the faculty of fundamental medicine of Moscow State University named after M.V. Lomonosov). The clinical diagnosis was established taking into account data from a retrospective analysis of the primary medical documentation of patients, cytological and histological studies of biopsy specimens obtained by cystoscopy, as well as samples of bladder tissue obtained after transurethral resection and surgical material. Bladder tissue samples (tumor, conditionally normal tissue) were obtained immediately after removal of the tumor. Each sample was stored in an RNALater Reagent (QIAGEN) solution stabilizing RNA molecules at a temperature of -70 ° C. All tumor samples were characterized according to the international system of clinical and morphological classification of TNM tumors, where T (tumor) - T0-T4 - categories reflecting an increase in the size and / or local distribution of the primary tumor, N (nodules) - N0-N3 - categories reflecting different the degree of defeat by metastases of the regional lymph nodes; M (metastasis) - M0-M1 - characterizes distant metastases. All possible combinations of TNM are combined into larger groups - stages that reflect the course of the tumor process.

2) Выделение препаратов РНК из тканей2) Isolation of RNA preparations from tissues

Суммарную РНК выделяют из замороженных, хранящихся в растворе RNALater Reagent (QIAGEN) образцов опухолевых и нормальных тканей с использованием TRIZOL Reagent (Invitrogen). Основные этапы включают:Total RNA was isolated from frozen, stored in RNALater Reagent (QIAGEN) solution samples of tumor and normal tissue using TRIZOL Reagent (Invitrogen). The main steps include:

а) разрушение ткани, замороженной в жидком азоте, с использованием микродесмембратора («Sartorius», Германия) и гомогенизацию разрушенного образца в лизирующем растворе, содержащем гуанидинизотиоцианат и фенол;a) the destruction of tissue frozen in liquid nitrogen, using a microdesembler ("Sartorius", Germany) and the homogenization of the destroyed sample in a lysis solution containing guanidine isothiocyanate and phenol;

б) добавление хлороформа и центрифугирование в течение 10 минут при ≤12000×g при температуре 4°С;b) the addition of chloroform and centrifugation for 10 minutes at ≤12000 × g at a temperature of 4 ° C;

в) осаждение РНК из водной фазы, образующейся после центрифугирования, путем добавления изопропилового спирта и повторного центрифугирования в течение 10 минут при ≤12000×g при температуре 4°С.c) precipitation of RNA from the aqueous phase formed after centrifugation by adding isopropyl alcohol and centrifuging again for 10 minutes at ≤12000 × g at 4 ° C.

Далее осадок РНК после повторного центрифугирования промывают водным 75% этиловым спиртом, высушивают и растворяют в воде, очищенной от нуклеаз.Next, the RNA pellet after repeated centrifugation is washed with aqueous 75% ethanol, dried and dissolved in water purified from nucleases.

Концентрацию РНК определяют спектрофотометрически. Качество выделенной РНК проверяют электрофорезом в 1%-ной агарозе в присутствии бромистого этидия и спектрофотометрически («Nanodrop», США).The concentration of RNA is determined spectrophotometrically. The quality of the isolated RNA was checked by electrophoresis in 1% agarose in the presence of ethidium bromide and spectrophotometrically (Nanodrop, USA).

3) Реакция обратной транскрипции3) reverse transcription reaction

На матрице РНК, выделенной, как описано в пункте 2), синтезируют одноцепочечную кДНК. Для проведения реакции обратной транскрипции берут по 1 мкг РНК, полученной одним из двух вышеописанных методов с использованием наборов реагентов Trizol Reagent (Invitrogen) или реагентов RNeasy Mini Kit (Qiagen), предварительно обработанной не содержащей РНКаз ДНКазой I (Sigma-Aldrich) и инкубируют 5 мин при 70°С, затем помещают в лед.Single-stranded cDNA is synthesized on an RNA template isolated as described in paragraph 2). For the reverse transcription reaction, 1 μg of RNA obtained by one of the two methods described above using Trizol Reagent reagent kits (Invitrogen) or RNeasy Mini Kit reagents (Qiagen) pretreated with RNase-free DNase I (Sigma-Aldrich) and incubated 5 is taken. min at 70 ° C, then placed in ice.

На каждую пробу готовят 20 мкл смеси, содержащей:For each sample, 20 μl of a mixture containing:

5 мМ MgCl2;5 mM MgCl 2 ;

1×Буфер для обратной транскриптазы AMV, содержащий 250 мМ Tris-HCl (pH 8.3, 25°С), 250 мМ KCl, 50 мМ MgCl2, 2,5 мМ спермидин и 50 мМ DTT (Promega);1 × AMV reverse transcriptase buffer containing 250 mM Tris-HCl (pH 8.3, 25 ° C), 250 mM KCl, 50 mM MgCl 2 , 2.5 mM spermidine and 50 mM DTT (Promega);

100 нг гексануклеотидных праймеров;100 ng hexanucleotide primers;

1 мМ dNTP (Evrogen);1 mM dNTP (Evrogen);

200 единиц обратной транскриптазы AMV (Promega).200 units of AMV reverse transcriptase (Promega).

К смеси добавляют РНК и воду до конечного объема 20 мкл и проводят реакцию при следующем температурном режиме: 25°С -10 мин, 42°С - 60 мин, 70°С -10 мин.RNA and water are added to the mixture to a final volume of 20 μl and the reaction is carried out at the following temperature conditions: 25 ° С -10 min, 42 ° С - 60 min, 70 ° С -10 min.

4) Подбор условий определения содержания мРНК гена KIFC1 в образцах тканей мочевого пузыря4) Selection of conditions for determining the content of KIFC1 mRNA gene in tissue samples of the bladder

Для ОТ-ПЦР и ПЦР-РВ используют одинаковые праймеры KIFC1_F (SEQ ID NO:1) и KIFC1_R (SEQ ID NO:2) при их молярном соотношении 1:1, специфичные для разных экзонов гена KIFC1, причем один из праймеров перекрывает границу между экзонами. Размер ампликона - 177 п.н.For RT-PCR and PCR-PB, the same primers KIFC1_F (SEQ ID NO: 1) and KIFC1_R (SEQ ID NO: 2) are used with their molar ratio 1: 1, specific for different exons of the KIFC1 gene, and one of the primers overlaps the boundary between exons. Amplicon size - 177 bp

Последовательности выбранных праймеров для контрольного гена: SEQ ID NO 3-4, при их молярном соотношении 1:1, размер ампликона - 145 п.н.The sequence of the selected primers for the control gene: SEQ ID NO 3-4, with their molar ratio of 1: 1, the size of the amplicon is 145 bp

Для проведения ПЦР-РВ подбирают оптимальные концентрации праймеров исследуемого и контрольного генов (Фиг.3).For PCR-PB select the optimal concentration of primers of the studied and control genes (Figure 3).

5) Количественная оценка содержания мРНК гена KIFC15) Quantification of the KIFC1 gene mRNA

Для количественных измерений используют прибор Stratagene MX3000P (США).For quantitative measurements using the device Stratagene MX3000P (USA).

Протокол определения содержания мРНК методом ПЦР-РВ с использованием набора «Комплект реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии SYBR Green I» или «Комплект реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии EVA Green» (Синтол, Россия).Protocol for determining the mRNA content by PCR-RV using the kit “Reagent kit for PCR-RV in the presence of SYBR Green I” or “Reagent kit for PCR-RV in the presence of EVA Green” (Synthol, Russia).

1. Готовят реакционные смеси для генов KIFC1 и АСТВ, осторожно смешав все компоненты реакции, кроме матрицы (кДНК), из расчета 1 реакция объемом 25 мкл для каждого образца + 1 дополнительная реакция по 25 мкл.1. Prepare the reaction mixtures for the KIFC1 and ASTV genes, carefully mixing all the components of the reaction, except the template (cDNA), at the rate of 1 reaction with a volume of 25 μl for each sample + 1 additional reaction of 25 μl.

Таблица 1.Table 1. Состав реакционной смеси для гена АСТВ:The composition of the reaction mixture for the ASTV gene: РеагентReagent Концентрация исходных растворовThe concentration of stock solutions Объем в расчете на одну реакцию (мкл)Volume per reaction (μl) Конечные концентрации в реакцииThe final concentration in the reaction ПЦР Буфер БPCR Buffer B 10Х10X 2,52.5 1X1X dNTPsdNTPs 2,5 мМ2.5 mm 2,52.5 250 мкМ250 μM MgCl2 MgCl 2 25 мМ25 mm 2,52.5 2,5 мМ2.5 mm Праймер ACTB_FPrimer ACTB_F 10 мкМ10 μM 1one 0,4 мкМ0.4 μM Праймер ACTB_RPrimer ACTB_R 10 мкМ10 μM 1one 0,4 мкМ0.4 μM Taq ДНК-полимеразаTaq DNA polymerase 5 ед./мкл5 units / μl 0,50.5 0,1 ед./мкл0.1 units / μl H2OH 2 O   13,213,2   кДНКcDNA   22  

Таблица 2.Table 2. Состав реакционной смеси для гена KIFC1:The composition of the reaction mixture for the KIFC1 gene: РеагентReagent Концентрация исходных растворовThe concentration of stock solutions Объем в расчете на одну реакцию (мкл)Volume per reaction (μl) Конечные концентрации в реакцииThe final concentration in the reaction ПЦР Буфер БPCR Buffer B 10Х10X 2,52.5 IXIX dNTPsdNTPs 2,5 мМ2.5 mm 2,52.5 250 мкМ250 μM MgCl2 MgCl 2 25 мМ25 mm 2,52.5 2,5 мМ2.5 mm Праймер KIFC1_FPrimer KIFC1_F 10 мкМ10 μM 1one 0,4 мкМ0.4 μM Праймер KIFC1_RPrimer KIFC1_R 10 мкМ10 μM 1one 0,4 мкМ0.4 μM Taq ДНК-полимеразаTaq DNA polymerase 5 ед./мкл5 units / μl 0,50.5 0,1 ед./мкл0.1 units / μl H2OH 2 O   13,213,2   кДНКcDNA   22  

2. В 0,2 мл пробирки, предназначенные для ПЦР-РВ, добавляют по 23 мкл приготовленных реакционных смесей без матрицы.2. In 0.2 ml tubes designed for PCR-PB, add 23 μl of the prepared reaction mixtures without a matrix.

3. Вносят по 2 мкл матрицы, плотно закрывают пробирки крышками.3. Pipette 2 μl of the matrix, tightly close the tubes with caps.

4. Помещают пробирки в приборное отделение, задают названия ячеек, температурный режим для 35 циклов: 95°С - 5 мин - денатурация и активация фермента, 95°С - 20 сек - денатурация, 60°С - 20 сек - отжиг зонда и полимеризация, 72°С - 30 сек - элонгация цепей.4. Place the tubes in the instrument compartment, set the cell names, temperature conditions for 35 cycles: 95 ° С - 5 min - denaturation and enzyme activation, 95 ° С - 20 sec - denaturation, 60 ° С - 20 sec - probe annealing and polymerization , 72 ° С - 30 sec - elongation of chains.

5. Реакции проводят в режиме относительных количественных измерений (программное обеспечение Stratagene МхРrо, США).5. The reactions are carried out in the mode of relative quantitative measurements (software Stratagene MXPro, USA).

6. После завершения реакции амплификации сохраняют данные.6. After completion of the amplification reaction, data is saved.

7. Проводят анализ продуктов реакции с помощью гель-электрофореза в ТВЕ-буфере, содержащем 10 мг/л этидий бромида. Для этого отбирают 5 мкл продуктов амплификации (40 циклов), наносят образцы на 1.8% агарозный гель, содержащий 0.5 мг/л этидий бромида, и маркер молекулярных масс ДНК, позволяющий оценить размер продуктов амплификации (НПО «СибЭнзим»).7. The reaction products are analyzed by gel electrophoresis in TBE buffer containing 10 mg / l ethidium bromide. For this, 5 μl of amplification products (40 cycles) are taken, 1.8% agarose gel containing 0.5 mg / L ethidium bromide samples and a molecular weight marker for DNA are used to evaluate the size of the amplification products (SibEnzyme NPO).

6) Математическая обработка данных ПЦР-РВ6) Mathematical processing of PCR-RV data

Данные ПЦР-РВ переносят в виде текстового файла в Microsoft Excel и проводят математическую обработку данных. Относительное содержание мРНК гена KIFC1 - RкДНК (далее R) в опухолевых и нормальных тканях мочевого пузыря нормируют относительно содержания мРНК гена АСТВ по формуле:PCR-RV data is transferred as a text file to Microsoft Excel and mathematical processing of the data is carried out. The relative content of the mRNA of the KIFC1 - R cDNA gene (hereinafter R) in tumor and normal tissues of the bladder is normalized relative to the content of mRNA of the ASTV gene according to the formula:

R^=2(Ct(ACTB)-Ct(KIFC1), где Ct - пороговый цикл.R ^ = 2 (Ct (ACTB) -Ct (KIFC1), where Ct is the threshold cycle.

Интервал крайних значений R вычисляют с учетом рассчитанных отклонений Е для значений Ct:The range of extreme values of R is calculated taking into account the calculated deviations E for the Ct values:

Е=((Σ(х-xcp)2)/(n-1))1/2,E = ((Σ (x-x cp ) 2 ) / (n-1)) 1/2 ,

где х - значения, полученные в результате измерения (число 1, число 2 …),where x is the values obtained as a result of the measurement (number 1, number 2 ...),

xcp=Σх/n,x cp = Σx / n,

n - размер выборки (число повторов реакции).n is the sample size (the number of repetitions of the reaction).

Достоверность наблюдаемых изменений оценивают исходя из нормального распределения данных. Данные считают достоверными при Р<0.05, где Р - показатель статистической значимости данных (Фиг.4).The reliability of the observed changes is estimated based on the normal distribution of data. Data is considered reliable at P <0.05, where P is an indicator of the statistical significance of the data (Figure 4).

7) Результаты7) Results

В результате, для всех исследованных образцов РМП (n=26) выявлено 8-45-кратное превышение уровня мРНК гена KIFC1 относительно нормальных образцов ткани мочевого пузыря (n=47).As a result, an 8-45-fold excess of the KIFC1 gene mRNA relative to normal bladder tissue samples (n = 47) was revealed for all the studied RMP samples (n = 26).

Пример 2. Определение уровня белка KIFC1 в нормальных и раковых тканях мочевого пузыря методом иммуноферментного анализа.Example 2. Determination of the level of KIFC1 protein in normal and cancerous tissues of the bladder by enzyme-linked immunosorbent assay.

1) Образцы тканей1) Tissue samples

Образцы тканей различных гистологических типов РМП (Т), морфологически нормальные ткани, прилегающие к опухолям (т.н. условные нормы (N), а также нормальные ткани мочевого пузыря (NB) от скоропостижно скончавшихся доноров собраны и охарактеризованы независимо двумя различными группами сотрудников ФГУ МНИОИ им. П.А.Герцена Росмедтехнологии и факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В.Ломоносова). Клинический диагноз установлен с учетом данных ретроспективного анализа первичной медицинской документации больных, цито- и гистологических исследований биоптатов, полученных при цистоскопии, а также образцов тканей мочевого пузыря, полученных после трансуретральной резекции и операционного материала. Образцы тканей мочевого пузыря (опухоль, условно-нормальная ткань) получены непосредственно после удаления опухоли. Каждый образец хранят в растворе RNALater Reagent (QIAGEN), стабилизирующем молекулы РНК, при температуре -70°С. Все опухолевые образцы охарактеризованы согласно международной системе клинико-морфологической классификации опухолей ТНМ, где Т (tumor) - Т0-Т4 - категории, отражающие увеличение размера и/или местного распространения первичной опухоли, N (nodules) - N0-N3 - категории, отражающие различную степень поражения метастазами регионарных лимфатических узлов; M (metastasis) - М0-М1 - характеризует отдаленные метастазы. Все возможные комбинации ТНМ объединяют в более крупные группы - стадии, отражающие течение опухолевого процесса.Tissue samples of various histological types of RMP (T), morphologically normal tissues adjacent to tumors (the so-called conditional norms (N), as well as normal bladder tissue (NB) from suddenly died donors were collected and characterized independently by two different groups of FSI employees MNIII named after P.A. Herzen of Rosmedtechnology and the faculty of fundamental medicine of Moscow State University named after M.V. Lomonosov). The clinical diagnosis was established taking into account data from a retrospective analysis of the primary medical documentation of patients, cytological and histological studies of biopsy specimens obtained by cystoscopy, as well as samples of bladder tissue obtained after transurethral resection and surgical material. Bladder tissue samples (tumor, conditionally normal tissue) were obtained immediately after removal of the tumor. Each sample was stored in an RNALater Reagent (QIAGEN) solution stabilizing RNA molecules at a temperature of -70 ° C. All tumor samples were characterized according to the international system of clinical and morphological classification of TNM tumors, where T (tumor) - T0-T4 - categories reflecting an increase in the size and / or local distribution of the primary tumor, N (nodules) - N0-N3 - categories reflecting different the degree of defeat by metastases of the regional lymph nodes; M (metastasis) - M0-M1 - characterizes distant metastases. All possible combinations of TNM are combined into larger groups - stages that reflect the course of the tumor process.

3) Выделение суммарного белка из образцов тканей мочевого пузыря.3) Isolation of total protein from tissue samples of the bladder.

Суммарный белок выделяют из замороженных образцов мочевого пузыря путем гомогенизации кусочков тканей, пунктатов или биоптатов в лизирующем буфере. Состав лизирующего буфера: 1XPBS (рН 7.6) буфер (1.7 mM KH2PO4, 5.2 mМ Na2HPO4, 150 mМ NaCl), 8 М мочевина. Для анализа содержания исследуемого белка в крови используют фракцию плазмы. Для анализа содержания исследуемого белка в моче используют цельную мочу.Total protein is isolated from frozen bladder samples by homogenizing pieces of tissue, punctate, or biopsy specimens in a lysis buffer. The composition of the lysis buffer: 1XPBS (pH 7.6) buffer (1.7 mM KH 2 PO 4 , 5.2 mM Na 2 HPO 4 , 150 mM NaCl), 8 M urea. To analyze the content of the studied protein in the blood, a plasma fraction is used. Whole urine is used to analyze the protein content in the urine.

2) Для связывания антигенов (белка KIFC1 или его фрагментов длиной свыше 8 аминокислот) с твердой фазой (носителем) проводится инкубация антигена с носителем в течение 14 часов при 4°С из расчета 100 мкл раствора антигена на ячейку в 96-луночном планшете.2) To bind antigens (KIFC1 protein or its fragments with a length of more than 8 amino acids) to the solid phase (carrier), the antigen is incubated with the carrier for 14 hours at 4 ° C at the rate of 100 μl of antigen solution per cell in a 96-well plate.

3) Удаляют несвязавшиеся антигены и промывают планшет 3 раза 1×PBS.3) Remove unbound antigens and wash the plate 3 times with 1 × PBS.

4) Блокируют неспецифичное связывание добавлением 1% BSA (100 мкл/ячейка) в 1×PBS не менее 1 часа при 37°С.4) Block non-specific binding by adding 1% BSA (100 μl / well) in 1 × PBS for at least 1 hour at 37 ° C.

5) Удаляют BSA и промывают 3 раза 1×PBS, содержащим 0,01% твин (полисорбат).5) BSA is removed and washed 3 times with 1 × PBS containing 0.01% tween (polysorbate).

6) Добавляют анти-сыворотку, разведенную в 1×PBS (если нужно) и инкубируют 2 часа при 37°С.6) Add anti-serum diluted in 1 × PBS (if necessary) and incubate for 2 hours at 37 ° C.

7) Промывают планшет 4 раза 1×PBS, содержащим 0,01% твин (полисорбат).7) Wash the plate 4 times with 1 × PBS containing 0.01% tween (polysorbate).

8) Добавляют конъюгат пероксидазы (или другого фермента) (50 мкл/ячейка), разведенный 1:1000 в 1% BSA и инкубируют 1 час при 37°С.8) A conjugate of peroxidase (or another enzyme) (50 μl / well) diluted 1: 1000 in 1% BSA is added and incubated for 1 hour at 37 ° C.

9) Промывают планшет 4 раза 1×PBS, содержащим 0,01% твин (полисорбат).9) Wash the plate 4 times with 1 × PBS containing 0.01% tween (polysorbate).

10) Добавляют субстрат (100 мкл/ячейка).10) Add substrate (100 μl / well).

11) Инкубируют 1-5 мин в темноте. Регистрируют изменение окраски (изменяется на синюю при протекании реакции).11) Incubate 1-5 minutes in the dark. Record a color change (changes to blue during the course of the reaction).

12) Останавливают реакцию добавлением 25 мкл 0.1М H2SO4/ячейка.12) Stop the reaction by adding 25 μl of 0.1 M H 2 SO 4 / well.

13) Анализируют результаты с помощью спектрофотометра при длине волны 450 нм (для тетраметилбензидинового субстрата - ТМБ).13) Analyze the results using a spectrophotometer at a wavelength of 450 nm (for tetramethylbenzidine substrate - TMB).

Состав используемых буферов:The composition of the buffers used:

1×PBS (Phosphate-Buffered Saline):1 × PBS (Phosphate-Buffered Saline):

NaCl 8 гNaCl 8 g

KCl 0.2 гKCl 0.2 g

Na2PO4 (безводный) 1.15 гNa 2 PO 4 (anhydrous) 1.15 g

KH2PO4 (безводный) 0.2 гKH 2 PO 4 (anhydrous) 0.2 g

dd H2O - до 100 мл.dd H 2 O - up to 100 ml.

PBS для отмывки плашек:PBS for washing dies:

100 мл 1×PBS100 ml 1 × PBS

10 мкл Твин (до конечной концентрации 0.01%)10 μl of tween (to a final concentration of 0.01%)

Цитрат/ацетатный буфер (рН 6.0):Citrate / Acetate Buffer (pH 6.0):

1. 500 мл 0,1 М ацетата натрия (ацетат натрия - 4,1 г, dd Н2О - до 500 мл)1.500 ml of 0.1 M sodium acetate (sodium acetate - 4.1 g, dd H 2 O - up to 500 ml)

2. 100 мл 0,1 М лимонной кислоты (лимонная кислота - 2,1 г, dd H2O - до 100 мл)2.100 ml of 0.1 M citric acid (citric acid - 2.1 g, dd H 2 O - up to 100 ml)

Титровать раствор 1 раствором 2 до конечного рН 6.0. Хранить полученный буфер при -20°С.Titrate solution 1 with solution 2 to a final pH of 6.0. Store the resulting buffer at -20 ° C.

Раствор ТМБ - 10 мг/мл в DMSO (хранить при 4°С).A solution of TMB - 10 mg / ml in DMSO (store at 4 ° C).

Добавить 3 мкл H2O2 к 20 мл цитрат/ацетатного буфера. На каждые 5 мл буфера добавляется 50 мкл раствора ТМБ. При этом цвет раствора изменяется с бесцветного на синий.Add 3 μl of H 2 O 2 to 20 ml of citrate / acetate buffer. For every 5 ml of buffer, 50 μl of TMB solution is added. The color of the solution changes from colorless to blue.

7) Результаты7) Results

В результате, для всех исследованных опухолевых образцов (n=26) выявлено 6-52 кратное превышение уровня белка KIFC1 относительно нормальных образцов ткани мочевого пузыря (n=47).As a result, for all the studied tumor samples (n = 26), a 6-52 fold excess of the level of KIFC1 protein was revealed relative to normal samples of bladder tissue (n = 47).

Пример 3. Определение концентрации мРНК гена KIFC1 в моче и крови больных РМП и здоровых людей.Example 3. Determination of the concentration of KIFC1 mRNA in the urine and blood of patients with RMP and healthy people.

1) Образцы мочи и крови1) Urine and blood samples

Образцы крови и мочи от пациентов с диагнозом РМП, а также от здоровых доноров собраны и охарактеризованы группой сотрудников ФГУ МНИОИ им. П.А.Герцена Росмедтехнологии. Клинический диагноз установлен с учетом данных ретроспективного анализа первичной медицинской документации больных, цито- и гистологических исследований биоптатов, полученных при цистоскопии, а также образцов тканей мочевого пузыря, полученных после трансуретральной резекции и операционного материала. Кровь смешивают с раствором антикоагулянта (например, цитратом натрия, ЭДТА и др.) в соотношении 9:1 (9 частей крови и 1 часть антикоагулянта), отделяют плазму от форменных элементов крови путем центрифугирования в течение 15 минут при 1500×g и сразу же смешивают с раствором, стабилизирующим молекулы РНК (RNAlater Reagent, QIAGEN). Полученный раствор хранят при температуре -20°С. Образцы мочи смешивают с раствором RNAlater Reagent, QIAGEN, замораживают и хранят при температуре -20°С.Blood and urine samples from patients diagnosed with RMP, as well as from healthy donors, were collected and characterized by a group of employees of FGU MNIII im. P.A. Herzen of the Russian Medical Technologies. The clinical diagnosis was established taking into account data from a retrospective analysis of the primary medical documentation of patients, cytological and histological studies of biopsy specimens obtained by cystoscopy, as well as samples of bladder tissue obtained after transurethral resection and surgical material. Blood is mixed with a solution of an anticoagulant (for example, sodium citrate, EDTA, etc.) in a ratio of 9: 1 (9 parts of blood and 1 part of an anticoagulant), the plasma is separated from blood cells by centrifugation for 15 minutes at 1500 × g and immediately mixed with a solution that stabilizes RNA molecules (RNAlater Reagent, QIAGEN). The resulting solution was stored at a temperature of -20 ° C. Urine samples are mixed with a solution of RNAlater Reagent, QIAGEN, frozen and stored at a temperature of -20 ° C.

2) Выделение препаратов РНК из тканей2) Isolation of RNA preparations from tissues

Суммарную РНК выделяют из замороженных, хранящихся в растворе RNALater Reagent (QIAGEN) образцов мочи и крови, полученных от больных и здоровых доноров, с использованием TRIZOL Reagent (Invitrogen). Основные этапы включают:Total RNA was isolated from frozen, stored in a solution of RNALater Reagent (QIAGEN) urine and blood samples obtained from patients and healthy donors using TRIZOL Reagent (Invitrogen). The main steps include:

а) обработка крови и мочи лизирующим раствором, содержащем гуанидинизотиоцианат и фенол;a) treatment of blood and urine with a lysing solution containing guanidine isothiocyanate and phenol;

б) добавление хлороформа и центрифугирование в течение 10 минут при 12000×g при температуре 4°С;b) the addition of chloroform and centrifugation for 10 minutes at 12000 × g at a temperature of 4 ° C;

в) осаждение РНК из водной фазы, образующейся после центрифугирования, путем добавления изопропилового спирта и повторного центрифугирования в течение 10 минут при 12000×g при температуре 4°С.c) precipitation of RNA from the aqueous phase formed after centrifugation by adding isopropyl alcohol and centrifuging again for 10 minutes at 12000 × g at 4 ° C.

Далее осадок РНК после повторного центрифугирования промывают водным 75% этиловым спиртом, высушивают и растворяют в воде, очищенной от нуклеаз.Next, the RNA pellet after repeated centrifugation is washed with aqueous 75% ethanol, dried and dissolved in water purified from nucleases.

Концентрацию РНК определяют спектрофотометрически. Качество выделенной РНК проверяют электрофорезом в 1%-ной агарозе в присутствии бромистого этидия и спектрофотометрически («Nanodrop», США).The concentration of RNA is determined spectrophotometrically. The quality of the isolated RNA was checked by electrophoresis in 1% agarose in the presence of ethidium bromide and spectrophotometrically (Nanodrop, USA).

3) Реакция обратной транскрипции3) reverse transcription reaction

На матрице РНК, выделенной, как описано в пункте 2), синтезируют одноцепочечную кДНК. Для проведения реакции обратной транскрипции берут по 1 мкг РНК, полученной одним из двух вышеописанных методов с использованием наборов реагентов Trizol Reagent (Invitrogen) или реагентов RNeasy Mini Kit (Qiagen), предварительно обработанной не содержащей РНКаз ДНКазой I (Sigma-Aldrich) и инкубируют 5 мин при 70°С, затем помещают в лед.Single-stranded cDNA is synthesized on an RNA template isolated as described in paragraph 2). For the reverse transcription reaction, 1 μg of RNA obtained by one of the two methods described above using Trizol Reagent reagent kits (Invitrogen) or RNeasy Mini Kit reagents (Qiagen) pretreated with RNase-free DNase I (Sigma-Aldrich) and incubated 5 is taken. min at 70 ° C, then placed in ice.

На каждую пробу готовят 20 мкл смеси, содержащей:For each sample, 20 μl of a mixture containing:

5 мМ MgCl2;5 mM MgCl 2 ;

1×Буфер для обратной транскриптазы AMV, содержащий 250 мМ Tris-HCl (pH 8.3, 25°С), 250 мМ KCl, 50 мМ MgCl2, 2,5 мМ спермидин и 50 мМ DTT (Promega);1 × AMV reverse transcriptase buffer containing 250 mM Tris-HCl (pH 8.3, 25 ° C), 250 mM KCl, 50 mM MgCl 2 , 2.5 mM spermidine and 50 mM DTT (Promega);

100 нг гексануклеотидных праймеров;100 ng hexanucleotide primers;

1 мМ dNTP (Evrogen);1 mM dNTP (Evrogen);

200 единиц обратной транскриптазы AMV (Promega).200 units of AMV reverse transcriptase (Promega).

К смеси добавляют РНК и воду до конечного объема 20 мкл и проводят реакцию при следующем температурном режиме: 25°С - 10 мин, 42°С - 60 мин, 70°С - 10 мин.RNA and water are added to the mixture to a final volume of 20 μl and the reaction is carried out at the following temperature conditions: 25 ° C for 10 minutes, 42 ° C for 60 minutes, 70 ° C for 10 minutes.

4) Подбор условий определения содержания мРНК гена KIFC14) Selection of conditions for determining the content of mRNA of the KIFC1 gene

Для ОТ-ПЦР и ПЦР-РВ используют одинаковые праймеры KIFC1_F (SEQ ID NO:1) и KIFC1_R (SEQ ID NO:2), специфичные для разных экзонов гена KIFC1, при их молярном соотношении 1:1, причем один из праймеров перекрывает границу между экзонами. Размер ампликона - 177 п.н.For RT-PCR and PCR-PB, the same primers KIFC1_F (SEQ ID NO: 1) and KIFC1_R (SEQ ID NO: 2) are used, specific for different exons of the KIFC1 gene, with their molar ratio 1: 1, one of the primers overlapping the border between exons. Amplicon size - 177 bp

Последовательности выбранных праймеров для контрольного гена: SEQ ID NO 3-4, размер ампликона - 145 п.н.The sequence of the selected primers for the control gene: SEQ ID NO 3-4, the size of the amplicon - 145 BP

Для проведения ПЦР-РВ подбирают оптимальные концентрации праймеров исследуемого и контрольного генов.For PCR-RV, optimal primer concentrations of the studied and control genes are selected.

5) Количественная оценка содержания мРНК гена KIFC15) Quantification of the KIFC1 gene mRNA

Для количественных измерений используют прибор Stratagene MX3000P (США).For quantitative measurements using the device Stratagene MX3000P (USA).

Протокол определения содержания мРНК методом ПЦР-РВ с использованием набора «Комплект реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии SYBR Green I» или «Комплект реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии EVA Green» (Синтол, Россия).Protocol for determining the mRNA content by PCR-RV using the kit “Reagent kit for PCR-RV in the presence of SYBR Green I” or “Reagent kit for PCR-RV in the presence of EVA Green” (Synthol, Russia).

1. Готовят реакционные смеси для генов KIFC1 и АСТВ, осторожно смешав все компоненты реакции, кроме матрицы (кДНК), из расчета 1 реакция объемом 25 мкл для каждого образца + 1 дополнительная реакция по 25 мкл.1. Prepare the reaction mixtures for the KIFC1 and ASTV genes, carefully mixing all the components of the reaction, except the template (cDNA), at the rate of 1 reaction with a volume of 25 μl for each sample + 1 additional reaction of 25 μl.

Таблица 3.Table 3. Состав реакционной смеси для гена АСТВ:The composition of the reaction mixture for the ASTV gene: РеагентReagent Концентрация исходных растворовThe concentration of stock solutions Объем в расчете на одну реакцию (мкл)Volume per reaction (μl) Конечные концентрации в реакцииThe final concentration in the reaction ПЦР Буфер БPCR Buffer B 10Х10X 2,52.5 1X1X dNTPsdNTPs 2,5 мМ2.5 mm 2,52.5 250 мкМ250 μM MgCl2 MgCl 2 25 мМ25 mm 2,52.5 2,5 мМ2.5 mm Праймер ACTB_FPrimer ACTB_F 10 мкМ10 μM 1one 0,4 мкМ0.4 μM Праймер ACTB_RPrimer ACTB_R 10 мкМ10 μM 1one 0,4 мкМ0.4 μM Taq ДНК-полимеразаTaq DNA polymerase 5 ед./мкл5 units / μl 0,50.5 0,1 ед./мкл0.1 units / μl H2OH 2 O   13,213,2   кДНКcDNA   22  

Таблица 4.Table 4. Состав реакционной смеси для гена KIFC1:The composition of the reaction mixture for the KIFC1 gene: РеагентReagent Концентрация исходных растворовThe concentration of stock solutions Объем в расчете на одну реакцию (мкл)Volume per reaction (μl) Конечные концентрации в реакцииThe final concentration in the reaction ПЦР Буфер БPCR Buffer B 10Х10X 2,52.5 1X1X dNTPsdNTPs 2,5 мМ2.5 mm 2,52.5 250 мкМ250 μM MgCl2 MgCl 2 25 мМ25 mm 2,52.5 2,5 мМ2.5 mm Праймер KIFC1_FPrimer KIFC1_F 10 мкМ10 μM 1one 0,4 мкМ0.4 μM Праймер KIFC1_RPrimer KIFC1_R 10 мкМ10 μM 1one 0,4 мкМ0.4 μM Taq ДНК-полимеразаTaq DNA polymerase 5 ед./мкл5 units / μl 0,50.5 0,1 ед./мкл0.1 units / μl H2OH 2 O   13,213,2   кДНКcDNA   22  

2. В 0,2 мл пробирки, предназначенные для ПЦР-РВ, добавляют по 23 мкл приготовленных реакционных смесей без матрицы.2. In 0.2 ml tubes designed for PCR-PB, add 23 μl of the prepared reaction mixtures without a matrix.

3. Вносят по 2 мкл матрицы, плотно закрывают пробирки крышками.3. Pipette 2 μl of the matrix, tightly close the tubes with caps.

4. Помещают пробирки в приборное отделение, задают названия ячеек, температурный режим для 35 циклов: 95°С - 5 мин - денатурация и активация фермента, 95°С - 20 сек - денатурация, 60°С - 20 сек - отжиг зонда и полимеризация, 72°С - 30 сек - элонгация цепей.4. Place the tubes in the instrument compartment, set the cell names, temperature conditions for 35 cycles: 95 ° С - 5 min - denaturation and enzyme activation, 95 ° С - 20 sec - denaturation, 60 ° С - 20 sec - probe annealing and polymerization , 72 ° С - 30 sec - elongation of chains.

5. Реакции проводят в режиме относительных количественных измерений (программное обеспечение Stratagene MxPro, США).5. The reactions are carried out in the mode of relative quantitative measurements (software Stratagene MxPro, USA).

6. После завершения реакции амплификации сохраняют данные.6. After completion of the amplification reaction, data is saved.

7. Проводят анализ продуктов реакции с помощью гель-электрофореза в ТВЕ-буфере, содержащем 10 мг/л этидий бромида. Для этого отбирают 5 мкл продуктов амплификации (40 циклов), наносят образцы на 1.8% агарозный гель, содержащий 0.5 мг/л этидий бромида, и маркер молекулярных масс ДНК, позволяющий оценить размер продуктов амплификации (НПО «СибЭнзим»).7. The reaction products are analyzed by gel electrophoresis in TBE buffer containing 10 mg / l ethidium bromide. For this, 5 μl of amplification products (40 cycles) are taken, 1.8% agarose gel containing 0.5 mg / L ethidium bromide samples and a molecular weight marker for DNA are used to evaluate the size of the amplification products (SibEnzyme NPO).

6) Математическая обработка данных ПЦР-РВ6) Mathematical processing of PCR-RV data

Данные ПЦР-РВ переносят в виде текстового файла в Microsoft Excel и проводят математическую обработку данных. Относительное содержание мРНК гена KIFC1 - RкДНК (далее R) в опухолевых и нормальных тканях мочевого пузыря нормируют относительно содержания мРНК гена АСТВ по формуле:PCR-RV data is transferred as a text file to Microsoft Excel and mathematical processing of the data is carried out. The relative content of the mRNA of the KIFC1 - R cDNA gene (hereinafter R) in tumor and normal tissues of the bladder is normalized relative to the content of mRNA of the ASTV gene according to the formula:

R=2^(Ct(ACTB)-Ct(KIFC1), где Ct - пороговый цикл.R = 2 ^ (Ct (ACTB) -Ct (KIFC1), where Ct is the threshold cycle.

Интервал крайних значений R вычисляют с учетом рассчитанных отклонений Е для значений Ct:The range of extreme values of R is calculated taking into account the calculated deviations E for the Ct values:

Е=((Σ(х-x cp)2)/(n-1))1/2,E = ((Σ (x - x cp ) 2 ) / (n-1)) 1/2 ,

где х - значения, полученные в результате измерения (число 1, число 2 …),where x is the values obtained as a result of the measurement (number 1, number 2 ...),

xcp=Σx/n.x cp = Σx / n.

n - размер выборки (число повторов реакции).n is the sample size (the number of repetitions of the reaction).

Достоверность наблюдаемых изменений оценивают исходя из нормального распределения данных. Данные считают достоверными при Р<0.05, где Р - показатель статистической значимости данных.The reliability of the observed changes is estimated based on the normal distribution of data. Data is considered reliable at P <0.05, where P is an indicator of the statistical significance of the data.

7) Результаты7) Results

В результате, для всех исследованных образцов мочи и крови, полученных от больных РМП (n=26) выявлено 5-72-кратное превышение концентрации мРНК гена KIFC1 относительно образцов мочи и крови, полученных от здоровых доноров (n=62).As a result, for all investigated urine and blood samples obtained from patients with RMP (n = 26), a 5-72-fold excess of the KIFC1 gene mRNA concentration was revealed relative to urine and blood samples obtained from healthy donors (n = 62).

Пример 4. Определение уровня белка KIFC1 в моче и крови больных РМП и здоровых людей методом иммуноферментного анализа.Example 4. Determination of the level of KIFC1 protein in the urine and blood of patients with RMP and healthy people by enzyme-linked immunosorbent assay.

1) Образцы мочи и крови1) Urine and blood samples

Образцы крови и мочи от пациентов с диагнозом РМП, а также от здоровых доноров собраны и охарактеризованы группой сотрудников ФГУ МНИОИ им. П.А.Герцена Росмедтехнологии. Клинический диагноз установлен с учетом данных ретроспективного анализа первичной медицинской документации больных, цито- и гистологических исследований биоптатов, полученных при цистоскопии, а также образцов тканей мочевого пузыря, полученных после трансуретральной резекции и операционного материала. Кровь смешивают с раствором антикоагулянта (например, цитратом натрия, ЭДТА и др.) в соотношении 9:1 (9 частей крови и 1 часть антикоагулянта) и хранят при +4°С или отделяют плазму от форменных элементов крови путем центрифугирования в течение 15 минут при 1500×g и хранят при температуре -20°С. Образцы мочи замораживают и хранят при температуре -20°С.Blood and urine samples from patients diagnosed with RMP, as well as from healthy donors, were collected and characterized by a group of employees of FGU MNIII im. P.A. Herzen of the Russian Medical Technologies. The clinical diagnosis was established taking into account data from a retrospective analysis of the primary medical documentation of patients, cytological and histological studies of biopsy specimens obtained by cystoscopy, as well as samples of bladder tissue obtained after transurethral resection and surgical material. Blood is mixed with a solution of an anticoagulant (for example, sodium citrate, EDTA, etc.) in a ratio of 9: 1 (9 parts of blood and 1 part of an anticoagulant) and stored at + 4 ° C or the plasma is separated from blood cells by centrifugation for 15 minutes at 1500 × g and stored at a temperature of -20 ° C. Urine samples are frozen and stored at -20 ° C.

Для анализа содержания исследуемого белка в крови используют фракцию плазмы. Для анализа содержания исследуемого белка в моче используют цельную мочу.To analyze the content of the studied protein in the blood, a plasma fraction is used. Whole urine is used to analyze the protein content in the urine.

2) Для связывания антигенов (белка KIFC1 или его фрагментов длиной свыше 8 аминокислот) с твердой фазой (носителем) проводится инкубация антигена с носителем в течение 14 часов при 4°С из расчета 100 мкл раствора антигена на ячейку в 96-луночном планшете.2) To bind antigens (KIFC1 protein or its fragments with a length of more than 8 amino acids) to the solid phase (carrier), the antigen is incubated with the carrier for 14 hours at 4 ° C at the rate of 100 μl of antigen solution per cell in a 96-well plate.

3) Удаляют несвязавшиеся антигены и промывают планшет 3 раза 1×PBS.3) Remove unbound antigens and wash the plate 3 times with 1 × PBS.

4) Блокируют неспецифичное связывание добавлением 1% BSA (100 мкл/ячейка) в 1×PBS не менее 1 часа при 37°С.4) Block non-specific binding by adding 1% BSA (100 μl / well) in 1 × PBS for at least 1 hour at 37 ° C.

5) Удаляют BSA и промывают 3 раза 1×PBS, содержащим 0,01% твин (полисорбат).5) BSA is removed and washed 3 times with 1 × PBS containing 0.01% tween (polysorbate).

6) Добавляют анти-сыворотку, разведенную в 1×PBS (если нужно) и инкубируют 2 часа при 37°С.6) Add anti-serum diluted in 1 × PBS (if necessary) and incubate for 2 hours at 37 ° C.

7) Промывают планшет 4 раза 1×PBS, содержащим 0,01% твин (полисорбат).7) Wash the plate 4 times with 1 × PBS containing 0.01% tween (polysorbate).

8) Добавляют конъюгат пероксидазы (или другого фермента) (50 мкл/ячейка), разведенный 1:1000 в 1% BSA и инкубируют 1 час при 37°С.8) A conjugate of peroxidase (or another enzyme) (50 μl / well) diluted 1: 1000 in 1% BSA is added and incubated for 1 hour at 37 ° C.

9) Промывают планшет 4 раза 1×PBS, содержащим 0,01% твин (полисорбат).9) Wash the plate 4 times with 1 × PBS containing 0.01% tween (polysorbate).

10) Добавляют субстрат (100 мкл/ячейка).10) Add substrate (100 μl / well).

11) Инкубируют 5 мин в темноте. Регистрируют изменение окраски (изменяется на синюю при протекании реакции.11) Incubate for 5 minutes in the dark. Record a color change (changes to blue during the course of the reaction.

12) Останавливают реакцию добавлением 25 мкл 0.1М H2SO4/ячейка.12) Stop the reaction by adding 25 μl of 0.1 M H 2 SO 4 / well.

13) Анализируют результаты с помощью спектрофотометра при длине волны 450 нм (для тетраметилбензидинового субстрата - ТМБ).13) Analyze the results using a spectrophotometer at a wavelength of 450 nm (for tetramethylbenzidine substrate - TMB).

Состав используемых буферов:The composition of the buffers used:

1×PBS (Phosphate-Buffered Saline):1 × PBS (Phosphate-Buffered Saline):

NaCl 8 гNaCl 8 g

KCl 0.2 гKCl 0.2 g

Na2PO4 (безводный) 1.15 гNa 2 PO 4 (anhydrous) 1.15 g

KH2PO4 (безводный) 0.2 гKH 2 PO 4 (anhydrous) 0.2 g

dd H2O - до 100 мл.dd H 2 O - up to 100 ml.

PBS для отмывки плашек:PBS for washing dies:

100 мл 1×PBS100 ml 1 × PBS

10 мкл Твин (до конечной концентрации 0.01%)10 μl of tween (to a final concentration of 0.01%)

Цитрат/ацетатный буфер (рН 6.0):Citrate / Acetate Buffer (pH 6.0):

1. 500 мл 0,1 М ацетата натрия (ацетат натрия - 4,1 г, dd H2O - до 500 мл)1.500 ml of 0.1 M sodium acetate (sodium acetate - 4.1 g, dd H 2 O - up to 500 ml)

2. 100 мл 0,1 М лимонной кислоты (лимонная кислота - 2,1 г, dd H2O - до 100 мл)2.100 ml of 0.1 M citric acid (citric acid - 2.1 g, dd H 2 O - up to 100 ml)

Титровать раствор 1 раствором 2 до конечного рН 6.0. Хранить полученный буфер при -20°С.Titrate solution 1 with solution 2 to a final pH of 6.0. Store the resulting buffer at -20 ° C.

Раствор ТМБ - 10 мг/мл в DMSO (хранить при 4°С).A solution of TMB - 10 mg / ml in DMSO (store at 4 ° C).

Добавить 3 мкл H2O2 к 20 мл цитрат/ацетатного буфера. На каждые 5 мл буфера добавляется 50 мкл раствора ТМБ. При этом цвет раствора изменяется с бесцветного на синий.Add 3 μl of H 2 O 2 to 20 ml of citrate / acetate buffer. For every 5 ml of buffer, 50 μl of TMB solution is added. The color of the solution changes from colorless to blue.

Результаты.Results.

В результате, для всех исследованных образцов мочи и крови, полученных от больных РМП (n=26) выявлено 5-63-кратное превышение уровня белка KIFC1 относительно образцов мочи и крови, полученных от здоровых доноров (n=62).As a result, for all studied urine and blood samples obtained from patients with RMP (n = 26), a 5-63-fold excess of the level of KIFC1 protein was revealed relative to urine and blood samples obtained from healthy donors (n = 62).

Пример 5.Example 5

Оценка эффективности проведенной терапии РМП по изменению уровня экспрессии гена KIFC1 и/или белка KIFC1 в моче и/или крови обследуемых пациентов.Evaluation of the effectiveness of the treatment of RMP by changing the expression level of the KIFC1 gene and / or KIFC1 protein in the urine and / or blood of the examined patients.

Оценка эффективности проведенной терапии РМП проводится путем анализа содержания белка KIFC1 и/или уровня экспрессии гена KIFC1 в моче и/или крови больных РМП до начала лечения и после проведенной терапии способами, указанными в примерах 3 и 4. В результате, для всех обследованных пациентов (n=12) с установленным диагнозом РМП выявлено снижение уровня экспрессии гена KIFC1 и уровня белка KIFC1 в моче и крови в 3-10 раз после проведенной терапии по сравнению с исходным уровнем экспрессии данного гена или уровнем белка в моче и крови, выявленными до начала лечения. Это указывает на возможность использования настоящего изобретения при мониторинге эффективности проводимой противораковой терапии, причем анализ способами настоящего изобретения следует проводить до начала и после окончания курса лечения, а также при необходимости по ходу курса лечения. Снижение содержания мРНК гена KIFC1 и/или белка KIFC1 по ходу или по завершении курса лечения может свидетельствовать о положительных сдвигах при лечении. Дальнейшее повышение содержания мРНК гена KIFC1 и/или белка KIFC1 указывает на низкую эффективность лечения.Evaluation of the effectiveness of the treatment of RMP is carried out by analyzing the content of KIFC1 protein and / or the expression level of the KIFC1 gene in the urine and / or blood of patients with RMP before treatment and after treatment by the methods described in examples 3 and 4. As a result, for all examined patients ( n = 12) with a diagnosis of RMP, a decrease in the level of KIFC1 gene expression and the level of KIFC1 protein in urine and blood was revealed 3-10 times after the treatment as compared with the initial level of expression of this gene or the level of protein in urine and blood detected before echeniya. This indicates the possibility of using the present invention in monitoring the effectiveness of anti-cancer therapy, and analysis by the methods of the present invention should be carried out before and after the course of treatment, and also, if necessary, during the course of treatment. A decrease in the KIFC1 gene and / or KIFC1 mRNA in the course or at the end of the course of treatment may indicate positive changes in treatment. A further increase in the mRNA content of the KIFC1 gene and / or KIFC1 protein indicates a low treatment efficiency.

Claims (1)

Способ диагностики рака мочевого пузыря методом иммуноферментного анализа, включающий получение образцов мочи и/или крови от пациента, выделение смеси белковых компонентов мочи и/или крови, проведение реакции иммуноферментного анализа с моноклональными, и/или поликлональными антителами, и/или их фрагментами против рекомбинантного белка KIFC1 и/или его уникальных фрагментов длиной свыше 8 аминокислот и проведение диагностики путем определения концентрации белка KIFC1 в исследуемом образце и его сравнения с концентрацией белка KIFC1 от здорового донора, и при превышении концентрации белка KIFC1 в исследуемом образце по сравнению с полученной от здорового донора в 5-63 раза диагностируют рак мочевого пузыря. A method for the diagnosis of bladder cancer by enzyme immunoassay, which includes obtaining urine and / or blood samples from a patient, isolating a mixture of protein components of urine and / or blood, carrying out an enzyme immunoassay reaction with monoclonal and / or polyclonal antibodies, and / or fragments thereof against recombinant KIFC1 protein and / or its unique fragments with a length of over 8 amino acids and diagnosing by determining the concentration of KIFC1 protein in the test sample and comparing it with the concentration of KIFC1 protein from healthy bladder donor, and when the concentration of KIFC1 protein in the test sample is exceeded, compared with that obtained from a healthy donor, bladder cancer is diagnosed 5-63 times.
RU2011109883/15A 2011-03-16 2011-03-16 Method of diagnosing urinary bladder cancer by means of oncomarker kifc1 (versions) and set for its realisation RU2470301C2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2011109883/15A RU2470301C2 (en) 2011-03-16 2011-03-16 Method of diagnosing urinary bladder cancer by means of oncomarker kifc1 (versions) and set for its realisation

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2011109883/15A RU2470301C2 (en) 2011-03-16 2011-03-16 Method of diagnosing urinary bladder cancer by means of oncomarker kifc1 (versions) and set for its realisation

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2011109883A RU2011109883A (en) 2012-09-27
RU2470301C2 true RU2470301C2 (en) 2012-12-20

Family

ID=47077902

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2011109883/15A RU2470301C2 (en) 2011-03-16 2011-03-16 Method of diagnosing urinary bladder cancer by means of oncomarker kifc1 (versions) and set for its realisation

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2470301C2 (en)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11391744B2 (en) 2015-06-08 2022-07-19 Arquer Diagnostic Limited Methods and kits
US11519916B2 (en) 2015-06-08 2022-12-06 Arquer Diagnostics Limited Methods for analysing a urine sample

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2393772C1 (en) * 2009-03-23 2010-07-10 Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ Федерального Агентства по здравоохранению и социальному развитию" (ГОУ ВПО БГМУ РОСЗДРАВА) Method of predicting development of recurrent invasive urinary bladder cancer

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2393772C1 (en) * 2009-03-23 2010-07-10 Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ Федерального Агентства по здравоохранению и социальному развитию" (ГОУ ВПО БГМУ РОСЗДРАВА) Method of predicting development of recurrent invasive urinary bladder cancer

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BHUSHAN L., KANDPA R.P. EphB6 Receptor Modulates Micro RNA Profile of Breast Carcinoma Cells. PLoS One. 2011, 6(7), p.1-10. *
BHUSHAN L., KANDPA R.P. EphB6 Receptor Modulates Micro RNA Profile of Breast Carcinoma Cells. PLoS One. 2011, 6(7), p.1-10. M.-L. PUIFFE et al. Characterization of Ovarian Cancer Ascites on Cell Invasion, Proliferation, Spheroid Formation, and Gene Expression in an In Vitro Model of Epithelial Ovarian Cancer, Neoplasia. 2007, 9(10), p.820-829. *
M.-L. PUIFFE et al. Characterization of Ovarian Cancer Ascites on Cell Invasion, Proliferation, Spheroid Formation, and Gene Expression in an In Vitro Model of Epithelial Ovarian Cancer, Neoplasia. 2007, 9(10), p.820-829. *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11391744B2 (en) 2015-06-08 2022-07-19 Arquer Diagnostic Limited Methods and kits
US11519916B2 (en) 2015-06-08 2022-12-06 Arquer Diagnostics Limited Methods for analysing a urine sample

Also Published As

Publication number Publication date
RU2011109883A (en) 2012-09-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11753680B2 (en) Methods of preparing a biofluid sample for detection of kidney injury
Tsui et al. Systematic micro-array based identification of placental mRNA in maternal plasma: towards non-invasive prenatal gene expression profiling
CA3103560C (en) Cardiovascular risk event prediction and uses thereof
EP2405022A2 (en) Gene expression profiling for predicting the survivability of prostate cancer subjects
Millholland et al. Detection of low frequency FGFR3 mutations in the urine of bladder cancer patients using next-generation deep sequencing
JP6285009B2 (en) Composition for prognosis detection and determination of prostate cancer and method for detection and determination
Melissourgos et al. Detection of human telomerase reverse transcriptase mRNA in urine of patients with bladder cancer: evaluation of an emerging tumor marker
US9856532B2 (en) Markers and methods for detecting posttraumatic stress disorder (PTSD)
Das et al. Effects of a novel cell stabilizing reagent on DNA amplification by PCR as compared to traditional stabilizing reagents
Lagatie et al. Plasma-derived parasitic microRNAs have insufficient concentrations to be used as diagnostic biomarker for detection of Onchocerca volvulus infection or treatment monitoring using LNA-based RT-qPCR
RU2463354C1 (en) Diagnostic technique for bladder cancer by cancer-specific marker tedp1 (versions) and kit for implementing it
RU2470301C2 (en) Method of diagnosing urinary bladder cancer by means of oncomarker kifc1 (versions) and set for its realisation
RU2468088C1 (en) Method of estimating efficiency of therapy urinary bladder cancer in humans by method of immunofermentative analysis
RU2351936C1 (en) Method of diagnosing non-small cell lung cancer and set for realising it
RU2469098C2 (en) Method for estimating clinical effectiveness of human bladder cancer by real-time pcr and kit for implementation thereof
AU2018428853A1 (en) Methods and compositions for the analysis of cancer biomarkers
RU2393472C1 (en) Diagnostic technique for clear cell renal adenocarcinoma and set for implementation thereof
RU2469323C2 (en) Diagnostic technique for bladder cancer (versions) and kit for implementation thereof
RU2468372C1 (en) Method of estimating efficiency of therapy of urinary bladder cancer by means of oncomarker nusap1
US11643690B2 (en) Early detection of preliminary stages of testicular germ cell tumors
US20150275313A1 (en) Marker for diagnosis of bladder cancer recurrence
Caratelli et al. Liquid Biopsy beyond Cancer: A miRNA Detection in Serum with Electrochemical Chip for Non‐Invasive Coeliac Disease Diagnosis
Kwak et al. Development of a multiplex reverse transcription qPCR assay for identification of saliva, blood, and semen
KR20210113140A (en) Composition And Kit For Diagnosing Prognosis Of Kidney Cancer According To Tumor Type
JP2022076117A (en) Method for testing prostate cancer

Legal Events

Date Code Title Description
PD4A Correction of name of patent owner
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20160317