RU2460790C2 - Способ иммобилизации l-фенилаланин-аммоний-лиазы на магнитных наночастицах - Google Patents
Способ иммобилизации l-фенилаланин-аммоний-лиазы на магнитных наночастицах Download PDFInfo
- Publication number
- RU2460790C2 RU2460790C2 RU2010127878/10A RU2010127878A RU2460790C2 RU 2460790 C2 RU2460790 C2 RU 2460790C2 RU 2010127878/10 A RU2010127878/10 A RU 2010127878/10A RU 2010127878 A RU2010127878 A RU 2010127878A RU 2460790 C2 RU2460790 C2 RU 2460790C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- nanoparticles
- phenylalanine
- ammonium
- immobilized
- lyase
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 title claims abstract description 12
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 7
- 229910044991 metal oxide Inorganic materials 0.000 claims abstract description 7
- 150000004706 metal oxides Chemical class 0.000 claims abstract description 7
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 50
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 claims description 32
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 claims description 32
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 24
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 24
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 24
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 21
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 229910010413 TiO 2 Inorganic materials 0.000 description 13
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 12
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-aminopropyl)triethoxysilane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 5
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 5
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 5
- 238000007098 aminolysis reaction Methods 0.000 description 4
- -1 azido, carboxyl Chemical group 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 4
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 3
- BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N Silane Chemical compound [SiH4] BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 239000002114 nanocomposite Substances 0.000 description 3
- 238000006068 polycondensation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 229910000077 silane Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 3
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical group O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- 150000004985 diamines Chemical class 0.000 description 2
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-M .beta-Phenylacrylic acid Natural products [O-]C(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-M 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 241000723347 Cinnamomum Species 0.000 description 1
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021586 Nickel(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 201000011252 Phenylketonuria Diseases 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 235000017803 cinnamon Nutrition 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 235000010299 hexamethylene tetramine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004312 hexamethylene tetramine Substances 0.000 description 1
- VKYKSIONXSXAKP-UHFFFAOYSA-N hexamethylenetetramine Chemical compound C1N(C2)CN3CN1CN2C3 VKYKSIONXSXAKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- RBURNKQMEAEGBB-UHFFFAOYSA-K iron(3+);2-methylprop-2-enoate Chemical compound [Fe+3].CC(=C)C([O-])=O.CC(=C)C([O-])=O.CC(=C)C([O-])=O RBURNKQMEAEGBB-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron(III) chloride Substances Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229910001510 metal chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002082 metal nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 1
- FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N methacrylamide Chemical compound CC(=C)C(N)=O FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005395 methacrylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- QMMRZOWCJAIUJA-UHFFFAOYSA-L nickel dichloride Chemical compound Cl[Ni]Cl QMMRZOWCJAIUJA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 150000004756 silanes Chemical class 0.000 description 1
- 235000013403 specialized food Nutrition 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- XJDNKRIXUMDJCW-UHFFFAOYSA-J titanium tetrachloride Chemical compound Cl[Ti](Cl)(Cl)Cl XJDNKRIXUMDJCW-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-N trans-cinnamic acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биохимии. Предложен способ иммобилизации L-фенилаланин-аммоний-лиазы на магнитных наночастицах оксидов металлов в присутствии конденсирующего агента 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида. Способ позволяет повысить удельную активность L-фенилаланин-аммоний-лиазы и сохранить от 64% до 75% ее активности. 6 табл., 3 пр.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу иммобилизации на поверхностно-модифицированных магнитных наночастицах фермента L-фенилаланин-аммоний-лиазы, осуществляющего биотрансформацию L-фенилаланина до аммиака и транс-циннамовой кислоты. Изобретение может быть использовано в качестве терапевтических композиций, а также для создания специализированных продуктов питания для больных фенилкетонурией.
Иммобилизованные ферменты обладают рядом очевидных преимуществ перед нативными: легкость отделения гетерогенного биокатализатора от реакционной среды; непрерывность проведения ферментативного процесса с возможностью регулирования скорости катализируемой реакции и выхода продукта; направленное изменение свойств фермента (специфичность, зависимость каталитической активности от рН и других параметров среды, стабильность к денатурирующим воздействиям); возможность регулирования каталитической активности иммобилизованных ферментов путем изменения свойств носителя.
В данной области предложено множество технических решений, среди которых наибольшее распространение получили химические способы иммобилизации ферментных препаратов, суть которых заключается в ковалентном связывании биомолекул с инертным носителем, модифицированным реакционно-способными функциональными группами (амино-, азидо-, карбоксильные, гидроксильные и др.). Однако в большинстве своем эти способы иммобилизации имеют ряд недостатков, а именно использование дорогостоящих материалов и реактивов для иммобилизации, трудоемкость и многостадийность методик.
Известен способ иммобилизации (см. пат. US №WO 2009120916 (A1), МПК С08K 3/08, заявл. 28.03.2008, опубл. 10.01.2009) биообъектов на поликарбонатных нанокомпозитах, представляющих собой металлические наночастицы, покрытые слоем поликарбоната полимеризацией в реакционной смеси. В данном случае поликарбонатные нанокомпозиты получают из смеси дигидроксисоединений, активированного карбоната, металлического прекурсора и растворителя. Затем реакционная смесь подвергается полимеризации с образованием поликарбонатного нанокомпозита, представляющего собой поликарбонатную матрицу с распределенными частицами металла. В качестве прекурсоров при этом используют оксиды таких металлов, как золото, платина, палладий, кобальт, железо, никель, магний. Данный способ иммобилизации отличается такими недостатками, как использование дорогостоящих металлов и невысокая удельная активность полученных препаратов.
Также известно изобретение (см. пат. IT №WО 2009040843 (А2), МПК А61K 47/48, заявл. 04.08.2008, опубл. 02.04.2009), описывающее способ получения неорганических микро- и наночастиц оксидов металлов с регулируемой пористостью, используемых в качестве носителей для биомолекул. Данное техническое решение описывает неорганические мицеллярные композиты, функционализированные с использованием различных реагентов с помощью процесса графт-сополимеризации. Данное техническое решение имеет следующие недостатки: многостадийность процесса и невысокая стабильность препаратов.
Известен также способ полимеризационной иммобилизации биологических макромолекул (см. пат. РФ №RU 2216547 (С2), заявл. 16.10.2001, опубл. 20.11.2003), описывающий композит для присоединения олигонуклеотидов, белков и нуклеиновых кислот, структура которых включает активные функциональные группы: - амино, сульфгидрильные и т.д. В качестве мономеров в данном техническом решении используются такие соединения, как акриламид, метакриламид, 2-гидроксиэтилэтилметакрилат или производные акриловой, метакриловой, коричной, кретоновой и других ненасыщенных кислот. Недостатки данного изобретения следующие: использование токсических соединений и узкий диапазон оптимальных условий функционирования: рН и температура.
Наиболее близким к заявляемому изобретению - прототипом - является техническое решение (см. пат.US №ЕР 0230649 (А1), МПК C12N 11/10, заявл. 23.12.1986, опубл. 05.08.1987), заключающееся в иммобилизации L-фенилаланин-аммоний-лиазы путем добавления полиамина, хитозана и многофункциональных соединений, содержащих аминогруппы, таких как глутаровый альдегид. Примеры полиаминов, используемых в данном изобретении, включают полиэтилендиамин, полиэтиленимин, полидиэтилентриамин, политриэтилентетрамин, полипентаэтиленгексамин или полигексаметилендиамин. В данном случае глутаровый альдегид выполняет функцию конденсирующего агента, посредством которого происходит образование ковалентной связи между функциональными группами фермента и носителя.
Основными недостатками данного технического решения следует считать относительно низкую удельную активность иммобилизованного препарата и узкий диапазон условий функционирования.
Задачей технического решения является повышение удельной активности и стабильности иммобилизованного препарата L-фенилаланин-аммоний-лиазы за счет химического взаимодействия реакционно-способных функциональных групп молекулы фермента с поверхностью магнитных наночастиц, что открывает перспективы многократного использования биокатализатора в технологическом процессе и непрерывного проведения ферментативного процесса с возможностью регулирования скорости катализируемой реакции и выхода продукта. Данные характеристики иммобилизованных препаратов позволят снизить их себестоимость. Использование магнитных наночастиц в получении иммобилизованных ферментных препаратов является перспективным в связи с тем фактом, что они обладают развитой активной поверхностью и высокой сорбционной емкостью, а также способны приближаться к биообъекту и связываться с ним вследствие размеров, сопоставимых с размерами клеток, вирусов, белков, ДНК. Проведенный поиск показал, что в источниках информации отсутствуют технические решения, связанные со всей совокупностью отличительных признаков, изложенных в изобретении.
Технический результат достигается за счет использования в качестве носителя для иммобилизации магнитных наночастиц, представляющих собой оксиды металлов. Выбор в качестве наночастиц оксидов металлов обусловлен их широким распространением и невысокой стоимостью. Данная техническая задача реализуется за счет модификации поверхности магнитных наночастиц функциональными группами с последующим ковалентным присоединением фермента L-фенилаланин-аммоний-лиазы в присутствии конденсирующего агента 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида.
Способ получения поверхностно-модифицированных магнитных наночастиц для иммобилизации биологических веществ включает выполнение следующих операций. На первом этапе осуществляется получение магнитных наночастиц, содержащих на поверхности электрофильные сложноэфирные группы, путем взаимодействия полиметилметакрилата, соответствующего хлорида металла и диэтиленгликоля. Вторая стадия заключается в формировании на поверхности наночастиц слоя аминопропилтриэтоксисисилана за счет протекания реакции аминолиза электрофильных фрагментов носителя. Полученные наночастицы служат для последующей иммобилизации ферментов с использованием 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.
Пример 1
Готовят смесь полиметилметакрилата, хлорида железа (III) и диэтиленгликоля, нагревают при перемешивании до 220°С. Затем к смеси добавляют раствор гидроксида натрия в диэтиленгликоле. Через несколько минут образуются наночастицы Fе3O4 с поверхностными сложноэфирными группами, которые отделяют центрифугированием. Образующиеся магнитные наночастицы пригодны для иммобилизации биологических веществ посредством конденсирующего агента.
На второй стадии получения ферментного препарата на поверхности наночастиц Fе3O4 формируют слой аминопропилтриэтоксисилана за счет протекания реакции аминолиза электрофильных фрагментов носителя. Важно избегать присутствия воды в системе на этой стадии, поскольку ее наличие приводит к гидролизу аминопропилтриэтоксисилана и образованию олигомерных силанов. Поэтому в отдельной камере объемом 30 см3 наночастицы Fе3O4 (1,0 мг) покрывают газообразным 3-аминопропилтриэтоксисиланом (1 см3) при атмосферном давлении и температуре 70°С в течение 30 минут. После остывания образец обрабатывают этиловым спиртом три раза по 5 см3 и высушивают на воздухе. Далее наночастицы Fе3O4 (1,0 мг) обрабатывают 0,5%-ным раствором 3-аминопропилтриэтоксисилана (растворитель - смесь этанол: вода 1:1) в течение одного часа при температуре 50°С. На этом этапе происходит совместная поликонденсация силана с триалкоксисилановыми группами. По окончании процесса модификации наночастицы Fе3O4 несколько раз промывают растворителем вода - этиловый спирт (1:1) и готовят суспензию наночастиц Fе3O4 с концентрацией 5 мг/см3 в 0,1М фосфатном буфере (рН 7,8).
Далее 200 мкл полученной суспензии инкубируют с 200 мкл 100 мМ 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида в 0,1М фосфатном буфере в течение трех часов при непрерывном перемешивании при комнатной температуре. По окончании инкубации суспензию промывают три раза 0,025М фосфатным буфером и готовят суспензию в 500 мкл 0,1М фосфатного буфера. На следующей стадии смешивают 20 мкл L-фенилаланин-аммоний-лиазы с 500 мкл 0,1М фосфатного буфера и инкубируют полученный раствор с 500 мкл суспензии наночастиц Fе3О4 в 0,1М фосфатном буфере при температуре 30°С в течение двух часов. По окончании иммобилизации наночастицы Fе3O4 промывают 0,025М фосфатным буферным раствором до исчезновения активности в промывных водах. Полученный иммобилизованный препарат хранится в виде суспензии наночастиц с ковалентно связанным ферментом в 1000 мкл 0,1М фосфатного буфера. Физико-химические характеристики L-фенилаланин-аммоний-лиазы, иммобилизованной на наночастицах Fе3O4, представлены в табл.1. В качестве контроля в данном случае используют L-фенилаланин-аммоний-лиазу, иммобилизованную на немодифицированных наночастицах Fе3O4 адсорбционным способом.
В табл.2 представлены данные, полученные при исследовании стабильности иммобилизованной на наночастицах Fе3O4 L-фенилаланин-аммоний-лиазы, по сравнению с контролем при хранении. Из табл.2 следует, что иммобилизация L-фенилаланин-аммоний-лиазы на наночастицах Fе3O4 приводит к стабилизации фермента. Так, по истечении 30 суток хранения иммобилизованная на наночастицах Fе3O4 L-фенилаланин-аммоний-лиаза сохраняет 65,5% активности, в то время как в контрольном опыте сохраняется 32,9% активности.
| Таблица 1 | ||||
| Физико-химические параметры иммобилизованной L-фенилаланин-аммоний-лиазы | ||||
| Способ иммобилизации | Удельная активность фермента, ед./мг белка | Удельная активность фермента, % от нативного | Оптимум рН | Температурный оптимум, °С |
| Иммобилизация на модифицированных наночастицах Fе3O4 | 0,53 | 60,9 | 7,5-9,0 | 30±3 |
| Контрольный опыт | 0,33 | 37,9 | 8,0-9,0 | 30±1 |
| Таблица 2 | ||
| Стабильность при хранении L-фенилаланин-аммоний-лиазы, иммобилизованной на наночастицах Fе3О4, по сравнению с контролем | ||
| Продолжительность хранения, сутки | Остаточная активность фермента, % | |
| L-фенилаланин-аммоний-лиаза, иммобилизованная на наночастицах Fе3O4 | Контрольный опыт | |
| 5 | 98,0 | 91,5 |
| 10 | 95,6 | 85,0 |
| 15 | 82,4 | 69,8 |
| 20 | 77,6 | 57,0 |
| 25 | 72,0 | 40,5 |
| 30 | 65,5 | 32,9 |
Пример 2
Смесь полиметилметакрилата, хлорида никеля и диэтиленгликоля тщательно перемешивают и нагревают до 180°С. К реакционной смеси добавляют раствор гидроксида натрия в диэтиленгликоле. Образующиеся через несколько минут наночастицы NiO с поверхностными сложноэфирными группами отделяют центрифугированием. Следующей стадией получения ферментного препарата является формирование слоя аминопропилтриэтоксисилана за счет протекания реакции аминолиза электрофильных фрагментов носителя. Для этого в отдельной камере объемом 50 см3 наночастицы NiO (5,0 мг) покрывают газообразным 3-аминопропилтриэтоксисиланом (2 см3) при атмосферном давлении и температуре 80°С в течение 20 минут. После остывания образец обрабатывают этиловым спиртом три раза по 5 см3 и высушивают на воздухе. Далее наночастицы NiO (1,0 мг) обрабатывают 0,5%-ным раствором 3-аминопропилтриэтоксисилана (растворитель - смесь этанол: вода 1:1) в течение одного часа при температуре 70°С. На этом этапе происходит совместная поликонденсация силана с триалкоксисилановыми группами. По окончании процесса модификации наночастицы NiO несколько раз промывают растворителем вода - этиловый спирт (1:1) и готовят суспензию наночастиц NiO с концентрацией 5 мг/см3 в 0,1М фосфатном буфере (рН 7,8).
Последующая иммобилизация L-фенилаланин-аммоний-лиазы на наночастицы NiO посредством конденсирующего агента 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида осуществляется аналогично примеру 1. Физико-химические характеристики L-фенилаланин-аммоний-лиазы, иммобилизованной на наночастицах NiO, по сравнению с контролем представлены в табл.3.
В табл.4 представлены данные, полученные при исследовании стабильности иммобилизованной на наночастицах NiO L-фенилаланин-аммоний-лиазы, по сравнению с контролем при хранении. Результаты, представленные в табл.4, свидетельствуют о том, что иммобилизация L-фенилаланин-аммоний-лиазы на наночастицах NiO приводит к стабилизации фермента. Так, по истечении 30 суток хранения иммобилизованная на наночастицах NiO L-фенилаланин-аммоний-лиаза сохраняет 64,4% активности, в то время как в контрольном опыте сохраняется 32,9% активности.
| Таблица 3 | ||||
| Физико-химические параметры иммобилизованной L-фенилаланин-аммоний-лиазы | ||||
| Способ иммобилизации | Удельная активность фермента, ед./мг белка | Удельная активность фермента, % от нативного | Оптимум рН | Температурный оптимум, °С |
| Иммобилизация на модифицированных наночастицах NiO | 0,65 | 74,7 | 7,3-9,2 | 30±4 |
| Контрольный опыт | 0,33 | 37,9 | 8,0-9,0 | 30±1 |
| Таблица 4 | ||
| Стабильность при хранении L-фенилаланин-аммоний-лиазы, иммобилизованной на наночастицах NiO, по сравнению с контролем | ||
| Продолжительность хранения, сутки | Остаточная активность фермента, % | |
| L-фенилаланин-аммоний-лиаза, иммобилизованная на наночастицах NiO | Контрольный опыт | |
| 5 | 95,0 | 91,5 |
| 10 | 93,2 | 85,0 |
| 15 | 80,1 | 69,8 |
| 20 | 74,0 | 57,0 |
| 25 | 69,5 | 40,5 |
| 30 | 64,4 | 32,9 |
Пример 3
Для получения поверхностно-модифицированных наночастиц ТiO2 готовят смесь хлорида титана (IV), полиметилметакрилата и диэтиленгликоля, после чего нагревают ее при перемешевании до 220°С. Затем к реакционной смеси добавляют гидроксид натрия в диэтиленгликоле. Через несколько минут образуются наночастицы ТiO2, которые отделяют центрифугированием. Следующий этап - образование слоя аминопропилтриэтоксисилана за счет протекания реакции аминолиза электрофильных фрагментов носителя. Для этого в отдельной камере объемом 10 см3 наночастицы TiO2 (1,0 мг) покрывают газообразным 3-аминопропилтриэтоксисиланом (1 см3) при атмосферном давлении и температуре 100°С в течение 60 минут. После остывания образец обрабатывают этиловым спиртом три раза по 5 см3 и высушивают на воздухе. Далее частицы ТiO2 (1,0 мг) обрабатывают 0,5%-ным раствором 3-аминопропилтриэтоксисилана (растворитель - смесь этанол: вода 1:1) в течение двух часов при температуре 90°С. На этом этапе происходит совместная поликонденсация силана с триалкоксисилановыми группами. По окончании процесса модификации наночастицы ТiO2 несколько раз промывают растворителем вода - этиловый спирт (1:1) и готовят суспензию наночастиц с концентрацией 5 мг/см3 в 0,1М фосфатном буфере (рН 7,8).
Иммобилизацию L-фенилаланин-аммоний-лиазы на наночастицы ТiO2 посредством конденсирующего агента 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида осуществляют аналогично примеру 1. Физико-химические характеристики L-фенилаланин-аммоний-лиазы, иммобилизованной на наночастицах ТiO2, по сравнению с контролем представлены в табл.5.
В табл.6 представлены данные, полученные при исследовании стабильности иммобилизованной на наночастицах TiO2 L-фенилаланин-аммоний-лиазы, по сравнению с контролем при хранении. Результаты, представленные в табл.6, свидетельствуют о том, что иммобилизация L-фенилаланин-аммоний-лиазы на наночастицах ТiO2 приводит к стабилизации фермента. Так, по истечении 30 суток хранения иммобилизованная на наночастицах ТiO2 L-фенилаланин-аммоний-лиаза сохраняет 75,0% активности, в то время как в контрольном опыте сохраняется 32,9% активности.
| Таблица 5 | ||||
| Физико-химические параметры иммобилизованной L-фенилаланин-аммоний-лиазы | ||||
| Способ иммобилизации | Удельная активность фермента, ед./мг белка | Удельная активность фермента, % от нативного | Оптимум рН | Температурный оптимум, °С |
| Иммобилизация на модифицированных наночастицах ТiO2 | 0,71 | 81,6 | 7,4-9,1 | 30±4 |
| Контрольный опыт | 0,33 | 37,9 | 8,0-9,0 | 30±1 |
| Таблица 6 | ||
| Стабильность при хранении L-фенилаланин-аммоний-лиазы, иммобилизованной на наночастицах TiO2, по сравнению с контролем | ||
| Продолжительность хранения, сутки | Остаточная активность, % | |
| L-фенилаланин-аммоний-лиаза, иммобилизованная на наночастицах ТiO2 | Контрольный опыт | |
| 5 | 98,7 | 91,5 |
| 10 | 97,2 | 85,0 |
| 15 | 90,3 | 69,8 |
| 20 | 85,4 | 57,0 |
| 25 | 81,5 | 40,5 |
| 30 | 75,0 | 32,9 |
Таким образом, иммобилизация L-фенилаланин-аммоний-лиазы на поверхностно-модифицированных наночастицах оксидов металлов открывает перспективу модуляции каталитических свойств фермента. Данное изобретение обладает рядом преимуществ перед прототипом:
- возможность использования в качестве инертного носителя магнитных наночастиц, имеющих ряд преимуществ перед макрообъектами;
- повышение удельной активности и стабильности иммобилизованных препаратов;
- оптимизация условий функционирования иммобилизованных препаратов;
- упрощение и удешевление технологии получения иммобилизованных препаратов.
Стабилизирующее действие наночастиц оксидов металлов на L-фенилаланин-аммоний-лиазу, очевидно, обусловлено конформационными изменениями в молекуле белка в результате его взаимодействия с наноразмерными объектами. Каталитические свойства полученного иммобилизованного препарата L-фенилаланин-аммоний-лиазы позволяют широко использовать его в биотехнологии.
Claims (1)
- Способ иммобилизации L-фенилаланин-аммоний-лиазы на магнитных наночастицах, заключающийся в ковалентном связывании молекул фермента с поверхностью носителя посредством конденсирующего агента, отличающийся тем, что в качестве носителя для иммобилизации выступают наночастицы оксидов металлов, а в качестве конденсирующего агента используют 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010127878/10A RU2460790C2 (ru) | 2010-07-06 | 2010-07-06 | Способ иммобилизации l-фенилаланин-аммоний-лиазы на магнитных наночастицах |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010127878/10A RU2460790C2 (ru) | 2010-07-06 | 2010-07-06 | Способ иммобилизации l-фенилаланин-аммоний-лиазы на магнитных наночастицах |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2010127878A RU2010127878A (ru) | 2012-01-20 |
| RU2460790C2 true RU2460790C2 (ru) | 2012-09-10 |
Family
ID=45785054
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010127878/10A RU2460790C2 (ru) | 2010-07-06 | 2010-07-06 | Способ иммобилизации l-фенилаланин-аммоний-лиазы на магнитных наночастицах |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2460790C2 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2551317C2 (ru) * | 2013-04-10 | 2015-05-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высокомолекулярных соединений Российской академии наук | Способ иммобилизации химотрипсина на наночастицах селена или серебра |
| RU2812044C1 (ru) * | 2023-02-16 | 2024-01-22 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский университет ИТМО" (Университет ИТМО) | Способ иммобилизации фермента на пористом керамическом носителе на основе диоксида кремния |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0230649A1 (en) * | 1986-01-02 | 1987-08-05 | Miles Inc. | Immobilization of phenylaline ammonia-lyase |
-
2010
- 2010-07-06 RU RU2010127878/10A patent/RU2460790C2/ru active IP Right Revival
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0230649A1 (en) * | 1986-01-02 | 1987-08-05 | Miles Inc. | Immobilization of phenylaline ammonia-lyase |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| KOUASSI G.K. et all. Activity of glucose oxidase functionalized onto magnetic nanoparticles // BioMagnetic Research and Technology 2005, 3:1. Найдено в Интернет <URL:http://www.biomagres.com/content/3/1/1. SHIH-HUNG HUANG et all. Direct Binding and Characterization of lipase onto Magnetic Nanoparticles // Biotechnol. Prog. 2003, v.19, №3, pp.1096-1100. KOUASSI G. K. et all. Examination of Cholesterol oxidase attachment to magnetic nanoparticles// BioMagnetic Research and Technology 2005, 3:1. Найдено в Интернет <URL:http://www.biomagres.com/content/3/1/1. LIAO М-Н; CHEN D-H. Immobilization of yeast alcohol dehydrogenase on magnetic nanoparticles for improving its stability // Biotechnology Letters, v.23, №20, October 2001, pp.1723-1727(5). * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2551317C2 (ru) * | 2013-04-10 | 2015-05-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высокомолекулярных соединений Российской академии наук | Способ иммобилизации химотрипсина на наночастицах селена или серебра |
| RU2812044C1 (ru) * | 2023-02-16 | 2024-01-22 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский университет ИТМО" (Университет ИТМО) | Способ иммобилизации фермента на пористом керамическом носителе на основе диоксида кремния |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2010127878A (ru) | 2012-01-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Abdelhamid | Biointerface between ZIF-8 and biomolecules and their applications | |
| Smith et al. | A comprehensive review of the covalent immobilization of biomolecules onto electrospun nanofibers | |
| Thangaraj et al. | Immobilization of lipases–a review. Part II: carrier materials | |
| Tian et al. | Recent development in the design of artificial enzymes through molecular imprinting technology | |
| Cipolatti et al. | Current status and trends in enzymatic nanoimmobilization | |
| Gačanin et al. | Biomedical applications of DNA‐based hydrogels | |
| Zhou et al. | Metal–organic framework in situ post-encapsulating DNA–enzyme composites on a magnetic carrier with high stability and reusability | |
| T. sriwong et al. | Recent advances in enzyme immobilization utilizing nanotechnology for biocatalysis | |
| Homaei et al. | Enzyme immobilization: an update | |
| CN102630241B (zh) | 中空微粒主体 | |
| CN102145279B (zh) | 磁响应性极高吸附容量溶菌酶分子印迹纳米粒子制备方法 | |
| Esmaeilnejad-Ahranjani et al. | Study of molecular conformation and activity-related properties of lipase immobilized onto core–shell structured polyacrylic acid-coated magnetic silica nanocomposite particles | |
| Seenuvasan et al. | Magnetic nanoparticles: a versatile carrier for enzymes in bio‐processing sectors | |
| Wang et al. | Immobilization of cellulase on polyamidoamine dendrimer-grafted silica | |
| Wang et al. | Advances in carrier-bound and carrier-free immobilized nanobiocatalysts | |
| Wei et al. | Highly selective entrapment of his-tagged enzymes on superparamagnetic zirconium-based MOFs with robust renewability to enhance pH and thermal stability | |
| Ma et al. | Microspheres and microcapsules in biotechnology: design, preparation and applications | |
| Bayramoglu et al. | Immobilisation of β-galactosidase onto double layered hydrophilic polymer coated magnetic nanoparticles: Preparation, characterisation and lactose hydrolysis | |
| Khafaga et al. | Green synthesis of biocatalysts based on nanocarriers promises an effective role in pharmaceutical and biomedical fields | |
| Bayramoğlu et al. | Immobilization of urease via adsorption onto l-histidine–Ni (II) complexed poly (HEMA-MAH) microspheres: preparation and characterization | |
| Acet | Design of enhanced smart delivery systems for therapeutic enzymes: kinetic and release performance of dual effected Enzyme-Loaded nanopolymers | |
| Liya et al. | Immobilization of papain in biosilica matrix and its catalytic property | |
| Sousa et al. | Supramolecular dendrimer-containing layer-by-layer nanoassemblies for bioapplications: current status and future prospects | |
| Li et al. | Recent advances in MOF-bio-interface: a review | |
| CN104558107A (zh) | 酶响应性的两亲性多肽和药物载体及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE Effective date: 20140522 |
|
| QC41 | Official registration of the termination of the licence agreement or other agreements on the disposal of an exclusive right |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20140522 Effective date: 20141111 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160707 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20190320 |