RU2467069C2 - System for expression of orthogonal translation components in eubacterial host cell - Google Patents

System for expression of orthogonal translation components in eubacterial host cell Download PDF

Info

Publication number
RU2467069C2
RU2467069C2 RU2008133028/10A RU2008133028A RU2467069C2 RU 2467069 C2 RU2467069 C2 RU 2467069C2 RU 2008133028/10 A RU2008133028/10 A RU 2008133028/10A RU 2008133028 A RU2008133028 A RU 2008133028A RU 2467069 C2 RU2467069 C2 RU 2467069C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
trna
composition
nucleotide sequence
host cell
providing
Prior art date
Application number
RU2008133028/10A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2008133028A (en
Inventor
Иоунга РИЮ (US)
Иоунга РИЮ
Питер Г. ШУЛЬЦ (US)
Питер Г. ШУЛЬЦ
Original Assignee
Зе Скрипс Ресеч Инститьют
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Зе Скрипс Ресеч Инститьют filed Critical Зе Скрипс Ресеч Инститьют
Publication of RU2008133028A publication Critical patent/RU2008133028A/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2467069C2 publication Critical patent/RU2467069C2/en

Links

Images

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

FIELD: chemistry.
SUBSTANCE: present invention relates to biotechnology. The invention discloses a composition for coexpression in an eubacterial host cell orthogonal tRNA (O-tRNA) and orthogonal aminoacyl-tRNA synthetase (O-RS), which preferably aminoacylates said O-tRNA with an unnatural amino acid. The disclosed composition consists of two nucleic acid constructs: the first construct contains promoter and terminator nucleotide sequences derived from an E.coli proline tRNA gene and which is derived from the archaea of the expressed sequence, which encodes one O-tRNA or is a polycistronic operon, and the second construct contains a modified E.coli glnS promoter and the expressed nucleotide sequence which encodes the corresponding O-RS. Described is a translation system which includes the disclosed vector constructs, and a method of obtaining the polypeptide of interest which contains an unnatural amino acid in a genetically defined position.
EFFECT: obtaining properties with new properties, which are defined by inclusion of unnatural amino acids into a predetermined position.
54 cl, 8 dwg, 7 ex

Description

Текст описания приведен в факсимильном виде.

Figure 00000001
Figure 00000002
Figure 00000003
Figure 00000004
Figure 00000005
Figure 00000006
Figure 00000007
Figure 00000008
Figure 00000009
Figure 00000010
Figure 00000011
Figure 00000012
Figure 00000013
Figure 00000014
Figure 00000015
Figure 00000016
Figure 00000017
Figure 00000018
Figure 00000019
Figure 00000020
Figure 00000021
Figure 00000022
Figure 00000023
Figure 00000024
Figure 00000025
Figure 00000026
Figure 00000027
Figure 00000028
Figure 00000029
Figure 00000030
Figure 00000031
Figure 00000032
Figure 00000033
Figure 00000034
Figure 00000035
Figure 00000036
Figure 00000037
Figure 00000038
Figure 00000039
Figure 00000040
Figure 00000041
Figure 00000042
Figure 00000043
Figure 00000044
Figure 00000045
Figure 00000046
Figure 00000047
Figure 00000048
Figure 00000049
Figure 00000050
Figure 00000051
Figure 00000052
Figure 00000053
Figure 00000054
Figure 00000055
Figure 00000056
Figure 00000057
Figure 00000058
Figure 00000059
Figure 00000060
Figure 00000061
Figure 00000062
Figure 00000063
Figure 00000064
Figure 00000065
Figure 00000066
Figure 00000067
Figure 00000068
Figure 00000069
Figure 00000070
Figure 00000071
Figure 00000072
Figure 00000073
Figure 00000075
Figure 00000076
Figure 00000077
Figure 00000078
Figure 00000079
Figure 00000080
Figure 00000081
Figure 00000082
Figure 00000083
Figure 00000084
Figure 00000085
Figure 00000086
Figure 00000087
Figure 00000088
Figure 00000089
Figure 00000090
Figure 00000091
Figure 00000092
Figure 00000093
Figure 00000094
Figure 00000095
Figure 00000096
Figure 00000097
Figure 00000098
Figure 00000099
Figure 00000100
Figure 00000101
Figure 00000102
Figure 00000103
Figure 00000104
Figure 00000105
Figure 00000106
Figure 00000107
Figure 00000108
Figure 00000109
Figure 00000110
Figure 00000111
Figure 00000112
Figure 00000113
Figure 00000114
Figure 00000115
Figure 00000116
Figure 00000117
Figure 00000118
Figure 00000119
Figure 00000120
Figure 00000121
Figure 00000122
The text of the description is given in facsimile form.
Figure 00000001
Figure 00000002
Figure 00000003
Figure 00000004
Figure 00000005
Figure 00000006
Figure 00000007
Figure 00000008
Figure 00000009
Figure 00000010
Figure 00000011
Figure 00000012
Figure 00000013
Figure 00000014
Figure 00000015
Figure 00000016
Figure 00000017
Figure 00000018
Figure 00000019
Figure 00000020
Figure 00000021
Figure 00000022
Figure 00000023
Figure 00000024
Figure 00000025
Figure 00000026
Figure 00000027
Figure 00000028
Figure 00000029
Figure 00000030
Figure 00000031
Figure 00000032
Figure 00000033
Figure 00000034
Figure 00000035
Figure 00000036
Figure 00000037
Figure 00000038
Figure 00000039
Figure 00000040
Figure 00000041
Figure 00000042
Figure 00000043
Figure 00000044
Figure 00000045
Figure 00000046
Figure 00000047
Figure 00000048
Figure 00000049
Figure 00000050
Figure 00000051
Figure 00000052
Figure 00000053
Figure 00000054
Figure 00000055
Figure 00000056
Figure 00000057
Figure 00000058
Figure 00000059
Figure 00000060
Figure 00000061
Figure 00000062
Figure 00000063
Figure 00000064
Figure 00000065
Figure 00000066
Figure 00000067
Figure 00000068
Figure 00000069
Figure 00000070
Figure 00000071
Figure 00000072
Figure 00000073
Figure 00000075
Figure 00000076
Figure 00000077
Figure 00000078
Figure 00000079
Figure 00000080
Figure 00000081
Figure 00000082
Figure 00000083
Figure 00000084
Figure 00000085
Figure 00000086
Figure 00000087
Figure 00000088
Figure 00000089
Figure 00000090
Figure 00000091
Figure 00000092
Figure 00000093
Figure 00000094
Figure 00000095
Figure 00000096
Figure 00000097
Figure 00000098
Figure 00000099
Figure 00000100
Figure 00000101
Figure 00000102
Figure 00000103
Figure 00000104
Figure 00000105
Figure 00000106
Figure 00000107
Figure 00000108
Figure 00000109
Figure 00000110
Figure 00000111
Figure 00000112
Figure 00000113
Figure 00000114
Figure 00000115
Figure 00000116
Figure 00000117
Figure 00000118
Figure 00000119
Figure 00000120
Figure 00000121
Figure 00000122

Claims (54)

1. Композиция для совместной экспрессии О-тРНК И О-РС, включающая:
(a) конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую последовательности промотора и терминатора, полученные из гена пролин-тРНК Escherichia coli, и экспрессируемую нуклеотидную последовательность, причем обе указанные последовательности промотора и терминатора функционально соединены с указанной экспрессируемой последовательностью, а указанная экспрессируемая последовательность происходит из Архей и является гетерологичной по отношению к указанным последовательностям промотора и терминатора; и
(b) конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность промотора, соответствующую модифицированному промотору glnS E.coli, которая имеет нуклеотидную последовательность, соответствующую SEQ ID NO:13, и экспрессируемую нуклеотидную последовательность, причем указанная модифицированная нуклеотидная последовательность промотора glnS E.coli функционально соединена с указанной экспрессируемой последовательностью; при этом конструкция (а) содержит экспрессируемые нуклеотидные последовательности, выбранные из: (c1) и (d), a (b) содержит экспрессируемую нуклеотидную последовательность (с2), где
(c1) представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую ортогональную тРНК (О-тРНК);
(с2) представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую ортогональную аминоацил-тРНК синтетазу (О-РС), где указанная О-РС предпочтительно аминоацилирует указанную О-тРНК путем присоединения к ней невстречающейся в природе аминокислоты;
(d) представляет собой один или более полицистронных оперонов, причем полицистронный оперон содержат множество нуклеотидных последовательностей генов тРНК, где по меньшей мере один ген тРНК отделен от по меньшей мере одного смежного с ним гена тРНК гетерологичным полинуклеотидным линкером, полученным из природного полинуклеотидного линкера от природного тРНК оперона.1. Composition for co-expression of O-tRNA and O-RS, including:
(a) a nucleic acid construct comprising the promoter and terminator sequences derived from the Escherichia coli proline tRNA gene and an expressed nucleotide sequence, both of which the promoter and terminator sequences are operably linked to said expressed sequence, and said expressed sequence is from Archaea and is heterologous with respect to said promoter and terminator sequences; and
(b) a nucleic acid construct comprising a nucleotide sequence of a promoter corresponding to a modified E. coli glnS promoter that has a nucleotide sequence corresponding to SEQ ID NO: 13 and an expressed nucleotide sequence, said modified nucleotide sequence of an E. coli glnS promoter being operably linked to the specified expressed sequence; wherein construct (a) contains the expressed nucleotide sequences selected from: (c1) and (d), a (b) contains the expressed nucleotide sequence (c2), where
(c1) is a nucleotide sequence encoding an orthogonal tRNA (O-tRNA);
(c2) is a nucleotide sequence encoding an orthogonal aminoacyl-tRNA synthetase (O-RS), wherein said O-RS preferably aminoacylates the indicated O-tRNA by attaching to it a non-naturally occurring amino acid;
(d) represents one or more polycistronic operons, the polycistronic operon containing many nucleotide sequences of tRNA genes, where at least one tRNA gene is separated from at least one adjacent tRNA gene by a heterologous polynucleotide linker derived from a natural polynucleotide linker from a natural tRNA operon. 2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанный ген пролин-тРНК Е. coli выбран из генов тРНК Е.coli: proK, proL и proM.2. The composition according to claim 1, characterized in that said E. coli proline tRNA gene is selected from E. coli tRNA genes: proK, proL and proM. 3. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанные последовательности промотора и терминатора пролин-тРНК Е. coli получены из последовательностей промотора и терминатора proK E.coli, представленных в SEQ ID NOS:32 и 33, соответственно.3. The composition according to claim 1, characterized in that the indicated sequences of the promoter and terminator of proline-tRNA E. coli obtained from the sequences of the promoter and terminator proK of E. coli, presented in SEQ ID NOS: 32 and 33, respectively. 4. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанная в (а) экспрессируемая нуклеотидная последовательность представляет собой полицистронный оперон, содержащий множество из одной или более нуклеотидных последовательностей.4. The composition according to claim 1, characterized in that the expressed nucleotide sequence indicated in (a) is a polycistronic operon containing many of one or more nucleotide sequences. 5. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанная в (а) экспрессируемая нуклеотидная последовательность кодирует тРНК.5. The composition according to claim 1, wherein the expressed nucleotide sequence indicated in (a) encodes tRNA. 6. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанная тРНК получена из одной или более тРНК Архей.6. The composition according to claim 1, characterized in that the specified tRNA obtained from one or more tRNA Archaea. 7. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанную тРНК кодирует нуклеотидная последовательность, соответствующая SEQ ID NO:1 (MjtRNA-Tyr (CUA)).7. The composition according to claim 1, characterized in that said tRNA encodes a nucleotide sequence corresponding to SEQ ID NO: 1 (MjtRNA-Tyr (CUA)). 8. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанная экспрессируемая нуклеотидная последовательность представляет собой полицистронный оперон, содержащий множество нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO:1 (MjtRNA-Tyr (CUA)).8. The composition according to claim 1, characterized in that the expressed nucleotide sequence is a polycistronic operon containing many nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1 (MjtRNA-Tyr (CUA)). 9. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанная экспрессируемая нуклеотидная последовательность содержит множество указанных полицистронных оперонов.9. The composition according to claim 1, characterized in that the expressed nucleotide sequence contains many of these polycistronic operons. 10. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанная О-РС получена из аминоацил-тРНК синтетазы Methanococcus jannaschii; предпочтительно, указанная О-РС получена из тирозил-тРНК синтетазы Methanococcus jannaschii.10. The composition according to claim 1, characterized in that the O-RS is obtained from aminoacyl-tRNA synthetase Methanococcus jannaschii; preferably, said O-RS is derived from the tyrosyl tRNA synthetase of Methanococcus jannaschii. 11. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что в указанной О-РС присутствует замена аспарагиновой кислоты на аргинин в положении 286 или в положении, аналогичном положению 286, по сравнению с аминокислотной последовательностью тирозил-тРНК синтетазы Methanococcus jannaschii дикого типа, соответствующей SEQ ID NO:2 (MjtRNA-Tyr PC дикого типа).11. The composition according to claim 1, characterized in that in said O-RS there is a substitution of aspartic acid for arginine at position 286 or at a position similar to position 286, compared with the amino acid sequence of wild-type Methanococcus jannaschii tyrosyl tRNA corresponding to SEQ ID NO: 2 (MjtRNA-Tyr PC wild-type). 12. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанный в (d) полицистронный оперон содержит множество идентичных гетерологичных полинуклеотидных линкеров.12. The composition according to claim 1, characterized in that the polycistronic operon specified in (d) contains many identical heterologous polynucleotide linkers. 13. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанный в (d) полицистронный оперон содержит множество гетерологичных полинуклеотидных линкеров, где по меньшей мере два гетерологичных полинуклеотидных линкера различаются.13. The composition according to claim 1, characterized in that the polycistronic operon specified in (d) contains many heterologous polynucleotide linkers, where at least two heterologous polynucleotide linkers are distinguished. 14. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанный в (d) полицистронный оперон содержит нуклеотид тимидин на 5′-конце, нуклеотид аденозин на 3′-конце, или одновременно нуклеотид тимидин на 5′-конце и нуклеотид аденозин на 3′-конце.14. The composition according to claim 1, characterized in that the polycistronic operon specified in (d) contains thymidine nucleotide at the 5′-end, adenosine nucleotide at the 3′-end, or thymidine nucleotide at the 5′-end and adenosine nucleotide at 3 ′ -End. 15. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанный гетерологичный полинуклеотидный линкер получен из природного полинуклеотидного линкера, расположенного между эндогенными генами тРНК Escherichia coli, выбранными из: valU и valX; ileT и alaT; serV и argV; valV и valW; glyT и thrT; metT и leuW; glnW и metU; hisR и leuT; glnU и glnW; leuP и leuV; glnV и glnX; alaW и alaX; ileU и alaU; ileV и alaV; metU и glnV; glyW и cysT; argX и hisR; и argY и argZ.15. The composition according to claim 1, characterized in that said heterologous polynucleotide linker is obtained from a natural polynucleotide linker located between the endogenous Escherichia coli tRNA genes selected from: valU and valX; ileT and alaT; serV and argV; valV and valW; glyT and thrT; metT and leuW; glnW and metU; hisR and leuT; glnU and glnW; leuP and leuV; glnV and glnX; alaW and alaX; ileU and alaU; ileV and alaV; metU and glnV; glyW and cysT; argX and hisR; and argY and argZ. 16. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанный в (d) гетерологичный полинуклеотидный линкер получен из нуклеотидной последовательности, соответствующей SEQ ID NO:14 (valU/valX линкер) или 15 (ileT/alaT линкер).16. The composition according to claim 1, characterized in that the heterologous polynucleotide linker indicated in (d) is obtained from the nucleotide sequence corresponding to SEQ ID NO: 14 (valU / valX linker) or 15 (ileT / alaT linker). 17. Клетка-хозяин, экспрессирующая О-РС и O-tRNA, которая содержит композицию по п.1 в виде одного или двух векторов.17. A host cell expressing O-PC and O-tRNA, which contains the composition according to claim 1 in the form of one or two vectors. 18. Клетка-хозяин по п.17, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой эубактериальную клетку-хозяин, которая предпочтительно представляет собой клетку Е. coli.18. A host cell according to claim 17, wherein said host cell is an eubacterial host cell, which is preferably an E. coli cell. 19. Система трансляции для экспрессии представляющего интерес полипептида, который содержит по меньшей мере одну невстречающуюся в природе аминокислоту в заданном положении, включающая:
(a) невстречающуюся в природе аминокислоту;
(b) композицию по п.1; и
(c) полинуклеотид, кодирующий указанный представляющий интерес полипептид, который содержит по меньшей мере один селекторный кодон, который распознается О-тРНК композиции, указанной в (b), причем положение указанного селекторного кодона в указанном полинуклеотиде определяет заданное положение указанной невстречающейся в природе аминокислоты в полипептиде, представляющем интерес, при экспрессии указанного полинуклеотида с получением указанного полипептида.19. A translation system for the expression of a polypeptide of interest that contains at least one non-naturally occurring amino acid at a given position, including:
(a) a non-naturally occurring amino acid;
(b) the composition according to claim 1; and
(c) a polynucleotide encoding the indicated polypeptide of interest, which contains at least one selector codon that is recognized by the O-tRNA of the composition indicated in (b), wherein the position of said selector codon in said polynucleotide determines a predetermined position of said non-naturally occurring amino acid in a polypeptide of interest in expressing said polynucleotide to obtain said polypeptide. 20. Система трансляции по п.19, отличающаяся тем, что в указанной в (b) композиции указанный ген пролин-тРНК Е. coli выбран из генов тРНК: proK, proL и proM.20. The translation system according to claim 19, characterized in that in the composition indicated in (b) the specified E. coli proline tRNA gene is selected from the tRNA genes: proK, proL and proM. 21. Система трансляции по п.19, отличающаяся тем, что в указанной в (b) композиции указанные последовательности промотора и терминатора пролин-тРНК Е.coli получены из последовательностей промотора и терминатора proK Е. coli, представленных в SEQ ID NOS:32 (промотор) и 33 (терминатор), соответственно.21. The translation system according to claim 19, characterized in that in the composition indicated in (b) the indicated E. coli promoter and proline tRNA terminator sequences are obtained from the E. coli promoter and proK terminator sequences shown in SEQ ID NOS: 32 ( promoter) and 33 (terminator), respectively. 22. Система трансляции по п.19, отличающаяся тем, что в указанной в (b) композиции указанный полицистронный оперон содержит множество идентичных гетерологичных полинуклеотидных линкеров.22. The translation system according to claim 19, characterized in that in the composition indicated in (b), said polycistronic operon contains many identical heterologous polynucleotide linkers. 23. Система трансляции по п.19, отличающаяся тем, что в указанной в (b) композиции указанный полицистронный оперон содержит множество гетерологичных полинуклеотидных линкеров, причем по меньшей мере два гетерологичных полинуклеотидных линкера различаются.23. The translation system according to claim 19, characterized in that said polycistronic operon contains a plurality of heterologous polynucleotide linkers in the composition indicated in (b), wherein at least two heterologous polynucleotide linkers are distinguished. 24. Система трансляции по п.19, отличающаяся тем, что в композиции, указанной в (b) указанный гетерологичный полинуклеотидный линкер содержит нуклеотид тимидин на 5′-конце или нуклеотид аденозин на 3′-конце или одновременно нуклеотид тимидин на 5′-конце и нуклеотид аденозин на 3′-конце.24. The translation system according to claim 19, characterized in that in the composition indicated in (b) said heterologous polynucleotide linker contains thymidine nucleotide at the 5′-end or adenosine nucleotide at the 3′-end or simultaneously thymidine nucleotide at the 5′-end and the nucleotide adenosine at the 3′-end. 25. Система трансляции по п.19, отличающаяся тем, что в указанной в (b) композиции указанный гетерологичный полинуклеотидный линкер получен из природного полинуклеотидного линкера, расположенного между эндогенными генами тРНК Escherichia coli, выбранными из: valU и valX; ileT и alaT; serV и argV; valV и valW; glyT и thrT; metT и leuW; glnW и metU; hisR и leuT; glnU и glnW; leuP и leuV; glnV и glnX; alaW и alaX; ileU и alaU; ileV и alaV; metU и glnV; glyW и cysT; argX и hisR; и argY и argZ.25. The translation system according to claim 19, characterized in that in the composition indicated in (b), said heterologous polynucleotide linker is obtained from a natural polynucleotide linker located between the endogenous Escherichia coli tRNA genes selected from: valU and valX; ileT and alaT; serV and argV; valV and valW; glyT and thrT; metT and leuW; glnW and metU; hisR and leuT; glnU and glnW; leuP and leuV; glnV and glnX; alaW and alaX; ileU and alaU; ileV and alaV; metU and glnV; glyW and cysT; argX and hisR; and argY and argZ. 26. Система трансляции по п.19, отличающаяся тем, что в указанной в (b) композиции указанный гетерологичный полинуклеотидный линкер получен из нуклеотидной последовательности, соответствующей SEQ ID NO:14 (valU/valX линкер) или 15 (ileT/alaT линкер).26. The translation system according to claim 19, characterized in that in the composition indicated in (b), said heterologous polynucleotide linker is obtained from a nucleotide sequence corresponding to SEQ ID NO: 14 (valU / valX linker) or 15 (ileT / alaT linker). 27. Система трансляции по п.19, отличающаяся тем, что в указанной в (b) композиции указанная О-тРНК получена из одной или более тРНК Архей.27. The translation system according to claim 19, characterized in that in the composition indicated in (b), said O-tRNA is derived from one or more Archaean tRNAs. 28. Система трансляции по п.19, отличающаяся тем, что в указанной в (b) композиции указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая О-тРНК, представляет собой полицистронный оперон, содержащий множество нуклеотидных последовательностей, кодирующих О-тРНК.28. The translation system according to claim 19, characterized in that in the composition indicated in (b), said nucleotide sequence encoding O-tRNA is a polycistronic operon containing a plurality of nucleotide sequences encoding O-tRNA. 29. Система трансляции по п.19, отличающаяся тем, что в указанной в (b) композиции указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая О-тРНК, содержит нуклеотидную последовательность, соответствующую SEQ ID NO:1 (MjtRNA-Tyr (CUA)).29. The translation system according to claim 19, characterized in that in the composition indicated in (b), said nucleotide sequence encoding O-tRNA contains a nucleotide sequence corresponding to SEQ ID NO: 1 (MjtRNA-Tyr (CUA)). 30. Система трансляции по п.19, отличающаяся тем, что в указанной в (b) композиции указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая О-тРНК, представляет собой полицистронный оперон, содержащий множество нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO:1 (MjtRNA-Tyr (CUA)).30. The translation system according to claim 19, characterized in that in the composition indicated in (b), said nucleotide sequence encoding O-tRNA is a polycistronic operon containing a plurality of nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1 (MjtRNA-Tyr (CUA)). 31. Система трансляции по п.19, отличающаяся тем, что в указанной в (b) композиции указанная О-РС получена из аминоацил-тРНК синтетазы Methanococcus jannaschii.31. The translation system according to claim 19, characterized in that in the composition indicated in (b), said O-RS is obtained from aminoacyl-tRNA synthetase Methanococcus jannaschii. 32. Система трансляции по п.19, отличающаяся тем, что в указанной в (b) композиции указанная О-РС получена из тирозил-тРНК синтетазы Methanococcus jannaschii.32. The translation system according to claim 19, characterized in that in the composition indicated in (b), said O-RS is obtained from tyrosyl tRNA synthetase Methanococcus jannaschii. 33. Система трансляции по п.19, отличающаяся тем, что в указанной в (b) композиции в указанной О-РС присутствует замена аспарагиновой кислоты на аргинин в положении 286 или в положении, аналогичном положению 286, по сравнению с аминокислотной последовательностью тирозил-тРНК синтетазы Methanococcus jannaschii дикого типа, соответствующей SEQ ID NO:2 (Mj-tRNA-Tyr PC дикого типа).33. The translation system according to claim 19, characterized in that in the composition indicated in (b) in said O-RS there is a substitution of aspartic acid for arginine at position 286 or at a position similar to position 286, compared to the amino acid sequence of tyrosyl tRNA wild-type Methanococcus jannaschii synthetases corresponding to SEQ ID NO: 2 (Mj-tRNA-Tyr PC wild-type). 34. Система трансляции по п.19, включающая клетку-хозяина, содержащую (a), (b), (c1) и (с2) композиции, указанной в п.1.34. The translation system according to claim 19, including the host cell containing (a), (b), (c1) and (c2) of the composition specified in claim 1. 35. Система трансляции по п.34, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой эубактериальную клетку-хозяина, предпочтительно, указанная клетка-хозяин представляет собой клетку Е.coli.35. The translation system according to clause 34, wherein said host cell is an eubacterial host cell, preferably said host cell is an E. coli cell. 36. Способ получения в клетке-хозяине представляющего интерес полипептида, содержащего в заданном положении невстречающуюся в природе аминокислоту, включающий:
(a) обеспечение
(i) невстречающейся в природе аминокислоты;
(ii) композиции по п.1; и
(iii) полинуклеотида, кодирующего указанный представляющий интерес полипептид, который содержит по меньшей мере один селекторный кодон, который распознается указанной О-тРНК, причем положение селекторного кодона соответствует заданному положению указанной невстречающейся в природе аминокислоты в указанном представляющем интерес полипептиде;
(iv) клетки-хозяина, которая содержит (i), (ii) и (iii);
(b) культивирование указанной клетки-хозяина; и
(c) включение указанной невстречающейся в природе аминокислоты в заданное положение указанного полипептида в ходе трансляции указанного полипептида в указанной клетке-хозяина с получением, таким образом, указанного представляющего интерес полипептида, содержащего указанную невстречающуюся в природе аминокислоту в заданном положении.36. The method of obtaining in the host cell of interest polypeptide containing in a given position non-naturally occurring amino acid, including:
(a) collateral
(i) non-naturally occurring amino acids;
(ii) the composition according to claim 1; and
(iii) a polynucleotide encoding said polypeptide of interest, which contains at least one selector codon that is recognized by said O-tRNA, wherein the position of the selector codon corresponds to a predetermined position of said non-naturally occurring amino acid in said polypeptide of interest;
(iv) a host cell that contains (i), (ii) and (iii);
(b) culturing said host cell; and
(c) incorporating said non-naturally occurring amino acid at a predetermined position of said polypeptide during translation of said polypeptide in said host cell, thereby obtaining said polypeptide of interest containing said non-naturally occurring amino acid at a predetermined position. 37. Способ по п.36, отличающийся тем, что указанное обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты в композиции, указанной в (ii), включает обеспечение нуклеотидной последовательности, кодирующей О-тРНК, полученную из одной или более тРНК Архей.37. The method according to clause 36, wherein said providing nucleic acid constructs in the composition specified in (ii) includes providing a nucleotide sequence encoding O-tRNA derived from one or more Archaean tRNAs. 38. Способ по п.36, отличающийся тем, что указанное обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты в композиции, указанной в (ii), включает обеспечение полицистронного оперона, который содержит множество нуклеотидных последовательностей, кодирующих одну или более разновидностей О-тРНК.38. The method according to clause 36, wherein said providing a nucleic acid construct in a composition indicated in (ii) comprises providing a polycistronic operon that contains a plurality of nucleotide sequences encoding one or more varieties of O-tRNA. 39. Способ по п.36, отличающийся тем, что указанное обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты в композиции, указанной в (ii), включает обеспечение нуклеотидной последовательности, кодирующей О-тРНК, содержащей нуклеотидную последовательность, соответствующую SEQ ID NO:1 (MjtRNA-Tyr (CUA).39. The method according to clause 36, wherein said providing a nucleic acid construct in a composition indicated in (ii) comprises providing a nucleotide sequence encoding O-tRNA containing a nucleotide sequence corresponding to SEQ ID NO: 1 (MjtRNA-Tyr (CUA). 40. Способ по п.36, отличающийся тем, что указанное обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты в композиции, указанной в (ii), включает обеспечение полицистронного оперона, содержащего множество нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO:1 (MjtRNA-Tyr (CUA)).40. The method according to clause 36, wherein said providing a nucleic acid construct in a composition specified in (ii) comprises providing a polycistronic operon containing a plurality of nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1 (MjtRNA-Tyr (CUA) ) 41. Способ по п.36, отличающийся тем, что указанное обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты в композиции, указанной в (ii), включает обеспечение нуклеотидной последовательности, кодирующей О-РС, полученную из аминоацил-тРНК синтетазы Methanococcus jannaschii.41. The method according to clause 36, wherein said providing a nucleic acid construct in a composition indicated in (ii) comprises providing a nucleotide sequence encoding O-RS derived from aminoancyl-tRNA synthetase of Methanococcus jannaschii. 42. Способ по п.36, отличающийся тем, что указанное обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты в композиции, указанной в (ii), включает обеспечение нуклеотидной последовательности, кодирующей О-РС, полученную из тирозил-тРНК синтетазы Methanococcus jannaschii.42. The method according to clause 36, wherein said providing a nucleic acid construct in a composition indicated in (ii) comprises providing a nucleotide sequence encoding O-RS derived from Methanococcus jannaschii tyrosyl tRNA synthetase. 43. Способ по п.36, отличающийся тем, что указанное обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты в композиции, указанной в (ii), включает обеспечение нуклеотидной последовательности, кодирующей О-РС, которая содержит замену аспарагиновой кислоты на аргинин в положении 286 или в положении, аналогичном положению 286, по сравнению с аминокислотной последовательностью тирозил-тРНК синтетазы Methanococcus jannaschii дикого типа, соответствующей SEQ ID NO:2 (Mj-tRNA-Tyr PC дикого типа).43. The method according to clause 36, wherein said providing nucleic acid constructs in the composition specified in (ii) includes providing a nucleotide sequence encoding O-RS, which comprises replacing aspartic acid with arginine at position 286 or position similar to position 286, compared with the amino acid sequence of the tyrosyl tRNA synthetase of wild-type Methanococcus jannaschii corresponding to SEQ ID NO: 2 (wild-type Mj-tRNA-Tyr PC). 44. Способ по п.36, отличающийся тем, что указанное обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты в композиции, указанной в (ii), включает обеспечение нуклеотидной последовательности, соответствующей последовательностям промотора и терминатора пролин-тРНК Escherichia coli, выбранной из тРНК Е.coli: proK, proL and proM tRNA.44. The method according to clause 36, wherein said providing nucleic acid constructs in the composition specified in (ii) includes providing a nucleotide sequence corresponding to the sequences of the promoter and terminator of the proline-tRNA of Escherichia coli selected from E. coli tRNA: proK , proL and proM tRNA. 45. Способ по п.36, отличающийся тем, что указанное обеспечение, конструкции нуклеиновой кислоты в композиции, указанной в (ii), включает обеспечение нуклеотидной последовательности, соответствующей последовательностям промотора и терминатора пролин- тРНК Escherichia coli, которые содержат последовательности промотора и терминатора proK E.coli, соответствующие SEQ ID NO:32 (промотор) и SEQ ID NO:33 (терминатор), соответственно.45. The method according to clause 36, wherein said provision of nucleic acid constructs in the composition indicated in (ii) comprises providing a nucleotide sequence corresponding to the sequences of the promoter and Escherichia coli proline tRNA terminator that contain the promoter and proK terminator sequences E. coli corresponding to SEQ ID NO: 32 (promoter) and SEQ ID NO: 33 (terminator), respectively. 46. Способ по п.36, отличающийся тем, что указанное обеспечение полицистронного оперона в композиции, указанной в (ii), включает обеспечение множества идентичных гетерологичных полинуклеотидных линкеров.46. The method according to clause 36, wherein said providing a polycistronic operon in the composition specified in (ii) comprises providing a plurality of identical heterologous polynucleotide linkers. 47. Способ по п.36, отличающийся тем, что указанное обеспечение полицистронного оперона в композиции, указанной в (ii), включает обеспечение множества гетерологичных полинуклеотидных линкеров, причем по меньшей мере два указанных гетерологичных полинуклеотидных линкера различаются.47. The method according to clause 36, wherein said providing a polycistronic operon in the composition specified in (ii) comprises providing a plurality of heterologous polynucleotide linkers, wherein at least two of said heterologous polynucleotide linkers are different. 48. Способ по п.36, отличающийся тем, что указанное обеспечение полицистронного оперона в композиции, указанной в (ii), включает обеспечение гетерологичного полинуклеотидного линкера, содержащего нуклеотид тимидин на 5′-конце, нуклеотид аденозин на 3′-конце или одновременно нуклеотид тимидин на 5′-конце и нуклеотид аденозин на 3′-конце.48. The method according to clause 36, wherein said providing a polycistronic operon in the composition specified in (ii) includes providing a heterologous polynucleotide linker containing thymidine nucleotide at the 5′-end, adenosine nucleotide at the 3′-end, or simultaneously a nucleotide thymidine at the 5′-end and nucleotide adenosine at the 3′-end. 49. Способ по п.36, отличающийся тем, что указанное обеспечение полицистронного оперона в композиции, указанной в (ii), включает обеспечение гетерологичного полинуклеотидного линкера, полученного из природного полинуклеотидного линкера, расположенного между эндогенными генами тРНК Escherichia coli, выбранными из: valU и valX; ileT и alaT; serV и argV; valV и valW; glyT и thrT; metT и leuW; glnW и metU; hisR и leuT; glnU и glnW; leuP и leuV; glnV и glnX; alaW и alaX; ileU и alaU; ileV и alaV; metU и glnV; glyW и cysT; argX и hisR; и argY и argZ.49. The method according to clause 36, wherein said providing a polycistronic operon in the composition specified in (ii) includes providing a heterologous polynucleotide linker derived from a natural polynucleotide linker located between endogenous Escherichia coli tRNA genes selected from: valU and valX; ileT and alaT; serV and argV; valV and valW; glyT and thrT; metT and leuW; glnW and metU; hisR and leuT; glnU and glnW; leuP and leuV; glnV and glnX; alaW and alaX; ileU and alaU; ileV and alaV; metU and glnV; glyW and cysT; argX and hisR; and argY and argZ. 50. Способ по n. 36, отличающийся тем, что указанное обеспечение полицистронного оперона в композиции, указанной в (и), включает обеспечение гетерологичного полинуклеотидного линкера, полученного из нуклеотидной последовательности, соответствующей SEQ ID NO:14 (valU/valX линкер) или SEQ ID NO:15 (ileT/alaT линкер).50. The method according to n. 36, wherein said providing a polycistronic operon in the composition specified in (s) includes providing a heterologous polynucleotide linker derived from a nucleotide sequence corresponding to SEQ ID NO: 14 (valU / valX linker) or SEQ ID NO: 15 (ileT / alaT linker). 51. Способ по п.36, отличающийся тем, что указанное обеспечение клетки-хозяина включает обеспечение эубактериальной клетки-хозяина, предпочтительно, указанное обеспечение клетки-хозяина включает обеспечение клетки-хозяина Escherichia coli.51. The method according to clause 36, wherein said providing a host cell includes providing an eubacterial host cell, preferably said providing a host cell includes providing a host cell of Escherichia coli. 52. Способ получения системы трансляции для экспрессии представляющего интерес полипептида, который в заданном положении содержит по меньшей мере одну невстречающуюся в природе аминокислоту, включающий обеспечение:
(a) невстречающейся в природе аминокислоты;
(b) композиции по п.1; и
(c) полинуклеотида, кодирующего указанный представляющий интерес полипептид, который содержит по меньшей мере один селекторный кодон, который распознается указанной О-тРНК, причем положение указанного селекторного кодона в указанном полинуклеотиде определяет указанное заданное положение указанной невстречающейся в природе аминокислоты в указанном представляющем интерес полипептиде при экспрессии указанного полинуклеотида с образованием полипептида.52. A method of obtaining a translation system for the expression of a polypeptide of interest, which at a given position contains at least one non-naturally occurring amino acid, comprising:
(a) non-naturally occurring amino acids;
(b) the composition according to claim 1; and
(c) a polynucleotide encoding said polypeptide of interest that contains at least one selector codon that is recognized by said O-tRNA, wherein the position of said selector codon in said polynucleotide determines said specified position of said non-naturally occurring amino acid in said polypeptide of interest when expressing said polynucleotide to form a polypeptide. 53. Способ по п.52, согласно которому обеспечивают клетку-хозяина, которая содержит (а), (b) и (с).53. The method according to paragraph 52, according to which provide a host cell, which contains (a), (b) and (c). 54. Способ получения представляющего интерес полипептида, который в заданном положении содержит невстречающуюся в природе аминокислоту, включающий:
(а) обеспечение системы трансляции, включающей
(i) невстречающуюся в природе аминокислоту;
(ii) композицию по п.1;
(iii) полинуклеотид, кодирующий указанный представляющий интерес полипептид, который содержит по меньшей мере один селекторный кодон, который распознается указанной О-тРНК, причем положение указанного селекторного кодона соответствует указанному заданному положению указанной невстречающейся в природе аминокислоты в указанном представляющем интерес полипептиде;
(iv) клетку-хозяина, содержащую (i), (ii) и (iii);
(b) культивирование указанной клетки-хозяина; и
(c) включение указанной невстречающейся в природе аминокислоты в указанное заданное положение указанного полипептида в ходе трансляции указанного полипептида в указанной клетке-хозяина с получением, таким образом, указанного представляющего интерес полипептида, содержащего указанную невстречающуюся в природе аминокислоту в указанном заданном положении. 54. A method of obtaining a polypeptide of interest, which in a predetermined position contains non-naturally occurring amino acid, including:
(a) providing a broadcast system including
(i) a non-naturally occurring amino acid;
(ii) the composition according to claim 1;
(iii) a polynucleotide encoding said polypeptide of interest that contains at least one selector codon that is recognized by said O-tRNA, wherein the position of said selector codon corresponds to said specified position of said non-naturally occurring amino acid in said polypeptide of interest;
(iv) a host cell containing (i), (ii) and (iii);
(b) culturing said host cell; and
(c) incorporating said non-naturally occurring amino acid at said predetermined position of said polypeptide during translation of said polypeptide in said host cell, thereby obtaining said polypeptide of interest containing said non-naturally occurring amino acid at said predetermined position.
RU2008133028/10A 2006-03-09 2007-03-07 System for expression of orthogonal translation components in eubacterial host cell RU2467069C2 (en)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US78097306P 2006-03-09 2006-03-09
US60/780,973 2006-03-09
US78349706P 2006-03-17 2006-03-17
US60/783,497 2006-03-17
US60/855,336 2006-10-29

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2008133028A RU2008133028A (en) 2010-04-20
RU2467069C2 true RU2467069C2 (en) 2012-11-20

Family

ID=46274785

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2008133028/10A RU2467069C2 (en) 2006-03-09 2007-03-07 System for expression of orthogonal translation components in eubacterial host cell

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2467069C2 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2704981C2 (en) * 2013-07-10 2019-11-01 Президент Энд Фэллоуз Оф Харвард Коллидж ORTHOGONAL PROTEINS Cas9 FOR RNA-DIRECTED REGULATION AND EDITING OF GENES

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050272121A1 (en) * 2004-05-25 2005-12-08 The Scripps Research Institute Site specific incorporation of heavy atom-containing unnatural amino acids into proteins for structure determination

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050272121A1 (en) * 2004-05-25 2005-12-08 The Scripps Research Institute Site specific incorporation of heavy atom-containing unnatural amino acids into proteins for structure determination

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HSU L. et al. Bacteriol J. 158(3), 934-942, 1984. *
WANG L. et al. Chemistry and Biology, 8, 883-890, 2001. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2704981C2 (en) * 2013-07-10 2019-11-01 Президент Энд Фэллоуз Оф Харвард Коллидж ORTHOGONAL PROTEINS Cas9 FOR RNA-DIRECTED REGULATION AND EDITING OF GENES

Also Published As

Publication number Publication date
RU2008133028A (en) 2010-04-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2009529328A5 (en)
Armbruster et al. The Arabidopsis thylakoid protein PAM68 is required for efficient D1 biogenesis and photosystem II assembly
US7083970B2 (en) Methods and compositions for the production of orthogonal tRNA-aminoacyl tRNA synthetase pairs
KR102022662B1 (en) Recombinant vector for expressing target protein
Lee et al. Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells
WO2006019876A2 (en) Production of fusion proteins by cell-free protein synthesis
RU2008135114A (en) GENETICALLY PROGRAMMED EXPRESSION OF PROTEINS CONTAINING ANNO ACCESSING PHENYLSELENOCYSTEIN AMINO ACID IN NATURE
JP2009529877A5 (en)
RU2473690C2 (en) Genetic coded fluorescent coumarinic amino acids
JP2010504096A5 (en)
US20240209039A1 (en) Novel polypeptide exhibiting fluorescent properties and use for same
Eichmann et al. Selection of high producers from combinatorial libraries for the production of recombinant proteins in Escherichia coli and Vibrio natriegens
CN113699124B (en) Preparation method of protein containing non-natural amino acid
JP2009538136A5 (en)
AU2021222340A1 (en) Archaeal pyrrolysyl tRNA synthetases for orthogonal use
WO2010114615A2 (en) A facile system for encoding unnatural amino acids in mammalian cells
RU2467069C2 (en) System for expression of orthogonal translation components in eubacterial host cell
US20100035300A1 (en) Producing a Target Protein Using Intramolecular Cleavage by TEV Protease
ES2254044T1 (en) FLUORESCENT PROTEINS OF THE COPEPODA SPECIES AND METHODS FOR USE.
JP2011211983A (en) Protein molecule pair, gene encoding protein molecule pair, and cell producing gene transfer vector and protein molecule pair
US9321816B2 (en) Expression systems and methods of producing spider silk proteins
CN110551193B (en) Novel tag protein for protein enrichment expression and intracellular localization and application thereof
US10465220B2 (en) Expression process
Williams et al. Recombinant glycoprotein production in the slime mould Dictyostelium discoideum
WO2010001414A1 (en) Expression of heterologous proteins in bacterial system using a gm-csf fusion tag

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20140308