RU2465601C2 - Method for evaluation of natural autoantibody level in human biological fluids - Google Patents
Method for evaluation of natural autoantibody level in human biological fluids Download PDFInfo
- Publication number
- RU2465601C2 RU2465601C2 RU2010117620/15A RU2010117620A RU2465601C2 RU 2465601 C2 RU2465601 C2 RU 2465601C2 RU 2010117620/15 A RU2010117620/15 A RU 2010117620/15A RU 2010117620 A RU2010117620 A RU 2010117620A RU 2465601 C2 RU2465601 C2 RU 2465601C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- solid phase
- physical sorption
- natural autoantibodies
- antigen
- natural
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторной диагностике, и может быть использовано для повышения эффективности и достоверности количественного определения концентрации естественных аутоантител в биологических жидкостях человека.The invention relates to medicine, in particular to laboratory diagnostics, and can be used to increase the efficiency and reliability of quantitative determination of the concentration of natural autoantibodies in human biological fluids.
Из уровня техники известен способ количественного определения уровня аутоантител к эндогенным белкам в биологических жидкостях человека путем твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) (RU 2137134 C1, G01N 33/53, 1999). Однако данный способ мало пригоден для количественного определения уровня естественных аутоантител в биологических жидкостях человека.The prior art method for the quantitative determination of the level of autoantibodies to endogenous proteins in human biological fluids by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (EN 2137134 C1, G01N 33/53, 1999). However, this method is not suitable for the quantitative determination of the level of natural autoantibodies in human biological fluids.
Известен также способ проведения иммуноферментного анализа, включающий адсорбцию антигенов на твердой фазе физической сорбции, инкубацию тестируемых биологических образцов, инкубацию конъюгатсодержащего раствора, спектрофотометрический анализ реакции по экстинции раствора хромагента (RU 2014610 C1, G01N 33/535, 1994).There is also a method for enzyme-linked immunosorbent assay, including adsorption of antigens on the solid phase of physical sorption, incubation of test biological samples, incubation of a conjugate-containing solution, spectrophotometric analysis of the reaction of extinction of a chromagent solution (RU 2014610 C1, G01N 33/535, 1994).
Кроме того, также известен способ проведения иммуноферментного анализа для определения уровня естественных аутоантител, включающий адсорбцию антигенов на твердой фазе физической сорбции, инкубацию тестируемых биологических образцов, инкубацию конъюгатсодержащего раствора и спектрофотометрический анализ реакции по экстинции раствора хромагента (BMS217TEN Human anti-IFN-alpha ELISA, Bender MedSystems GmbH, Австрия). Несмотря на достаточную простоту, чувствительность и специфичность данного решения полученные результаты могут быть ложноположительными, из-за неспецифического и низкоаффинного связывания различных иммуноглобулинов сыворотки или плазмы с антигеном, адсорбированным на ИФА планшете. Кроме того, присутствие в крови полиреактивных иммуноглобулинов, не являющихся естественными антителами, также приводит к получению ложноположительных результатов из-за неспецифического связывания полиреактивных иммуноглобулинов с компонентами ИФА планшета. Боле того, в ИФА детектируется только фракция свободных естественных аутоантител, в то время как большая часть естественных аутоантител присутствуют в крови в связанном со своим антигеном комплексе.In addition, an enzyme-linked immunosorbent assay is also known to determine the level of natural autoantibodies, including adsorption of antigens on a solid phase of physical sorption, incubation of test biological samples, incubation of a conjugate-containing solution, and spectrophotometric analysis of the extinction reaction of a chromagent solution (BMS217TEN Human anti-IFN-alpha ELISA, Bender MedSystems GmbH, Austria). Despite the sufficient simplicity, sensitivity and specificity of this solution, the results obtained can be false positive, due to the non-specific and low-affinity binding of various serum or plasma immunoglobulins to the antigen adsorbed on the ELISA plate. In addition, the presence in the blood of polyreactive immunoglobulins, which are not natural antibodies, also leads to false positive results due to the non-specific binding of polyreactive immunoglobulins to the ELISA components of the tablet. Moreover, only a fraction of free natural autoantibodies is detected in ELISA, while most of the natural autoantibodies are present in the blood in a complex associated with its antigen.
Изобретение направлено на создание технологически простого, чувствительного и специфического способа количественного определения уровня естественных аутоантител в биологических жидкостях человека ИФА методом.The invention is aimed at creating a technologically simple, sensitive and specific method for the quantitative determination of the level of natural autoantibodies in human biological fluids by the ELISA method.
Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что в способе количественного определения уровня естественных аутоантител в биологических жидкостях человека путем иммуноферментного анализа, включающем обработку твердой фазы физической сорбции антигеном, внесение тестируемых биологических образцов, обработку твердой фазы конъюгатсодержащим раствором, разделение твердой и жидкой фаз и спектрофотометрический анализ реакции по экстинции раствора хромагента, согласно изобретению, в качестве твердой фазы физической сорбции используют твердую фазу физической сорбции, покрытую стрептавидином, а обработку твердой фазы физической сорбции производят предварительно биотинилированным антигеном и блокирующим агентом для закрытия на твердой фазе физической сорбции мест неспецифического связывания, в качестве которого используют биотинилированные по стандартной процедуре белки, в качестве конъюгатсодержащего раствора используют моноклональные или поликлональные антитела, меченные ферментом, реагирующие с одним или всеми изотипами человеческих иммуноглобулинов, при этом тестируемую биологическую жидкость предварительно разводят в буфере, содержащем белки, используемые для закрытия на твердой фазе физической сорбции мест неспецифического связывания, а также вещества, защищающие естественные аутоантитела от разрушения при термической обработке, подвергают биологическую жидкость воздействию железосодержащим окислителем и производят термическую обработку, для каждого тестируемого образца биологической жидкости применяют биотинирилованный контрольный белок (идентичные белку, используемому для закрытия на твердой фазе физической сорбции мест неспецифического связывания) для связывания со стрептавидином твердой фазы, а количество естественных аутоантител определяют с использованием калибровочной кривой, которая стандартизуется по моноклональным или поликлональным антителам к антигену.The solution of this problem is ensured by the fact that in a method for quantitatively determining the level of natural autoantibodies in human biological fluids by enzyme immunoassay, which includes treating the solid phase of physical sorption with an antigen, introducing test biological samples, treating the solid phase with a conjugate-containing solution, separating solid and liquid phases and spectrophotometric analysis of the reaction for extinction of a chromagent solution according to the invention, I use the solid phase of physical sorption as the solid phase of physical sorption coated with streptavidin, and the treatment of the solid phase of physical sorption is performed with a pre-biotinylated antigen and a blocking agent to close non-specific binding sites on the solid phase of physical sorption, using proteins biotinylated according to the standard procedure, using monoclonal or conjugate-containing solution enzyme-labeled polyclonal antibodies that react with one or all isotypes of human immunoglobulins when This test biological fluid is pre-diluted in a buffer containing proteins used to close non-specific binding sites on the solid phase of physical sorption, as well as substances that protect natural autoantibodies from degradation during heat treatment, expose the biological fluid to an iron-containing oxidizing agent and heat treatment for each The test sample of the biological fluid uses a biotinylated control protein (identical to the protein used for closing the solid state physical sorption beds nonspecific binding) for binding to streptavidin solid phase and the amount of natural autoantibodies is determined using a calibration curve which is standardized by monoclonal or polyclonal antibodies to the antigen.
Благодаря сочетанию использования в качестве твердой фазы физической сорбции твердой фазы физической сорбции, покрытой стрептавидином, и биотинилированных антигенов, у иммобилизированного антигена все эпитопы остаются свободными для связывания с ними естественных аутоантител, и тем самым повышается чувствительность заявленного способа, в то время как прямая иммобилизация антигена приводит к конформационным изменениям и разрушению эпитопов антигена, что снижает чувствительность ИФА метода. Кроме того, использование антител, меченных ферментом и реагирующих с одним или всеми изотипами человеческих иммуноглобулинов, позволяет определить уровень определенного изотипа или всех изотипов естественных аутоантител, и соответственно, расширяет функциональные возможности заявленного способа. Предварительное разведение исследуемого образца в буфере, содержащем белки, присутствующие в блокирующем буфере и используемые для закрытия на твердой фазе физической сорбции мест неспецифического связывания, минимизирует возможность неспецифического связывания антител исследуемого образца с твердой фазой, на которой иммобилизированы белки, что также повышает специфичность заявленного способа. Добавление железосодержащего окислителя и проведение термической обработки исследуемого образца позволяет разрушить комплекс естественных аутоантител с антигенами и анти-идиотипическими антителами, или обеспечивать доступность паратопов антител эпитопам антигенов за счет различных демаскирующих эффектов, а предварительное разведение исследуемого образца в буфере защищает естественные аутоантитела от разрушения при термической обработке, что позволяет определить общий уровень естественных аутоантител (то есть как свободную и связанную с антигеном формы естественных аутоантител или естественных аутоантител с закрытыми паратопами), и тем самым снижает возможность получения ложноотрицательных результатов, повышает чувствительность, эффективность и функциональные возможности заявленного способа. Использование для каждого из исследуемых образцов биологической жидкости индивидуальной контрольной твердой фазы физической сорбции, на которой иммобилизирован биотинилированный блокирующий белок, позволяет измерить специфический для естественных аутоантител спектрофотометрический сигнал и не специфический спектрофотометрический сигнал, что также снижает возможность получения ложноположительных результатов и повышает чувствительность заявленного способа.Due to the combination of the use of the solid phase of the physical sorption coated with streptavidin and biotinylated antigens as a solid phase of physical sorption, all epitopes remain free for binding of natural autoantibodies to them in an immobilized antigen, thereby increasing the sensitivity of the claimed method, while direct immobilization of the antigen leads to conformational changes and destruction of antigen epitopes, which reduces the sensitivity of the ELISA method. In addition, the use of antibodies labeled with an enzyme and reacting with one or all isotypes of human immunoglobulins, allows you to determine the level of a particular isotype or all isotypes of natural autoantibodies, and, accordingly, expands the functionality of the claimed method. Pre-dilution of the test sample in a buffer containing proteins that are present in the blocking buffer and used to close the sites of non-specific binding on the solid phase of physical sorption minimizes the possibility of non-specific binding of the antibodies of the test sample to the solid phase on which the proteins are immobilized, which also increases the specificity of the claimed method. The addition of an iron-containing oxidizing agent and thermal treatment of the test sample allows to destroy the complex of natural autoantibodies with antigens and anti-idiotypic antibodies, or to ensure the availability of antibody paratopes to epitopes of antigens due to various unmasking effects, and preliminary dilution of the test sample in the buffer protects the natural autoantibodies from destruction during thermal processing , which allows us to determine the overall level of natural autoantibodies (i.e., as free and yazannuyu antigen forms of natural autoantibodies or natural autoantibodies closed paratope), and thereby reduces the possibility of false negative results, increases the sensitivity, efficiency and functionality of the claimed method. The use of an individual control solid phase of physical sorption for each of the studied biological fluid samples on which the biotinylated blocking protein is immobilized allows the measurement of a spectrophotometric signal specific for natural autoantibodies and a non-specific spectrophotometric signal, which also reduces the possibility of obtaining false-positive results and increases the sensitivity of the claimed method.
Кроме того, заявленная совокупность существенных признаков, которая обеспечивает возможность количественного определения уровня естественных аутоантител, расширяет арсенал технических средств для решения поставленной задачи.In addition, the claimed combination of essential features, which provides the ability to quantify the level of natural autoantibodies, expands the arsenal of technical means to solve the problem.
Заявленный способ количественного определения уровня естественных аутоантител в биологических жидкостях человека реализуют следующим образом.The claimed method for quantitative determination of the level of natural autoantibodies in human biological fluids is implemented as follows.
Твердую фазу физической сорбции (лунки) стандартного луночного планшета покрывают стрептавидином или его аналогами (например, авидином и др.), блокируют твердую фазу физической сорбции блокирующим агентом и инкубируют с биотинилированным антигеном (для определения антиген специфических антител), к которому необходимо определить уровень естественных аутоантител, или (для контрольных лунок) с биотинилированным блокирующим белком (например, бычьим сывороточным альбумином, овальбумином, человеческим сывороточным альбумином, кроличьим сывороточным альбумином, желатином и др.), являющимся контролем неспецифического связывания. Антиген биотинилируется минимальным количеством биотина (молярное отношение антиген: биотин составляет 1:2) для минимизации разрушения эпитопов.The solid phase of physical sorption (wells) of a standard well plate is coated with streptavidin or its analogues (for example, avidin, etc.), the solid phase of physical sorption is blocked with a blocking agent and incubated with biotinylated antigen (to determine the antigen of specific antibodies), to which the level of natural autoantibodies, or (for control wells) with a biotinylated blocking protein (e.g. bovine serum albumin, ovalbumin, human serum albumin, rabbit cheese collar albumin, gelatin, etc.), which is a control of non-specific binding. The antigen is biotinylated with a minimum amount of biotin (antigen: biotin molar ratio is 1: 2) to minimize the destruction of epitopes.
Подготавливают для анализа исследуемую биологическую жидкость (например, сыворотка крови, плазма крови и др.), при этом тестируемые образцы разводят (в диапазоне от 50 до 200000 раз) в буферном растворе, содержащем белки, входящие в состав блокирующего буфера (например, бычий сывороточный альбумин, овальбумин, человеческий сывороточный альбумин, кроличий сывороточный альбумин, желатин и др.), консерванты (например, тимерозал и др.) и поверхностно-активные вещества (например, Triton-X100 и др.), которые защищают естественные аутоантитела от разрушения при термической обработке, обрабатывают железосодержащим окислителем (например, хлорид железа (III) [FeCl3] и производят термическую обработку полученного раствора биологической жидкости путем инкубации в температурном диапазоне от 50°С до 80°С. Затем обработанный железосодержащим окислителем и термически обработанный раствор исследуемой биологической жидкости вносят в лунки также, как и антиген - специфические антитела, используемые для построения калибровочной кривой, в качестве которых используют моноклональные или поликлональные антитела к антигену с известной концентрацией. Для проявления образовавшегося иммунного комплекса (антиген - естественные аутоантитела) используют конъюгат поликлональных или моноклональных антител (например, козьи поликлональные антитела, овечьи поликлональные антитела, мышиные моноклональные антитела и др.) к легким цепям определенного или всех иммуноглобулинов человека с ферментом (например, щелочной фосфатазой, пероксидазой хрена и др.). Определяют количество естественных аутоантител, учитывая реакцию по экстинции раствора хромагента, изменяющего свою окраску в зависимости от количества хромагента, выделенного из субстрата при разложении его ферментом (например, щелочной фосфатазой и др.) - субстрат продуцирует растворимый продукт, цветовые характеристики которого могут быть измерены спектрофотометрически при определенной длине волны.A test biological fluid is prepared for analysis (for example, blood serum, blood plasma, etc.), while the test samples are diluted (in the range from 50 to 200,000 times) in a buffer solution containing proteins that are part of the blocking buffer (for example, bovine serum albumin, ovalbumin, human serum albumin, rabbit serum albumin, gelatin, etc.), preservatives (e.g. thimerosal, etc.) and surfactants (e.g. Triton-X100, etc.) that protect natural autoantibodies from destruction When heat treated, treated with iron-containing oxidant (e.g., iron chloride (III) [FeCl 3] and produce heat treatment of the resulting solution of biological fluid by incubation in a temperature range from 50 ° C to 80 ° C. The treated iron-oxidizing and thermally treated solution was investigated biological fluid is introduced into the wells as well as antigen-specific antibodies used to construct a calibration curve, which are used as monoclonal or polyclonal itel to an antigen with a known concentration. For the manifestation of the formed immune complex (antigen - natural autoantibodies), a conjugate of polyclonal or monoclonal antibodies (for example, goat polyclonal antibodies, sheep polyclonal antibodies, mouse monoclonal antibodies, etc.) to the light chains of a certain or all human immunoglobulins with an enzyme (for example, alkaline phosphatase) is used , horseradish peroxidase, etc.). The amount of natural autoantibodies is determined, taking into account the extinction reaction of the chromagent solution, which changes color depending on the amount of chromagent isolated from the substrate when it is decomposed by an enzyme (for example, alkaline phosphatase, etc.) - the substrate produces a soluble product, the color characteristics of which can be measured spectrophotometrically at a specific wavelength.
Пример 1.Example 1
Для подтверждения возможности получения технического результата при осуществлении заявленного способа количественного определения уровня естественных аутоантител к интерферону гамма человека были взяты образцы сыворотки двадцати здоровых доноров, у которых не проводилась интерферонотерапия, и следовательно, в сыворотке отсутствуют аутоантитела к интерферону гамма человека, но присутствуют естественные аутоантитела к интерферону гамма человека,To confirm the feasibility of obtaining a technical result in the implementation of the claimed method for quantitative determination of the level of natural autoantibodies to human gamma interferon, serum samples of twenty healthy donors who did not receive interferon therapy were taken, and therefore, serum autoantibodies to human gamma interferon are absent, but natural autoantibodies to human gamma interferon,
В часть лунок 96 луночного планшета, покрытого стрептавидином, компании Greiner bio-one GmbH (кат. №655990) вносили рекомбинантный интерферон гамма человека производства eBiosciences (кат. №.34-8319-85) и в другую часть (контрольные лунки для исследуемых образцов) - бычий сывороточный альбумин производства Sigma Aldrich (кат. №. А-3803), биотинилированные по стандартной процедуре компании U-CyTech bioscience (СОП № UCT-127) из расчета 100 мкл/лунка и инкубировали в течение 2 часов при температуре 37°С и при 100% влажности.Greiner bio-one GmbH (Cat. No. 655990) was introduced into a portion of the wells of a 96 well plate coated with streptavidin (Cat. No. 655990) with recombinant human gamma manufactured by eBiosciences (Cat. No. 34-8319-85) and into another part (control wells for the test samples) ) - bovine serum albumin manufactured by Sigma Aldrich (cat. no. A-3803), biotinylated according to the standard procedure of U-CyTech bioscience (SOP No. UCT-127) at the rate of 100 μl / well and incubated for 2 hours at 37 ° C and at 100% humidity.
Образцы сыворотки крови разводили в 10 раз (10 мкл сыворотки разводили в 90 мкл фосфатно-солевого буфера, содержащего 1% Triton-Х100 и 0,002% тимерозал), обрабатывали 2 мМ FeCl3 и инкубировали в течение 40 минут при температуре 56°С.Serum samples were diluted 10 times (10 μl of serum was diluted in 90 μl of phosphate-buffered saline containing 1% Triton-X100 and 0.002% thimerosal), treated with 2 mM FeCl 3 and incubated for 40 minutes at 56 ° C.
Затем проинкубированный раствор еще разводили в 5 раз (100 мкл проинкубированного раствора разводили в 400 мкл фосфатно-солевого буфера, содержащего 1% бычий сывороточный альбумин (БСА), 1% Triton-X100 и 0,002% тимерозал) и в дальнейшем использовали для внесения в лунки планшета (по 100 мкл в лунку).Then, the incubated solution was further diluted 5 times (100 μl of the incubated solution was diluted in 400 μl of phosphate-buffered saline containing 1% bovine serum albumin (BSA), 1% Triton-X100 and 0.002% thimerosal) and were subsequently used for adding to the wells tablet (100 μl per well).
Для построения калибровочной кривой приготавливали растворы стандартных антител (мышиные моноклональные антитела к интерферону гамма человека, клон MD-2) в диапазоне концентраций от 16 Ед/мл до 0,5 Ед/мл. За 1 Ед/мл принимали 100 пкг/мл мышиных моноклональных антител.To construct the calibration curve, solutions of standard antibodies (mouse monoclonal antibodies to human gamma interferon, clone MD-2) were prepared in the concentration range from 16 U / ml to 0.5 U / ml. 100 pg / ml of murine monoclonal antibodies was taken as 1 U / ml.
Подготовленные стандартные антитела, раствор, используемый в качестве отрицательного контроля (фосфотно-солевой буфер, содержащий 1% БСА, 1% Triton-X100 и 0,002% тимерозал) и растворы исследуемых образцов вносили в лунки планшета, как указано в таблице 1, и инкубировали при температуре 37°С в течение 2 часов. По завершению инкубации жидкость удаляли из планшета декантированием и 5 раз планшет промывали стандартным моющим раствором (фосфатно-солевой буфер, содержащий 0,05% Твин-20 и 0,01% тимерозал).Prepared standard antibodies, a solution used as a negative control (phosphate-buffered saline containing 1% BSA, 1% Triton-X100 and 0.002% thimerosal) and solutions of the test samples were added to the wells of the plate as indicated in table 1 and incubated with temperature of 37 ° C for 2 hours. At the end of the incubation, the liquid was removed from the plate by decantation and the plate was washed 5 times with standard washing solution (phosphate-buffered saline containing 0.05% Tween-20 and 0.01% thimerosal).
В таблице 1 приведена схема внесения образцов в лунки планшета.Table 1 shows the scheme of introducing samples into the wells of the tablet.
N: Отрицательный контроль - фосфотно-солевой буфер, содержащий 1% БСА, 1% Triton-X100 и 0,002% тимерозалN: Negative control - phosphate-buffered saline containing 1% BSA, 1% Triton-X100 and 0.002% thimerosal
S1-S20: Исследуемые образцы 1-20S1-S20: Test Samples 1-20
ИФН-γ - рекомбинантный интерферон гамма человекаIFN-γ - recombinant human gamma interferon
БСА - бычий сыворотчный альбуминBSA - Bovine Serum Albumin
Затем во все лунки планшета вносили по 100 мкл раствора, содержащего смесь конъюгированых с щелочной фосфатазой козьих антител к IgA, IgM, IgG человека (Sigma Aldrich; кат. № A-3313), что позволяет определить уровень всех изотипов естественных аутоантител к интерферону гамма человека, или козьи антитела к IgG мыши (Sigma Aldrich; кат. № А-3562), конъюгированные с щелочной фосфатазой, для определения уровня моноклональных антител к интерферону гамма человека (MD-2), используемых для построения калибровочной кривой. Затем планшет инкубировали в течение 1 часа при температуре 37°С. По завершении инкубации жидкость удаляли из лунок планшета декантированием и 5 раз планшет промывали стандартным моющим раствором (фосфатно-солевой буфер, содержащий 0,05% Твин-20 и 0,01% тимерозал).Then, 100 μl of a solution containing a mixture of goat conjugated goat anti-human IgA, IgM, IgG antibodies (Sigma Aldrich; Cat. No. A-3313) was added to all wells of the plate, which makes it possible to determine the level of all isotypes of natural autoantibodies to human gamma interferon or goat antibodies to mouse IgG (Sigma Aldrich; cat. No. A-3562) conjugated to alkaline phosphatase to determine the level of monoclonal antibodies to human gamma interferon (MD-2) used to construct the calibration curve. Then the plate was incubated for 1 hour at a temperature of 37 ° C. At the end of the incubation, the liquid was removed from the plate wells by decantation and the plate was washed 5 times with standard washing solution (phosphate-buffered saline containing 0.05% Tween-20 and 0.01% thimerosal).
За 15 минут до окончания инкубации с конъюгатсодержащим раствором готовили раствор хромагента, растворяя 1 таблетку субстратного буфера и 1 таблетку субстрата (пара-нитрофенилфосфат), производства фирмы Sigma (кат. № N-2770) в 20 мл дистиллированной воды.15 minutes before the end of incubation with the conjugate-containing solution, a chromagent solution was prepared by dissolving 1 tablet of substrate buffer and 1 tablet of substrate (para-nitrophenyl phosphate), manufactured by Sigma (Cat. No. N-2770) in 20 ml of distilled water.
По 100 мкл приготовленного раствора хромагента вносили в каждую из лунок планшета и инкубировали планшет в течение 30 минут при температуре 37°С.100 μl of the prepared chromagent solution was added to each of the wells of the plate and the plate was incubated for 30 minutes at 37 ° C.
По окончании инкубации во все лунки планшета вносили останавливающий раствор (3N гидроксид натрия) производства фирмы Merck KgaA (кат. №.1.06495) и измеряли экстинцию при длине волны 405 нм с использованием стандартного фотометра.At the end of the incubation, a stopping solution (3N sodium hydroxide) manufactured by Merck KgaA (Cat. No. 1.06495) was added to all wells of the plate and the extinction was measured at a wavelength of 405 nm using a standard photometer.
По полученным результатам измерений рассчитывали уровень естественных аутоантител к интерферону гамма. Для этого определяли истинное значение оптической плотности (ОП) стандартных антител и истинное значение ОП исследуемых образцов следующим образом:According to the obtained measurement results, the level of natural autoantibodies to interferon gamma was calculated. For this, the true optical density (OD) value of standard antibodies and the true OD value of the studied samples were determined as follows:
1. Рассчитывали среднюю ОП для отрицательного контроля (среднее арифметическое значение ОП в лунках 1G, 1Н, 2G, 2Н).1. The mean OD for the negative control was calculated (arithmetic mean OD in wells 1G, 1H, 2G, 2H).
2. Рассчитывали среднюю ОП для стандартных антител (среднее арифметическое значение ОП в лунках соответствующего стандарта Р1-Р6).2. The mean OD for standard antibodies was calculated (arithmetic mean OD in the wells of the corresponding standard P1-P6).
3. Рассчитывали истинное значения ОП стандартных антител как разность среднего значения ОП стандартных антител и среднего значения ОП отрицательного контроля.3. The true OD values of standard antibodies were calculated as the difference between the average OD values of standard antibodies and the average OD values of the negative control.
Результаты расчетов приведены в таблице 2.The calculation results are shown in table 2.
4. По полученным значениям истинной ОП стандартных антител построили калибровочную кривую (см. фиг.1), где по оси ординат (y) расположены значения ОП, по оси абсцисс (x) - концентрация антител к интерферону гамма. Построенная калибровочная кривая может быть описана следующим уравнением: y=-0,0049x2+0,1807x+0,01844. Based on the obtained values of the true OD of standard antibodies, a calibration curve was constructed (see Fig. 1), where the OD values are located on the ordinate (y) axis, and the concentration of antibodies to gamma interferon on the abscissa (x) axis. The constructed calibration curve can be described by the following equation: y = -0.0049x2 + 0.1807x + 0.0184
5. Рассчитывали среднее ОП для исследуемых образцов в лунках планшета, в которых иммобилизирован биотинилированный ИФН-γ (ряды 3, 5, 7, 9, 11 в таблице 1) и в которых иммобилизирован биотинилированный БСА (ряды 4, 6, 8, 10, 12 в таблице 1). Например, для исследуемого образца S1 среднее значение ОП в лунках A3, В3 и А4, В4, соответственно.5. The average OD was calculated for the test samples in the wells of the plate in which biotinylated IFN-γ was immobilized (rows 3, 5, 7, 9, 11 in table 1) and in which biotinylated BSA was immobilized (
6. Рассчитывали истинное значения ОП для исследуемых образцов как разность среднего значения ОП для исследуемых образцов, измеренной в лунках планшета, в которых иммобилизирован биотинилированный ИФН-γ, и среднего значение ОП для исследуемых образцов, измеренной в лунках планшета, в которых иммобилизирован биотинилированный БСА. Например, для исследуемого образца S1 вычитаем из среднего значения ОП, измеренного в лунках планшета A3, В3, среднее значение ОП, измеренное в лунках планшета А4, В4.6. The true OD value for the test samples was calculated as the difference between the average OD value for the test samples measured in the wells of the plate in which biotinylated IFN-γ was immobilized and the average OD value for the test samples measured in the wells of the tablet in which biotinylated BSA was immobilized. For example, for the test sample S1, we subtract from the average OD value measured in the wells of plate A3, B3, the average OD value measured in the wells of tablet A4, B4.
7. Используя калибровочную кривую (фиг.1), определяли концентрацию разведенных естественных аутоантител к интерферону гамма человека в исследуемых образцах. Для получения истинного значения концентрации естественных аутоантител к интерферону гамма человека в исследуемых образцах полученный результат умножали на степень разведения образцов (на 100).7. Using the calibration curve (figure 1), the concentration of diluted natural autoantibodies to human gamma interferon in the test samples was determined. To obtain the true concentration of natural autoantibodies to human gamma interferon in the studied samples, the result was multiplied by the degree of dilution of the samples (by 100).
8. Результаты представлены в таблице 3.8. The results are presented in table 3.
Таким образом, приведенные примеры с использования сыворотки крови, в которой присутствуют естественные аутоантитела к интерферону гамма человека, подтверждают эффективность и надежность количественного определение уровня естественных аутоантител к интерферону гамма человека при реализации заявленной совокупности признаковThus, the above examples using blood serum in which natural autoantibodies to human gamma interferon are present confirm the effectiveness and reliability of quantitative determination of the level of natural autoantibodies to human gamma interferon when implementing the claimed combination of features
Claims (1)
Priority Applications (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2010117620/15A RU2465601C2 (en) | 2010-05-05 | 2010-05-05 | Method for evaluation of natural autoantibody level in human biological fluids |
EP11737346.4A EP2529228A4 (en) | 2010-01-26 | 2011-01-24 | Method of determination of autoantibody level by means of enzyme immunoassay |
EA201200936A EA020484B1 (en) | 2010-01-26 | 2011-01-24 | Method of quantitative determination of natural autoantibody level in human biological fluids by means of enzyme immunoassay |
US13/575,320 US20130189707A1 (en) | 2010-01-26 | 2011-01-24 | Method of determination of autoantibody level by means of enzyme immunoassay |
JP2012551116A JP5785959B2 (en) | 2010-01-26 | 2011-01-24 | Method for measuring autoantibody concentration using enzyme immunoassay |
PCT/RU2011/000034 WO2011093745A1 (en) | 2010-01-26 | 2011-01-24 | Method of determination of autoantibody level by means of enzyme immunoassay |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2010117620/15A RU2465601C2 (en) | 2010-05-05 | 2010-05-05 | Method for evaluation of natural autoantibody level in human biological fluids |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2010117620A RU2010117620A (en) | 2011-11-10 |
RU2465601C2 true RU2465601C2 (en) | 2012-10-27 |
Family
ID=44996843
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2010117620/15A RU2465601C2 (en) | 2010-01-26 | 2010-05-05 | Method for evaluation of natural autoantibody level in human biological fluids |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2465601C2 (en) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113567661B (en) * | 2021-07-05 | 2024-04-16 | 深圳市计量质量检测研究院(国家高新技术计量站、国家数字电子产品质量监督检验中心) | Enzyme-labeled antibody protection liquid |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2147128C1 (en) * | 1997-12-15 | 2000-03-27 | Медико-экологический фонд "Чернобыль-Тест" | Method for determining neuropsychic diseases development risk degree |
-
2010
- 2010-05-05 RU RU2010117620/15A patent/RU2465601C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2147128C1 (en) * | 1997-12-15 | 2000-03-27 | Медико-экологический фонд "Чернобыль-Тест" | Method for determining neuropsychic diseases development risk degree |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
HYLKEMA MN et al. Clinical evaluation of a modified ELISA, using photobiotinylated DNA, for the detection of anti-DNA antibodies.J Immunol Methods. 1994 Mar 29; 170(1): 93-102. (ref.). * |
Набор для иммуноферментного определения аллергенспецифического иммуноглобулина Е в сыворотке и плазме крови. 2006 г. найдено из Интернет, [on-line], найдено 02.10.11. www.diameb.ua/manuals/rus/KP27EW.pdf. ТЕРТОН М. и др. Новые методы иммуноанализа. - М.: Из-во «Мир», 1991, с.25-28, 55. Components for diagnostic kit developers solutions for everyday problem. 2007. найдено из Интернет, [on-line], найдено 02.10.11. http://www.whatman.com/References/CompleteComponentSolutionsforDiagnosticManufacturers.pdf. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2010117620A (en) | 2011-11-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Montesinos et al. | Evaluation of two automated and three rapid lateral flow immunoassays for the detection of anti-SARS-CoV-2 antibodies | |
Quinn et al. | A rapid, inexpensive and disposable point‐of‐care blood test for sickle cell disease using novel, highly specific monoclonal antibodies | |
Güven et al. | Non-specific binding in solid phase immunoassays for autoantibodies correlates with inflammation markers | |
US20130189707A1 (en) | Method of determination of autoantibody level by means of enzyme immunoassay | |
US9726672B2 (en) | Anti-VLA-4 related assays | |
Pawade et al. | Rapid and selective detection of experimental snake envenomation–Use of gold nanoparticle based lateral flow assay | |
US5804391A (en) | Elimination of rheumatoid factor interference using anti-FD antibodies | |
RU2465601C2 (en) | Method for evaluation of natural autoantibody level in human biological fluids | |
Degn et al. | Assay interference caused by antibodies reacting with rat kappa light-chain in human sera | |
KR101667088B1 (en) | METHOD FOR MEASURING IMMUNITY OF COMPLEX OF Ku86 AND AUTOANTIBODY THEREOF, KIT USED THEREFOR, AND METHOD FOR DETERMINING CANCER USING SAME | |
RU2465600C2 (en) | Method for evaluation of natural antibody level in human biological fluids by immune-enzyme assay | |
Hinman et al. | An enzyme-linked immunosorbent assay for antibody against acetylcholine receptor | |
EP0262217B1 (en) | Solid phase analysis method | |
US4900684A (en) | CEA immunoassay free of human anti-mouse antibody false positives | |
EA020484B1 (en) | Method of quantitative determination of natural autoantibody level in human biological fluids by means of enzyme immunoassay | |
RU2744521C1 (en) | Method and a kit for an immunoenzymometric assay of the quantitative content of antitoxic anti-diphtheria igg antibodies in human serum | |
RU2678765C1 (en) | Method of laboratory diagnostics of functional pathology of liver on adults with psoriasis | |
Huizinga et al. | Detection of precipitating and complement consuming antibodies by enzyme linked immune sorbent assay in pigeon breeders' disease | |
RU2197736C1 (en) | Reagent for immunoenzyme analysis and method of immunoenzyme testing of specific antibody in opisthorchiasis caused by hepatic trematode opisthorchis felineus | |
JP5257788B2 (en) | Immunoassay method for complex of clathrin heavy chain and its autoantibody, kit used therefor, and cancer determination method using the same | |
JP2001153868A (en) | Immunoassay of assaying casein phosphopetide(cpp) | |
JPH0792457B2 (en) | High-sensitivity antibody measurement method | |
JP2020012797A (en) | Method and kit for detecting zika virus antigen and anti-zika virus antibody | |
UA66096A (en) | IMMUNOENZYME ASSAY KIT FOR DETECTING IgG AGAINST TOXOPLASMA GONDII IN HUMAN BLOOD SERUM (DIA-TOXO-IgG) | |
JP2002533677A (en) | How to diagnose autoimmune arthritis |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190506 |