RU2445768C1 - Method for obtaining genetically modified plants of kalanchoe, expressing gene of cecropin p1 - Google Patents

Method for obtaining genetically modified plants of kalanchoe, expressing gene of cecropin p1 Download PDF

Info

Publication number
RU2445768C1
RU2445768C1 RU2010130041/10A RU2010130041A RU2445768C1 RU 2445768 C1 RU2445768 C1 RU 2445768C1 RU 2010130041/10 A RU2010130041/10 A RU 2010130041/10A RU 2010130041 A RU2010130041 A RU 2010130041A RU 2445768 C1 RU2445768 C1 RU 2445768C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
kalanchoe
plants
cecropin
transgenic
gene
Prior art date
Application number
RU2010130041/10A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2010130041A (en
Inventor
Наталья Сергеевна Захарченко (RU)
Наталья Сергеевна Захарченко
Анна Александровна Лебедева (RU)
Анна Александровна Лебедева
Ярослав Иванович Бурьянов (RU)
Ярослав Иванович Бурьянов
Original Assignee
Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН filed Critical Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
Priority to RU2010130041/10A priority Critical patent/RU2445768C1/en
Publication of RU2010130041A publication Critical patent/RU2010130041A/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2445768C1 publication Critical patent/RU2445768C1/en

Links

Images

Abstract

FIELD: agriculture.
SUBSTANCE: invention relates to the field of plant biotechnology. A method is proposed for obtaining genetically modified plants of genus Kalanchoe expressing the gene of cecropin P1 and having antimicrobial activity.
EFFECT: use of the invention provides increased bactericidal properties of plants of genus Kalanchoe, which may find further application in pharmacology.
3 cl, 1 tbl, 15 ex, 5 dwg

Description

Изобретение относится к области селекции и биотехнологии растений, в частности к генной инженерии растений. Изобретение может быть использовано для получения генетически модифицированных растений каланхоэ, экспрессирующих ген антимикробного пептида - цекропина Р1.The invention relates to the field of plant breeding and biotechnology, in particular to the genetic engineering of plants. The invention can be used to obtain genetically modified Kalanchoe plants expressing the gene of the antimicrobial peptide - cecropin P1.

Каланхоэ - лекарственное растение, сок которого используют для лечения ожогов, язв, кожных ран и в качестве биостимулятора при пересадке кожи. В соке этого многолетнего травянистого растения содержатся флавоноиды, дубильные вещества, витамин С, микро- и макроэлементы: алюминий, магний, железо, кальций, кремний, марганец, медь. В листьях каланхоэ обнаружены полисахариды, органические кислоты: яблочная, щавелевая, уксусная, а также ферменты, из которых получают биологически активные препараты. Каланхоэ оказывает общее благотворное влияние на иммунитет человека.Kalanchoe is a medicinal plant whose juice is used to treat burns, ulcers, skin wounds and as a biostimulant for skin grafts. The juice of this perennial herb contains flavonoids, tannins, vitamin C, micro and macro elements: aluminum, magnesium, iron, calcium, silicon, manganese, copper. Polysaccharides, organic acids: malic, oxalic, acetic, and also enzymes from which biologically active preparations are obtained are found in Kalanchoe leaves. Kalanchoe has a general beneficial effect on human immunity.

Повышение лечебных и бактерицидных свойств каланхоэ можно получить за счет экспрессии в растениях генов антибактериальных пептидов. В настоящее время антимикробные пептиды рассматривают как перспективную альтернативу классическим антибиотикам. Антимикробные пептиды различных классов найдены у всех эукариот, в том числе у растений и человека. Они являются интегрированной частью их иммунной системы, проявляют специфическую антибиотическую активность против различных патогенных бактерий и грибов и обладают апоптозной активностью [1].An increase in the therapeutic and bactericidal properties of Kalanchoe can be obtained through the expression of antibacterial peptide genes in plants. Currently, antimicrobial peptides are considered as a promising alternative to classic antibiotics. Antimicrobial peptides of various classes were found in all eukaryotes, including plants and humans. They are an integrated part of their immune system, exhibit specific antibiotic activity against various pathogenic bacteria and fungi and have apoptotic activity [1].

Механизм действия антимикробных пептидов связан с нарушением целостности клеточной мембраны патогенов и последующей их гибелью. В отличие от разнообразной защиты против классических антибиотиков, микроорганизмы не обладают механизмами устойчивости против антимикробных пептидов. В настоящее время установлена структура более 700 таких соединений, характерные свойства которых - суммарный положительный заряд и амфифильность. Антимикробные пептиды вызывают лизис клеток бактерий и грибов, нарушая целостность мембран и повышая их проницаемость. В концентрации 0.1-5 мкМ они проявляют литическую активность против различных микроорганизмов, но не по отношению к клеткам животных и растений [2].The mechanism of action of antimicrobial peptides is associated with a violation of the integrity of the cell membrane of pathogens and their subsequent death. In contrast to the diverse protection against classical antibiotics, microorganisms do not have resistance mechanisms against antimicrobial peptides. At present, the structure of more than 700 such compounds is established, whose characteristic properties are the total positive charge and amphiphilicity. Antimicrobial peptides cause the lysis of bacterial and fungal cells, disrupting the integrity of the membranes and increasing their permeability. At a concentration of 0.1–5 μM, they exhibit lytic activity against various microorganisms, but not with respect to animal and plant cells [2].

В настоящее время методы генетической инженерии позволяют синтезировать и производить в клетках различных органов гетерологичные белки с терапевтической целью. Трансгенные растения являются перспективными объектами для получения дешевых и безопасных рекомбинантных белков по сравнению с их традиционными продуцентами. В бактериальных системах экспрессии синтезируемые белки могут не приобретать нативной конформации и требуют сложной и дорогостоящей процедуры их очистки.Currently, genetic engineering methods allow the synthesis and production of heterologous proteins in the cells of various organs for therapeutic purposes. Transgenic plants are promising objects for obtaining cheap and safe recombinant proteins compared to their traditional producers. In bacterial expression systems, the synthesized proteins may not acquire a native conformation and require a complex and expensive procedure for their purification.

Трансгенные растения представляют собой экономически выгодную альтернативу другим системам экспрессии и могут быть использованы в качестве "биофабрик" по производству целевых белков для медицинских и фармацевтических целей.Transgenic plants are a cost-effective alternative to other expression systems and can be used as biofactories for the production of target proteins for medical and pharmaceutical purposes.

Так, с помощью генно-инженерных методов получены растения, способные производить ряд биофармацевтических продуктов для лечения различных заболеваний человека, например, эритропоэтин для лечения анемии, инсулин для лечения диабета, также получены трансгенные растения, экспрессирующие энкефалины, α-интерферон, человеческий сывороточный альбумин [3, 4]. Что касается получения трансгенных растений каланхоэ, то имеются только единичные публикации по трансформации некоторых видов этих растений.So, using genetic engineering methods, plants have been obtained that are capable of producing a number of biopharmaceutical products for the treatment of various human diseases, for example, erythropoietin for the treatment of anemia, insulin for the treatment of diabetes, transgenic plants expressing enkephalins, α-interferon, human serum albumin have also been obtained [ 3, 4]. As for the production of transgenic Kalanchoe plants, there are only a few publications on the transformation of some species of these plants.

Известен способ агробактериальной трансформации вида каланхоэ Kalanchoe daigremontiana, когда исследовалось соединение фруктозо-2.6-бифосфат (Fru2,6-P2), играющее важную роль в регуляции углеродного обмена при САМ фотосинтезе (кислотный метаболизм толстянковых). Трансгенные растения каланхоэ содержали ген 6-фосфофрукто-2-киназу (35S/6-PF-2-K), клонированный в бинарный вектор pBin19 в штамме агробактерий Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (pAL4404). Трансформация растений этим геном приводила к увеличению концентрации Fru2,6-P2 в листьях и, как следствие, к повышению устойчивости растений к стрессовым условиям.There is a method of agrobacterial transformation of the species of Kalanchoe Kalanchoe daigremontiana, when the compound fructose-2.6-bisphosphate (Fru2,6-P 2 ) was studied, which plays an important role in the regulation of carbon metabolism in CAM photosynthesis (acid metabolism of Crassulaceae). Transgenic Kalanchoe plants contained the 6-phosphofructo-2-kinase (35S / 6-PF-2-K) gene cloned into the pBin19 binary vector in the Agrobacterium tumefaciens LBA4404 strain of agrobacteria (pAL4404). The transformation of plants by this gene led to an increase in the concentration of Fru2,6-P 2 in the leaves and, as a result, to increased resistance of plants to stressful conditions.

В качестве эксплантов для трансформации использовали сегменты листьев. В процессе трансформации экспланты культивировали на селективной среде МС (Мурашиге-Скуга) [5], содержащей 3,0% сахарозы, 0.8% агара, 10 мкМ кинетина (КТ), 0.5 мкМ 2.4.дихлорфеноксиуксусной кислоты (2.4 Д), 100 мг/л карбенициллина (Кб) и 50 мг/л канамицина для индукции каллусогенеза. После образования каллусов через 3 недели, экспланты переносили на свежую среду МС, содержащую 3% сахарозы, 0.8% агара, 5 мкМ бензиладенина (БА), 100 мг/л Кб и 50 мг/л Км для побегообразования (6-8 недель). Образовавшиеся побеги для укоренения переносили в сосуды со средой МС, содержащей 2% сахарозы, 0.8% агара и 20 мг/л Км. Растения культивировали при 24°C, световой режим: 14 ч день и 10 ч ночь, 3 клк [6].Leaf segments were used as explants for transformation. During the transformation process, the explants were cultivated on a selective MS medium (Murashige-Skoog) [5] containing 3.0% sucrose, 0.8% agar, 10 μM kinetin (CT), 0.5 μM 2.4. Dichlorophenoxyacetic acid (2.4 D), 100 mg / l of carbenicillin (Kb) and 50 mg / l of kanamycin for the induction of callusogenesis. After the formation of calli in 3 weeks, the explants were transferred to fresh MS medium containing 3% sucrose, 0.8% agar, 5 μM benzyladenine (BA), 100 mg / L Kb and 50 mg / L Km for shoot formation (6-8 weeks). The resulting shoots for rooting were transferred into vessels with MS medium containing 2% sucrose, 0.8% agar, and 20 mg / L Km. Plants were cultivated at 24 ° C; light conditions: 14 h day and 10 h night, 3 klx [6].

Этот способ трансформации имеет недостаток - в нем отсутствует органогенез и применена стадия каллусообразования, что повышает вероятность сомаклональной изменчивости.This method of transformation has a drawback - there is no organogenesis in it and the stage of callus formation is applied, which increases the likelihood of somaclonal variation.

Известен способ трансформации каланхоэ вида Ласиниата (Kalanchoe laciniata). Листовые экспланты каланхоэ кокультивировали с агробактериальными штаммами Agrobacterium tumefaciens A208SE, Agrobacterium tumefaciens GV3111SE, Agrobacterium tumefaciens EHA101, несущими бинарный вектор pRDA93. Вектор содержал гены nptII (неомицинфосфотрансферазы II) и gus (β-глюкуронидазы).A known method of transformation of Kalanchoe species Lasinyata (Kalanchoe laciniata). Kalanchoe leaf explants were cocultivated with agrobacterial strains Agrobacterium tumefaciens A208SE, Agrobacterium tumefaciens GV3111SE, Agrobacterium tumefaciens EHA101 carrying the binary vector pRDA93. The vector contained the genes nptII (neomycin phosphotransferase II) and gus (β-glucuronidase).

Для получения трансгенных побегов использовали 3 стадии культивирования: 1-я стадия включала индукцию побегов на среде МС, содержащей 1 мг/л БА и 0.2 мг/л ИУК (индолилуксусной кислоты); 2-я стадия - элонгацию побегов на среде МС, содержащей 0.5 мг/л КТ и 0.1 мг/л ИУК. 3-я стадия - укоренение побегов - включала культивирование растений на среде, содержащей 1/2 солей МС и 0.2 мг/л ИУК [7].Three stages of cultivation were used to obtain transgenic shoots: the 1st stage included the induction of shoots on MS medium containing 1 mg / L BA and 0.2 mg / L IAA (indolylacetic acid); Stage 2 - elongation of shoots on MS medium containing 0.5 mg / l CT and 0.1 mg / l IAA. 3rd step - rooting shoots - comprises culturing plants on a medium containing 1/2 MS salts and 0.2 mg / l IAA [7].

Известен способ получения трансгенных растений каланхоэ вида Блосфельдиана (Kalanchoe blossfeldiana) с уменьшенной чувствительностью к растительному гормону этилену, за счет экспрессии мутантного рецептора гена etr1-1 из арабидопсиса (Arabidopsis thaliana) под контролем цветоспецифичного промотора fbp1 из петунии (Petunia).A known method for producing transgenic Kalanchoe plants of the species Blosfeldiana (Kalanchoe blossfeldiana) with reduced sensitivity to the plant hormone ethylene, by expression of the mutant etr1-1 gene receptor from Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) under the control of the color-specific fbp1 promoter from petunia (Petunia).

В этой работе генетическую трансформацию каланхоэ проводили с помощью агробактерий Agrobacterium tumefaciens AGL0 с бинарным вектором рВЕO210:: etr1-1. Для регенерации побегов использовали селективную среду, содержащую регуляторы роста: 0.45 мкМ тидиазурон (ТДЗ), 0.57 мМ ИУК и антибиотики: 100 мг/л канамицин (Км) и 300 мг/л цефотаксим. Субкультивацию проводили через каждые 3 недели. Через 4 месяца побеги пересаживали на среду, содержащую 0.57 мМ гибберелловой кислоты (ГА) и 0.57 мМ нафтилуксусной кислоты (НУК) для элонгации и укоренения побегов. Через 3 месяца отдельные укорененные растения высаживали в почву.In this work, the genetic transformation of Kalanchoe was performed using agrobacteria Agrobacterium tumefaciens AGL0 with the binary vector pBEO210 :: etr1-1. For shoot regeneration, we used a selective medium containing growth regulators: 0.45 μM thidiazuron (TDZ), 0.57 mm IAA and antibiotics: 100 mg / L kanamycin (Km) and 300 mg / L cefotaxime. Subculture was performed every 3 weeks. After 4 months, the shoots were transplanted onto a medium containing 0.57 mM gibberellic acid (HA) and 0.57 mM naphthylacetic acid (NAA) for elongation and rooting of the shoots. After 3 months, individual rooted plants were planted in the soil.

Трансгенные растения обладали замедленной скоростью старения. Увядание контрольных цветов начиналось на 2-й день при добавлении этилена 2 мкл/л, в то время как цветы трансгенных растений увядали на 10-й день [8].Transgenic plants had a slower rate of aging. Withering of the control flowers began on the 2nd day with the addition of ethylene 2 μl / l, while the flowers of transgenic plants wilted on the 10th day [8].

Известен способ агробактериальной трансформации каланхоэ вида Дегремона (Kalanchoe daigremontiana). Используя механизмы процессов органогенеза и эмбриогенеза исследовали регуляцию вегетативного размножения в листьях каланхоэ. Супрессия мутантного гена stm (shoot meristemless) из арабидопсиса, перенесенного в растения каланхоэ, исключала возможность образования молодых побегов («деток») по краю листа каланхоэ [9, 10].A known method of agrobacterial transformation of Kalanchoe of the species Degremon (Kalanchoe daigremontiana). Using the mechanisms of organogenesis and embryogenesis, we studied the regulation of vegetative propagation in leaves of Kalanchoe. Suppression of the mutant stm (shoot meristemless) gene from arabidopsis transferred to Kalanchoe plants excluded the possibility of the formation of young shoots (“children”) along the edge of the Kalanchoe leaf [9, 10].

Однако эти способы имеют ряд недостатков - низкая эффективность трансформации - около 3%, использовалось большое количество регуляторов роста, из-за чего эксперимент по получению трансгенных растений занимает длительный период времени (больше года).However, these methods have several disadvantages - low transformation efficiency of about 3%, a large number of growth regulators were used, which is why the experiment to obtain transgenic plants takes a long period of time (more than a year).

Рассмотренные примеры способов генетической трансформации различных видов каланхоэ указывают на их отличия как в использовании векторных систем, так и в методах селекции трансформированных клеток и их культивирования и регенерации до целых растений, что свидетельствует о необходимости разработки эффективных специфических способов трансформации каждого конкретного вида каланхоэ.The considered examples of methods for the genetic transformation of various types of Kalanchoe indicate their differences both in the use of vector systems and in the methods of selection of transformed cells and their cultivation and regeneration to whole plants, which indicates the need to develop effective specific methods of transformation of each specific type of Kalanchoe.

Что касается каланхоэ перистого (Kalanchoe pinnata), широко применяемого в фармакологии, то в литературе отсутствуют данные о получении трансформированных растений этого вида.As for the Kalanchoe pinnata (Kalanchoe pinnata), widely used in pharmacology, in the literature there are no data on obtaining transformed plants of this species.

Цекропин Р1 нематод относится к группе линейных α-спиральных пептидов, не содержащих цистеина. Изучение его структуры показало, что в отличие от цекропинов насекомых он состоит из одной длинной положительно заряженной α-спирали, в образовании которой задействованы практически все аминокислотные остатки.Cecropin P1 nematodes belongs to the group of linear α-helical peptides that do not contain cysteine. A study of its structure showed that, unlike insect cecropins, it consists of one long positively charged α-helix, in the formation of which almost all amino acid residues are involved.

В связи с особенностями действия на мембраны цекропин Р1 обладает уникальными свойствами. Он высоко активен против грамотрицательных бактерий (Pseudomonas aeruginosa IFO3899, Salmonella typhimurium IFO 13245, Serratia marcescens IFO3736, Escherichia coli JM 109, Acinetobacter calcoaceticus Ac 11), против грамположительных бактерий (Staphylococcus aureus IFO12732, Bacillus subtillis IFO3134, Bacillus megaterium Bm 11, Micrococcus luteus IFO12708), а также против дрожжей (Sacharomyces cerevisiae MAFF113011, Candida albicans IFO1060), опухолевых клеток [12] и грибных фитопатогенов [13].In connection with the peculiarities of action on membranes, cecropin P1 has unique properties. It is highly active against gram-negative bacteria (Pseudomonas aeruginosa IFO3899, Salmonella typhimurium IFO 13245, Serratia marcescens IFO3736, Escherichia coli JM 109, Acinetobacter calcoaceticus Ac 11), against gram-positive bacteria (Staphylococcus aureus IFO3us Bactus MbO1323210 IFO12708), as well as against yeast (Sacharomyces cerevisiae MAFF113011, Candida albicans IFO1060), tumor cells [12] and fungal phytopathogens [13].

Таким образом, представляется актуальным биосинтез в трансгенных растениях, в частности в каланхоэ, цекропина Р1 для его фармацевтического и медицинского использования. Трансгенные растения свободны от вирусов патогенных для человека и, следовательно, не требуется очистка получаемого в них продукта от вирусов.Thus, biosynthesis in transgenic plants, in particular in Kalanchoe, Cecropin P1 for its pharmaceutical and medical use, seems to be relevant. Transgenic plants are free of viruses pathogenic to humans and, therefore, the purification of the resulting product from viruses is not required.

Наиболее близким к предлагаемому является способ, описанный в работе [14], он включает получение и анализ трансгенных растений каланхоэ перистое (Kalanchoe pinnata), экспрессирующее синтетический ген цекропина Р1. Для трансформации растений каланхоэ использовалась конструкция - вектор pGA482::cecP1. Полученную конструкцию переносили в клетки агробактерий GV310 (pMP90RK), которую использовали для трансформации растений.Closest to the proposed is the method described in [14], it involves the preparation and analysis of transgenic plants of Kalanchoe pinnata (Kalanchoe pinnata), expressing the synthetic gene cecropin P1. For the transformation of Kalanchoe plants, the construction was used - the vector pGA482 :: cecP1. The resulting construct was transferred to agrobacterial cells GV310 (pMP90RK), which was used to transform plants.

Результаты биотестирования по устойчивости показали, что трансгенные растения каланхоэ проявляли антибактериальную и антифунгальную активность против Erwinia carotovora, Pseudomonas syringae, Sclerotinium sclerotiorum и Phytophthora infestans.Resistance biotesting results showed that transgenic Kalanchoe plants showed antibacterial and antifungal activity against Erwinia carotovora, Pseudomonas syringae, Sclerotinium sclerotiorum and Phytophthora infestans.

В данной работе описано получение трансгенного растения одного вида, проявляющее антибактериальную и антифунгальную активность против четырех видов фитопатогенов и не проявляющего активность против патогенов человека.This work describes the preparation of a transgenic plant of one species, exhibiting antibacterial and antifungal activity against four types of phytopathogens and not showing activity against human pathogens.

Задачей указанного изобретения является разработка эффективного способа получения генетически модифицированных растений рода Kalanchoe, экспрессирующих ген цекропина Р1.The objective of this invention is to develop an effective method for producing genetically modified plants of the genus Kalanchoe expressing the gene cecropin P1.

Технический эффект, который может быть получен при использовании предлагаемого изобретения, заключается в том, что полученные трансгенные растения каланхоэ обладают ценными фармакологическими свойствами и повышенной устойчивостью к патогенам, кроме того, способ обеспечивает высокую эффективность трансформации и сокращение сроков получения генетически модифицированных растений. Сок полученных трансгенных растений каланхоэ обладает свойством сохранять антимикробную активность за счет экспрессии цекропина Р1 после кипячения, что может быть полезным для получения фармакологического препарата сока каланхоэ.The technical effect that can be obtained by using the present invention is that the obtained transgenic Kalanchoe plants possess valuable pharmacological properties and increased resistance to pathogens, in addition, the method provides high transformation efficiency and shortens the time for obtaining genetically modified plants. The juice of the transgenic Kalanchoe plants obtained has the property of preserving antimicrobial activity due to the expression of cecropin P1 after boiling, which may be useful for obtaining a pharmacological preparation of Kalanchoe juice.

Поставленная задача решается тем, что проводят сокультивирование эксплантов растений, выбранных из ряда растений вида Kalanchoe daigremontiana, Kalanchoe laciniata, Kalanchoe blossfeldiana, Kalanchoe pinnata, со штаммом бактерий Agrobacterium tumefaciens GV3101(pMP90RK), содержащим плазмиду pGA482, несущую ген белка цекропина P1 cecP1. Помещают экспланты на питательную среду для прямой регенерации до фертильных трансгенных растений, имеющих внесенные гены и признаки исходного сорта. Для элиминации агробактерий используют антибиотик тикарциллин и стимулирующую морфогенез добавку - банановый порошок. Для регенерации растений используют питательную среду МС, содержащую 6-бензиламинопурин (БАП) в количестве 0.5-1.0 мг/л и нафтилуксусную кислоту (НУК) в количестве 0.07-0.1 мг/л.The problem is solved in that they carry out the co-cultivation of plant explants selected from a number of plants of the species Kalanchoe daigremontiana, Kalanchoe laciniata, Kalanchoe blossfeldiana, Kalanchoe pinnata, with a bacterial strain Agrobacterium tumefaciens GV3101 (pMP90RK) containing the plasmid pGA gene PGA482. Explants are placed on a nutrient medium for direct regeneration to fertile transgenic plants having introduced genes and traits of the original variety. To eliminate agrobacteria, they use the antibiotic ticarcillin and a morphogenesis-stimulating additive - banana powder. For plant regeneration, MS nutrient medium containing 6-benzylaminopurin (BAP) in an amount of 0.5-1.0 mg / L and naphthylacetic acid (NAA) in an amount of 0.07-0.1 mg / L is used.

В качестве целевого гена для трансформации используют синтетический ген антимикробного пептида цекропина Р1 (cecP1), кодирующий 31-членную аминокислотную последовательность: SWLSKTAKKLENSAKKRISEGIAIAIQGGPR [11].As the target gene for transformation, the synthetic gene of the antimicrobial peptide cecropin P1 (cecP1) encoding the 31-membered amino acid sequence: SWLSKTAKKLENSAKKRISEGIAIAIQGGPR [11] is used.

Штамм бактерий Agrobacterium tumefaciens GV3101(pMP90RK) [15] содержит плазмиду pGA482 [16]. При этом в состав кассеты экспрессии плазмиды pGA482 входят генетические конструкции, выбранные из ряда: промотор CaMV 35S - ген cecP1 - терминатор pACaMV;The bacterial strain Agrobacterium tumefaciens GV3101 (pMP90RK) [15] contains the plasmid pGA482 [16]. Moreover, the expression constructs of the plasmid pGA482 contain genetic constructs selected from the following: CaMV 35S promoter - cecP1 gene - pACaMV terminator;

промотор pNOS - ген nptII- терминатор pAnos.pNOS promoter - nptII gene terminator pAnos.

Сокультивацию эксплантов каланхоэ с агробактериями (процесс трансформации) предпочтительно осуществляют в течение 48±5 часов при 18 - 24±2°С. При этом для регенерации используют питательную среду МС, содержащую регуляторы роста 1 мг/л БАП, 0.1 мг/л НУК и 30 г/л бананового порошка (Banana powder, "Sigma") (БП).The co-cultivation of explants of Kalanchoe with agrobacteria (transformation process) is preferably carried out for 48 ± 5 hours at 18 - 24 ± 2 ° C. At the same time, MS nutrient medium containing growth regulators of 1 mg / L BAA, 0.1 mg / L NAA and 30 g / L Banana powder (Banana powder, "Sigma") (BP) is used for regeneration.

В качестве вектора для трансформации используют сконструированную при участии авторов предлагаемого изобретения плазмиду pGA482::сесР1 [17] (Фиг.1).As a vector for transformation, the plasmid pGA482 :: cecP1, constructed with the participation of the authors of the present invention, is used [17] (Figure 1).

Ген цекропина P1 (cecP1) встречается в природе у нематод млекопитающих, из которых он был выделен и охарактеризован [18].The cecropin P1 gene (cecP1) is found in nature in mammalian nematodes, from which it was isolated and characterized [18].

Векторная плазмида pGA482 с последовательностью cecP1, кодирующей пептид цекропин Р1, для переноса в растительные клетки конструировалась с использованием известных методов молекулярного клонирования [19] (Фиг.1).The pGA482 vector plasmid with the cecP1 sequence encoding the cecropin P1 peptide for construction into plant cells was constructed using known methods of molecular cloning [19] (Figure 1).

Частота регенерации трансгенных побегов является важным показателем эффективности способа генетической трансформации. Она складывается из эффективностей отдельных этапов, начиная с подготовки эксплантов и заканчивая составом среды для селекции трансформантов. Частота регенерации отражает число отдельных трансформантов при пересчете на число исходных инокулированных эксплантов.The frequency of regeneration of transgenic shoots is an important indicator of the effectiveness of the method of genetic transformation. It consists of the efficiencies of the individual stages, starting with the preparation of explants and ending with the composition of the medium for the selection of transformants. The regeneration frequency reflects the number of individual transformants when converted to the number of initial inoculated explants.

Полученные данные приводятся в таблице 1. Из таблицы видно, что усовершенствованный метод трансформации, который включает добавление в питательную среду для регенерации бананового порошка, стимулирующего морфогенез, и использование нового антибиотика тиракциллина повышает эффективность регенерации трансформированных побегов до 30%, по сравнению с методами трансформации, когда используется антибиотик цефатоксим и не добавляется банановый порошок.The data obtained are shown in table 1. It can be seen from the table that the improved transformation method, which includes adding banana powder that stimulates morphogenesis to the nutrient medium and using the new antibiotic tiracillin, increases the regeneration efficiency of transformed shoots by up to 30%, compared with transformation methods, when cefatoxime antibiotic is used and banana powder is not added.

Проводят анализ природы полученных растений. С целью изучения встраивания Т-ДНК в геном канамицин-резистентных линий, полученных генетической трансформации посредством бинарного вектора pGA482, проводят ПЦР анализ ДНК растений. Для выделения геномной ДНК и белковых экстрактов используют материал как in vitro, так и in vivo. Для анализа ДНК растений, выращенных in vitro, молодые побеги возраста 2-3 недели, растирают в жидком азоте [20]. Из тепличного материала ДНК выделяют с применением 2хCTAБ-бyфepa [6].An analysis is made of the nature of the resulting plants. In order to study the incorporation of T-DNA into the genome of kanamycin-resistant lines obtained by genetic transformation using the binary vector pGA482, PCR analysis of plant DNA is performed. To isolate genomic DNA and protein extracts, material is used both in vitro and in vivo. To analyze the DNA of plants grown in vitro, young shoots of 2–3 weeks of age are ground in liquid nitrogen [20]. DNA is isolated from greenhouse material using 2 x CTAB-buffer [6].

Присутствие гена cecP1 в трансгенных растениях каланхоэ подтверждают методом ПНР с праймерами, специфичными для кодирующей области трансгенной конструкции.The presence of the cecP1 gene in transgenic Kalanchoe plants is confirmed by the NDP method with primers specific for the coding region of the transgenic construct.

Прямой поиск трансгенных растений каланхоэ, синтезирующих антимикробный пептид цекропин Р1, проводят методом вестерн-блот анализа.A direct search for transgenic Kalanchoe plants synthesizing the antimicrobial peptide Cecropin P1 is carried out by Western blot analysis.

Анализ уровня экспрессии цекропина Р1 в трансгенных растениях осуществляют методом ингибирования роста бактериальной культуры экстрактами трансгенных растений.Analysis of the expression level of cecropin P1 in transgenic plants is carried out by inhibiting the growth of a bacterial culture with extracts of transgenic plants.

На Фиг.1 представлена схема бинарного вектора pGA482::cecP1, где TL и TR - левый и правый краевые повторы Т-ДНК; CaMV35S - промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты; polyA - сигнал полиаденилирования; nptII - ген растительного селективного маркера неомицинфосфотрансферазы II; cecP1 - последовательность cecropinP1, кодирующая ген антимикробного пептида цекропина P1; oriV - начало репликации; Тетr - ген устойчивости к антибиотику тетрациклину для селекции бактерий; HindIII, X, Ss, Hp, K, C, Bg - сайты рестрикции рестриктаз HindIII, XhoII, SspI, HpaI, KpnI, CfrI, BglII.Figure 1 presents a diagram of the binary vector pGA482 :: cecP1, where TL and TR are the left and right edge repeats of T-DNA; CaMV35S - 35S RNA promoter of cauliflower mosaic virus; polyA - polyadenylation signal; nptII is a gene for a plant selective marker of neomycin phosphotransferase II; cecP1 — cecropinP1 sequence encoding the gene for the antimicrobial peptide cecropin P1; oriV - start of replication; Tet r - tetracycline antibiotic resistance gene for bacterial selection; HindIII, X, Ss, Hp, K, C, Bg are restriction enzyme restriction sites of HindIII, XhoII, SspI, HpaI, KpnI, CfrI, BglII.

В таблице 1 показана эффективность регенерации и трансформации каланхоэ. Указаны средние значения по результатам 3 опытов.Table 1 shows the efficiency of regeneration and transformation of Kalanchoe. The average values for the results of 3 experiments are indicated.

На Фиг.2А представлены результаты ПЦР-анализа ДНК трансгенных растений каланхоэ, содержащих ген cecP1 под контролем промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты: 1-4 - ДНК разных видов трансгенных растений; 5 - ДНК нетрансформированного растения; 6 - ДНК плазмиды, содержащей ген cecP1.Figure 2A shows the results of a PCR analysis of DNA of transgenic Kalanchoe plants containing the cecP1 gene under the control of the 35S promoter of cauliflower mosaic virus: 1-4 - DNA of different types of transgenic plants; 5 - DNA of an untransformed plant; 6 - DNA of a plasmid containing the cecP1 gene.

На Фиг.2Б показаны результаты вестерн-блот-анализа экстрактов листьев растений каланхоэ разных видов: 1-4 - растительные экстракты исследуемых растений (100 мкг общего белка); 5 - экстракт нетрансгенного растения; 6 - синтетический пептид цекропин Р1 (10 нг).On Figb shows the results of a Western blot analysis of leaf extracts of Kalanchoe plants of different species: 1-4 - plant extracts of the studied plants (100 μg of total protein); 5 - extract of a non-transgenic plant; 6 - synthetic peptide cecropin P1 (10 ng).

На Фиг.3 демонстируется ингибирующее действие растительных экстрактов из трансгенных (лунки 2-4) и контрольных (лунка 1) растений на рост штамма Staphylococeus aureus FDA 209-р, ИНА 00985, условно патогенного для человека.Figure 3 demonstrates the inhibitory effect of plant extracts from transgenic (wells 2-4) and control (well 1) plants on the growth of Staphylococeus aureus strain FDA 209-p, INA 00985, conditionally pathogenic for humans.

На Фиг.4 показано ингибирующее действие растительными экстрактами трансгенных (А) и контрольных растений (Б) на рост фитопатогенных бактерий Erwinia carotovora В15.Figure 4 shows the inhibitory effect of plant extracts of transgenic (A) and control plants (B) on the growth of phytopathogenic bacteria Erwinia carotovora B15.

На Фиг.5 - повышенная устойчивость трансгенных растений каланхоэ перистого к фитопатогенным бактериям Erwinia carotovora В15 (А) и фитопатогенным грибам Sclerotinia sclerotiorum (Б): 1 - лист нетрансформированного растения каланхоэ на 10-й день заражения - появление зон отмирания ткани; 2 - лист трансгенного растения с геном cecP1 - полное сохранение жизнеспособности.Figure 5 - increased resistance of transgenic plants of Kalanchoe pinnate to phytopathogenic bacteria Erwinia carotovora B15 (A) and phytopathogenic fungi Sclerotinia sclerotiorum (B): 1 - a sheet of an untransformed Kalanchoe plant on the 10th day of infection - the appearance of tissue death zones; 2 - a leaf of a transgenic plant with the cecP1 gene - complete preservation of viability.

Возможность осуществления предлагаемого способа подтверждается представленными примерами, но не ограничивается ими.The possibility of implementing the proposed method is confirmed by the presented examples, but is not limited to them.

Пример 1. Микроклональное размножение и культивирование в гноотобиотических условиях растений каланхоэ.Example 1. Microclonal propagation and cultivation under purulent biotic conditions of Kalanchoe plants.

Стерилизацию растительного материала проводят следующим образом: срезают молодые, полностью развернувшиеся листья каланхоэ, выращенные в теплице, дезинфицируют их, обработав 5% раствором гипохлорита натрия, содержащим 0,5% Твин 20 в течение 10 мин, затем ополаскивают трижды в стерильной дистиллированной воде. Разрезают листья на кусочки длиной 5-10 мм и помещают их на питательную среду МС, содержащую стандартный набор солей, 7 г/л агара, 30 г/л сахарозы (pH 5,8) и включающую в качестве регуляторов роста 6-бензиламинопурин 1 мг/л и нафтилуксусную кислоту 0.1 мг/л, а также добавку банановый порошок 30 г/л.Sterilization of plant material is carried out as follows: young, fully unfolded leaves of Kalanchoe grown in a greenhouse are cut off, they are disinfected by treating them with a 5% sodium hypochlorite solution containing 0.5% Tween 20 for 10 minutes, then rinsing three times in sterile distilled water. Cut the leaves into pieces with a length of 5-10 mm and place them on an MS nutrient medium containing a standard set of salts, 7 g / l agar, 30 g / l sucrose (pH 5.8) and including 6 mg benzylaminopurine as growth regulators / l and naphthylacetic acid 0.1 mg / l, as well as the addition of banana powder 30 g / l.

Экспланты инкубируют при 22-24°С, 16-часовом световом дне и освещенности 2000 лк. Придаточные побеги или регенеранты образуются из экспланта через 4 недели. Побеги отрезают и переносят в стеклянные пробирки со свежей средой МС. Черенкование растений проводят 1 раз в месяц. Для этого растение каланхоэ высотой 15-20 см делят на 4 части, оставляя на стебле 1-2 листа с междоузлиями, и рассаживают в пробирки.Explants are incubated at 22-24 ° C, a 16-hour daylight and an illumination of 2000 lux. Subsidiary shoots or regenerants form from the explant after 4 weeks. The shoots are cut off and transferred to glass tubes with fresh MS medium. Cuttings of plants are carried out 1 time per month. For this, a Kalanchoe plant 15-20 cm high is divided into 4 parts, leaving 1-2 leaves with internodes on the stem and planted in test tubes.

Через 2 месяца проводят очередное черенкование и таким образом растения размножают до нужного количества. Затем микроразмноженный in vitro посадочный материал используют для трансформации. Трансформированные растения каланхоэ из пробирок высаживают в закрытый грунт в условия in vivo для адаптации. Через 2 недели, когда растения укоренятся, их пересаживают в почву для продолжения вегетации и получения семян.After 2 months, the next cuttings are carried out and thus the plants are propagated to the desired amount. Then micropropagated in vitro planting material is used for transformation. Transformed Kalanchoe plants from test tubes are planted in closed ground in vivo for adaptation. After 2 weeks, when the plants take root, they are transplanted into the soil to continue the growing season and obtain seeds.

Пример 2. Генные конструкции для трансформации каланхоэ.Example 2. Gene constructs for transformation of Kalanchoe.

Плазмиду pGA482, содержащую ген сесР1 и селективный ген устойчивости к канамицину nptII, переносят в штамм Agrobacterium tumefaciens GV3101(pMP90RK), который используют для трансформации растений каланхоэ.Plasmid pGA482, containing the cecP1 gene and the selective kptam resistance nptII gene, is transferred to the Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 (pMP90RK), which is used to transform Kalanchoe plants.

Пример 3. Условия трансформации и селекции эксплантов Kalanchoe pinnata.Example 3. Conditions for the transformation and selection of explants Kalanchoe pinnata.

А. Подготовка бактериальной суспензии. Бактериальную суспензию штамма Agrobacterium tumefaciens GV3101(pMP90RK, pGA482::сесР1) для инокуляции наращивают в течение ночи в 50 мл среды LB [19] при 28°С. Перед инокуляцией суспензию клеток центрифугируют при 6 т. об/мин в течение 5 минут. Осадок промывают в 50 мл жидкой среды МС для удаления остатков LB. Промытый осадок клеток ресуспендируют в жидкой среде МС до О.П.600=0.5.A. Preparation of the bacterial suspension. The bacterial suspension of the strain Agrobacterium tumefaciens GV3101 (pMP90RK, pGA482 :: cecP1) for inoculation was increased overnight in 50 ml of LB medium [19] at 28 ° C. Before inoculation, the cell suspension is centrifuged at 6 tons / min for 5 minutes. The precipitate is washed in 50 ml of liquid MS medium to remove LB residues. The washed cell pellet is resuspended in liquid MS medium to O. P. 600 = 0.5.

Б. Подготовка растительных эксплантов. Со стерильных растений, выращенных описанным выше способом, за два дня до трансформации срезают молодые листья, обрезают у них кромку и центральную жилку. Затем скальпелем на чашке Петри в присутствии небольшого количества жидкой среды МС листья нарезают на небольшие кусочки размером 0.5х05 см2, которые раскладывают на поверхности твердой среды МС, содержащей 1 мг/л БАП, 0.1 мг/л НУК и 30 г/л БП. Инкубацию проводят при температуре 22-24°C и 16-часовом световом дне в течение 2 суток.B. Preparation of plant explants. From sterile plants grown in the manner described above, two days before the transformation, young leaves are cut, their edge and central vein are cut off. Then, with a scalpel on a Petri dish in the presence of a small amount of liquid MS medium, the leaves are cut into small pieces 0.5 × 05 cm 2 in size, which are laid on the surface of a solid MS medium containing 1 mg / L BAP, 0.1 mg / L NAA and 30 g / L BP. Incubation is carried out at a temperature of 22-24 ° C and a 16-hour daylight for 2 days.

Затем экспланты аккуратно пинцетом переносят в суспензию агробактерий Agrobacterium tumefaciens GV3101 (pMP90RK) на 20 минут. После этого экспланты переносят в стерильные чашки с бумажными фильтрами и подсушивают в течение 5 минут для удаления избытка агробактерий, после чего раскладывают на чашки со средой МС с 1 мг/л БАП, 0.1 мг/л НУК и 30 г/л БП на 2 суток. На следующем этапе трансформации экспланты переносят в чашку Петри с жидкой средой МС с добавлением 500 мг/л тикарциллина (Tr) и 5 минут перемешивают для удаления избытка агробактерий.Then the explants are carefully transferred with tweezers to a suspension of agrobacterium Agrobacterium tumefaciens GV3101 (pMP90RK) for 20 minutes. After that, the explants are transferred into sterile cups with paper filters and dried for 5 minutes to remove excess agrobacteria, after which they are laid out on plates with MS medium with 1 mg / L BAP, 0.1 mg / L NAA and 30 g / L BP for 2 days . In the next stage of transformation, the explants are transferred to a Petri dish with liquid MS medium with the addition of 500 mg / L ticarcillin (Tr) and mixed for 5 minutes to remove excess agrobacteria.

Отмытые экспланты переносят в чашки Петри с твердой средой МС, содержащей 1 мг/л БАП, 0.1 мг/л НУК, 30 г/л БП, 500 мг/л тикарциллина и 50 мг/л канамицина.Washed explants are transferred to Petri dishes with solid MS medium containing 1 mg / L BAP, 0.1 mg / L NAA, 30 g / L BP, 500 mg / L ticarcillin and 50 mg / L kanamycin.

Тикарциллин используют для элиминации агробактерий на эксплантах, а канамицин является селективным агентом, поскольку в векторной конструкции в качестве селективного маркера используется ген неомицинфосфотрансферазы nptII.Ticarcillin is used to eliminate agrobacteria on explants, and kanamycin is a selective agent, because the neptic phosphotransferase gene nptII is used as a selective marker in the vector construct.

Регенерация побегов начинается через 3 недели культивирования трансформированных эксплантов.The regeneration of shoots begins after 3 weeks of cultivation of transformed explants.

Образовавшиеся побеги отделяют от исходной ткани эксплантов и переносят для дальнейшего роста на среду с 1/2 солей МС и с уменьшенной концентрацией антибиотиков: 250 мг/л тиракциллина и 25 мг/л канамицина. Укоренение протекает в течение 2-3 недель. Полученные укорененные растения используют для дальнейшего молекулярно-генетического анализа и биологического тестирования.The resulting shoots are separated from the original explant tissue and transferred for further growth on medium with 1/2 MS salts and with reduced antibiotic concentration: 250 mg / l tiraktsillina and 25 mg / l kanamycin. Rooting takes place within 2-3 weeks. The resulting rooted plants are used for further molecular genetic analysis and biological testing.

Пример 4. Условия трансформации и селекции эксплантов Kalanchoe daigremontiana.Example 4. Conditions for the transformation and selection of explants Kalanchoe daigremontiana.

Трансформацию эксплантов Kalanchoe daigremontiana и селекцию проводят аналогично описанному в примере 3.Transformation of explants Kalanchoe daigremontiana and selection is carried out similarly as described in example 3.

Пример 5. Условия трансформации и селекции эксплантов Kalanchoe laciniata.Example 5. Conditions for the transformation and selection of explants Kalanchoe laciniata.

Трансформацию эксплантов Kalanchoe laciniata и селекцию проводят аналогично описанному в примере 3.Transformation of explants Kalanchoe laciniata and selection is carried out similarly as described in example 3.

Пример 6. Условия трансформации и селекции эксплантов Kalanchoe blossfeldiana.Example 6. Conditions for the transformation and selection of explants Kalanchoe blossfeldiana.

Трансформацию эксплантов Kalanchoe blossfeldiana и селекцию проводят аналогично описанному в примере 3.Transformation of explants Kalanchoe blossfeldiana and selection is carried out similarly as described in example 3.

Пример 7. Анализ растений методом ПЦР.Example 7. Plant analysis by PCR.

Для ПЦР-анализа генома растений на наличие гена сесР1 используют праймеры, последовательность которых была сконструирована на основе данных о последовательности гена цекропина Р1:For PCR analysis of the plant genome for the presence of the cecP1 gene, primers are used, the sequence of which was constructed on the basis of data on the sequence of the cecropin P1 gene:

1) 5'-CGGGATCCATGGGCTCTTG-3' и1) 5'-CGGGATCCATGGGCTCTTG-3 'and

2) 5'-CGAGATCTCTACTTAGCGCGGC-3'.2) 5'-CGAGATCTCTACTTAGCGCGGC-3 '.

ДНК трансгенных растений выделяют из листьев 3-х недельных растений Kalanchoe [20]. Листья (около 100 мг) растирают в 2 мл пробирках, добавляют 0,4 мл буфера для экстракции (0.2 М трис-HCl, pH 7.5; 0.25 М NaCl; 25 мМ ЭДТА; 0.5% SDS), перемешивают и оставляют на 1 ч при комнатной температуре. Далее экстракты осветляют центрифугированием при 12000 об/мин. ДНК осаждают равным объемом изопропанола и осадок растворяют в 100 мкл буфера ТЕ (10 мМ трис-HCl, pH 8.0; 1 мМ ЭДТА).DNA of transgenic plants is isolated from the leaves of 3-week-old Kalanchoe plants [20]. Leaves (about 100 mg) are triturated in 2 ml tubes, 0.4 ml of extraction buffer (0.2 M Tris-HCl, pH 7.5; 0.25 M NaCl; 25 mm EDTA; 0.5% SDS) is added, stirred and left for 1 h at room temperature. The extracts are then clarified by centrifugation at 12,000 rpm. DNA is precipitated with an equal volume of isopropanol and the precipitate is dissolved in 100 μl of TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA).

Полученную растительную ДНК используют в качестве матрицы в ПЦР анализах. Реакционная смесь содержит 0,1 мкг плазмидной ДНК рВМ-сес в качестве матрицы, 10 мМ трис-HCl, pH 8.8 (при 25°C), 50 мМ KCl, 0.1% Тритон Х-100, 1.5 мМ MgCl2, 0.2 мМ смеси дНТФ (USB, США), по 50 пикомолей каждого праймера и 2.5 ед. ДНК полимеразы Taq ("Promega", США).The resulting plant DNA is used as a template in PCR analyzes. The reaction mixture contains 0.1 μg of plasmid DNA rVM-cec as a matrix, 10 mM Tris-HCl, pH 8.8 (at 25 ° C), 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 1.5 mM MgCl 2 , 0.2 mM mixture DNTF (USB, USA), 50 picomoles of each primer and 2.5 units. Taq polymerase DNA ("Promega", USA).

Реакцию проводят в объеме 25 мкл при следующих условиях: 94°C - 5 мин; 30 циклов: 94°C - 1 мин, 55°C - 30 с, 72°C - 30 с, затем 72°C - 7 мин на амплификаторе Gene Amp® PCR System 2400 (Perkin Elmer, США).The reaction is carried out in a volume of 25 μl under the following conditions: 94 ° C - 5 min; 30 cycles: 94 ° C - 1 min, 55 ° C - 30 s, 72 ° C - 30 s, then 72 ° C - 7 min on a Gene Amp® PCR System 2400 thermocycler (Perkin Elmer, USA).

Продукты амплификации анализируют с помощью электрофореза в 6%-ном ПААГе в трис-боратном буфере при напряженности электрического поля 6 В/см с последующим окрашиванием геля бромистым этидием. При этом концентрация красящего раствора - 2 мкг/мл в воде, время окрашивания - 20 минут при комнатной температуре. Гель фотографируют в ультрафиолете при длине волны 260-280 нм.Amplification products are analyzed by electrophoresis in 6% PAG in Tris-borate buffer at an electric field strength of 6 V / cm followed by staining of the gel with ethidium bromide. The concentration of the coloring solution is 2 μg / ml in water, the staining time is 20 minutes at room temperature. The gel is photographed in ultraviolet at a wavelength of 260-280 nm.

На фиг.2А представлена электрофореграмма ПЦР-продуктов амплификации ДНК трансгенных растений каланхоэ, содержащих ген сесР1 под контролем промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты: 1 - ДНК трансгенных растений Kalanchoe pinnata; 2 - ДНК трансгенных растений Kalanchoe daigremontiana; 3 - ДНК трансгенных растений Kalanchoe laciniata; 4 - ДНК трансгенных растений Kalanchoe blossfeldiana; 5 - ДНК нетрансформированного растения; 6 - ДНК плазмиды, содержащей ген cecP1.Figure 2A shows an electrophoregram of PCR amplification products of DNA of transgenic Kalanchoe plants containing the cecP1 gene under the control of the cauliflower mosaic virus 35S RNA promoter: 1 - DNA of transgenic plants Kalanchoe pinnata; 2 - DNA of transgenic plants Kalanchoe daigremontiana; 3 - DNA of transgenic plants Kalanchoe laciniata; 4 - DNA of transgenic plants Kalanchoe blossfeldiana; 5 - DNA of an untransformed plant; 6 - DNA of a plasmid containing the cecP1 gene.

Появление продукта ПНР с указанными праймерами и длиной 102 нуклеотида при условии отсутствия его в реакциях, поставленных на контрольной ДНК, свидетельствует о присутствии искомого гена в ДНК исследуемых растений.The appearance of a PNR product with the indicated primers and a length of 102 nucleotides, provided that it is absent in the reactions put on the control DNA, indicates the presence of the desired gene in the DNA of the studied plants.

Пример 5. Анализ растений методом вестерн-блот.Example 5. Plant analysis by Western blot.

Проводят анализ экстрактов из листьев Kalanchoe, содержащих около 100 мкг общего белка. Концентрацию общего белка определяют по методу Бредфорд [21]. Ткани трансформированных и контрольных растений замораживают в жидком азоте и разрушают растиранием в ступке. К полученным лизатам добавляют буфер в соотношении 1:1. Экстрагирующий буфер имеет состав: 4% ДДС-Na и 20 мМ Трис-HCl, pH 6.8. Гомогенат выдерживают 10 мин при 95°C и центрифугируют 4 мин при 14000 g.An analysis is made of extracts from Kalanchoe leaves containing about 100 μg of total protein. The concentration of total protein is determined by the Bradford method [21]. Tissues of transformed and control plants are frozen in liquid nitrogen and destroyed by grinding in a mortar. To the resulting lysates add buffer in a ratio of 1: 1. The extraction buffer has the composition: 4% DDS-Na and 20 mm Tris-HCl, pH 6.8. The homogenate is incubated for 10 min at 95 ° C and centrifuged for 4 min at 14000 g.

Для электрофоретического разделения белков трансгенных растений используют SDS-трициновую систему в 16%-ном ПААГе [22]. Для переноса белков используют PVDF-мембрану ("Porablot", Германия). Электроперенос проводят в течение 2 ч при 200 мА или ночь при 20 мА в буфере (25М Трис-HCl, 250 мМ глицина) с добавлением 20% метанола.For the electrophoretic separation of proteins of transgenic plants, the SDS-tricin system in 16% PAGE is used [22]. For the transfer of proteins using a PVDF membrane ("Porablot", Germany). The electrotransfer is carried out for 2 hours at 200 mA or overnight at 20 mA in a buffer (25 M Tris-HCl, 250 mm glycine) with the addition of 20% methanol.

Мембрану сначала инкубируют с антителами к гену cecP1, затем с вторичными кроличьими поликлональными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена. Иммунодетекцию проводят с помощью набора реактивов хемилюминесцентной системы ECL ("Amersham", Великобритания). Синтетический цекропин Р1 получают методом твердофазного синтеза.The membrane is first incubated with antibodies to the cecP1 gene, then with secondary rabbit polyclonal antibodies conjugated to horseradish peroxidase. Immunodetection is carried out using a set of reagents of the ECL chemiluminescent system ("Amersham", UK). Synthetic cecropin P1 is prepared by solid phase synthesis.

На фиг.2Б представлены результаты вестерн-блот-анализа экстрактов листьев отдельных растений каланхоэ. 1 - растительные экстракты (100 мкг общего белка) Kalanchoe pinnata; 2 - растительные экстракты Kalanchoe daigremontiana; 3 - растительные экстракты Kalanchoe laciniata; 4 - растительные экстракты Kalanchoe blossfeldiana; 5 - экстракт нетрансгенного растения; 6 - синтетический пептид цекропин Р1 (10 нг).On figb presents the results of a Western blot analysis of leaf extracts of individual Kalanchoe plants. 1 - plant extracts (100 μg of total protein) Kalanchoe pinnata; 2 - plant extracts of Kalanchoe daigremontiana; 3 - plant extracts of Kalanchoe laciniata; 4 - plant extracts of Kalanchoe blossfeldiana; 5 - extract of a non-transgenic plant; 6 - synthetic peptide cecropin P1 (10 ng).

В результате анализа в экстрактах растений каланхоэ был обнаружен искомый пептид с молекулярной массой 3,4 кДа, соответствующий зрелой форме цекропина Р1.As a result of the analysis, the desired peptide with a molecular weight of 3.4 kDa corresponding to the mature form of cecropin P1 was found in plant extracts of Kalanchoe.

Пример 6. Анализ антибиотической активности растительных экстрактов трансгенных растений каланхоэ по отношению к микроорганизмам, условно-патогенным для человека.Example 6. Analysis of the antibiotic activity of plant extracts of transgenic Kalanchoe plants in relation to microorganisms, conditionally pathogenic for humans.

Листья анализируемых растений каланхоэ растирают в фарфоровой ступке с жидким азотом, затем добавляют экстракционный буфер (10% глицерина, 40 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl, 100 мМ NH4Cl, 10,0 мМ трис-HCl, pH 7,5; 3,0 мг/мл дитиотрейтола; 0,2 мг/мл лейпептина; 0,2 мг/мл ингибитора трипсина; 4 мМ фенилметилсульфонилфторида; 2 мг/мл БСА [6]) и продолжают растирать до гомогенной суспензии.The leaves of the analyzed Kalanchoe plants are ground in a porcelain mortar with liquid nitrogen, then extraction buffer (10% glycerol, 40 mm EDTA, 150 mm NaCl, 100 mm NH 4 Cl, 10.0 mm Tris-HCl, pH 7.5; 3, 0 mg / ml dithiothreitol; 0.2 mg / ml leupeptin; 0.2 mg / ml trypsin inhibitor; 4 mM phenylmethylsulfonyl fluoride; 2 mg / ml BSA [6]) and continue to grind to a homogeneous suspension.

Полученный экстракт центрифугируют 20 мин при 10000 g и супернатант используют для определения в нем антибиотической активности методом радиальной диффузии [23]. Белок в растительных экстрактах определяют по методу [21].The extract obtained is centrifuged for 20 min at 10,000 g and the supernatant is used to determine the antibiotic activity in it by radial diffusion [23]. Protein in plant extracts is determined according to the method [21].

Ингибирующее влияние экстрактов на рост клеток бактерий анализируют на чашках Петри, содержащих 30 мл 1.5% агара со штаммом бактерий Staphylococeus aureus FDA 209-р, ИНА 00985 (108 клеток/мл). Для этого в лунки (диаметр 5 мм) добавляют экстракты с одинаковым количеством белка (2 мг общего белка) из листьев трансгенных и контрольных (нормальных) растений.The inhibitory effect of extracts on bacterial cell growth was analyzed on Petri dishes containing 30 ml of 1.5% agar with the bacterial strain Staphylococeus aureus FDA 209-p, INA 00985 (10 8 cells / ml). To do this, extracts with the same amount of protein (2 mg of total protein) from the leaves of transgenic and control (normal) plants are added to the wells (diameter 5 mm).

Каждый опыт проводят с листом среднего яруса растения в трех биологических повторностях. Чашку Петри инкубируют 8 ч при 4°C для диффузии экстрактов в агар, а затем инкубируют при 25°C в течение двух дней. Радиус чистой зоны вокруг лунки служит показателем ингибирования роста бактерий. Количественную оценку содержания цекропина Р1 в экстрактах трансгенных растений проводят сравнением с контрольными экспериментами, где в качестве стандарта используют известные концентрации синтетического цекропина ("Sigma", США).Each experiment is carried out with a leaf of the middle tier of the plant in three biological replicates. A Petri dish was incubated for 8 hours at 4 ° C to diffuse the extracts into agar, and then incubated at 25 ° C for two days. The radius of the clean zone around the well is an indicator of inhibition of bacterial growth. A quantitative assessment of the content of cecropin P1 in extracts of transgenic plants is carried out by comparison with control experiments, where known concentrations of synthetic cecropin are used as a standard (Sigma, USA).

На фиг.3 видно, что экстракты трансгенных растений каланхоэ проявляют значительно большую антибактериальную активность по сравнению с экстрактами из нетрансгенных растений по отношению к бактериальному штамму Staphylococeus aureus FDA 209-р ИНА 00985, условно патогенному для человека: лунка 1 - контрольное (не трансформированное) растение; лунка 2 - экстракт растения Kalanchoe pinnata, лунка 3 - экстракт растения Kalanchoe daigremontiana, лунка 4 - экстракт растения Kalanchoe blossfeldiana.Figure 3 shows that extracts of transgenic Kalanchoe plants exhibit significantly greater antibacterial activity compared to extracts from non-transgenic plants with respect to the bacterial strain Staphylococeus aureus FDA 209-INA 00985, conditionally pathogenic for humans: well 1 - control (not transformed) plant; well 2 - extract of the plant Kalanchoe pinnata, well 3 - extract of the plant Kalanchoe daigremontiana, well 4 - extract of the plant Kalanchoe blossfeldiana.

Экстракт растения Kalanchoe laciniata проявлял аналогичную описанной ранее антимикробную активность по отношению к штамму Staphylococeus aureus. Проявление некоторой антибактериальной активности у экстрактов нетрансгенных растений (лунка 1) может быть связано с наличием у них собственных антибактериальных защитных соединений, в том числе и антибактериальных пептидов. Так, диаметр чистой зоны у экстрактов контрольных растений составляет 2 мм (лунка 1), тогда как у экстрактов трансгенных растений диаметр такой зоны составляет 6-8 мм (лунки 2-4), что говорит о повышенной антибактериальной активности в клетках растений, экспрессирующих ген цекропина P1.The extract of the plant Kalanchoe laciniata showed a similar antimicrobial activity as previously described with respect to the Staphylococeus aureus strain. The manifestation of some antibacterial activity in extracts of non-transgenic plants (well 1) may be due to the presence of their own antibacterial protective compounds, including antibacterial peptides. Thus, the diameter of the clean zone in extracts of control plants is 2 mm (well 1), while in the extracts of transgenic plants, the diameter of this zone is 6-8 mm (holes 2-4), which indicates increased antibacterial activity in plant cells expressing the gene cecropin P1.

Образование чистой зоны вокруг лунки является результатом совместного действия как собственных защитных пептидов, так и дополнительно синтезируемых.The formation of a clean zone around the hole is the result of the joint action of both our own protective peptides and additionally synthesized ones.

Аналогичные результаты антибиотической активности получены для штаммов условно патогенных для человека: Pseudomonas aeruginosa IF03899, Bacillus subtillis ATEC 6633 ИНА 01041, бактериальных фитопатогенов: Erwinia carotovora В 15, Pseudomonas syringae В-1546 и Pseudomonas sp. marginata В-1298, грибных фитопатогенов: Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxyspomm и Phomopsis helianthi.Similar antibiotic activity results were obtained for strains conditionally pathogenic for humans: Pseudomonas aeruginosa IF03899, Bacillus subtillis ATEC 6633 INA 01041, bacterial phytopathogens: Erwinia carotovora B 15, Pseudomonas syringae B-1546 and Pseudomonas sp. marginata B-1298, fungal plant pathogens: Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxyspomm and Phomopsis helianthi.

Пример 7. Анализ уровня экспрессии цекропина Р1 в растениях каланхоэ методом ингибирования роста бактериальной культуры экстрактами трансгенных растений.Example 7. Analysis of the expression level of cecropin P1 in Kalanchoe plants by inhibiting the growth of a bacterial culture by extracts of transgenic plants.

Для тестирования антимикробной активности экстрактов из трансгенных растений используют метод ингибирования роста, который проводят на газоне клеток бактерий [24]. Бактерии Erwinia carotovora В15 выращивают до О.П.600=0.2 для получения клеток, находящихся в среднелогарифмической фазе роста. Затем культуру бактерий разводят свежей средой LB в соотношении 1:1000, к которой добавляют экстракты из трансгенных и нетрансгенных растений до конечной концентрации белка 1 мг.To test the antimicrobial activity of extracts from transgenic plants, the method of growth inhibition is used, which is carried out on the lawn of bacterial cells [24]. Bacteria Erwinia carotovora B15 are grown to O. P. 600 = 0.2 to obtain cells in the medium logarithmic phase of growth. The bacterial culture is then diluted with fresh LB medium in a ratio of 1: 1000, to which extracts from transgenic and non-transgenic plants are added to a final protein concentration of 1 mg.

Культуру бактерий с экстрактами инкубируют 30 минут при 37°C, затем аликвоту 10 мкл высевают на чашки Петри и инкубируют в течение ночи в термостате при 37°C.A bacterial culture with extracts was incubated for 30 minutes at 37 ° C, then an aliquot of 10 μl was plated on Petri dishes and incubated overnight in an incubator at 37 ° C.

Для определения количественного содержания пептида в трансгенных растениях исследуют ингибирование роста бактерий с разным содержанием синтетического цекропина Р1 - от 1 - до 6 мкМ. Подсчитывают количество жизнеспособных клеток бактерий, выросших в чашках Петри на среде LB. Полное ингибирование роста бактерий цекропином Р1 происходит при добавлении пептида в растущую культуру бактерий в количестве 6 мкМ. Подсчет выросших колоний и сравнение данных по калибровочной кривой, построенной для разных разведений синтетического цекропина Р1, показывает, что экстракты трансформированных растений в количестве 1 мг общего белка ингибируют рост патогенных бактерий так же, как при добавлении раствора цекропина Р1 в количестве 5 мкМ. Это соответствует экспрессии цекропина Р1 в трансгенных растениях на уровне 0.002% от общего содержания белка листьев.To determine the quantitative content of the peptide in transgenic plants, inhibition of bacterial growth with different contents of synthetic cecropin P1 from 1 to 6 μM is studied. Count the number of viable bacterial cells grown in Petri dishes on LB medium. Complete inhibition of bacterial growth by cecropin P1 occurs when peptide is added to a growing bacterial culture in an amount of 6 μM. Counting the grown colonies and comparing the data on the calibration curve constructed for different dilutions of synthetic cecropin P1 shows that extracts of transformed plants in an amount of 1 mg of total protein inhibit the growth of pathogenic bacteria in the same way as when adding a solution of cecropin P1 in an amount of 5 μM. This corresponds to the expression of cecropin P1 in transgenic plants at the level of 0.002% of the total leaf protein content.

На фиг.4 показано ингибирующее действие растительных экстрактов из трансгенных (А) и контрольных растений Kalanchoe pinnata (Б) на рост фитопатогенных бактерий Erwinia carotovora В15. Экстракты растений Kalanchoe daigremontiana, Kalanchoe blossfeldiana и Kalanchoe laciniata проявляли ингибирующее действие на рост бактериальных клеток аналогично экстрактам Kalanchoe pinnata. Экстракты контрольных растений активностью, ингибирующей рост бактериальных клеток, не обладали.Figure 4 shows the inhibitory effect of plant extracts from transgenic (A) and control plants Kalanchoe pinnata (B) on the growth of phytopathogenic bacteria Erwinia carotovora B15. Plant extracts Kalanchoe daigremontiana, Kalanchoe blossfeldiana and Kalanchoe laciniata exhibited an inhibitory effect on bacterial cell growth similarly to Kalanchoe pinnata extracts. The extracts of the control plants did not possess activity inhibiting the growth of bacterial cells.

Пример 8. Анализ устойчивости трансгенных растений Kalanchoe pinnata к бактериальным фитопатогенным микроорганизмам Erwinia carotovora В 15, Pseudomonas syringae В-1546 и Pseudomonas sp. marginata B-1298.Example 8. Analysis of the resistance of transgenic plants Kalanchoe pinnata to bacterial phytopathogenic microorganisms Erwinia carotovora B 15, Pseudomonas syringae B-1546 and Pseudomonas sp. marginata B-1298.

Штаммы бактерий выращивают в LB среде до плотности 106 кл/мл и используют для инфицирования отдельных листьев и целых растений. Заражение отдельных листьев растений проводят уколом иглой, смоченной в суспензии бактерий. Листья инкубируют в чашках Петри на влажной фильтровальной бумаге при температуре 22-24°C.Bacterial strains are grown in LB medium to a density of 10 6 cells / ml and used to infect individual leaves and whole plants. Infection of individual leaves of plants is carried out by an injection with a needle soaked in a suspension of bacteria. Leaves are incubated in Petri dishes on wet filter paper at a temperature of 22-24 ° C.

Степень повреждения оценивают спустя 7-21 суток после заражения. Через неделю на контрольных листьях отмечается разрушение ткани мезофилла. К концу третьей недели поражение контрольных листьев составляет 100% по площади. В то же время трансгенные листья остаются без признаков повреждения.The degree of damage is evaluated after 7-21 days after infection. After a week, the destruction of the mesophyll tissue was observed on the control leaves. By the end of the third week, the defeat of the control leaves is 100% by area. At the same time, transgenic leaves remain without signs of damage.

Аналогичные симптомы наблюдаются при заражении целых растений штаммами. Трансгенные растения остаются неповрежденными в течение всего времени эксперимента, в то время как контрольные полностью сгнивают. На фиг.5А показаны симптомы заражения листьев фитопатогенным штаммом Erwinia carotovora В 15.Similar symptoms are observed when whole plants are infected with strains. Transgenic plants remain intact throughout the duration of the experiment, while control plants completely rot. On figa shows the symptoms of leaf infection phytopathogenic strain of Erwinia carotovora B 15.

Степень повреждения растений Kalanchoe pinnata бактериальными штаммами Pseudomonas syringae В-1546 и Pseudomonas sp. marginata В-1298 была аналогично описанному повреждению штаммом Erwinia carotovora В 15.The degree of damage to Kalanchoe pinnata plants by the bacterial strains of Pseudomonas syringae B-1546 and Pseudomonas sp. marginata B-1298 was similar to the damage described by Erwinia carotovora B 15 strain.

Пример 9. Анализ устойчивости трансгенных растений Kalanchoe daigremontiana к бактериальным фитопатогенным микроорганизмам Erwinia carotovora В 15, Pseudomonas syringae В-1546 и Pseudomonas sp. marginata B-1298.Example 9. Analysis of the resistance of transgenic plants Kalanchoe daigremontiana to bacterial phytopathogenic microorganisms Erwinia carotovora B 15, Pseudomonas syringae B-1546 and Pseudomonas sp. marginata B-1298.

Признаки повышения устойчивости Kalanchoe daigremontiana к фитопатогенным бактериальным штаммам были аналогичны описанному в примере 8.Signs of increased resistance of Kalanchoe daigremontiana to phytopathogenic bacterial strains were similar to those described in example 8.

Пример 10. Анализ устойчивости трансгенных растений Kalanchoe blossfeldiana к бактериальным фитопатогенным микроорганизмам Erwinia carotovora В 15, Pseudomonas syringae В-1546 и Pseudomonas sp. marginata B-1298.Example 10. Analysis of the resistance of transgenic plants Kalanchoe blossfeldiana to bacterial phytopathogenic microorganisms Erwinia carotovora B 15, Pseudomonas syringae B-1546 and Pseudomonas sp. marginata B-1298.

Повышение устойчивости Kalanchoe blossfeldiana к фитопатогенным бактериальным штаммам было аналогично описанному в примере 8.Increasing the resistance of Kalanchoe blossfeldiana to phytopathogenic bacterial strains was similar to that described in example 8.

Пример 11. Анализ устойчивости трансгенных растений Kalanchoe laciniata к бактериальным фитопатогенным микроорганизмам Erwinia carotovora В 15, Pseudomonas syringae В-1546 и Pseudomonas sp. marginata B-1298.Example 11. Analysis of the resistance of transgenic plants Kalanchoe laciniata to bacterial phytopathogenic microorganisms Erwinia carotovora B 15, Pseudomonas syringae B-1546 and Pseudomonas sp. marginata B-1298.

Повышение устойчивости Kalanchoe laciniata к фитопатогенным бактериальным штаммам было аналогично описанному в примере 8.The increased resistance of Kalanchoe laciniata to phytopathogenic bacterial strains was similar to that described in example 8.

Пример 12. Анализ устойчивости трансгенных растений Kalanchoe pinnata к грибным фитопатогенным микроорганизмам Sclerotinia sclerotiomm, Fusarium oxysporum и Phomopsis helianthi.Example 12. Analysis of the resistance of transgenic plants Kalanchoe pinnata to fungal plant pathogens Sclerotinia sclerotiomm, Fusarium oxysporum and Phomopsis helianthi.

Фитопатогенные грибы для тестирования растений выращивают на глюкозо-картофельном агаре. Культуру грибов Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum и Phomopsis helianthi поддерживают при +4°C. Для определения устойчивости трансгенных растений к заражению грибным патогенам берут как целые растения, так и отдельные листья. Для отдельных листьев используют метод заражения в чашках Петри.Phytopathogenic fungi for plant testing are grown on glucose-potato agar. The fungi culture Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum and Phomopsis helianthi are maintained at + 4 ° C. To determine the resistance of transgenic plants to infection by fungal pathogens, both whole plants and individual leaves are taken. For individual leaves, the infection method in Petri dishes is used.

Заражение отдельных листьев растений Kalanchoe pinnata проводят, помещая кусочки агара с мицелием на срез черешка листа. Листья инкубируют в чашках Петри на влажной фильтровальной бумаге при температуре 22-24°C. Степень повреждения оценивают спустя месяц после заражения. Уже в первые дни эксперимента на контрольных листьях заметны признаки поражения - темные некротические пятна и в дальнейшем полная гибель. У трансгенных листьев таких признаков нет, они остаются полностью здоровыми и неповрежденными (фиг.5Б).Infection of individual leaves of Kalanchoe pinnata plants is carried out by placing pieces of mycelium agar on a section of leaf petiole. Leaves are incubated in Petri dishes on wet filter paper at a temperature of 22-24 ° C. The degree of damage is assessed one month after infection. Already in the early days of the experiment, signs of damage are visible on the control leaves — dark necrotic spots and further complete death. Transgenic leaves do not have such symptoms; they remain completely healthy and intact (Fig. 5B).

Целые растения заражают грибами, помещая кусочки мицелия гриба в междоузлия листьев. Растения выращивают при температуре 22-24°C. Уже через неделю на контрольных листьях заметен некроз ткани. К концу второй недели поражение контрольных растений составляет 50% по площади, в то время как трансгенные растения остаются без признаков повреждения.Whole plants infect fungi by placing slices of mycelium of the fungus in the internodes of the leaves. Plants are grown at a temperature of 22-24 ° C. Within a week, tissue necrosis was seen on the control leaves. By the end of the second week, the defeat of control plants is 50% by area, while transgenic plants remain without signs of damage.

В течение 15-20 суток контрольные растения погибают от воздействия патогена, а трансгенные проявляют устойчивость.Within 15-20 days, control plants die from exposure to the pathogen, and transgenic plants show resistance.

На фиг.5Б показаны симптомы заражения листьев Kalanchoe pinnata фитопатогенным штаммом Sclerotinia sclerotiorum.On figb shows the symptoms of infection of the leaves of Kalanchoe pinnata phytopathogenic strain of Sclerotinia sclerotiorum.

Степень повреждения растений Kalanchoe pinnata грибными штаммами Fusarium oxysporum и Phomopsis helianthi была аналогична описанному повреждению штаммом Sclerotinia sclerotiorum.The degree of damage to Kalanchoe pinnata plants by the fungal strains Fusarium oxysporum and Phomopsis helianthi was similar to that described by the strain Sclerotinia sclerotiorum.

Пример 13. Анализ устойчивости трансгенных растений Kalanchoe daigremontiana к грибным фитопатогенным микроорганизмам Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum и Phomopsis helianthi.Example 13. Analysis of the resistance of transgenic plants Kalanchoe daigremontiana to fungal phytopathogenic microorganisms Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum and Phomopsis helianthi.

Повышение устойчивости Kalanchoe daigremontiana к грибным фитопатогенным штаммам было аналогично описанному в примере 12.Increasing the resistance of Kalanchoe daigremontiana to fungal phytopathogenic strains was similar to that described in example 12.

Пример 14. Анализ устойчивости трансгенных растений Kalanchoe blossfeldiana к грибным фитопатогенным микроорганизмам Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum и Phomopsis helianthi.Example 14. Analysis of the resistance of transgenic plants Kalanchoe blossfeldiana to fungal phytopathogenic microorganisms Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum and Phomopsis helianthi.

Повышение устойчивости Kalanchoe blossfeldiana к грибным фитопатогенным штаммам было аналогично описанному в примере 12.Increasing the resistance of Kalanchoe blossfeldiana to fungal phytopathogenic strains was similar to that described in example 12.

Пример 15. Анализ устойчивости трансгенных растений Kalanchoe laciniata к грибным фитопатогенным микроорганизмам Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum и Phomopsis helianthi.Example 15. Analysis of the resistance of transgenic plants Kalanchoe laciniata to fungal pathogenic microorganisms Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum and Phomopsis helianthi.

Повышение устойчивости Kalanchoe laciniata к грибным фитопатогенным штаммам было аналогично описанному в примере 12.Increasing the resistance of Kalanchoe laciniata to fungal phytopathogenic strains was similar to that described in example 12.

Тестирование проростков in vitro на устойчивость к исследуемым патогенам показало их значительную устойчивость в 3-5 раз по сравнению с контрольными проростками.Testing of seedlings in vitro for resistance to the studied pathogens showed their significant resistance 3-5 times compared to control seedlings.

При пересадке трансгенных проростков из пробирок в грунт теплицы происходит их быстрая приживаемость, активное развитие растений и устойчивость их к почвенным фитопатогенам за счет экспрессии в тканях растения антимикробного пептида цекропина Р1. Растения выращивают до стадии цветения. Образовавшиеся семена обладают хорошей всхожестью.When transgenic seedlings are transplanted from test tubes into the soil of the greenhouse, their quick survival, active development of plants, and their resistance to soil phytopathogens occur due to the expression of the antimicrobial peptide cecropin P1 in plant tissues. Plants are grown to flowering. The resulting seeds have good germination.

Аналогичные симптомы наблюдали при заражении целых растений штаммами фитопатогенных микроорганизмов. Трансгенные растения остаются неповрежденными в течение всего времени эксперимента, в то время как контрольные полностью сгнивают.Similar symptoms were observed when whole plants were infected with strains of phytopathogenic microorganisms. Transgenic plants remain intact throughout the duration of the experiment, while control plants completely rot.

Способы трансформации каланхоэ, применяемые ранее другими исследователями имеют ряд недостатков - низкая эффективность трансформации - около 3%, использование большего количества регуляторов роста, из-за чего эксперимент по получению трансгенных растений занимает длительный период времени (больше года). Наш метод позволяет ускорить процесс получения трансгенных побегов каланхоэ за счет оптимизации состава среды МС. В работе была использована питательная среда МС, содержащая регуляторы роста - БАП в количестве 0.5-1.0 мг/л и НУК в количестве 0.07-0.1 мг/л. Это позволило проводить прямой органогенез растений без стадии каллусообразования. Для элиминации агробактерий в процессе трансформации был использован антибиотик тикарциллин вместо широко используемого цефотаксима и стимулирующая морфогенез добавка - банановый порошок в количестве 30 г/л. Это позволило получить высокий уровень трансформации - от 18% до 30%.Kalanchoe transformation methods previously used by other researchers have several drawbacks: low transformation efficiency of about 3%, the use of more growth regulators, which is why an experiment to produce transgenic plants takes a long period of time (more than a year). Our method allows you to speed up the process of obtaining transgenic shoots of Kalanchoe by optimizing the composition of the MS environment. In the work, we used the nutrient medium MS containing growth regulators - BAP in the amount of 0.5-1.0 mg / L and NAA in the amount of 0.07-0.1 mg / L. This allowed direct organogenesis of plants without a callus formation stage. To eliminate agrobacteria in the process of transformation, the antibiotic ticarcillin was used instead of the widely used cefotaxime and a morphogenesis-stimulating additive - banana powder in an amount of 30 g / l. This allowed to obtain a high level of transformation - from 18% to 30%.

Впервые была проведена трансформация каланхоэ вида Kalanchoe pinnata. Впервые в качестве целевого гена для трансформации каланхоэ был использован ген пептидного антибиотика цекропина P1.The Kalanchoe Kalanchoe pinnata species was first transformed. For the first time, the peptide antibiotic gene cecropin P1 was used as the target gene for the transformation of Kalanchoe.

Таким образом, способ получения трансгенных растений каланхоэ Kalanchoe daigremontiana, Kalanchoe laciniata, Kalanchoe blossfeldiana, синтезирующих и накапливающих в клетках зрелую форму антимикробного пептида цекропина Р1, является перспективным для получения растений каланхоэ с ценными фармакологическими свойствами и с повышенной устойчивостью к фитопатогенам и условно патогенным для человека Staphylococeus aureus, Pseudomonas aemginosa, Bacillus subtillis.Thus, the method for producing transgenic Kalanchoe plants Kalanchoe daigremontiana, Kalanchoe laciniata, Kalanchoe blossfeldiana, synthesizing and accumulating the mature form of the antimicrobial peptide cecropin P1 in cells, is promising for producing Kalanchoe plants with valuable pharmacological properties and with increased resistance to pathogenic pathogens and for pathogens and Staphylococeus aureus, Pseudomonas aemginosa, Bacillus subtillis.

Figure 00000001
Figure 00000002
Figure 00000003
Figure 00000001
Figure 00000002
Figure 00000003

Список используемых в тексте сокращений и терминов.List of abbreviations and terms used in the text.

Km - канамицинKm - Kanamycin

Tr - тираклициллинTr - thiraclicillin

КТ - кинетинCT - kinetin

2.4Д - дихлорфеноксиуксусная кислота2.4D - dichlorophenoxyacetic acid

LB - питательная среда Luria-BertaniLB - Luria-Bertani culture medium

БАП - 6-бензиламинопуринBAP - 6-benzylaminopurine

НУК - нафтилуксусная кислотаNAA - naphthylacetic acid

БП - банановый порошокBP - Banana Powder

ПЦР - полимеразная цепная реакцияPCR - polymerase chain reaction

нг - нанограмм веществаng - nanograms of substance

dNTP - дезоксирибонуклеотидыdNTP - deoxyribonucleotides

NTP II - ген, кодирующий белок неомицинфосфотрансферазуNTP II - gene encoding neomycin phosphotransferase protein

35S - промотор35S - promoter

cecP1 - ген, кодирующий антимикробный пептид цекропин Р1cecP1 - gene encoding the antimicrobial peptide cecropin P1

pGA482 - плазмидаpGA482 - plasmid

GV3101(pMP90RK) - штамм Agrobacterium tumefaciens.GV3101 (pMP90RK) - Agrobacterium tumefaciens strain.

Таблица 1Table 1 Эффективность регенерации и трансформации каланхоэThe efficiency of regeneration and transformation of Kalanchoe     РегенерантыRegenerants   Вид каланхоэKalanchoe view Всего эксплантовTotal explants ВсегоTotal Устойчивые к канамицинуKanamycin resistant Трансгенные (ПЦР + вестерн-анализ)Transgenic (PCR + Western analysis) Процент трансформацииTransformation Percentage Kalanchoe pinnataKalanchoe pinnata 100one hundred 76±376 ± 3 41±241 ± 2 18±118 ± 1 23±123 ± 1 Kalanchoe daigremontianaKalanchoe daigremontiana 100one hundred 65±365 ± 3 27±427 ± 4 12±112 ± 1 18±218 ± 2 Kalanchoe laciniataKalanchoe laciniata 100one hundred 59±259 ± 2 38±138 ± 1 15±315 ± 3 25±125 ± 1 Kalanchoe blossfeldianaKalanchoe blossfeldiana 100one hundred 55±355 ± 3 26±426 ± 4 17±217 ± 2 30±130 ± 1

Claims (3)

1. Способ получения генетически модифицированных растений рода каланхоэ, экспрессирующих ген цекропина Р1 и обладающих антимикробной активностью против бактерий видов Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, характеризующийся тем, что проводят сокультивирование эксплантов растений, выбранных из ряда растений вида Kalanchoe daigremontiana, Kalanchoe laciniata, Kalanchoe blossfeldiana, Kalanchoe pinnata, со штаммом бактерий Agrobacterium tumefaciens GV3101(pMP90RK), содержащим плазмиду pGA482, несущую ген белка цекропина P1 - cecP1, после сокультивации экспланты помещают на питательную среду для элиминации агробактерий и прямой регенерации до фертильных трансгенных растений, имеющих внесенные гены и признаки исходного сорта.1. A method of producing genetically modified plants of the genus Kalanchoe expressing the cecropin P1 gene and having antimicrobial activity against bacteria of the species Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, characterized in that they carry out the co-cultivation of explants of plants selected from a number of plants of the species Kalanchoe daigremontacini Kalana Kalanchoe blossfeldiana, Kalanchoe pinnata, with the bacterial strain Agrobacterium tumefaciens GV3101 (pMP90RK) containing the plasmid pGA482 carrying the cecropin P1 protein gene - cecP1, after co-cultivation, the explants are placed on a nutrient medium for elimination grobaktery and to direct the regeneration of fertile transgenic plants having introduced genes and features of the initial variety. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для элиминации агробактерий используют антибиотик тикарциллин.2. The method according to claim 1, characterized in that the antibiotic ticarcillin is used to eliminate agrobacteria. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для регенерации растений используют питательную среду Мурашиге-Скуга, содержащую дополнительно в качестве регуляторов роста 6-бензиламинопурин в количестве 0,5-1,0 мг/л и нафтилуксусную кислоту в количестве 0,07-0,1 мг/л. 3. The method according to claim 1, characterized in that for the regeneration of plants using nutrient medium Murashige-Skoog, containing additionally as growth regulators 6-benzylaminopurine in an amount of 0.5-1.0 mg / l and naphthylacetic acid in an amount of 0, 07-0.1 mg / l.
RU2010130041/10A 2010-07-21 2010-07-21 Method for obtaining genetically modified plants of kalanchoe, expressing gene of cecropin p1 RU2445768C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2010130041/10A RU2445768C1 (en) 2010-07-21 2010-07-21 Method for obtaining genetically modified plants of kalanchoe, expressing gene of cecropin p1

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2010130041/10A RU2445768C1 (en) 2010-07-21 2010-07-21 Method for obtaining genetically modified plants of kalanchoe, expressing gene of cecropin p1

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2010130041A RU2010130041A (en) 2012-01-27
RU2445768C1 true RU2445768C1 (en) 2012-03-27

Family

ID=45786155

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2010130041/10A RU2445768C1 (en) 2010-07-21 2010-07-21 Method for obtaining genetically modified plants of kalanchoe, expressing gene of cecropin p1

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2445768C1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2624042C2 (en) * 2015-12-17 2017-06-30 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) Method for obtaining of non-marked transgenic pinnated kalanchoe plants expressing cecropin p1 gene

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZAKHARCHENKO N.S. et al., "Enhanced Resistance to Phytopathogenic Bacteria in Transgenic Tobacco Plants with Synthetic Gene of Antimicrobial Peptide Cecropin P1", Russian Journal of Genetics (2005), 41(11): 1187-1193. GIACOMETTI A. et al., "In Vitro Activities of Membrane-Active Peptides against Gram-Positive and Gram-Negative Aerobic Bacteria", Antimicrobial Agents And Chemotherapy (1998), 42(12): 3320-3324. BECHTOLD N. and PELLETIER G., "In Planta Agrobacterium-mediated Transformation of Adult Arabidopsis thaliana Plants by Vacuum Infiltration", Methods Mol. Biol. (1998), 82:259-66. LING H.-Q. et al., "Effect of ticarcillin/potassium clavulanate on callus growth and shoot regeneration in Agrobacterium-mediated transformation of tomato (Lycopersicon esculentum Mill.)", Plant Cell Reports (1998) 17: 843-847. JAYASHREE R. et al., "Genetic transformation and regeneration of rubber tree (Hevea brasiliensis Muell. Arg) transgenic plants with a constitutive version of an anti-oxidative stre *
ЗАХАРЧЕНКО Н.С. и др. Получение и анализ трансгенных растений рапса масличного и каланхоэ перистого, экспрессирующих антимикробный пептид цекропин Р1. Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю.А.Овчинникова, т.1. - Тезисы пленарных и стендовых докладов, 28.09.-02.10.2009, с.218. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2624042C2 (en) * 2015-12-17 2017-06-30 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) Method for obtaining of non-marked transgenic pinnated kalanchoe plants expressing cecropin p1 gene

Also Published As

Publication number Publication date
RU2010130041A (en) 2012-01-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2812685B2 (en) Stilbene synthase gene
ES2227730T3 (en) ANTIFUNGIC PROTEINS, DNA THAT CODIFIES FOR THE SAME AND HOSPEDADORES THAT INCORPORATE IT.
KR100994443B1 (en) Antibiotics marker free soybean having resistance against two herbicides
RU2445768C1 (en) Method for obtaining genetically modified plants of kalanchoe, expressing gene of cecropin p1
KR100887461B1 (en) Disease-resistant plants and method of constructing the same
CN102191253B (en) Plant disease-resistant regulation and control gene UEP and application thereof
US6235973B1 (en) Expression of magainin and PGL classes of antimicrobial peptide genes in plants, and their use in creating resistance to multiple plant pathogens
CZ289646B6 (en) Antimicrobial proteins, recombinant DNAs encoding thereof, antimicrobial preparation containing thereof and method of fighting fungi or bacteria
KR100458153B1 (en) Promoter of S-adenosyl-L-methionine: jasmonic acid carboxyl methyl transferase gene and method for producing target protein in plants using the same
JP5164093B2 (en) Method for increasing resistance of rice to pathogens and pathogen-resistant rice transformants
Ganapathi et al. Expression of an antimicrobial peptide (MSI-99) confers enhanced resistance to Aspergillus niger in transgenic potato
KR100744612B1 (en) Brassica rapa ssp. pekinensis transformed by glutatione S-trnasferase coding gene
KR101627462B1 (en) Method for improving disease resistance using CabZIP2 in plants
KR100703566B1 (en) DISEASE RESISTANCE GENE ISOLATED FROM Oryza sativa EXPRESSION VECTOR CONTAINING THE GENE TRANSFORMANT TRANSFORMED BY THE VECTOR AND METHOD FOR PREPARATION OF THE TRANSFORMANT
WO2011002126A1 (en) Transgenic chinese cabbage with enhanced tolerance to soft rot disease and production method thereof
AU2019208218B2 (en) A herbal composition comprising antifungal protein derivatives
JPH05500308A (en) Pumpkin somatic embryogenesis
CN110734483B (en) Low-potassium-resistant related protein TaPR1 and coding gene and application thereof
KR100819878B1 (en) A method for producing Chinese cabbage transformant using tissues of flower stalk and a transformant with promoted soft rot resistance obtained from the method
RU2333220C2 (en) Albumens inducing plural resistance of plants to phytopathogens and vermin
KR100951062B1 (en) BrD1 Gene coding the insect-resistant Defensin from Brassica rapa, transgenic plants using that and method enhancing the insect-resistant by expression of said gene
Zakharchenko et al. The obtainment and characteristics of Kalanchoe pinnata L. plants expressing the artificial gene of the cecropin P1 antimicrobial peptide
Stephen In vitro evaluation of linear plant host defense peptides Shepherin 2, Skh-AMP1, Cn-AMP1, and Cr-ACP1 for cytotoxicity and antimicrobial activities against potato pathogens
Dolgov et al. Phytopathogen resistance improvement of horticultural crops by plant-defensin gene introduction
RU2624042C2 (en) Method for obtaining of non-marked transgenic pinnated kalanchoe plants expressing cecropin p1 gene

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20180722