RU2468816C1 - Probiotic bacterial preparation of corpuscular antigens of lipopeptidopolysaccharide corynebacteria for prevention and treatment of tuberculosis, method for preparing it - Google Patents
Probiotic bacterial preparation of corpuscular antigens of lipopeptidopolysaccharide corynebacteria for prevention and treatment of tuberculosis, method for preparing it Download PDFInfo
- Publication number
- RU2468816C1 RU2468816C1 RU2011125757/10A RU2011125757A RU2468816C1 RU 2468816 C1 RU2468816 C1 RU 2468816C1 RU 2011125757/10 A RU2011125757/10 A RU 2011125757/10A RU 2011125757 A RU2011125757 A RU 2011125757A RU 2468816 C1 RU2468816 C1 RU 2468816C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- tuberculosis
- cells
- corynebacteria
- preparation
- antigens
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству пробиотических бактериальных препаратов, и может быть использовано для лечения и профилактики туберкулеза у людей и животных.The invention relates to biotechnology, in particular to the production of probiotic bacterial preparations, and can be used for the treatment and prevention of tuberculosis in humans and animals.
Туберкулез остается одним из самых распространенных и опасных инфекционных заболеваний, несмотря на то, что до 85% детей планеты вакцинированы против туберкулеза вакциной БЦЖ и постоянно совершенствуются терапевтические химиопрепараты (1, 2, 3).Tuberculosis remains one of the most common and dangerous infectious diseases, despite the fact that up to 85% of the world's children are vaccinated against BC with the BCG vaccine and therapeutic chemotherapy is constantly being improved (1, 2, 3).
Одной из причин недостаточной эффективности борьбы с туберкулезом является недостаточная эффективность вакцины БЦЖ на фоне постоянного роста числа лиц с пониженным иммунитетом. Другой причиной является рост числа штаммов М. tuberculosis, обладающих множественной лекарственной устойчивостью к применяемым химиопрепаратам, и отсутствие этиотропных иммунопрепаратов.One of the reasons for the lack of effectiveness in the fight against tuberculosis is the lack of effectiveness of the BCG vaccine against the background of a constant increase in the number of people with reduced immunity. Another reason is the increase in the number of M. tuberculosis strains with multidrug resistance to the chemotherapy drugs used, and the absence of etiotropic immunopreparations.
Туберкулез - хроническое инфекционное заболевание, наиболее часто поражающее легкие. Основным патогенетическим звеном туберкулеза является грануломатозное изменение структуры ткани вокруг очагов инфекции. Процесс формирования туберкулезной гранулемы начинается с проникновения М. tuberculosis в составе мелкодисперсных аэрозолей в альвеолы, где они поглощаются резидентными макрофагами. Взаимоотношение микобактерий с макрофагами определяет дальнейшее развитие туберкулезного процесса. Туберкулез считается классической внутримакрофагальной инфекцией (2, 5).Tuberculosis is a chronic infectious disease that most often affects the lungs. The main pathogenetic link of tuberculosis is a granulomatous change in the structure of the tissue around the foci of infection. The process of formation of tuberculous granuloma begins with the penetration of M. tuberculosis in the composition of finely divided aerosols into the alveoli, where they are absorbed by resident macrophages. The relationship of mycobacteria with macrophages determines the further development of the tuberculosis process. Tuberculosis is considered a classic intramacrophagous infection (2, 5).
При высоком уровне неспецифической резистентности туберкулезные бактерии, попавшие в макрофагальные лизосомы, активно уничтожаются, высвободившиеся при этом антигены М. tuberculosis побуждают макрофаги к дальнейшей стимуляции воспалительных реакций, в основном неспецифического характера. Образуется доиммунная гранулема, инфекционный процесс обрывается (2).At a high level of nonspecific resistance, tuberculous bacteria that enter macrophage lysosomes are actively destroyed, and the released M. tuberculosis antigens induce macrophages to further stimulate inflammatory reactions, mainly of a nonspecific nature. Preimmune granuloma is formed, the infection process breaks off (2).
При слабой потенции иммунитета ведущая роль в развитии инфекционного процесса принадлежит М. tuberculosis. Клеточные стенки М. tuberculosis содержат огромное количество разнообразных липидов, которые входят не только в состав поверхностной мембраны, но и пронизывают весь сложный регидный каркас пептидогликана и арабиногалактана (6, 7). Уникальный липопептидополисахаридный состав клеточных стенок М. tuberculosis позволяет им во время внутримакрофагального пребывания гибельно воздействовать на лизосомы, подавляя их образование или превращая в комфортную для себя зону. Замедленный процесс роста, длительное пребывание М. tuberculosis в лизосомах, беспрепятственный выход в цитоплазму, устойчивость к антимикробным факторам или их инактивация ослабляют чувствительность макрофагов к активирующим сигналам лимфоцитов, снижают их антигенпредставляющую функцию и уменьшают реакцию цитотоксических лимфоцитов. Инициирование М. tuberculosis такого поведения макрофагов дает им возможность ускользать от острого воспаления, усиливая эффекторные ресурсы гранулемы. Задержка воспалительного процесса способствует размножению М. tuberculosis и тем самым способствует развитию инфекционного процесса. Доиммунная гранулема у людей с низким уровнем иммунитета не останавливает туберкулезную инфекцию. Дальнейшие события тесно связаны со специфическим воспалением, в основе которого лежит образование иммунной гранулемы и аллергическая реакция макроорганизма на антигены М. tuberculosis (1, 2, 8).With a weak potency of immunity, the leading role in the development of the infectious process belongs to M. tuberculosis. The cell walls of M. tuberculosis contain a huge number of different lipids, which are not only part of the surface membrane, but also penetrate the entire complex reid skeleton of peptidoglycan and arabinogalactan (6, 7). The unique lipopeptidopolysaccharide composition of M. tuberculosis cell walls allows them to act fatally on lysosomes during intramacrophagous stay, suppressing their formation or turning them into a comfortable zone. Slowed growth process, prolonged stay of M. tuberculosis in lysosomes, unhindered access to the cytoplasm, resistance to antimicrobial factors or their inactivation weaken the sensitivity of macrophages to the activating signals of lymphocytes, reduce their antigen-presenting function and reduce the response of cytotoxic lymphocytes. The initiation of M. tuberculosis of such macrophage behavior allows them to elude acute inflammation, enhancing the effector resources of the granuloma. Delay in the inflammatory process promotes the multiplication of M. tuberculosis and thereby contributes to the development of the infectious process. Pre-immune granuloma in people with low levels of immunity does not stop tuberculosis infection. Further events are closely associated with specific inflammation, which is based on the formation of an immune granuloma and an allergic reaction of a macroorganism to M. tuberculosis antigens (1, 2, 8).
Таким образом, противотуберкулезная защита определяется наличием высокого уровня неспецифического и/или специфического иммунитета.Thus, tuberculosis protection is determined by the presence of a high level of nonspecific and / or specific immunity.
В настоящее время для лечения туберкулеза используют различные химиопрепараты и антибиотики - тубазид, салюзид, метазид, изониазид, фтивазид, этамбутол, рифампицин, пиразинамид, стрептомицин и многие другие соединения. Стандартная схема лечения обычного туберкулеза, рекомендованная ВОЗ (схема DOTS), заключается в шестимесячном ежедневном применении стандартного набора лекарств (рифампицин, изониазид, паразинамид, этамбутол, стрептомицин). Однако туберкулез продолжает оставаться актуальнейшей социальной проблемой.Currently, various chemotherapy drugs and antibiotics are used to treat tuberculosis - tubazide, saluside, metazide, isoniazid, phtivazide, ethambutol, rifampicin, pyrazinamide, streptomycin and many other compounds. The standard treatment regimen for conventional tuberculosis recommended by WHO (DOTS regimen) consists of a six-month daily use of a standard set of drugs (rifampicin, isoniazid, parasinamide, ethambutol, streptomycin). However, tuberculosis continues to be an urgent social problem.
Известны попытки использовать в качестве дополнительных средств лечения туберкулеза различные биологически активные соединения, например, прополисное масло (9).Attempts are known to use various biologically active compounds, for example, propolis oil, as additional treatment for tuberculosis (9).
Бактериальные пробиотические препараты для лечения и профилактики туберкулеза не известны.Bacterial probiotic preparations for the treatment and prevention of tuberculosis are not known.
Известна композиция, включающая носитель и очищенный компонент липидов клеточной стенки микобактерий, предлагаемая для профилактики и лечения туберкулеза и для повышения неспецифической резистентности при различных аутоиммунных состояниях (11-19).A known composition comprising a carrier and a purified component of the lipids of the cell wall of mycobacteria, proposed for the prevention and treatment of tuberculosis and to increase nonspecific resistance in various autoimmune conditions (11-19).
При этом в качестве очищенного компонента липидов клеточной стенки предлагают использовать миколовые кислоты, обладающие биологической активностью. В качестве носителя возможно использование фармакологически подходящего носителя или адъюванта, в частности масла Marcol 52 или парообразной жидкости. Известная композиция, содержащая очищенный компонент клеточной стенки микобактерий, рассматривается как наиболее близкий аналог заявленного пробиотического бактериального препарата симбионтных коринебактерий (15).In this case, as a purified component of the lipids of the cell wall, it is proposed to use mycolic acids with biological activity. As a carrier, it is possible to use a pharmacologically suitable carrier or adjuvant, in particular Marcol 52 oil or a vaporous liquid. The known composition containing the purified component of the cell wall of mycobacteria is considered as the closest analogue of the claimed probiotic bacterial preparation of symbiont corynebacteria (15).
Для получения очищенного компонента липидов клеточной стенки используют микобактерии, продуцирующие миколовые кислоты. Возможно также использование Corynebacteriae, Nocardia и Rodococcus. Композиция включает отдельные компоненты липидов клеточной стенки микобактерий - миколовые кислоты или их смесь, выделенные химическим путем. Так как выделенная субстанция обладает токсичностью, ее подвергают дополнительной очистке. Результаты испытания миколовых кислот на животных подтверждают гипотезу авторов, что миколовые кислоты являются иммуногенами, способными индуцировать продукцию антител к миколовым кислотам. Результаты испытания композиции на людях, больных туберкулезом, свидетельствуют о том, что миколовые кислоты у больных способны вызывать выработку антимиколовых антител. Однако антитела были обнаружены всего у 2 из 58 больных туберкулезом. Антитела являются специфическими. Авторы заключают, что композиция очищенных миколовых кислот, выделенных из М. Tuberculesis H37Rv, обладает иммунорегуляторными и иммуногенными свойствами и может быть использована для профилактики и/или терапии болезней, особенно связанных с микобактериями.To obtain a purified component of the lipids of the cell wall, mycobacteria producing mycolic acids are used. The use of Corynebacteriae, Nocardia, and Rodococcus is also possible. The composition includes the individual components of the lipids of the cell wall of mycobacteria - mycolic acids or their mixture, isolated by chemical means. Since the isolated substance has toxicity, it is subjected to additional purification. Test results of mycolic acids in animals confirm the authors' hypothesis that mycolic acids are immunogens capable of inducing the production of antibodies to mycolic acids. The test results of the composition in people with tuberculosis indicate that mycolic acids in patients can cause the production of antimycol antibodies. However, antibodies were found in only 2 out of 58 patients with tuberculosis. Antibodies are specific. The authors conclude that the composition of purified mycolic acids isolated from M. Tuberculesis H37Rv has immunoregulatory and immunogenic properties and can be used for the prevention and / or treatment of diseases, especially those associated with mycobacteria.
Сведений о практическом использовании вышеуказанных составов для лечения и профилактики туберкулеза нет.There is no information on the practical use of the above formulations for the treatment and prevention of tuberculosis.
Заявляемое изобретение касается пробиотического бактериального препарата для профилактики и лечения туберкулеза, не обладающего токсичностью и способного индуцировать неспецифический и специфический противотуберкулезный иммунитет, и способа его получения.The claimed invention relates to a probiotic bacterial preparation for the prevention and treatment of tuberculosis, which is not toxic and capable of inducing nonspecific and specific anti-tuberculosis immunity, and a method for its preparation.
Известно, что возбудитель туберкулеза М. tuberculosis относится к роду Mycobacterium семейства Mycobacteriaceae, которые входят в порядок Actinomycetales. К этому порядку принадлежит и род Corynebacterium. Их объединяют общие морфологические, физиологические, генотипические признаки, общая ультраструктура и химический состав клеточных клеток, которые отличаются от других прокариот.The tuberculosis pathogen M. tuberculosis is known to belong to the genus Mycobacterium of the family Mycobacteriaceae, which are part of the Actinomycetales order. The genus Corynebacterium belongs to this order. They are united by common morphological, physiological, genotypic characters, a common ultrastructure and chemical composition of cell cells, which differ from other prokaryotes.
Общность химической структуры основного компонента клеточных стенок Corynebacteriae и Mycobacteriae пептидогликана является наиболее надежным доказательством родственных связей между ними (6, 7).The common chemical structure of the main component of the cell walls of Corynebacteriae and Mycobacteriae peptidoglycan is the most reliable evidence of family ties between them (6, 7).
Близкое родство коринебактерий и микобактерий, идентичность антигенов их клеточных стенок подтверждены иммунологическим ответом на их антигены. Серологическими методами (агглютинацией, преципитацией, электроиммунофорезом) выявлено наличие гомологичных антигенов в поверхностных структурах коринебактерий и микобактерий. Показано, что арабиноманнан и арабиногалактан клеточных стенок коринебактерий и микобактерий ответственны за перекрестные серологические реакции (6, 7).The close relationship of corynebacteria and mycobacteria, the identity of the antigens of their cell walls is confirmed by the immunological response to their antigens. Serological methods (agglutination, precipitation, electroimmunophoresis) revealed the presence of homologous antigens in the surface structures of corynebacteria and mycobacteria. It was shown that arabinomannan and arabinogalactan of the cell walls of corynebacteria and mycobacteria are responsible for cross-serological reactions (6, 7).
Вместе с тем корпускулярные антигены клеточных стенок коринебактерий в отличие от корпускулярных антигенов микобактерий туберкулеза безвредны, не токсичны.At the same time, corpuscular antigens of the cell walls of corynebacteria, in contrast to the corpuscular antigens of mycobacterium tuberculosis, are harmless and non-toxic.
Наиболее близким аналогом заявленного способа является способ получения пробиотического бактериального препарата, содержащего структурные компоненты микробной клетки, для профилактики и лечения инфекционных заболеваний животных и человека, а также коррекции микробиоценозов. Для получения препарата используют клеточные стенки симбионтного штамма нетоксигенных коринебактерий Corynebacterium diphtheriae tox- №2 ГИСК им. Л.А. Тарасевича, из суспензии которых выделяют структурный компонент микробной клетки путем дезинтеграции и центрифугирования. Для этого полученный влажный осадок суспендируют в растворе хлорида натрия до концентрации клеток 5 масс.% и проводят дезинтеграцию на ультразвуковой установке в течение 20 мин при частоте 20 кГц и амплитуде 14 мкм при температуре 25-30°С. Суспензию дезинтеграта центрифугируют при 5000g, осадок удаляют, а надосадочную жидкость центрифугируют при 14000g в течение 20 мин. После чего отмывают клеточные стенки от примесей цитоплазмы и питательной среды и ресуспендируют в растворе стабилизатора - глицина (15 мг в 1 мл). В полученном препарате структурным компонентом клеточной стенки является пептидополисахарид, определенный по содержанию пентоз и гексоз по Биалю. Препарат разводят до необходимой концентрации и при необходимости подвергают его стерилизации при температуре 100°С и лиофильному высушиванию (20).The closest analogue of the claimed method is a method for producing a probiotic bacterial preparation containing structural components of a microbial cell for the prevention and treatment of infectious diseases of animals and humans, as well as the correction of microbiocenoses. To obtain the drug, the cell walls of the symbiont strain of nontoxigenic corynebacteria Corynebacterium diphtheriae tox are used - No. 2 GISK named after L.A. Tarasevich, from the suspension of which the structural component of the microbial cell is isolated by disintegration and centrifugation. For this, the obtained wet cake is suspended in a solution of sodium chloride to a cell concentration of 5 wt.% And disintegration is carried out on an ultrasonic unit for 20 minutes at a frequency of 20 kHz and an amplitude of 14 μm at a temperature of 25-30 ° C. The disintegrate suspension is centrifuged at 5000g, the precipitate is removed, and the supernatant is centrifuged at 14000g for 20 minutes. Then the cell walls are washed away from the impurities of the cytoplasm and the nutrient medium and resuspended in a stabilizer solution - glycine (15 mg in 1 ml). In the resulting preparation, the structural component of the cell wall is the peptidopolysaccharide, determined by the content of pentoses and hexoses according to Bial. The drug is diluted to the required concentration and, if necessary, subjected to sterilization at a temperature of 100 ° C and freeze drying (20).
Однако вышеуказанным способом не представляется возможным получить пробиотический препарат для профилактики и лечения туберкулеза, направленный на повышение не только неспецифической резистентности, но и на формирование специфического иммунитета.However, it is not possible by the above method to obtain a probiotic preparation for the prevention and treatment of tuberculosis, aimed at increasing not only non-specific resistance, but also the formation of specific immunity.
Технический результат заявляемых технических решений выражается в получении безопасного и эффективного пробиотического бактериального препарата для профилактики и лечения туберкулеза у человека и животных, представляющего собой корпускулярные антигены (липопептидополисахариды) клеточных стенок коринебактерий, идентичные по химическому составу и антигенным свойствам компонентам клеточных стенок микобактерий, что обеспечивает создание неспецифического и специфического противотуберкулезного иммунитета.The technical result of the claimed technical solutions is expressed in obtaining a safe and effective probiotic bacterial preparation for the prevention and treatment of tuberculosis in humans and animals, which is corpuscular antigens (lipopeptidopolysaccharides) of corynebacterial cell walls, identical in chemical composition and antigenic properties to the components of mycobacterial cell walls, which ensures the creation of nonspecific and specific anti-tuberculosis immunity.
Указанный технический результат достигается тем, что способ получения пробиотического бактериального препарата, содержащего корпускулярные антигены симбионтных коринебактерий для профилактики и лечения туберкулеза, предусматривает наращивание биомассы симбионтного штамма Corynebacterium diphtheriae tox- №2 ГИСК им. Л.А.Тарасевича в жидкой питательной среде, содержащей гидролизат казеина, осаждение микробных клеток центрифугированием, промывание при центрифугировании с получением осадка целых клеток, суспендирование их в растворе хлорида натрия, дезинтеграцию при температуре 25-30°С в течение 15 мин при частоте 20 кГц и амплитуде 14 мкм, последующее центрифугирование при 5000g и удаление оставшихся целых клеток, полученный надосадок центрифугируют при 14000g в течение 20 мин с получением осадка, представляющего собой корпускулярные антигены клеточных стенок коринебактерий, который ресуспендируют в растворе стабилизатора и подвергают дезинтеграции при температуре 25-30°С в течение 5 мин при частоте 20 кГц и амплитуде 14 мкм, полученный препарат разводят до концентрации 225-275 мкг/мл, стерилизуют и высушивают методом лиофилизации для использования в инъекционной форме или форме спрея.The specified technical result is achieved by the fact that the method of obtaining a probiotic bacterial preparation containing corpuscular antigens of symbiont corynebacteria for the prevention and treatment of tuberculosis involves the increase in biomass of the symbiont strain Corynebacterium diphtheriae tox - No. 2 GISK them. L.A. Tarasevich in a liquid nutrient medium containing casein hydrolyzate, sedimentation of microbial cells by centrifugation, washing during centrifugation to obtain a precipitate of whole cells, suspending them in a solution of sodium chloride, disintegration at a temperature of 25-30 ° C for 15 min at a frequency of 20 kHz and an amplitude of 14 μm, subsequent centrifugation at 5000g and removal of the remaining whole cells, the resulting supernatant is centrifuged at 14000g for 20 min to obtain a precipitate representing corpuscular antigens of cell walls corynebacteria, which are resuspended in a stabilizer solution and disintegrated at a temperature of 25-30 ° C for 5 min at a frequency of 20 kHz and an amplitude of 14 μm, the resulting preparation is diluted to a concentration of 225-275 μg / ml, sterilized and dried by lyophilization for use in Injectable or spray form.
В полученном предлагаемым способом препарате структурными компонентами клеточных стенок являются корпускулярные антигены клеточных стенок симбионтного штамма Corynebacterium diphtheriae tox- №2 ГИСК им. Л.А.Тарасевича, который используют для профилактики и лечения туберкулеза. Препарат подвергают лиофильному высушиванию для получения лекарственных форм для парентерального введения или в форме спрея для местной аппликации ротоглотки.In the preparation obtained by the proposed method, the structural components of the cell walls are the corpuscular antigens of the cell walls of the symbiont strain Corynebacterium diphtheriae tox - No. 2 GISK them. L.A. Tarasevich, which is used for the prevention and treatment of tuberculosis. The drug is subjected to freeze drying to obtain dosage forms for parenteral administration or in the form of a spray for local application of the oropharynx.
Традиционно для получения пробиотических бактериальных препаратов используют базовые питательные среды общего назначения на основе гидролизата казеина, рыбного гидролизата с добавлением сыворотки крупного рогатого скота, МПА, мартеновский пептон, мартеновский агар с мясной водой двойной концентрации и т.п. среды.Traditionally, to obtain probiotic bacterial preparations, general-purpose basic nutrient media are used based on casein hydrolyzate, fish hydrolyzate with the addition of cattle serum, MPA, open-hearth peptone, open-hearth meat agar with double concentration, etc. Wednesday.
В качестве стабилизатора из традиционно используемых, предпочтительно, выбран глицин из расчета 15 мг в 1 мл.As a stabilizer from the traditionally used, preferably, glycine is selected at the rate of 15 mg per 1 ml.
Ниже приведен пример получения пробиотического бактериального препарата корпускулярных антигенов симбионтных коринебактерий для профилактики и лечения туберкулеза и примеры, подтверждающие эффективность пробиотического препарата корпускулярных антигенов симбионтных коринебактерий для создания неспецифического и специфического противотуберкулезного иммунитета.The following is an example of obtaining a probiotic bacterial preparation of corpuscular antigens of symbiotic corynebacteria for the prevention and treatment of tuberculosis and examples confirming the effectiveness of a probiotic preparation of corpuscular antigens of symbiont corynebacteria for creating non-specific and specific anti-tuberculosis immunity.
Пример 1.Example 1
Для приготовления препарата используют симбионтный пробиотический штамм Corynebacterium diphtheriae tox- №2 ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Биомассу наращивают в течение 16 ч при температуре 37°С на плотной питательной среде, содержащей рыбный гидролизат с добавлением сыворотки крупного рогатого скота. Затем культуру смывают жидкой питательной средой, содержащей, г/л: гидролизат казеина - 2,0, пептон - 10,0, глюкозу - 10,0, дрожжевой экстракт - 2,0, натрия хлорид - 6,0. Культивируют в течение 5 ч при температуре 37°С, вносят в ферментер с той же питательной средой и проводят наращивание биомассы при постоянном аэрировании при температуре 37°С в течение 16 ч. Микробные клетки осаждают центрифугированием при 5000g в течение 20 мин и трижды промывают раствором хлорида натрия при центрифугировании в режиме не менее 5000g в течение 20 мин.For the preparation of the drug using a symbiotic probiotic strain of Corynebacterium diphtheriae tox - No. 2 GISK them. L.A. Tarasevich. The biomass is grown over 16 hours at a temperature of 37 ° C in a dense nutrient medium containing fish hydrolyzate with the addition of cattle serum. Then the culture is washed off with a liquid nutrient medium containing, g / l: casein hydrolyzate - 2.0, peptone - 10.0, glucose - 10.0, yeast extract - 2.0, sodium chloride - 6.0. It is cultivated for 5 hours at 37 ° C, introduced into the fermenter with the same nutrient medium, and biomass is grown with constant aeration at 37 ° C for 16 hours. Microbial cells are precipitated by centrifugation at 5000g for 20 minutes and washed three times with solution sodium chloride by centrifugation in a mode of at least 5000g for 20 minutes
Полученный влажный осадок целых клеток симбионтного штамма С.diphtheriae tox- №2 ГИСК им. Л.А.Тарасевича взвешивают, суспендируют в забуференном растворе хлорида натрия, рН 7,2, до концентрации клеток 5 масс.%. Затем суспензию целых клеток дезинтегрируют на ультразвуковой установке в течение 15 мин при частоте 20 гГц и амплитуде 14 мкм, при охлаждении льдом или водой до 25-30°С. Полученную суспензию дезинтеграта центрифугируют при 5000g в течение 15 мин с целью отделения неразрушенных клеток и их фрагментов от клеточных стенок. Осадок удаляют, надосадочную жидкость центрифугируют при 14000g в течение 20 мин. Полученный осадок ресуспендируют в растворе хлорида натрия и снова центрифугируют при 14000g в течение 20 мин. Отмывание корпускулярных антигенов клеточных стенок от примесей цитоплазмы и питательной среды повторяют 3 раза. Отмытые корпускулярные антигены ресуспендируют в растворе глицина из расчета 15 мг в 1 мл и повторно дезинтегрируют на ультразвуковой установке в течение 5 мин при частоте 20 кГц и амплитуде 14 мкм при температуре 25-30°С.The resulting wet cake of whole cells of the symbiont strain C. diphtheriae tox - No. 2 GISK them. L.A. Tarasevich is weighed, suspended in a buffered solution of sodium chloride, pH 7.2, to a cell concentration of 5 wt.%. Then a suspension of whole cells is disintegrated on an ultrasonic unit for 15 minutes at a frequency of 20 GHz and an amplitude of 14 μm, when cooled with ice or water to 25-30 ° C. The resulting disintegrate suspension is centrifuged at 5000 g for 15 min in order to separate the undamaged cells and their fragments from the cell walls. The precipitate was removed, the supernatant was centrifuged at 14000g for 20 minutes. The resulting precipitate was resuspended in a sodium chloride solution and centrifuged again at 14000g for 20 minutes. The washing off of the corpuscular antigens of the cell walls from impurities of the cytoplasm and culture medium is repeated 3 times. Washed corpuscular antigens are resuspended in a solution of glycine at the rate of 15 mg per 1 ml and re-disintegrated on an ultrasonic unit for 5 min at a frequency of 20 kHz and an amplitude of 14 μm at a temperature of 25-30 ° C.
В полученном препарате определяют концентрацию биологически активного липопептидополисахарида по содержанию пентоз и гексоз. Затем препарат разводят до концентрации 250±25 мкг/мл, подвергают стерилизации при температуре 100°С и лиофильно высушивают для использования в инъекционной форме или форме спрея. Количество активного начала в 1 дозе конечного препарата зависит от лекарственной формы и возраста человека или животного.In the resulting preparation, the concentration of the biologically active lipopeptide polysaccharide is determined by the content of pentoses and hexoses. Then the drug is diluted to a concentration of 250 ± 25 μg / ml, sterilized at a temperature of 100 ° C and freeze-dried for use in injectable or spray form. The amount of active principle in 1 dose of the final preparation depends on the dosage form and the age of the person or animal.
Пример 2. Активность фагоцитирующих клеток перитониального экссудата мышей, иммунизированных препаратом корпускулярных антигенов клеточной стенки.Example 2. The activity of phagocytic cells of peritoneal exudate of mice immunized with the preparation of corpuscular antigens of the cell wall.
Мышей подкожно иммунизируют препаратом корпускулярных антигенов С.diphtheriae tox- №2 ГИСК им. Л.А.Тарасевича в дозе 200 мкг. Через две недели опытным животным в брюшную полость вводят живую культуру возбудителей дифтерии (C.diptheriae tox+). Эффективность фагоцитоза оценивают в перитониальной пробе по И.Ф.Здродовскому. Пробу берут через 3 часа после заражения. Основными показателями эффективности фагоцитоза были: количество свободных клеток С.diptheriae tox+, процент фагоцитирующих клеток в пробе перитониального экссудата (в 30 полях зрения), а также завершенность фагоцитоза. Результаты исследования приведены в таблице 1.Mice are subcutaneously immunized with the preparation of corpuscular antigens C. diphtheriae tox - No. 2 GISK them. L.A. Tarasevich at a dose of 200 mcg. After two weeks, a live culture of diphtheria pathogens (C. diptheriae tox +) is introduced into the abdominal cavity of the experimental animals. The effectiveness of phagocytosis is evaluated in a peritoneal test according to I.F.Zdrodovsky. A sample is taken 3 hours after infection. The main indicators of the effectiveness of phagocytosis were: the number of free cells of C. diptheriae tox + , the percentage of phagocytic cells in the sample of peritoneal exudate (in 30 fields of view), as well as the completeness of phagocytosis. The results of the study are shown in table 1.
Из таблицы видно, что через 3 ч после заражения фагоцитирующие клетки контрольных животных концентрируются в очаге заражения, количество свободных бактерий С.diptheriae tox+ достигает 300, они продолжают размножаться, фагоцитирующие клетки составляют 57,9%. Разрушения бактериальных клеток внутри макрофагов не происходит.The table shows that 3 hours after infection, the phagocytic cells of the control animals concentrate in the infection site, the number of free bacteria of C. diptheriae tox + reaches 300, they continue to multiply, and the phagocytic cells account for 57.9%. Destruction of bacterial cells within macrophages does not occur.
У мышей, иммунизированных корпускулярными антигенами клеточных стенок симбионтного штамма С.diptheriae tox- №2 ГИСК им. Л.А.Тарасевича, выявлена повышенная активность фагоцитирующих клеток, процент макрофагов, завершающих фагоцитоз, составляет всего 11,8%, что подтверждается полным отсутствием свободных клеток C.diptheriae tox+ в пробе экссудата. Макрофаги представляют собой гигантские клетки с хорошо дифференцированным ядром, цитоплазмой, большим количеством свободных лизосом.In mice immunized with corpuscular antigens of the cell walls of the symbiont strain C. diptheriae tox - No. 2 GISK them. L.A. Tarasevich, an increased activity of phagocytic cells was detected, the percentage of macrophages that complete phagocytosis is only 11.8%, which is confirmed by the complete absence of free C.diptheriae tox + cells in the exudate sample. Macrophages are giant cells with a well differentiated nucleus, cytoplasm, and a large number of free lysosomes.
Таким образом, после иммунизации животных корпускулярными антигенами симбионтного штамма С.diptheriae tox- №2 ГИСК им. Л.А.Тарасевича в зоне контакта «иммунных» макрофагов с С.diptheriae tox+ они быстро активизируются, адсорбируют, поглощают и утилизируют токсичные C.diptheriae tox+.Thus, after immunization of animals with corpuscular antigens of the symbiont strain C. diptheriae tox - No. 2 GISK them. L.A. Tarasevich in the contact zone of “immune” macrophages with C. diptheriae tox + they quickly activate, adsorb, absorb and utilize toxic C.diptheriae tox + .
Пример 3. Повышение активности нейтрофилов под влиянием корпускулярных антигенов симбионтного штамма С.diptheriae tox- №2 ГИСК им. Л.А.Тарасевича.Example 3. The increased activity of neutrophils under the influence of corpuscular antigens of the symbiont strain C. diptheriae tox - No. 2 GISK them. L.A. Tarasevich.
Роль нейтрофилов совместно с макрофагами заключается в разрушении целых клеток микроорганизмов и переработке бактериальных антигенов в форму, пригодную для восприятия их иммунокомпетентными клетками. Неспецифические реакции нейтрофилов и макрофагов являются предфазой создания специфического иммунитета.The role of neutrophils in conjunction with macrophages is the destruction of whole cells of microorganisms and the processing of bacterial antigens into a form suitable for perception by immunocompetent cells. Nonspecific reactions of neutrophils and macrophages are a pre-phase of the creation of specific immunity.
В тесте НСТ показана активация кислородзависимого метаболизма нейтрофилов под влиянием корпускулярных антигенов клеточных стенок симбионтного штамма С.diptheriae tox- №2 ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Антигены активно взаимодействуют с нейтрофилами человека, подвергаясь опсонизации нормальными антителами человека IgG-изотипа (антитела выделены из сыворотки здоровых людей).The HCT test shows the activation of oxygen-dependent neutrophil metabolism under the influence of corpuscular antigens of the cell walls of the symbiont strain C. dipipriaria tox - No. 2 GISK named after L.A. Tarasevich. Antigens actively interact with human neutrophils, undergoing opsonization with normal human antibodies of the IgG isotype (antibodies isolated from the serum of healthy people).
Активация нейтрофилов в прямой (без опсонизации IgG) реакции взаимодействия с антигенами клеточных стенок симбионтного штамма С.diphtheriae tox- №2 ГИСК им. Л.А.Тарасевича свидетельствует о функциональных возможностях антигенов клеточных стенок С.diptheriae tox_ в активации фагоцитирующих клеток (рис.1,2).Neutrophil activation in a direct (without IgG opsonization) reaction of interaction with antigens of the cell walls of the symbiont strain C. diphtheriae tox - No. 2 GISK named after L.A. Tarasevich testifies to the functional capabilities of the antigens of the cell walls of C. diptheriae tox _ in the activation of phagocytic cells (Fig. 1.2).
Таким образом, активация нейтрофилов корпускулярными антигенами симбионтного штамма C.diphtheriae tox- №2 ГИСК им. Л.А.Тарасевича приводит к повышению неспецифической резистентности макроорганизма.Thus, neutrophil activation by the corpuscular antigens of the symbiont strain C.diphtheriae tox - No. 2 GISK named after L.A. Tarasevich leads to an increase in nonspecific resistance of the macroorganism.
Рис.1. Прямая (I) и IgG опосредованная (II) реактивность нейтрофилов человека к антигенам клеточных стенок штамма С.diphtheriae tox - №2 ГИСК им. Л.А.Тарасевича.Fig. 1. Direct (I) and IgG mediated (II) reactivity of human neutrophils to antigens of the cell walls of C. diphtheriae tox strain - No. 2 GISK named after L.A. Tarasevich.
Рис.2. Влияние опсонизирующей концентрации IgG на реактивность нейтрофилов человека к корпускулярным антигенам симбионтного штамма C.diphtheriae tox- №2 ГИСК им. Л.А.Тарасевича.Fig. 2. The influence of the opsonizing concentration of IgG on the reactivity of human neutrophils to the corpuscular antigens of the symbiont strain C.diphtheriae tox - No. 2 GISK them. L.A. Tarasevich.
По оси абсцисс - концентрация IgG (мг/мл), по оси ординат - количество стимулированных нейтрофилов (в %).The abscissa shows the concentration of IgG (mg / ml), the ordinate shows the number of neutrophils stimulated (in%).
Пример 3.Example 3
Протективные свойства корпускулярных антигенов симбионтного штамма С.diphtheriae tox - №2 ГИСК им. Л.А.Тарасевича.The protective properties of corpuscular antigens of the symbiont strain C. diphtheriae tox - No. 2 GISK them. L.A. Tarasevich.
Две группы беспородных белых мышей иммунизируют корпускулярными антигенами симбионтных коринебактерий в дозах 200 мкг и 400 мкг. В контрольную группу входят животные, иммунизированные вакциной БЦЖ. Через 48 суток мышам обеих опытных групп и мышам контрольной группы вводят вирулентный штамм возбудителя туберкулеза в дозах 10-3, 10-5, 10-6 микробных клеток. В таблице 2 представлены данные по влиянию препарата на устойчивость беспородных белых мышей на заражение их вирулентным штаммом возбудителя туберкулеза.Two groups of outbred white mice are immunized with corpuscular antigens of symbiont corynebacteria at doses of 200 μg and 400 μg. The control group includes animals immunized with BCG vaccine. After 48 days, mice of both experimental groups and mice of the control group are injected with a virulent strain of the causative agent of tuberculosis in doses of 10 -3 , 10 -5 , 10 -6 microbial cells. Table 2 presents data on the effect of the drug on the resistance of outbred white mice on infection with their virulent strain of the causative agent of tuberculosis.
Как видно, пробиотический бактериальный препарат корпускулярных антигенов клеточных стенок (липопептидополисахаридов) симбионтного штамма С.diphtheriae tox- №2 ГИСК им. Л.А.Тарасевича повышает резистентность мышей к туберкулезной инфекции. Это проявляется в выживаемости животных при заражении их вирулентным штаммом M.tuberculosis.As you can see, the probiotic bacterial preparation of corpuscular antigens of the cell walls (lipopeptidopolysaccharides) of the symbiont strain C. diphtheriae tox - No. 2 GISK them. L.A. Tarasevicha increases the resistance of mice to tuberculosis infection. This is manifested in the survival of animals when infected with their virulent strain of M. tuberculosis.
Таким образом, впервые предложен пробиотический бактериальный препарат для профилактики и лечения туберкулеза, направленный на повышение неспецифической резистентности, конкретно на активацию макрофагального звена клеточного иммунитета, а также на формирование специфического иммунитета.Thus, a probiotic bacterial preparation for the prevention and treatment of tuberculosis was first proposed, aimed at increasing nonspecific resistance, specifically the activation of the macrophage link of cellular immunity, as well as the formation of specific immunity.
Препарат представляет собой корпускулярные антигены (липопептидополисахариды) клеточных стенок симбионтного штамма С.diphtheriae tox- №2 ГИСК им. Л.А.Тарасевича, идентичные по химическому составу и антигенным свойствам компонентам клеточных стенок микобактерий, что обеспечивает его нетоксичность, безопасность и эффективность. Противотуберкулезная защита осуществляется за счет создания напряженного неспецифического и специфического иммунитета. Способ получения препарата технологичен, безвреден. Препарат пригоден для использования в различных лекарственных формах для профилактики и лечения туберкулеза у людей и животных.The drug is a corpuscular antigens (lipopeptidopolysaccharides) of the cell walls of the symbiont strain C. diphtheriae tox - No. 2 GISK them. L.A. Tarasevich, identical in chemical composition and antigenic properties to the components of the cell walls of mycobacteria, which ensures its non-toxicity, safety and effectiveness. Tuberculosis protection is carried out by creating intense nonspecific and specific immunity. The method of obtaining the drug is technological, harmless. The drug is suitable for use in various dosage forms for the prevention and treatment of tuberculosis in humans and animals.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011125757/10A RU2468816C1 (en) | 2011-06-23 | 2011-06-23 | Probiotic bacterial preparation of corpuscular antigens of lipopeptidopolysaccharide corynebacteria for prevention and treatment of tuberculosis, method for preparing it |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011125757/10A RU2468816C1 (en) | 2011-06-23 | 2011-06-23 | Probiotic bacterial preparation of corpuscular antigens of lipopeptidopolysaccharide corynebacteria for prevention and treatment of tuberculosis, method for preparing it |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2468816C1 true RU2468816C1 (en) | 2012-12-10 |
Family
ID=49255650
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011125757/10A RU2468816C1 (en) | 2011-06-23 | 2011-06-23 | Probiotic bacterial preparation of corpuscular antigens of lipopeptidopolysaccharide corynebacteria for prevention and treatment of tuberculosis, method for preparing it |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2468816C1 (en) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6433013B1 (en) * | 1997-03-03 | 2002-08-13 | Adcock Ingram Limited | Composition comprising a carrier and a purified mycobacterial lipid cell-wall component and its use in the prevention, treatment and diagnosis of disease |
| CN1465354A (en) * | 2002-07-03 | 2004-01-07 | 中国药品生物制品检定所 | Use of acellular short corynebacteria preparation in preparation of medicine for treating tuberculosis |
| RU2230113C1 (en) * | 2002-11-12 | 2004-06-10 | Шмелева Елена Александровна | Method for preparing probiotic bacterial preparation comprising structural components of bacterial cell |
| RU2008142140A (en) * | 2006-03-24 | 2010-04-27 | Универсидад Сарагоса (Es) | Anti-tuberculosis vaccine |
-
2011
- 2011-06-23 RU RU2011125757/10A patent/RU2468816C1/en active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6433013B1 (en) * | 1997-03-03 | 2002-08-13 | Adcock Ingram Limited | Composition comprising a carrier and a purified mycobacterial lipid cell-wall component and its use in the prevention, treatment and diagnosis of disease |
| US7122577B1 (en) * | 1997-03-03 | 2006-10-17 | Adcock Ingram Limited | Composition comprising a carrier and a purified mycobacterial lipid cell-wall component and its use in the treatment and diagnosis of disease |
| CN1465354A (en) * | 2002-07-03 | 2004-01-07 | 中国药品生物制品检定所 | Use of acellular short corynebacteria preparation in preparation of medicine for treating tuberculosis |
| RU2230113C1 (en) * | 2002-11-12 | 2004-06-10 | Шмелева Елена Александровна | Method for preparing probiotic bacterial preparation comprising structural components of bacterial cell |
| RU2008142140A (en) * | 2006-03-24 | 2010-04-27 | Универсидад Сарагоса (Es) | Anti-tuberculosis vaccine |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU660430B2 (en) | Mycobacterium as adjuvant for antigens | |
| CA2065286C (en) | Treatment of chronic inflammatory conditions | |
| KR101656252B1 (en) | Immunopotentiating composition and process for producing same | |
| CN108992667A (en) | A kind of shingles zoster vaccine and preparation method thereof, application | |
| CN1602199B (en) | Gram positive bacteria preparations for the treatment of diseases comprising an immune dysregulation | |
| AU691797B2 (en) | Immunotherapeutic composition | |
| EP2373332A1 (en) | Process for production of vaccines | |
| JP2010508254A (en) | Tuberculosis preventive vaccine | |
| JP4875494B2 (en) | Immunomodulator | |
| Newman et al. | Separation of serum bactericidal and opsonizing activities for Haemophilus influenzae type b | |
| Dentovskaya et al. | Molecular bases of vaccine-prevention of plague | |
| RU2468816C1 (en) | Probiotic bacterial preparation of corpuscular antigens of lipopeptidopolysaccharide corynebacteria for prevention and treatment of tuberculosis, method for preparing it | |
| JP2009520789A (en) | Use of whole bacterial cells (actinomycetes) for maternal administration to modulate offspring immune responses | |
| AU779214B2 (en) | A vaccine comprising lactobacilli for treating prostate inflammation and benign prostate hyperplasias | |
| WO2014077723A1 (en) | Method for obtaining a probiotic preparation of particulate antigens of corynebacteria, probiotic bacterial preparation for preventing and treating tuberculosis, and symbiotic strain | |
| Zahednia et al. | Cytotoxicity Evalution of Mannan Polysaccharide Purified from Mycobacterium Bovis for Use in Vaccine Formulation as an Adjuvant | |
| KR970001710B1 (en) | Pseudomonas infection preventing agent and the method of preparation thereof | |
| Bayed | The Effect of Transfer Factor as Immunoprotective in Mice Challenged with Mycobacterium tuberculosis | |
| Alley et al. | Effect of inoculation with neuraminidase-treated tumor cells on macrophage cytotoxicity in vitro | |
| MXPA01008243A (en) | Treatment of chronic viral infections with m. vaccae. | |
| RU2540144C1 (en) | METHOD FOR OBTAINING ANATOXIN Bordetella pertussis | |
| JP2008538499A (en) | CD4 T cell activation method {MethodForActivating CD4TCells} | |
| JP2008536511A (en) | CD8 T cell activation method {MethodForActivating CD8 TCells} | |
| Allen | Vaccine-induced protective immunity to Bordetella pertussis | |
| Zienkiewicz | Dendritic Cells: sensors of extreme antigen dilutions and role in immunity against Salmonella typhimurium infections |