RU2458145C1 - СПОСОБ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ПОЛИМОРФИЗМА rs17522918 ГЕНА ПЕРОКСИРЕДОКСИНА-1 У ЧЕЛОВЕКА - Google Patents
СПОСОБ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ПОЛИМОРФИЗМА rs17522918 ГЕНА ПЕРОКСИРЕДОКСИНА-1 У ЧЕЛОВЕКА Download PDFInfo
- Publication number
- RU2458145C1 RU2458145C1 RU2011109770/10A RU2011109770A RU2458145C1 RU 2458145 C1 RU2458145 C1 RU 2458145C1 RU 2011109770/10 A RU2011109770/10 A RU 2011109770/10A RU 2011109770 A RU2011109770 A RU 2011109770A RU 2458145 C1 RU2458145 C1 RU 2458145C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- polymorphism
- genotype
- gene
- genotyping
- base pairs
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано в медицине при определении наследственной предрасположенности к развитию заболеваний, ассоциированных с носительством полиморфных вариантов гена пероксиредоксина-1. Предложен способ генотипировании полиморфизма rs 17522918 гена PRDX1, предусматривающий проведение ПЦР с использованием специально подобранной пары праймеров (F: 5'-ACACTCACCAGTCCCAACACAAG-3' и R: 5'-ССАСАТСССССТССТСТСТСТС-3') и последующий анализ ПЦР-продукта методом ПДРФ, который включает обработку эндонуклеазой BstH2I и фракционирование полученных фрагментов в 2% агарозном геле. При этом ДНК-фрагменты размером 81 и 84 п.н. верифицируют как гомозиготный генотип дикого типа СС, фрагмент размером 165 п.н. - как гомозиготный мутантный генотип АА, а фрагменты 165, 81 и 84 п.н. - как гетерозиготный генотип СА. Способ по изобретению отличается простотой и точностью диагностики. 1 ил., 1 пр.
Description
Изобретение относится к области молекулярной биологии и генетики, а именно к разработке методов генотипирования полиморфизма генов ферментов антиоксидантной защиты у человека.
Система антиоксидантной защиты представляет собой разветвленную, многокомпонентную сеть физиологически активных веществ, объединяющих ферментные и неферментные соединения, которые включаются в работу последовательно, взаимно дополняя друг друга, тем самым, обеспечивая контроль окислительных реакций и инактивацию всего многообразия токсичных продуктов свободнорадикального окисления. Хорошо известно, что антиоксидантная система включает в себя большое количество звеньев, но генетически детерминированными являются антиоксидантные ферменты, характеризующиеся выраженными межиндивидуальными и популяционными различиями в ферментативной активности, благодаря наличию в структуре их генов функционально неравноценных полиморфных аллелей [Gutteridge.J.M.C., Halliwell В. Antioxidants: Molecules, medicines, and myths // Biochemical and biophysical research communications. - 2010. - Vol.393, issue 4. - P.561-564]. В последние годы отмечается значительный интерес исследователей к изучению полиморфизма генов системы антиоксидантной защиты при различной патологии у человека.
Пероксиредоксин, PRDX1 (OMIM 176763) является одним из важных антиоксидантных ферментов, широко представленных в различных видах тканей (особенно в тех, которые характеризуются высоким уровнем пролиферативной активности), но преимущественно в лимфобластах, гладкомышечной ткани и эпителии бронхов. Фермент обладает одновременно оксидоредуктазной и пероксидазной активностью, а также участвует в клеточной пролиферации и развитии мышечной ткани [Neumann С.А., Hallek M. Essential role for the peroxiredoxin Prdxl in erythrocyte antioxidant defense and tumor suppression // Nature. - 2003. - Vol.424. - P.561-565].
Ген PRDX1 локализован в 1р34.1 хромосоме и имеет множество однонуклеотидных полиморфизмов. Одним из наиболее частных полиморфизмов, потенциально способных оказывать влияние на экспрессию гена PRDX1, является полиморфизм С/А (rs17522918) в 5'-нетранслируемой (5'-UTR) области гена. Однако данные о существующих в литературе методиках идентификации указанного полиморфизма полностью отсутствуют. Таким образом, существует реальная потребность в создании быстрого, недорогого способа идентификации полиморфизма rs17522918 гена PRDX1, который мог бы использоваться в качестве" рутинного метода генотипирования в ПЦР-лаборатории со стандартным набором оборудования и реактивов.
Задачей изобретения является разработка простого в исполнении и экономически целесообразного способа генотипирования однонуклеотидного полиморфизма rs17522918 в 5'-нетранслируемой области гена PRDX1 с помощью полимеразной цепной реакции и полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ).
Предлагаемый способ осуществляется следующим образом:
При разработке способа генотипирования полиморфизма rs17522918 гена PRDX1 использовали образцы геномной ДНК, выделенные из замороженной венозной крови стандартным двухэтапным методом фенольно-хлороформной экстракции (Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генной инженерии. Молекулярное клонирование. Пер. с анг. М.: Мир, - 1984. - 480 с.). Сначала на основе нуклеотидной последовательности гена пероксиредоксина-1 (Gene ID: 5052, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/5052) с помощью программы "GeneFisher" 1.3 (http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de) была подобрана пара олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих интересуемую область гена PRDX1, имеющих следующую структуру:
F: 5'-ACACTCACCAGTCCCAACACAAG-3' (SEQ ID NO 1)
R: 5'-CCACATCCCCCTCCTCTCTCTC-3' (SEQ ID NO 2)
Праймеры были синтезированы в НПО "Литех" (г.Москва). Амплификацию проводили на многоканальном термоциклере "Терцик" (ЗАО НПО "ДНК-Технология", г.Москва).
При приготовлении растворов для проведения ПЦР использовали импортные реагенты высокой степени очистки (Ultra pure и Biotechnology Grade). ПЦР проводили в 12 мкл реакционной смеси, содержащей 0,5 мкл образца геномной ДНК. Смесь для амплификации включала: 67 мМ Трис-НСl рН 8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мкМ ЭДТА, 1,6 мM MgCl2, 1 мМ β-меркаптоэтанола, 1 мМ каждого dNTPs (dATP, dCTP, dTTP и dGTP), 15 нМ каждого из праймеров и 1U (1 единица активности) Taq-полимеразы. Для предотвращения испарения амплификационной смеси и образования конденсата на реакционную смесь наслаивали по 30 мкл минерального масла.
Параметры ПЦР были следующими: "горячий старт" в течение 5 мин при 95°С, затем 38 циклов амплификации в режиме 95°С - 30 сек; 65°С - 30 сек; 72°С - 30 сек, заключительный цикл элонгации ДНК - 7 мин при 72°С. Размер амплифицированного в ходе ПЦР фрагмента гена PRDX1 составил 165 пар нуклеотидов (п.н.). С целью проверки качества амплификации интересуемого фрагмента ДНК нуклеотидную последовательность продукта ПЦР гена PRDX1 секвенировали на генетическом анализаторе ABI PRISM 310 Genetic Analyzer с использованием набора реактивов BigDye Termination Kit 1.1 ("Applied Biosystems", США). Контроль успешности проведения ПЦР осуществлялся с помощью электрофореза продуктов амплификации на 2% агарозном геле. Обнаружение полиморфизма rs17522918 гена PRDX1 проводилось путем обработки ампликона 5U (5 единиц активности) эндонуклеазой BstH2I (ООО "Сибэнзим", г.Новосибирск; прототип HaeII) согласно протоколу, описанному производителем фермента. Рестрикционную смесь термостатировали в течение 6 ч при температуре 65°С. После инкубации фрагменты ДНК фракционировали с помощью электрофореза в 2% агарозном геле, приготовленном на основе ТАЕ буфера (0,089 М Трис-HCl, 2 мМ ЭДТА, 0,089М борная кислота) с 0,01% бромистым этидием. Фракционирование фрагментов ДНК проводили в камере для горизонтального электрофореза SE-2 (ООО "Хеликон", г.Москва) в течение 25 мин при напряжении 180В. В качестве маркера молекулярного веса использовали ДНК фага λ, гидролизированную эндонуклеазой PstI. Разделенные фрагменты ДНК визуализировали на трансиллюминаторе с помощью прибора компьютерной видеосъемки GDS-8000 ("UVP", США). Документирование и обработка изображений электрофоретических гелей проводилась с помощью аналитического пакета Labworks.
Для демонстрации эффективности разработанного способа идентификации полиморфизма rs17522918 гена PRDX1 было проведено генотипирование тотальной ДНК 20 добровольцев. Результаты электрофоретического разделения продуктов ПЦР-рестрикции полиморфизма rs17522918 гена PRDX1 представлены на фигуре. При наличии аллеля дикого типа С существует сайт узнавания для эндонуклеазы BstH2I, которая расщепляет ампликон размером 165 п.н. на два фрагмента 81 и 84 п.н. (при электрофоретическом разделении они накладываются друг на друга). При наличии мутантного аллеля А гена PRDX1 происходит потеря сайта узнавания для эндонуклеазы BstH2I, в результате чего ампликон остается нерасщепленным данной рестриктазой и визуализируется в виде одного фрагмента размером 165 п.н. У гетерозиготных носителей благодаря наличию обоих аллельных вариантов гена присутствуют все три фрагмента ДНК: 165, 81 и 84 п.н.
Таким образом, представленные результаты показывают, что предлагаемый способ позволяет эффективно идентифицировать полиморфизм rs17522918 в гене пероксиредоксина-1 с помощью предложенного нами метода ПЦР-ПДРФ. В связи с незначительной себестоимостью анализа, обусловленной низкой ценой эндонуклеазы BstH2I отечественного производства ООО "Сибэнзим" (http://russia.sibenzyme.com/info59.php), предлагаемый способ генотипирования может быть применен в любой ПЦР-лаборатории с минимальным набором оборудования и реактивов.
Claims (1)
- Способ генотипирования полиморфизма rs17522918 гена пероксиредоксина-1 у человека, включающий генотипирование полиморфизма методами полимеразной цепной реакции и полиморфизма длин рестрикционных фрагментов с использованием праймеров с SEQ ID NO 1-2 и эндонуклеазы BstH2 I для дифференцировки аллелей С и А полиморфизма rs17522918 гена PRDX1, при этом гомозиготному генотипу дикого типа СС соответствуют длины рестрикционных фрагментов размерами 81 и 84 пар нуклеотидов, гомозиготному мутантному генотипу АА - длины рестрикционных фрагментов размером 165 пар нуклеотидов, гетерозиготному генотипу СА - длины рестрикционных фрагментов размерами 165, 81 и 84 пар нуклеотидов.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2011109770/10A RU2458145C1 (ru) | 2011-03-15 | 2011-03-15 | СПОСОБ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ПОЛИМОРФИЗМА rs17522918 ГЕНА ПЕРОКСИРЕДОКСИНА-1 У ЧЕЛОВЕКА |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2011109770/10A RU2458145C1 (ru) | 2011-03-15 | 2011-03-15 | СПОСОБ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ПОЛИМОРФИЗМА rs17522918 ГЕНА ПЕРОКСИРЕДОКСИНА-1 У ЧЕЛОВЕКА |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2458145C1 true RU2458145C1 (ru) | 2012-08-10 |
Family
ID=46849609
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2011109770/10A RU2458145C1 (ru) | 2011-03-15 | 2011-03-15 | СПОСОБ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ПОЛИМОРФИЗМА rs17522918 ГЕНА ПЕРОКСИРЕДОКСИНА-1 У ЧЕЛОВЕКА |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2458145C1 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2528743C1 (ru) * | 2013-01-29 | 2014-09-20 | Рамиль Ришадович Вафин | Способ проведения пцр-пдрф для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям а и к гена dgat1 |
RU2549688C1 (ru) * | 2013-11-19 | 2015-04-27 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Курский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации" | СПОСОБ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ПОЛИМОРФИЗМА rs2551715 ГЕНА ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ У ЧЕЛОВЕКА |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6783961B1 (en) * | 1999-02-26 | 2004-08-31 | Genset S.A. | Expressed sequence tags and encoded human proteins |
-
2011
- 2011-03-15 RU RU2011109770/10A patent/RU2458145C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6783961B1 (en) * | 1999-02-26 | 2004-08-31 | Genset S.A. | Expressed sequence tags and encoded human proteins |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
СОЛОДИЛОВА М.А. Автореферат дисс. на соискание ученой степени д.б.н. - М., 2009. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2528743C1 (ru) * | 2013-01-29 | 2014-09-20 | Рамиль Ришадович Вафин | Способ проведения пцр-пдрф для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям а и к гена dgat1 |
RU2549688C1 (ru) * | 2013-11-19 | 2015-04-27 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Курский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации" | СПОСОБ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ПОЛИМОРФИЗМА rs2551715 ГЕНА ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ У ЧЕЛОВЕКА |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Jiggins et al. | The maintenance of species differences across a Heliconius hybrid zone | |
Williams et al. | SNP identification, verification, and utility for population genetics in a non-model genus | |
Muñoz-Calderón et al. | Oral transmission of Chagas disease: typing of Trypanosoma cruzi from five outbreaks occurred in Venezuela shows multiclonal and common infections in patients, vectors and reservoirs | |
Luetkemeier et al. | Multiple Asian pig origins revealed through genomic analyses | |
Okamura et al. | Comparative genome analysis of the mouse imprinted gene impact and its nonimprinted human homolog IMPACT: toward the structural basis for species-specific imprinting | |
Mozhui et al. | Genetic regulation of Nrnx1 expression: an integrative cross-species analysis of schizophrenia candidate genes | |
Donnelly et al. | Nuclear DNA recapitulates the cryptic mitochondrial lineages of Lumbricus rubellus and suggests the existence of cryptic species in an ecotoxological soil sentinel | |
Calvete et al. | Segmental duplication, microinversion, and gene loss associated with a complex inversion breakpoint region in Drosophila | |
Lanzavecchia et al. | Microsatellite markers from the'South American fruit fly'Anastrepha fraterculus: a valuable tool for population genetic analysis and SIT applications | |
Seifert et al. | DNA sequence variation and development of SNP markers in beech (Fagus sylvatica L.) | |
Zhang et al. | Whole-genome resequencing from bulked-segregant analysis reveals gene set based association analyses for the Vibrio anguillarum resistance of turbot (Scophthalmus maximus) | |
CN104894230A (zh) | 一种hla-dqb1基因分型的组特异性引物pcr-sbt方法及试剂 | |
RU2458145C1 (ru) | СПОСОБ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ПОЛИМОРФИЗМА rs17522918 ГЕНА ПЕРОКСИРЕДОКСИНА-1 У ЧЕЛОВЕКА | |
Terol et al. | Involvement of a citrus meiotic recombination TTC-repeat motif in the formation of gross deletions generated by ionizing radiation and MULE activation | |
Grainger et al. | Genetic analysis of atherosclerosis identifies a major susceptibility locus in the major histocompatibility complex of mice | |
Chen et al. | Eight SNVs in NF-κB pathway genes and their different performances between subclinical mastitis and mixed Chinese Holstein cows | |
Kim et al. | Development of single nucleotide polymorphism markers specific to Apis mellifera (Hymenoptera: Apidae) line displaying high hygienic behavior against Varroa destructor, an ectoparasitic mite | |
RU2458146C1 (ru) | СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПОЛИМОРФИЗМА rs1128446 ГЕНА ТИОРЕДОКСИНРЕДУКТАЗЫ-1 У ЧЕЛОВЕКА | |
CN102181517A (zh) | 绵羊mstn基因启动子区两个新snp位点检测及其检测方法的建立 | |
CN113265471B (zh) | 一种检测绵羊fasn基因单核苷酸多态性的方法及其在肉质性状早期筛选中的应用 | |
Shin et al. | Genetic association of phosphodiesterase 1B (PDE1B) with carcass traits in Korean cattle | |
Faria et al. | Molecular tools for species discrimination and detection of hybridization between two closely related Clupeid fishes Alosa alosa and A. fallax | |
RU2549688C1 (ru) | СПОСОБ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ПОЛИМОРФИЗМА rs2551715 ГЕНА ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ У ЧЕЛОВЕКА | |
Fu et al. | Investigation of JAK1 and STAT3 polymorphisms and their gene–gene interactions in nonspecific digestive disorder of rabbits | |
Wu et al. | Evaluation of genetic diversity and relationships within and between two breeds of duck based on microsatellite markers |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20130316 |