RU2445627C1

RU2445627C1 - Diagnosing technique for non-small-cell lung cancer and set for implementing thereof

Info

Publication number: RU2445627C1
Application number: RU2010136681/15A
Authority: RU
Inventors: Михаил Валентинович Шепелев (RU); Михаил Валентинович Шепелев; Николай Васильевич Гнучев (RU); Николай Васильевич Гнучев; Георгий Павлович Георгиев (RU); Георгий Павлович Георгиев; Игорь Викторович Коробко (RU); Игорь Викторович Коробко
Original assignee: Учреждение Российской Академии Наук Институт Биологии Гена Ран
Priority date: 2010-09-02
Filing date: 2010-09-02
Publication date: 2012-03-20

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: potentially affected tissue and adjoining histologically normal tissue are examined for a level of RHOV gene transcription. A higher level of RHOV gene transcription in potentially affected tissue in comparison with the same in adjoining histologically normal tissue serves as a diagnostic sign of non-small-cell lung cancer. A polymerase chain reaction for the purpose of RHOV gene transcription is conducted by using a set of primers having sequences SEQ ID NO: 1 and 2.

EFFECT: invention provides high-reliable diagnosis of non-small-cell lung cancer, including squamous cell carcinoma and adenocarcinoma, including at the early stage of progressing cancer transformation.

12 cl, 1 tbl, 7 ex, 2 dwg

Description

Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION

Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности онкологии и молекулярной биологии, и может быть использовано для ранней диагностики немелкоклеточного рака легких, включая плоскоклеточный рак и аденокарциному.The present invention relates to medicine, in particular oncology and molecular biology, and can be used for early diagnosis of non-small cell lung cancer, including squamous cell carcinoma and adenocarcinoma.

Предшествующий уровень техникиState of the art

Рак легких остается одной из основных причин смерти онкологических больных в мире. Смертность от рака легких превышает смертность от рака молочной железы, толстой кишки и простаты, вместе взятых [Jemal A., Siegel R., Ward E., Murray Т., Xu J., Smigal С., Thun M.J. 2006. Cancer statistics, 2006. CA Cancer J Clin. 56, 6-30]. В России показатели смертности от рака легких у мужчин составляют 68,2 случая на 100 тысяч населения, у женщин - 6,8 случая [Заридзе Д.Г. 2004. Эпидемиология и этиология злокачественных новообразований, стр.29-85 - в кн. Канцерогенез. / Под ред. Д.Г.Заридзе. - М.: Медицина]. Различают два основных вида рака легких (РЛ): мелкоклеточный (МРЛ) и немелкоклеточный (НМРЛ), составляющих соответственно 15-20 и 75-80%. К НМРЛ относят плоскоклеточный рак легких (ПРЛ), аденокарциному легких (АКЛ) и крупноклеточный рак. Среди разных форм рака легких по частоте встречаемости ПРЛ занимает первое место, АКЛ - второе.Lung cancer remains one of the leading causes of cancer death in the world. Mortality from lung cancer exceeds mortality from cancer of the breast, colon and prostate combined [Jemal A., Siegel R., Ward E., Murray T., Xu J., Smigal C., Thun M.J. 2006. Cancer statistics, 2006. CA Cancer J Clin. 56, 6-30]. In Russia, the mortality rate from lung cancer in men is 68.2 cases per 100 thousand of the population, in women - 6.8 cases [Zaridze D.G. 2004. Epidemiology and etiology of malignant neoplasms, pp. 29-85 - in the book. Carcinogenesis. / Ed. D.G. Zaridze. - M .: Medicine]. Two main types of lung cancer (RL) are distinguished: small-cell (MRL) and non-small-cell (NSCLC), comprising 15-20 and 75-80%, respectively. NSCLC includes squamous cell lung cancer (PRL), lung adenocarcinoma (AKL), and large cell cancer. Among the various forms of lung cancer, in terms of the frequency of occurrence of PRL, it ranks first, and AKL is second.

Диагноз в половине случаев НМРЛ устанавливают на развернутой стадии опухолевого процесса, что делает малореальным радикальное излечение. Современные методы лечения повышают среднюю пятилетнюю продолжительность жизни больных НМРЛ не более чем на 15%. Этот показатель может быть существенно улучшен только с помощью разработки методов ранней диагностики.The diagnosis in half of the cases of NSCLC is established at the advanced stage of the tumor process, which makes radical cure unrealistic. Modern treatment methods increase the average five-year life expectancy of patients with NSCLC by no more than 15%. This indicator can be significantly improved only through the development of early diagnostic methods.

Основными методами диагностики рака легких служат инструментальные - рентгеновские и эндоскопические. Используют также анализ мокроты на атипичные клетки, биопсию ткани легких, компьютерную томографию, флуоресцентную фиброскопию. Иммунологические методы диагностики находят пока ограниченное клиническое применение. Практическую значимость имеет определение опухолевых маркеров: СЕА (раковоэмбриональный антиген) - онкомаркер рака прямой кишки, но может использоваться в оценке рака легких; NSE (нейрон-специфическая энолаза) в ряде случаев используют в оценке состояния пациентов с раком легких; ТРА (тканевый полипептидный антиген) - фрагмент цитокератина, более специфичный маркер рака легких. Эти маркеры применяют для контроля лечения, выявления рецидивов, но не для диагностики РЛ на ранней стадии. Для диагностики НМРЛ широко используют маркеры SCC (антиген плоскоклеточной карциномы) и фрагмент цитокератина-19 (CYFRA 21.1) [Pastor A., Menendez R., Cremades M.J., Pastor V., Llopis R., Aznar J. 1997. Diagnostic value of SCC, СЕА and CYFRA 21.1 in lung cancer: a Bayesian analysis. Eur Respir J. 10, 603-609; Buccheri G., Torchio P., Ferrigno D. 2003. Clinical Equivalence of Two Cytokeratin Markers in Non-small Cell Lung Cancer. A Study of Tissue Polypeptide Antigen and Cytokeratin 19 Fragments. Chest. 124, 622-632], но они также малопригодны для ранней диагностики РЛ.The main methods for diagnosing lung cancer are instrumental - x-ray and endoscopic. Sputum analysis for atypical cells, lung tissue biopsy, computed tomography, and fluorescence fibroscopy are also used. Immunological diagnostic methods have so far limited clinical use. The definition of tumor markers is of practical importance: CEA (cancer embryonic antigen) is a cancer marker of colon cancer, but can be used in the evaluation of lung cancer; NSE (neuron-specific enolase) in some cases is used in assessing the status of patients with lung cancer; TPA (tissue polypeptide antigen) is a fragment of cytokeratin, a more specific marker of lung cancer. These markers are used to control treatment, to identify relapses, but not to diagnose early stage RL. For the diagnosis of NSCLC, SCC markers (squamous cell carcinoma antigen) and a fragment of cytokeratin-19 (CYFRA 21.1) are widely used [Pastor A., Menendez R., Cremades MJ, Pastor V., Llopis R., Aznar J. 1997. Diagnostic value of SCC , CEA and CYFRA 21.1 in lung cancer: a Bayesian analysis. Eur Respir J. 10, 603-609; Buccheri G., Torchio P., Ferrigno D. 2003. Clinical Equivalence of Two Cytokeratin Markers in Non-small Cell Lung Cancer. A Study of Tissue Polypeptide Antigen and Cytokeratin 19 Fragments. Chest. 124, 622-632], but they are also of little use for the early diagnosis of RL.

Диагностическими признаками злокачественной трансформации клеток могут служить также изменения генома в опухолевых клетках - точечные мутации в кодирующих и регуляторных участках генов, микросателлитная нестабильность, аллельные потери, изменение уровня транскрипции или трансляции генов, изменения характера метилирования промоторных участков генов и др. В отличие от белковых молекулярно-генетические маркеры обладают значительно большей чувствительностью. Рак легких сопровождается изменением функциональной активности многих генов. В числе перспективных потенциальных маркерных генов, вовлеченных в канцерогенез разных форм НМРЛ, можно рассматривать ген RHOV.Diagnostic signs of malignant transformation of cells can also be changes in the genome in tumor cells - point mutations in the coding and regulatory regions of genes, microsatellite instability, allelic losses, changes in the level of transcription or translation of genes, changes in the methylation pattern of promoter regions of genes, etc. In contrast to protein molecular Genetic markers have significantly greater sensitivity. Lung cancer is accompanied by a change in the functional activity of many genes. Among the promising potential marker genes involved in the carcinogenesis of various forms of NSCLC, the RHOV gene can be considered.

Ген RHOV [ras homolog gene family, member V]), кодирующий Rho ГТФазу Chp/Wrch2, содержит три экзона и у человека локализован на хромосоме 15q13.3 [Katoh, М., 2002. Molecular cloning and characterization of WRCH2 on human chromosome 15q15. Int J Oncol 20(5): 977-82]. ГТФаза Chp способна вызывать формирование ламеллиподий [Aronheim, A., Y.С.Broder, et al. 1998. Chp, a homologue of the GTPase Cdc42Hs, activates the JNK pathway and is implicated in reorganizing the actin cytoskeleton. Curr Biol 8(20): 1125-8; Aspenstrom, P., A. Fransson, et al. (2004). Rho GTPases have diverse effects on the organization of the actin filament system. Biochem J 377(Pt 2): 327-37], актин-богатых выпячиваний плазматической мембраны на лидирующем конце движущейся клетки, играющих важную роль в миграции и метастазировании опухолевых клеток. Одними из возможных эффекторов ГТФазы Chp являются серин-треониновые протеинкиназы Pak1 и Pak4. При этом было показано, что ГТФаза Chp способна активировать протеинкиназу Pak1 [Aspenstrom, P., A. Fransson, et al. (2004). Rho GTPases have diverse effects on the organization of the actin filament system. Biochem J 377(Pt 2): 327-37; Weisz Hubsman, M., N. Volinsky, et al. 2007. Autophosphorylation-dependent degradation of Paki, triggered by the Rho-family GTPase, Chp. Biochem J 404(3): 487-97]. Увеличение уровня экспрессии и/или уровня активности Pak киназ характерно для многих опухолей человека [Dummler, В., К. Ohshiro, et al. 2009. Pak protein kinases and their role in cancer. Cancer Metastasis Rev 28(1-2): 51-63]. При этом наиболее часто встречается увеличение экспрессии Pak1 и Pak4, в частности за счет амплификации соответствующих генов [Dummler, В., К. Ohshiro, et al. 2009. Pak protein kinases and their role in cancer. Cancer Metastasis Rev 28(1-2): 51-63]. Повышение уровня активности этих протеинкиназ приводит к увеличению подвижности клеток, резистентности к апоптозу и вызывает пролиферацию клеток вне зависимости от контакта с субстратом. Учитывая эти данные, можно предположить, что увеличение активности Chp в опухоли может сопровождаться увеличением активности Pak1.The RHOV gene [ras homolog gene family, member V]) encoding the Rho GTPase Chp / Wrch2 contains three exons and is located on the chromosome 15q13.3 in humans [Katoh, M., 2002. Molecular cloning and characterization of WRCH2 on human chromosome 15q15 . Int J Oncol 20 (5): 977-82]. GTPase Chp is capable of causing the formation of lamellipodia [Aronheim, A., Y. C. Broder, et al. 1998. Chp, a homologue of the GTPase Cdc42Hs, activates the JNK pathway and is implicated in reorganizing the actin cytoskeleton. Curr Biol 8 (20): 1125-8; Aspenstrom, P., A. Fransson, et al. (2004). Rho GTPases have diverse effects on the organization of the actin filament system. Biochem J 377 (Pt 2): 327-37], actin-rich protrusions of the plasma membrane at the leading end of a moving cell, which play an important role in the migration and metastasis of tumor cells. One of the possible effectors of GTPase Chp are the serine-threonine protein kinases Pak1 and Pak4. It was shown that GTPase Chp is able to activate the protein kinase Pak1 [Aspenstrom, P., A. Fransson, et al. (2004). Rho GTPases have diverse effects on the organization of the actin filament system. Biochem J 377 (Pt 2): 327-37; Weisz Hubsman, M., N. Volinsky, et al. 2007. Autophosphorylation-dependent degradation of Paki, triggered by the Rho-family GTPase, Chp. Biochem J 404 (3): 487-97]. An increase in the expression level and / or activity level of Pak kinases is characteristic of many human tumors [Dummler, B., K. Ohshiro, et al. 2009. Pak protein kinases and their role in cancer. Cancer Metastasis Rev 28 (1-2): 51-63]. Moreover, an increase in the expression of Pak1 and Pak4 is most common, in particular due to amplification of the corresponding genes [Dummler, B., K. Ohshiro, et al. 2009. Pak protein kinases and their role in cancer. Cancer Metastasis Rev 28 (1-2): 51-63]. An increase in the activity level of these protein kinases leads to an increase in cell motility, resistance to apoptosis and causes cell proliferation regardless of contact with the substrate. Given these data, it can be assumed that an increase in the activity of Chp in the tumor may be accompanied by an increase in the activity of Pak1.

Помимо опосредованного протеинкиназами Pak влияния на онкогенез, ген RHOV сам по себе обладает свойствами онкогена. Было показано, что экспрессия активной формы ГТФазы Chp в клетках линии фибробластов мыши NIH3T3 приводит к формированию вторичных очагов роста в конфлуэнтных культурах и вызывает формирование колоний клеток в мягком агаре [Chenette, E.J., A. Abo, et al. 2005. Critical and distinct roles of ammo- and carboxyl-terminal sequences in regulation of the biological activity of the Chp atypical Rho GTPase. J Biol Chem 280(14): 13784-92; Chenette, E.J., N.Y. Mitin, et al. (2006). Multiple sequence elements facilitate Chp Rho GTPase subcellular location, membrane association, and transforming activity. Mol Biol Cell 17(7): 3108-21], что отражает соответственно потерю контактного торможения роста и появление способности клеток к пролиферации независимо от контакта с субстратом. Эти процессы являются одними из характерных особенностей злокачественной трансформации клеток и позволяют рассматривать ген RHOV в качестве потенциального онкогена.Apart from Pak protein kinase-mediated effects on oncogenesis, the RHOV gene itself has oncogen properties. It has been shown that expression of the active form of Chp GTPase in NIH3T3 mouse fibroblast line cells leads to the formation of secondary growth foci in confluent cultures and causes the formation of cell colonies in soft agar [Chenette, E.J., A. Abo, et al. 2005. Critical and distinct roles of ammo- and carboxyl-terminal sequences in regulation of the biological activity of the Chp atypical Rho GTPase. J Biol Chem 280 (14): 13784-92; Chenette, E.J., N.Y. Mitin, et al. (2006). Multiple sequence elements facilitate Chp Rho GTPase subcellular location, membrane association, and transforming activity. Mol Biol Cell 17 (7): 3108-21], which reflects, respectively, the loss of contact inhibition of growth and the appearance of the ability of cells to proliferate regardless of contact with the substrate. These processes are one of the characteristic features of the malignant transformation of cells and allow us to consider the RHOV gene as a potential oncogen.

Механистически экспрессия RHOV может быть связана с активацией канонического Wnt-сигнального пути [Guemar, L., P. de Santa Barbara, et al. 2007. The small GTPase RhoV is an essential regulator of neural crest induction inXenopus. Dev Biol 310(1): 113-28]. В то же время аномальная активация Wnt-сигнального пути часто наблюдается в различных типах опухолей и вносит свой вклад в формирование и прогрессию опухолевого фенотипа, в частности, в случае опухолей легких [Mazieres J., Не В., You L., Xu Z., Jablons D.M. 2005. Wnt signaling in lung cancer. Cancer Lett. 222: 1-10; He В., You L., Uematsu K., Xu Z., Lee A.Y., Matsangou M., McCormick P., Jablons D.M. 2004. A monoclonal antibody against Wnt-1 induces apoptosis in human cancer cells. Neoplasia. 6: 7-14; You L., He В., Xu Z., Uematsu K., Mazieres J., Mikami I., Reguart N., Moody T.W., Kitajewski J., McCormick P., Jablons D.M. 2004. Inhibition of Wnt-2 -mediated signaling induces programmed cell death in non-small-cell lung cancer cells. Oncogene. 23: 6170-6174]. Вместе эти данные позволяют предположить, что аномальная активация Wnt-сигнального пути в опухолевых клетках может приводить к усиленной экспрессии RHOV в них.Mechanically, RHOV expression may be associated with activation of the canonical Wnt signaling pathway [Guemar, L., P. de Santa Barbara, et al. 2007. The small GTPase RhoV is an essential regulator of neural crest induction inXenopus. Dev Biol 310 (1): 113-28]. At the same time, abnormal activation of the Wnt signaling pathway is often observed in various types of tumors and contributes to the formation and progression of the tumor phenotype, in particular in the case of lung tumors [Mazieres J., He B., You L., Xu Z. Jablons DM 2005. Wnt signaling in lung cancer. Cancer Lett. 222: 1-10; He B., You L., Uematsu K., Xu Z., Lee A.Y., Matsangou M., McCormick P., Jablons D.M. 2004. A monoclonal antibody against Wnt-1 induces apoptosis in human cancer cells. Neoplasia. 6: 7-14; You L., He B., Xu Z., Uematsu K., Mazieres J., Mikami I., Reguart N., Moody T.W., Kitajewski J., McCormick P., Jablons D.M. 2004. Inhibition of Wnt-2 -mediated signaling induces programmed cell death in non-small-cell lung cancer cells. Oncogene. 23: 6170-6174]. Together, these data suggest that abnormal activation of the Wnt signaling pathway in tumor cells can lead to enhanced expression of RHOV in them.

Анализ экспрессии гена RHOV у человека не выявил транскрипта в легких [Katoh, M. 2002. Molecular cloning and characterization of WRCH2 on human chromosome 15q15. Int J Oncol 20(5): 977-82], однако у крысы экспрессия RhoV была отмечена в ткани легких [Aronheim, A., Y.С.Broder, et al. 1998. Chp, a homologue of the GTPase Cdc42Hs, activates the JNK pathway and is implicated in reorganizing the actin cytoskeleton. Curr Biol 8(20): 1125-8]. Усиленная экспресия гена RHOV обнаруживалась в ряде опухолевых клеточных линий, в том числе в клетках линии рака легких А549 [Katoh, M. 2002. Molecular cloning and characterization of WRCH2 on human chromosome 15q15. Int J Oncol 20(5): 977-82]. Анализ экспрессии гена RHOV в 66 образцах первичных опухолей человека различного происхождения по сравнению с прилежащей нормальной тканью выявил значительное усиление экспрессии гена RHOV лишь в 5 случаях [Katoh, M. 2002. Molecular cloning and characterization of WRCH2 on human chromosome 15q15. Int J Oncol 20(5): 977-82]. При этом выборка опухолей легкого в данном исследовании насчитывала лишь 3 образца, поэтому полученные данные не позволяют сделать какой-либо вывод об экспрессии гена RHOV в опухолях легких.Analysis of RHOV gene expression in humans did not reveal a lung transcript [Katoh, M. 2002. Molecular cloning and characterization of WRCH2 on human chromosome 15q15. Int J Oncol 20 (5): 977-82], however, in rats, RhoV expression was noted in lung tissue [Aronheim, A., Y. Broder, et al. 1998. Chp, a homologue of the GTPase Cdc42Hs, activates the JNK pathway and is implicated in reorganizing the actin cytoskeleton. Curr Biol 8 (20): 1125-8]. Enhanced RHOV gene expression was detected in a number of tumor cell lines, including A549 lung cancer cell lines [Katoh, M. 2002. Molecular cloning and characterization of WRCH2 on human chromosome 15q15. Int J Oncol 20 (5): 977-82]. Analysis of RHOV gene expression in 66 samples of primary human tumors of various origin compared with adjacent normal tissue revealed a significant increase in RHOV gene expression in only 5 cases [Katoh, M. 2002. Molecular cloning and characterization of WRCH2 on human chromosome 15q15. Int J Oncol 20 (5): 977-82]. At the same time, the sample of lung tumors in this study consisted of only 3 samples; therefore, the data obtained do not allow us to draw any conclusion about the expression of the RHOV gene in lung tumors.

В качестве ближайшего аналога настоящего изобретения авторы предлагают рассмотреть патент РФ №2330285. Изобретение согласно патенту РФ №2330285 относится к способу диагностики немелкоклеточного рака легких на основании определения различия уровня транскрипции гена WIF1 в предположительно пораженной раком ткани человека и в прилегающей гистологически нормальной ткани.As the closest analogue of the present invention, the authors propose to consider the patent of the Russian Federation No. 2330285. The invention according to RF patent No. 2330285 relates to a method for the diagnosis of non-small cell lung cancer based on determining the difference in the level of transcription of the WIF1 gene in presumably cancerous human tissue and adjacent histologically normal tissue.

В указанном патенте приведен обзор методов, позволяющих осуществить стадии способа согласно настоящему изобретению.This patent provides an overview of methods that allow the implementation of the stages of the method according to the present invention.

Так, в соответствии с указанным аналогом в качестве образцов для проведения анализа могут быть использованы биоптаты, пунктаты, в том числе материал, полученный при бронхоскопии с прямой биопсией (центральный рак легких) и трансторакальной (чрескожной) пункции опухоли (периферический рак).So, in accordance with the indicated analogue, biopsy samples, punctate, including material obtained by bronchoscopy with direct biopsy (central lung cancer) and transthoracic (percutaneous) tumor puncture (peripheral cancer) can be used as samples for analysis.

Способы выделения тотальной РНК из образцов ткани млекопитающих хорошо известны специалистам и, как правило, включают следующие стадии: измельчение в жидком азоте образцов опухолевых и нормальных тканей, лизис клеток, выделение РНК и ее очистку, проверку качества РНК электрофорезом в 1%-ном агарозном геле в присутствии красителя бромида этидия или в денатурирующем полиакриламидном геле, а также спектрофотометрическое определение количества РНК. Гомогенизацию кусочков ткани можно проводить вручную, растирая пестиком в керамической ступке, или с помощью механических гомогенизаторов, например, Omni Mixer или Micro-Dismembrator U фирмы Sartorius (Германия). Для выделения РНК могут быть использованы различные протоколы, широко известные специалистам в данной области. В классических методах выделения РНК используют растворяющие белки сильные хаотропные агенты, такие как гуанидинхлорид и гуанидинизотиоцианат, и последовательные экстракции фенолом и хлороформом для денатурации и удаления белков [Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis Т., Molecular Cloning. A laboratory Manual. 2nd Edition ed. 1989, Cold Spring Harbour: CSHL Press]. Широко используют также метод с использованием реагента Trizol [GIBCO/Life Technologies]. Для предотвращения разрушения РНК РНКазами могут быть использованы ингибиторы, такие как игибитор RNAsin плацентарного или рекомбинантного происхождения или, например, ванадил-рибозидный комплекс - неспецифический ингибитор РНКаз широкого спектра действия.Methods for isolating total RNA from mammalian tissue samples are well known in the art and typically include the following steps: grinding tumor and normal tissue samples in liquid nitrogen, cell lysis, RNA isolation and purification, RNA quality control by electrophoresis in 1% agarose gel in the presence of ethidium bromide dye or in a denaturing polyacrylamide gel, as well as spectrophotometric determination of the amount of RNA. Homogenization of tissue pieces can be carried out manually, grinding with a pestle in a ceramic mortar, or using mechanical homogenizers, for example, Omni Mixer or Micro-Dismembrator U from Sartorius (Germany). Various protocols can be used to isolate RNA that are well known to those skilled in the art. Classical RNA isolation methods utilize protein-dissolving strong chaotropic agents such as guanidine chloride and guanidinisothiocyanate, and sequential phenol and chloroform extractions to denature and remove proteins [Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T., Molecular Cloning. A laboratory manual. 2nd Edition ed. 1989, Cold Spring Harbor: CSHL Press]. The Trizol reagent method [GIBCO / Life Technologies] is also widely used. In order to prevent RNA degradation by RNases, inhibitors can be used, such as an RNAsin inhibitor of placental or recombinant origin or, for example, a vanadyl-riboside complex, a non-specific broad-spectrum RNAse inhibitor.

Быстрое и качественное выделение РНК можно проводить с использованием ряда коммерчески доступных наборов ("Выделение тотальной РНК YellowSolve" (фирма Клоноген, Санкт-Петербург); RNeasy kits (Qiagen, Германия); SV Total RNA Isolation System (Promega, США) и т.д.).Rapid and high-quality RNA isolation can be carried out using a number of commercially available kits (“Isolation of Total Yellow Solve RNA” (Clonogen, St. Petersburg); RNeasy kits (Qiagen, Germany); SV Total RNA Isolation System (Promega, USA), etc. d.).

Также в патенте РФ №2330285 описано проведение реакции обратной транскрипции: синтеза кДНК на матрице РНК, выделенной из образцов ткани легких, и ее перевод в двуцепочечную форму. Процесс обратной транскрипции, в результате которой на РНК-матрице синтезируют одноцепочечную цепь ДНК, при необходимости, с достройкой второй цепи, позволяет от нестабильных молекул РНК перейти к более стабильным молекулам ДНК и амплифицировать с помощью полимеразной цепной реакции до количеств, необходимых для детекции. ОТ-ПЦР-амплификация позволяет использовать очень малые количества исходной РНК (на уровне 1 нанограмма), а следовательно, и количество исследуемой легочной ткани, из которой выделяют РНК.Also, in the patent of the Russian Federation No. 2330285, a reverse transcription reaction is described: synthesis of cDNA on an RNA matrix isolated from lung tissue samples, and its conversion into a double-stranded form. The reverse transcription process, as a result of which a single-stranded DNA chain is synthesized on the RNA matrix, if necessary, with the completion of the second chain, allows us to switch from unstable RNA molecules to more stable DNA molecules and amplify using the polymerase chain reaction to the amounts necessary for detection. RT-PCR amplification allows the use of very small amounts of the original RNA (at the level of 1 nanogram), and therefore the amount of the lung tissue under study, from which RNA is isolated.

Реакцию обратной транскрипции можно проводить с использованием ряда коммерчески доступных препаратов обратных транскриптаз, таких как обратная транскриптаза вируса лейкоза мышей Молони (M-MLV), вируса миелобластоза птиц (AMV), PowerScript (точечная мутация M-MLV-RT), C.Therm Polymerase и др., с помощью которых можно получать продукты амплификации длиной до нескольких тысяч и даже несколько десятков тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.). Может быть использована термостабильная ДНК-полимераза Thermus thermophilus (Tth), обладающая обратной транскриптазной активностью в присутствии ионов Mn²⁺.The reverse transcription reaction can be carried out using a number of commercially available reverse transcriptase preparations, such as Moloney mouse leukemia virus (M-MLV), avian myeloblastosis virus (AMV) reverse transcriptase, PowerScript (M-MLV-RT point mutation), C. Therm Polymerase and others, with the help of which it is possible to obtain amplification products up to several thousand and even several tens of thousands of nucleotide pairs (kb). Thermostable Thermus thermophilus (Tth) DNA polymerase can be used, with reverse transcriptase activity in the presence of Mn ^{2+ ions} .

Для обратной транскрипции могут быть использованы различные праймеры, например:For reverse transcription, various primers can be used, for example:

1. Олиго(dT)n-содержащие праймеры, которые связываются с эндогенным полиА-хвостом на 3'-конце мРНК (число n обычно равно 12-18, но может достигать и большей величины). Эти праймеры наиболее часто используют для получения полноразмерных кДНК. К олиго(dT)-последовательности часто добавляют на 3'-конце нуклеотиды А, С или G, чтобы «заякорить» праймер на границу транскрипта и поли-А тракта.1. Oligo (dT) n-containing primers that bind to the endogenous polyA tail at the 3'-end of the mRNA (the number n is usually 12-18, but can reach a larger value). These primers are most often used to obtain full-size cDNA. Nucleotides A, C or G are often added to the oligo (dT) sequences at the 3'end to "anchor" the primer to the border of the transcript and the poly-A tract.

2. Случайные гексануклеотидные праймеры (статистические затравки), которые гибридизуются с РНК в многочисленных участках. При обратной транскрипции с этими праймерами получают короткие кДНК. Случайные гексамеры используют для преодоления трудностей, связанных с прочной вторичной структурой РНК, они более эффективны при обратной транскрипции 5'-областей мРНК.2. Random hexanucleotide primers (statistical primers) that hybridize with RNA in numerous sites. When reverse transcription with these primers receive short cDNA. Random hexamers are used to overcome the difficulties associated with the strong secondary structure of RNA; they are more effective in reverse transcription of 5'-regions of mRNA.

3. Гексамеры или другие короткие олигонуклеотиды (10-12 нуклеотидов) случайного состава могут быть также использованы в комбинации с олиго(dT)-содержащими праймерами.3. Hexamers or other short oligonucleotides (10-12 nucleotides) of random composition can also be used in combination with oligo (dT) -containing primers.

4. Специфические олигонуклеотидные праймеры используют для транскрипции участка мРНК, представляющего интерес для исследования. Эти праймеры успешно применяют для диагностических целей.4. Specific oligonucleotide primers are used to transcribe the mRNA region of interest for the study. These primers are successfully used for diagnostic purposes.

Анализ транскрипции генов можно проводить, используя одноцепочечную или двуцепочечную и амплифицированную кДНК. Для синтеза второй цепи и ее амплификации наиболее часто используют специфичные праймеры. Коммерчески доступны наборы для синтеза кДНК, основанные на применении различных обратных транскриптаз и различных праймеров для затравки. Для получения кДНК разработан также SMART-метод (switching mechanism at the 5' end of RNA templates of reverse transcriptase), в основе которого лежит свойство обратных транскриптаз добавлять на 3'-конец синтезированной первой цепи кДНК несколько нуклеотидных остатков, преимущественно dC. Эта олиго(dC)-последовательность служит местом отжига олигонуклеотидного адаптера, имеющего комплементарную олиго(dG)-последовательность на 3'-конце. Обратная транскриптаза воспринимает праймер как продолжение РНК-матрицы и продолжает синтез первой цепи [Schmidt W.M., Mueller M.W. 1999. CapSelect: a highly sensitive method for 5' CAP-dependent enrichment of full-length cDNA in PCR-mediated analysis of mRNAs. Nucleic Acids Res. 27, e31]. Таким образом, первая цепь кДНК оказывается фланкирована с одной стороны последовательностью 3'-праймера с олиго(dT) на 3'-конце, а с другой - последовательностью, комплементарной адаптеру. Эти праймеры имеют одинаковые внешние последовательности, отличаясь только на 3'-конце. Затем первую цепь амплифицируют в ПЦР с праймером, соответствующим внешней части 3'-праймера и адаптера. Нуклеотидную последовательность общей части этих праймеров подбирают в зависимости от дальнейших целей, например, получения клонотек, применения вычитающей гибридизации и т.д. В результате получают двухцепочечную ДНК, обогащенную полноразмерными последовательностями. За счет использования адаптера с заблокированным 3'-концом достигается существенное снижение фоновой амплификации. При использовании модифицированного SMART-метода за короткое время происходит амплификация исходного материала более чем в 10⁵ раз, поэтому можно работать с очень небольшими количествами РНК (меньше 1 нанограмма), а следовательно, и с небольшим количеством исследуемой ткани [Zhu Y.Y., Machleder E.M., Chenchik A., Li R., Siebert P.D. 2001. Reverse transcriptase template switching: a SMART approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques 30, 892-897]. Наборы для получения кДНК этим способом выпускают различные фирмы, например, Евроген, Россия (набор MINT), Clontech, США и т.п.Gene transcription analysis can be performed using single-stranded or double-stranded and amplified cDNA. Specific primers are most often used for the synthesis of the second chain and its amplification. Commercially available kits for cDNA synthesis based on the use of various reverse transcriptases and various primers for seed. To obtain cDNA, the SMART method (switching mechanism at the 5 'end of RNA templates of reverse transcriptase) was also developed, which is based on the property of reverse transcriptases to add several nucleotide residues, mainly dC, to the 3'-end of the synthesized first cDNA chain. This oligo (dC) sequence serves as an annealing site for the oligonucleotide adapter having a complementary oligo (dG) sequence at the 3'-end. Reverse transcriptase perceives the primer as an extension of the RNA template and continues the synthesis of the first strand [Schmidt WM, Mueller MW 1999. CapSelect: a highly sensitive method for 5 'CAP-dependent enrichment of full-length cDNA in PCR-mediated analysis of mRNAs. Nucleic Acids Res. 27, e31]. Thus, the first cDNA strand is flanked on one side by a 3'-primer sequence with oligo (dT) at the 3'-end, and on the other hand, by a sequence complementary to the adapter. These primers have the same external sequence, differing only at the 3'-end. Then the first chain is amplified in PCR with a primer corresponding to the outer part of the 3'-primer and adapter. The nucleotide sequence of the common part of these primers is selected depending on further goals, for example, obtaining clonotech, using subtractive hybridization, etc. The result is double-stranded DNA enriched with full-sized sequences. By using an adapter with a locked 3'-end, a significant reduction in background amplification is achieved. When using the modified SMART method, the source material is amplified by more than 10 ⁵ times in a short time, so it is possible to work with very small amounts of RNA (less than 1 nanogram) and, therefore, with a small amount of the studied tissue [Zhu YY, Machleder EM, Chenchik A., Li R., Siebert PD 2001. Reverse transcriptase template switching: a SMART approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques 30, 892-897]. Kits for producing cDNA by this method are produced by various companies, for example, Evrogen, Russia (MINT kit), Clontech, USA, etc.

Раскрытие настоящего изобретенияDisclosure of the present invention

Настоящее изобретение стало возможным в результате проведенного авторами сравнительного анализа уровня транскрипции гена RHOV в опухолевых тканях легких различного типа и на разных этапах их злокачественного перерождения и выявления того факта, что уже ранние стадии развития злокачественной трансформации сопровождаются значительным увеличением уровня транскрипции гена RHOV. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает новый генетический маркер для диагностики немелкоклеточного рака легких и основанный на определении уровня транскрипции этого маркера простой и надежный способ диагностики НМРЛ на разных стадиях развития злокачественной трансформации, включая начальные. Достоверное различие уровней транскрипции гена RHOV в нормальных и опухолевых тканях может быть использовано для обнаружения рака легких.The present invention was made possible by the authors of a comparative analysis of the level of transcription of the RHOV gene in tumor tissues of the lungs of various types and at different stages of their malignant transformation and the fact that already early stages of the development of malignant transformation are accompanied by a significant increase in the level of transcription of the RHOV gene. Thus, the present invention provides a new genetic marker for the diagnosis of non-small cell lung cancer and based on the determination of the level of transcription of this marker a simple and reliable method for the diagnosis of NSCLC at various stages of the development of malignant transformation, including the initial ones. A significant difference in the levels of transcription of the RHOV gene in normal and tumor tissues can be used to detect lung cancer.

Настоящее изобретение в своем первом аспекте относится к новому маркеру для диагностики немелкоклеточного рака легких, который представляет собой уровень транскрипции гена RHOV. Повышенный уровень в предположительно пораженной раком ткани человека по сравнению с ее уровнем в здоровой ткани служит диагностическим признаком немелкоклеточного рака легких.The present invention in its first aspect relates to a new marker for the diagnosis of non-small cell lung cancer, which is the level of transcription of the RHOV gene. An elevated level in human tissue presumably affected by cancer compared with its level in healthy tissue is a diagnostic sign of non-small cell lung cancer.

Конкретно настоящее изобретение относится к способу диагностики немелкоклеточного рака легких, предусматривающему следующие стадии:Specifically, the present invention relates to a method for diagnosing non-small cell lung cancer, comprising the following steps:

а) получение исходной пары образцов ткани от пациента, где один из образцов получен из предположительно пораженной раком ткани, а второй получен из прилегающей гистологически нормальной (условно нормальной) ткани;a) obtaining the initial pair of tissue samples from the patient, where one of the samples was obtained from tissue suspected of cancer, and the second was obtained from adjacent histologically normal (conditionally normal) tissue;

б) выделение и очистка препаратов РНК из исходной пары образцов;b) isolation and purification of RNA preparations from the initial pair of samples;

в) синтез одноцепочечной или двуцепочечной кДНК на матрице РНК с использованием олигонуклеотидных праймеров;c) synthesis of single-stranded or double-stranded cDNA on an RNA template using oligonucleotide primers;

г) нормирование концентрации кДНК гена-маркера по контрольному гену, уровень транскрипции которого постоянен в норме и при раке легких;d) normalization of the cDNA concentration of the marker gene according to the control gene, the transcription level of which is constant in normal conditions and in lung cancer;

д) проведение количественной или полуколичественной реакции амплификации фрагмента кДНК гена-маркера с использованием кДНК, полученной на стадии в), в качестве матрицы и пары геноспецифичных олигонуклеотидных праймеров;d) conducting a quantitative or semi-quantitative reaction of amplification of the cDNA fragment of the marker gene using the cDNA obtained in stage c) as a matrix and a pair of gene-specific oligonucleotide primers;

е) сравнение количества амплифицированного фрагмента кДНК гена-маркера для образца, полученного из предположительно пораженной раком ткани, с количеством амплифицированного фрагмента кДНК для образца, полученного из нормальной ткани. При этом указанные количества амплифицированного фрагмента кДНК отражают уровень транскрипции гена-маркера, причем изменение транскрипции гена-маркера служит диагностическим признаком немелкоклеточного рака легких;f) comparing the amount of the amplified cDNA fragment of the marker gene for the sample obtained from the tissue presumably affected by cancer with the amount of the amplified cDNA fragment for the sample obtained from normal tissue. Moreover, the indicated amounts of the amplified cDNA fragment reflect the level of transcription of the marker gene, and the change in the transcription of the marker gene serves as a diagnostic sign of non-small cell lung cancer;

отличающемуся тем, что ген-маркер представляет собой ген RHOV, а изменение транскрипции гена-маркера представляет собой усиление транскрипции гена RHOV.characterized in that the marker gene is the RHOV gene, and a change in the transcription of the marker gene is an increase in the transcription of the RHOV gene.

Как следует из формулировки способа, в качестве материала для сравнительного анализа уровней транскрипции гена RHOV в нормальных и опухолевых тканях использовали кДНК, синтезированные на матрицах РНК, изолированных из сравниваемых образцов тканей и нормированных между собой по содержанию кДНК контрольного гена, как это описано в уровне техники (в частности, в патенте РФ №2330285). Осуществление (в существенной степени повторение) этих известных стадий описано в примерах 1-4 ниже. Отличие дальнейших стадий от стадий изобретения-аналога определяются тем, что в качестве гена-маркера немелкоклеточного рака легких в соответствии с настоящим изобретением впервые использован ген RHOV.As follows from the formulation of the method, cDNAs synthesized on RNA matrices isolated from the compared tissue samples and normalized to each other by the cDNA content of the control gene, as described in the prior art, were used as a material for comparative analysis of RHOV gene transcription levels in normal and tumor tissues (in particular, in the patent of the Russian Federation No. 2330285). The implementation (substantially repetition) of these known steps is described in Examples 1-4 below. The difference between the further stages and the stages of the analogue invention is determined by the fact that the RHOV gene was first used as a marker gene for non-small cell lung cancer in accordance with the present invention.

В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения рак легких, в отношении которого уровень транскрипции гена RHOV служит в качестве диагностического маркера, представляет собой плоскоклеточный рак легких.In accordance with one embodiment of the present invention, lung cancer, for which the level of transcription of the RHOV gene serves as a diagnostic marker, is squamous cell lung cancer.

В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения рак легких, в отношении которого уровень транскрипции гена RHOV служит в качестве диагностического маркера, представляет собой аденокарциному легких.In accordance with another embodiment of the present invention, lung cancer, for which the level of transcription of the RHOV gene serves as a diagnostic marker, is lung adenocarcinoma.

В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения на стадии в) указанного способа олигонуклеотидные праймеры, используемые для синтеза одноцепочечной или двуцепочечной кДНК, выбирают из числа олиго(dT)-содержащих праймеров, случайных гексануклеотидных праймеров или их комбинации, а также геноспецифичных праймеров.In accordance with one embodiment of the present invention, in step c) of the method, the oligonucleotide primers used to synthesize single or double stranded cDNA are selected from oligo (dT) -containing primers, random hexanucleotide primers or a combination thereof, as well as gene-specific primers.

В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения последовательность праймеров на стадии д) указанного способа представлена SEQ ID NO:1 и 2.In accordance with one of the embodiments of the present invention, the sequence of primers in stage d) of the specified method is represented by SEQ ID NO: 1 and 2.

В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения на стадии д) указанного способа количественная или полуколичественная реакция амплификации фрагмента гена RHOV представляет собой ПЦР в реальном времени или стандартную ОТ-ПЦР.In accordance with one embodiment of step 1) of said method, the quantitative or semi-quantitative amplification reaction of the RHOV gene fragment is real-time PCR or standard RT-PCR.

В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения на стадии г) указанного способа в качестве контрольного гена используют ген GAPDH, кодирующий белок глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу.In accordance with one embodiment of the present invention, in step g) of the method, the GAPDH gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase protein is used as a control gene.

Используя первую или вторую цепь кДНК как матрицу, коммерчески доступную от ряда производителей термостабильную ДНК-полимеразу (например, Taq, Pfu, Tfl, Tth, Tma и т.д.) и специфические праймеры, сайты отжига которых расположены в представляющем интерес транскрипте или комплементарны ему, проводят стандартную полуколичественную ПЦР, в ходе которой амплифицируемый фрагмент транскрипта детектируется простым гель-электорофорезом, или количественную ПЦР в реальном времени. Выбор специфических праймеров осуществляют способом, хорошо известным специалистам в данной области. Для подбора праймеров и температур отжига целесообразно использовать коммерчески доступные программы или программы, находящиеся в свободном доступе в сети Интернет. Среди таких программ можно упомянуть Oligo (версия 6.42), PrimerSelect из пакета Lasergene (www.dnastar.com), Primer Premier 5, primers3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgiC), EasyExonPrimer (Wu X., Munroe D.J. 2006. EasyExonPrimer: Automated Primer Design for Exon Sequences. Appl Bioinformatics. 5, 119-120), ExPrimer (Sandhu K.S., Acharya K.K. 2005. ExPrimer: to design primers from exon-exon junctions. Bioinformatics. 21, 2091-2092), PerlPrimer, FastPCR (http:/www.biocenter.helsinki.fi/bi/Programs/fastpcr.htm), PrimerQuest (http://scitools.idtdna.com/Primerquest/). С учетом сложности анализируемого генома длина праймеров может быть выбрана в диапазоне от 18 до 25 п.н.Using the first or second cDNA strand as a template commercially available from a number of manufacturers, thermostable DNA polymerase (e.g. Taq, Pfu, Tfl, Tth, Tma, etc.) and specific primers whose annealing sites are located in the transcript of interest or are complementary him, conduct standard semi-quantitative PCR, during which the amplified transcript fragment is detected by simple gel electrophoresis, or real-time quantitative PCR. The selection of specific primers is carried out by a method well known to specialists in this field. To select primers and annealing temperatures, it is advisable to use commercially available programs or programs that are freely available on the Internet. Such programs include Oligo (version 6.42), PrimerSelect from the Lasergene package (www.dnastar.com), Primer Premier 5, primers3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgiC ), EasyExonPrimer (Wu X., Munroe DJ 2006. EasyExonPrimer: Automated Primer Design for Exon Sequences. Appl Bioinformatics. 5, 119-120), ExPrimer (Sandhu KS, Acharya KK 2005. ExPrimer: to design primers from exon-exon junctions . Bioinformatics. 21, 2091-2092), PerlPrimer, FastPCR (http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/Programs/fastpcr.htm), PrimerQuest (http://scitools.idtdna.com/Primerquest/). Given the complexity of the analyzed genome, the length of the primers can be selected in the range from 18 to 25 bp

С целью упростить процедуру осуществления способа для целей клинического анализа и обеспечить максимальную сохранность содержащейся в образце РНК необходимо свести к минимуму манипуляции с образцом ткани, которые потенциально могут приводить к разрушению РНК. В этой связи в одном из предпочтительных вариантов получения препарата РНК в данном изобретении не используют ДНКазу, свободную от РНКазы. При этом праймеры для ПНР подбирают таким образом, чтобы продукты амплификации на матрице кДНК даже в присутствии в препарате примеси геномной ДНК могли быть дифференцированы от продуктов амплификации на матрице примесной геномной ДНК. Этого можно достигнуть, например, путем подбора праймеров к разным экзонам гена RHOV. При использовании геноспецифичных праймеров, комплементарных участкам разных экзонов, длина продукта ПЦР, амплифицированного с примесной геномной ДНК, будет значительно больше длины ожидаемого продукта ПЦР, амплифицированного с кДНК.In order to simplify the procedure for implementing the method for the purposes of clinical analysis and to ensure maximum preservation of the RNA contained in the sample, it is necessary to minimize manipulations with the tissue sample, which could potentially lead to RNA destruction. In this regard, in one of the preferred variants of obtaining the RNA preparation in this invention do not use RNAse-free DNase. In this case, the primers for the NDP are selected so that the amplification products on the cDNA template, even in the presence of impurities of genomic DNA in the preparation, can be differentiated from the amplification products on the matrix of impurity genomic DNA. This can be achieved, for example, by selecting primers for different exons of the RHOV gene. When using gene-specific primers complementary to regions of different exons, the length of the PCR product amplified with impurity genomic DNA will be significantly longer than the expected PCR product amplified with cDNA.

В соответствии с одним из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения используют праймер RHOV_F, выбранный в экзоне 2 гена RHOV, и праймер RHOV_R, последовательность которого комплементарна фрагменту последовательности экзона 3 гена RHOV:In accordance with one preferred embodiment of the present invention, the RHOV_F primer selected in exon 2 of the RHOV gene and the RHOV_R primer, the sequence of which is complementary to the fragment of the exon 3 sequence of the RHOV gene, are used:

RHOV_F (SEQ ID NO:1) 5'-GCATTGAGCTCTGGGACACA-3' иRHOV_F (SEQ ID NO: 1) 5'-GCATTGAGCTCTGGGACACA-3 'and

RHOV_R (SEQ ID NO:2) 5'-TGGTCCAGCTGAATTAGTACG-3'.RHOV_R (SEQ ID NO: 2) 5'-TGGTCCAGCTGAATTAGTACG-3 '.

Специалисту в данной области будет понятно, что могут быть подобраны и другие пары праймеров, различающиеся, например, по своей длине, по своей локализации относительно последовательности транскрипта гена RHOV, которые будут обеспечивать специфическую и эффективную амплификацию фрагмента транскрипта гена RHOV лаже в присутствии примеси геномной ДНК.One skilled in the art will understand that other primer pairs can be selected that differ, for example, in length, in their localization relative to the RHOV gene transcript sequence, which will provide specific and efficient amplification of the RHOV gene transcript fragment even in the presence of an impurity of genomic DNA .

Количественная оценка уровня транскрипции достигается с помощью параллельного проведения ПЦР на матрице тестируемого транскрипта и на матрице контрольного (стандартного) транскрипта или предварительного уравнивания количеств матриц в ПЦР по количеству контрольного (стандартного) транскрипта. В качестве эндогенного внутреннего контроля, относительно которого проводилось нормирование продуктов амплификации исследуемого гена RHOV, удобно выбрать ген «домашнего хозяйства», например, ген GAPDH, кодирующий глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу. Экспрессия генов «домашнего хозяйства» во всех клетках одинакова. Для гена GAPDH в случае НМРЛ показан наименьший разброс уровней транскрипции в нормальных и опухолевых тканях (D.W.Liu, S.T.Chen, H.P.Liu. Choice of endogeneous control for gene expression in nonsmall lung cancer. 2005. Eur. Respir.J, 26, 1002-1008).A quantitative assessment of the transcription level is achieved by parallel PCR on the matrix of the test transcript and on the matrix of the control (standard) transcript or by preliminary equalizing the number of matrices in PCR by the number of control (standard) transcript. It is convenient to choose the “housekeeping” gene, for example, the GAPDH gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, as an endogenous internal control, relative to which the amplification products of the RHOV gene were normalized. The expression of the “housekeeping” genes is the same in all cells. For the GAPDH gene in the case of NSCLC, the smallest spread of transcription levels in normal and tumor tissues is shown (DWLiu, STChen, HPLiu. Choice of endogenous control for gene expression in nonsmall lung cancer. 2005. Eur. Respir.J, 26, 1002- 1008).

Для анализа уровня транскрипции генов может быть использована не только стандартная ПЦР, но и ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). В отличие от стандартного метода, где фиксируются только конечные продукты реакции, для ПЦР в реальном времени используются флуоресцентно меченные олигонуклеотидные зонды для детекции ДНК в процессе ее амплификации, что позволяет наблюдать накопление амплифицированных фрагментов в экспоненциальной фазе реакции, что, в свою очередь, увеличивает чувствительность и точность метода. Зонд, комплементарный средней части амплифицируемого фрагмента, содержит на концах флуорофор и тушитель. Когда флуорофор и тушитель связаны с олигонуклеотидным зондом, наблюдается лишь незначительная флуоресцентная эмиссия. В ходе процесса амплификации за счет 5'-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы флуоресцентная метка переходит в раствор, освобождаясь от соседства с тушителем, и генерирует флуоресцентный сигнал, усиливающийся в реальном времени пропорционально накоплению амплификата.To analyze the level of gene transcription, not only standard PCR but also real-time PCR (PCR-RV) can be used. Unlike the standard method, where only the final reaction products are recorded, real-time PCR uses fluorescently labeled oligonucleotide probes to detect DNA during its amplification, which allows the accumulation of amplified fragments to be observed in the exponential phase of the reaction, which, in turn, increases the sensitivity and accuracy of the method. The probe, complementary to the middle part of the amplified fragment, contains a fluorophore and a quencher at the ends. When the fluorophore and quencher are associated with an oligonucleotide probe, only slight fluorescence emission is observed. During the amplification process, due to the 5'-exonuclease activity of Taq polymerase, the fluorescent label passes into solution, being released from the vicinity of the quencher, and generates a fluorescent signal that amplifies in real time in proportion to the accumulation of the amplification.

Подбор зондов для проведения ПЦР-РВ может осуществляться в соответствии со стандартными рекомендациями производителя приборов для ПЦР-РВ. Если отсутствует необходимость мультиплексного анализа нескольких генов одновременно, экономичной альтернативой может быть система, использующая специфический к двухспиральной ДНК краситель SYBR Green, интенсивность флуоресценции которого возрастает в реальном времени пропорционально увеличению количества ампликонов. В таком варианте можно использовать праймеры без зонда.The selection of probes for PCR-RV can be carried out in accordance with the standard recommendations of the manufacturer of devices for PCR-RV. If there is no need for multiplex analysis of several genes simultaneously, an economical alternative can be a system using SYBR Green dye specific for double-stranded DNA, the fluorescence intensity of which increases in real time in proportion to the increase in the number of amplicons. In this embodiment, primers without a probe can be used.

Для проведения ПНР в реальном времени различными фирмами разработаны амплификаторы, например: ABI Prism 7000 Sequence Detection System фирмы Applied Biosystems (США), Chromo4, MiniOpticon или iCycler iQ5 MJ Research (Bio-Rad), а также отечественные приборы ДТ-322 (ДНК-Технология), АНК-32 (Институт Аналитического Приборостоения РАН, http://www.syntol.ru/productank.htm) и т.д. Применение ПЦР-РВ позволяет также уменьшить риск контаминации и автоматизировать процесс диагностики. Процесс продолжается два-три часа (50 или 60 циклов ПЦР соответственно) и включает одновременное проведение ПЦР, детекцию флуоресцентного сигнала, обработку данных и их представление в графическом виде (полной кинетической кривой) с помощью специального программного обеспечения. Результаты анализа становятся доступными сразу после завершения процесса и не требуют дополнительно очистки и анализа продуктов ПЦР. В качестве основного метода измерения уровня транскрипции генов обычно выбирают сравнительный метод (метод относительных измерений, RQ-метод), основанный на относительном измерении количества исследуемых полинуклеотидных последовательностей, позволяющий проводить двойное сравнение результатов - для контрольных и целевых генов, а также для нормальных и опухолевых образцов кДНК.For real-time commissioning in real time, various companies have developed amplifiers, for example: ABI Prism 7000 Sequence Detection System by Applied Biosystems (USA), Chromo4, MiniOpticon or iCycler iQ5 MJ Research (Bio-Rad), as well as domestic devices DT-322 (DNA- Technology), ANK-32 (Institute for Analytical Instrumentation RAS, http://www.syntol.ru/productank.htm), etc. The use of PCR-RV also reduces the risk of contamination and automates the diagnostic process. The process lasts two to three hours (50 or 60 PCR cycles, respectively) and includes simultaneous PCR, detection of a fluorescent signal, data processing and their presentation in graphical form (full kinetic curve) using special software. The results of the analysis become available immediately after the completion of the process and do not require additional purification and analysis of PCR products. As the main method for measuring the level of gene transcription, the comparative method (relative measurement method, RQ method) is usually chosen, based on the relative measurement of the number of studied polynucleotide sequences, which allows a double comparison of the results for control and target genes, as well as for normal and tumor samples cDNA

Уровень транскрипции гена RHOV считался повышенным в опухоли в следующих случаях: а) если продукт не обнаруживался на любом из циклов амплификации в норме и обнаруживался в опухоли, начиная с любого из циклов амплификации, б) если продукт обнаруживался в норме, начиная с любого из циклов амплификации, и уровень траснкрипта RHOV в опухоли после 34 циклов амплифкации превышал таковой в норме. Достоверность различий в транскрипции RHOV в опухолях и условных нормах оценивали по точному критерию Фишера. Данные считали достоверными при Р<0,05, где Р - показатель статистической значимости (достоверности) данных.The level of transcription of the RHOV gene was considered elevated in the tumor in the following cases: a) if the product was not detected in any of the amplification cycles normal and was detected in the tumor starting from any of the amplification cycles, b) if the product was detected normally from any of the cycles amplification, and the level of RHOV transcript in the tumor after 34 cycles of amplification was higher than normal. The significance of differences in RHOV transcription in tumors and conditional norms was evaluated by Fisher's exact test. The data were considered reliable at P <0.05, where P is an indicator of the statistical significance (reliability) of the data.

Настоящим изобретением также предусмотрено, что, поскольку повышенный уровень транскрипта RHOV является характерной чертой опухолевых, но не нормальных, клеток в ткани легких, определение уровня транскрипции гена RHOV будет полезным при мониторинге эффективности проводимой противораковой терапии, причем анализ в соответствии со способом согласно настоящему изобретению следует проводить до начала и после окончания курса лечения, а также при необходимости по ходу курса лечения. Снижение уровня транскрипции гена RHOV по ходу или по завершении курса лечения может рассматриваться как индикатор элиминации опухолевых клеток и, возможно, принимая во внимания упомянутую выше возможную причинно-следственную связь транскрипции гена RHOV с прогрессией опухоли, позволит говорить о положительном эффекте лечения. Напротив, увеличение или неизменность уровня транскрипции гена RHOV может свидетельствовать о неэффективности лечения.The present invention also provides that, since an elevated level of RHOV transcript is a characteristic of tumor, but not normal, cells in lung tissue, determining the level of transcription of the RHOV gene will be useful in monitoring the effectiveness of anti-cancer therapy, and analysis in accordance with the method according to the present invention follows carry out before and after the course of treatment, and also, if necessary, during the course of treatment. A decrease in the level of transcription of the RHOV gene during or at the end of the course of treatment can be considered as an indicator of the elimination of tumor cells and, possibly, taking into account the possible causal relationship between transcription of the RHOV gene and tumor progression mentioned above, we can speak of a positive treatment effect. In contrast, an increase or invariance in the level of transcription of the RHOV gene may indicate treatment failure.

В соответствии с еще одним своим аспектом настоящее изобретение относится к набору праймеров для осуществления полимеразной цепной реакции для определения уровня транскрипции гена RHOV, имеющих последовательность SEQ ID NO:1 и 2.In accordance with another aspect of the present invention relates to a set of primers for the implementation of the polymerase chain reaction to determine the level of transcription of the RHOV gene having the sequence of SEQ ID NO: 1 and 2.

Таким образом, настоящее изобретение позволяет расширить арсенал средств диагностики немелкоклеточного рака легких и, снабжая онколога дополнительным диагностическим инструментом, повысить точность такой диагностики.Thus, the present invention allows to expand the arsenal of diagnostic tools for non-small cell lung cancer and, providing the oncologist with an additional diagnostic tool, to increase the accuracy of such a diagnosis.

Краткое описание фигурBrief Description of the Figures

Далее изобретение будет более подробно раскрыто со ссылкой на отдельные иллюстративные примеры и фигуры.The invention will now be described in more detail with reference to certain illustrative examples and figures.

На фиг.1 показаны результаты подбора условий определения уровня транскрипции гена RHOV в образцах тканей легких. Электрофоретическое разделение в агарозном геле продуктов ПНР (размер 238 п.н.), полученных после 34, 37 и 40 циклов, проводили в 1,8%-ном агарозном геле при использовании в качестве матрицы кДНК одного из образцов опухоли легких. М - маркер молекулярных масс ДНК (50 bp Ladder, Fermentas, Литва).Figure 1 shows the results of the selection of conditions for determining the level of transcription of the RHOV gene in lung tissue samples. Electrophoretic separation on an agarose gel of PNR products (size 238 bp) obtained after 34, 37 and 40 cycles was carried out on a 1.8% agarose gel using one of the lung tumor samples as the cDNA template. M - DNA molecular weight marker (50 bp Ladder, Fermentas, Lithuania).

На фиг.2 показаны результаты ОТ-ПЦР-анализа уровня транскрипции гена RHOV при ПРЛ с центральной локализацией опухоли и АКЛ (после 34-х, 37-ми и 40-ка циклов). Номера образцов и число циклов амплификации указаны над дорожками. Т - опухоль, N - условная норма (прилежащие к опухоли ткани). Образцы были предварительно выравнены по уровню транскрипции GAPDH. Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР проводили в 1,8%-ном агарозном геле. Показаны репрезентативные результаты анализа.Figure 2 shows the results of RT-PCR analysis of the level of transcription of the RHOV gene in PRL with centralized localization of the tumor and AKL (after 34, 37 and 40 cycles). Sample numbers and the number of amplification cycles are indicated above the tracks. T - tumor, N - conditional norm (tissue adjacent to the tumor). Samples were pre-aligned with GAPDH transcription. Electrophoretic separation of PCR products was carried out on a 1.8% agarose gel. Representative analysis results are shown.

Далее настоящее изобретение будет подробно проиллюстрировано конкретными примерами, представляющими собой одни из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения. При этом среднему специалисту в данной области техники будет очевидно, что изобретение не ограничивается этими конкретно описанными вариантами осуществления. Напротив, предполагается, что под его объем подпадают любые альтернативы, модификации или эквиваленты, допустимые с учетом сущности изобретения.Further, the present invention will be illustrated in detail by specific examples representing one of the preferred embodiments of the present invention. Moreover, it will be apparent to one of ordinary skill in the art that the invention is not limited to these specifically described embodiments. On the contrary, it is intended that its scope covers any alternatives, modifications or equivalents that are acceptable given the nature of the invention.

Описание конкретных примеров осуществления изобретенияDescription of specific embodiments of the invention

Пример 1. Образцы тканей легкихExample 1. Samples of lung tissue

Анализировали 29 пар образцов легочных тканей (опухоль/условная норма) пациентов с НМРЛ: 25 пар образцов ПРЛ (19 образцов с центральной локализацией опухоли и шесть - с периферической) и четыре пары образцов АКЛ. За условную норму принимали гистологически нормальные ткани легких, взятые из прилегающей к опухоли ткани ближе к краю резекции. Средний возраст пациентов, среди которых 28 мужчин и одна женщина, составляет 61 год (диапазон 34-76 лет). Диагноз в каждом случае устанавливали на основании результатов клинического, морфологического, эндоскопического и рентгенологического обследований. Все опухолевые образцы охарактеризованы согласно международной системе клинико-морфологической классификации опухолей TNM, где Т (tumor) - ТО-Т4 - категории, отражающие нарастание размера и/или местного распространения первичной опухоли, N (nodulus) - N0-N3 - категории, отражающие различную степень поражения региональных лимфатических узлов; М (metastasis) - М0-М1 - характеризует отдаленные метастазы. Все возможные комбинации TNM объединяют в более крупные группы - стадии, отражающие течение опухолевого процесса. I-я стадия заболевания установлена у шести больных, II-я - у 18-ти, III-я - у пяти. Признаков отдаленных метастазов не наблюдали ни у одного из пациентов. Никто из пациентов не подвергался до операции лучевой терапии и химиотерапии.We analyzed 29 pairs of lung tissue samples (tumor / conditional norm) of patients with NSCLC: 25 pairs of PRL samples (19 samples with central tumor location and six with peripheral) and four pairs of AKL samples. The histologically normal lung tissue taken from the tissue adjacent to the tumor closer to the edge of the resection was taken as the conditional norm. The average age of patients, including 28 men and one woman, is 61 years old (range 34-76 years). The diagnosis in each case was established on the basis of the results of clinical, morphological, endoscopic and radiological examinations. All tumor samples were characterized according to the international system of clinical and morphological classification of TNM tumors, where T (tumor) - TO-T4 - categories reflecting an increase in the size and / or local distribution of the primary tumor, N (nodulus) - N0-N3 - categories reflecting different the degree of damage to regional lymph nodes; M (metastasis) - M0-M1 - characterizes distant metastases. All possible combinations of TNM are combined into larger groups - stages that reflect the course of the tumor process. The first stage of the disease was found in six patients, the second stage in 18 patients, the third stage in five. Signs of distant metastases were not observed in any of the patients. None of the patients were exposed to radiation therapy and chemotherapy before surgery.

Пример 2. Выделение РНК из образцов тканейExample 2. The selection of RNA from tissue samples

Тотальную РНК выделяли из замороженных, измельченных в жидком азоте образцов опухолевых и нормальных тканей. Образцы тканей гомогенизировали на приборе Micro-Dismembrator U (Sartorius, Германия). Очистку РНК проводили стандартным методом с использованием гуанидинизотиоцианата и фенола с последующим осаждением этиловым спиртом [Sambrook et al., 1989, supra]. Для удаления примесей гликопротеидов, которыми богаты ткани легких, использовали дополнительное осаждение РНК солевым раствором [Chomczynski P., Mackey К. 1995. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide- and proteoglycan-rich sources. Biotechniques 19, 942-945]. После солевого осаждения все препараты РНК очищали с помощью набора "RNeasy Mini kit" (Qiagen, США) согласно прилагаемому изготовителем протоколу. Такая трехэтапная процедура очистки РНК позволила эффективно избавиться не только от труднорастворимых осадков гликопротеидов, но и от низкомолекулярных РНК. Качество препарата РНК проверяли электрофорезом в 1%-ном агарозном геле в присутствии бромида этидия. Количество РНК определяли спектрофотометрически [Sambrook et al., 1989, supra].Total RNA was isolated from frozen samples of tumor and normal tissues, crushed in liquid nitrogen. Tissue samples were homogenized on a Micro-Dismembrator U device (Sartorius, Germany). RNA was purified by the standard method using guanidinisothiocyanate and phenol, followed by precipitation with ethanol [Sambrook et al., 1989, supra]. To remove impurities of glycoproteins that are rich in lung tissue, additional RNA precipitation was used with saline [Chomczynski P., Mackey K. 1995. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide- and proteoglycan-rich sources. Biotechniques 19, 942-945]. After salt precipitation, all RNA preparations were purified using the RNeasy Mini kit (Qiagen, USA) according to the protocol supplied by the manufacturer. Such a three-stage RNA purification procedure allowed us to effectively get rid of not only insoluble glycoprotein precipitates, but also low molecular weight RNA. The quality of the RNA preparation was checked by electrophoresis on a 1% agarose gel in the presence of ethidium bromide. The amount of RNA was determined spectrophotometrically [Sambrook et al., 1989, supra].

Пример 3. Реакция обратной транскрипцииExample 3. The reaction of reverse transcription

Синтез первой цепи кДНКSynthesis of the first strand of cDNA

На матрице РНК, выделенной, как описано в примере 2, синтезировали одноцепочечную кДНК. Для получения кДНК использовали модифицированный SMART-метод [Zhu Y.Y., Machleder E.M., Chenchik A., Li R., Siebert P.D. 2001, Reverse transcriptase template switching: a SMART approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques 30, 892-897], 2 нг - 1 мкг тотальной РНК, праймеры:Single-stranded cDNA was synthesized on an RNA matrix isolated as described in Example 2. To obtain cDNA, a modified SMART method was used [Zhu Y. Y., Machleder E.M., Chenchik A., Li R., Siebert P.D. 2001, Reverse transcriptase template switching: a SMART approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques 30, 892-897], 2 ng - 1 μg of total RNA, primers:

SMART (5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCrGrGrG-3') иSMART (5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCrGrGrG-3 ') and

CDS(5'-AGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30N-1N-3'), иCDS (5'-AGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC (T) 30N-1N-3 '), and

обратную транскриптазу PowerScript (Clontech, США).PowerScript reverse transcriptase (Clontech, USA).

Условия реакции:Reaction conditions:

Состав реакционной смеси (10 мкл):The composition of the reaction mixture (10 μl):

РНК (1 мкг/мкл)RNA (1 μg / μl) 1,0 мкл1.0 μl праймер SMART (6 мкМ)SMART primer (6 μM) 2,0 мкл2.0 μl праймер CDS (10 мкМ)CDS primer (10 μM) 1,0 мкл1.0 μl стерильная деионизованная водаsterile deionized water 1,0 мкл.1.0 μl

Смесь прогревали при 72°С в течение 3 мин и помещали в лед. Добавляли 5 мкл смеси:The mixture was warmed at 72 ° C for 3 minutes and placed on ice. 5 μl of the mixture was added:

буфер (Clontech) для построения 1-й цепи (5×)buffer (Clontech) for building the 1st chain (5 ×) 2,0 мкл2.0 μl dNTP (10 мМ)dNTP (10 mm) 1,0 мкл1.0 μl DТТ (20 мМ)DTT (20 mm) 1,0 мкл1.0 μl обратная транскриптаза PowerScript (Clontech)PowerScript reverse transcriptase (Clontech) 1,0 мкл1.0 μl

Смесь инкубировали при 42°С в течение 60 мин. Реакцию останавливали прогреванием при 65°С в течение 5 мин, добавляли 2 мкл 60 мМ ЭДТА и доводили объем смеси до 20 мкл.The mixture was incubated at 42 ° C for 60 minutes. The reaction was stopped by heating at 65 ° C for 5 min, 2 μl of 60 mM EDTA was added, and the mixture volume was adjusted to 20 μl.

Пример 4. Синтез второй цепи кДНКExample 4. The synthesis of the second strand of cDNA

Для синтеза второй цепи кДНК и амплификации брали 1/10 часть от объема реакционной смеси, полученной в примере 3. Синтез проводили с помощью Advantage2 DNA Polymerase с праймером 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' согласно протоколу «Advantage 2 PCR kit» (Clontech, Heidelberg, Germany).For the synthesis of the second cDNA strand and amplification, 1/10 of the reaction mixture obtained in Example 3 was taken. The synthesis was performed using Advantage2 DNA Polymerase with 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3 'primer according to the Advantage 2 PCR kit protocol (Clontech, Heidelberg , Germany).

Условия проведения ПЦР:PCR conditions:

Состав реакционной смеси (50 мкл):The composition of the reaction mixture (50 μl):

ПЦР-буфер Advantage 2 (Clontech) (10×)Advantage 2 PCR buffer (Clontech) (10 ×) 5,0 мкл5.0 μl dNTP (2,5 мМ)dNTP (2.5 mm) 5,0 мкл5.0 μl праймер 10 мкМ10 μM primer 1,0 мкл1.0 μl кДНК (одноцепочечная)cDNA (single stranded) 1,0 мкл1.0 μl Advantage 2 ДНК-полимераза (Clontech)Advantage 2 DNA Polymerase (Clontech) 1,0 мкл1.0 μl стерильная деионизованная водаsterile deionized water 37,0 мкл37.0 μl

Условия амплификации:Amplification conditions:

95°С, 1,5 мин, 1 цикл;95 ° C, 1.5 min, 1 cycle;

95°С, 20 с; 65°С, 20 с; 72°С, 3 мин, 14-17-20-23 цикла.95 ° C, 20 s; 65 ° C, 20 s; 72 ° C, 3 min, 14-17-20-23 cycle.

Для каждого образца подбирали количество циклов, позволяющих получать одинаковое количество амплифицированного материала.For each sample, the number of cycles was selected, allowing to obtain the same amount of amplified material.

Пример 5. Подбор условий определения уровня транскрипции гена RHOV в образцах тканей опухолей легкихExample 5. Selection of conditions for determining the level of transcription of the RHOV gene in tissue samples of lung tumors

При подборе условий определения уровней транскрипции для амплификации двуцепочечной кДНК использовали геноспецифичные праймеры RHOV_F (SEQ ID NO: 1) и RHOV_R (SEQ ID NO: 2), которые были подобраны к разным экзонам гена RHOV. В этих условиях присутствие примесей геномной ДНК не влияет на результаты определения уровня транскрипта RHOV, поскольку возможные продукты амплификации на матрице геномной ДНК (гена RHOV) будут большего размера, чем продукты амплификации на матрице кДНК RHOV.When selecting conditions for determining transcription levels for amplification of double-stranded cDNA, gene-specific primers RHOV_F (SEQ ID NO: 1) and RHOV_R (SEQ ID NO: 2), which were matched to different exons of the RHOV gene, were used. Under these conditions, the presence of impurities of genomic DNA does not affect the results of determining the level of the RHOV transcript, since the possible amplification products on the genomic DNA matrix (RHOV gene) will be larger than the amplification products on the RHOV cDNA matrix.

Амлификацию проводили с помощью набора реагентов для амплификации ДНК "GenePak PCR Core" производства Isogene Lab. Ltd. (Москва, Россия) согласно протоколу производителя. Размер продукта амплификации составляет 238 п.н. Подбор условий проведения ПЦР осуществляли на нескольких образцах кДНК тканей случайно выбранных опухолей легких. Амплификацию проводили в 20 мкл смеси. Реакционную смесь (60 мкл) разделяли на 3 части по 20 мкл для проведения 34, 37 и 40 циклов амплификации.Amplification was performed using the GenePak PCR Core DNA amplification reagent kit from Isogene Lab. Ltd. (Moscow, Russia) according to the manufacturer's protocol. The size of the amplification product is 238 bp. The selection of PCR conditions was carried out on several cDNA samples of tissues of randomly selected lung tumors. Amplification was carried out in 20 μl of the mixture. The reaction mixture (60 μl) was divided into 3 parts of 20 μl for 34, 37 and 40 amplification cycles.

В состав реакционной смеси (60 мкл) входило:The composition of the reaction mixture (60 μl) included:

ПЦР-растворительPCR solvent 30,0 мкл30.0 μl праймер RHOV_F, 45 мкМprimer RHOV_F, 45 μM 0,6 мкл0.6 μl праймер RHOV_R, 43 мкМprimer RHOV_R, 43 μm 0,6 мкл0.6 μl образец кДНК (0,1 мкг/мкл)cDNA sample (0.1 μg / μl) 3,0 мкл3.0 μl стерильная деионизованная водаsterile deionized water 25,8 мкл.25.8 μl.

ПЦР проводилась в следующих условиях:PCR was performed under the following conditions:

94°С, 2 мин 1 цикл;94 ° C, 2 min 1 cycle;

94°С, 30 с; 60°С, 60 с; 72°С, 60 с; 34, 37 и 40 циклов;94 ° C, 30 s; 60 ° C, 60 s; 72 ° C, 60 s; 34, 37 and 40 cycles;

72°С, 3 мин 1 цикл.72 ° C, 3 min 1 cycle.

Образцы кДНК нормировали по контрольному гену GAPDH, кодирующему белок глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу. Для этого подбирали количества матриц, обеспечивающих получение равных количеств продукта амплификации на матрице GAPDH в ПЦР с одинаковыми количествами циклов амплификации до наступления насыщения по продукту амплификации. Амплификацию проводили с праймерами GAPDH-for (5'-TTAGCACCCCTGGCCAAGG-3') и GAPDH-rev (5'-CTTACTCCTTGGAGGCCATG-3') в реакционной смеси объемом 50 мкл, содержащей 16,6 мМ сульфата аммония, 67 мМ Трис-HCl, рН 8,8, 0,1% Tween 20, 2,5 мМ MgCl₂, 0,125 мМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 0,4 мМ каждого из праймеров и 1 ед. активности ДНК-полимеразы Taq (ГосНИИ Генетика, Россия). ПЦР проводили в следующих условиях: 94°С, 30 с; 58°С, 30 с и 72°С, 40 с. После 24, 27 и 30 циклов отбирали аликвоты реакционной смеси.The cDNA samples were normalized by the control GAPDH gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase protein. To do this, we selected the number of matrices providing equal amounts of the amplification product on the GAPDH matrix in PCR with the same number of amplification cycles until saturation of the amplification product. Amplification was performed with GAPDH-for primers (5'-TTAGCACCCCTGGCCAAGG-3 ') and GAPDH-rev (5'-CTTACTCCTTGGAGGCCATG-3') in a 50 μl reaction mixture containing 16.6 mM ammonium sulfate, 67 mM Tris-HCl, pH 8.8, 0.1% Tween 20, 2.5 mm MgCl ₂ , 0.125 mm each deoxynucleotide triphosphate, 0.4 mm each of the primers and 1 unit activity of Taq DNA polymerase (State Research Institute of Genetics, Russia). PCR was performed under the following conditions: 94 ° C, 30 s; 58 ° C, 30 s and 72 ° C, 40 s. After 24, 27 and 30 cycles, aliquots of the reaction mixture were selected.

ПЦР проводили на амплификаторе РТС-220 DNA Engine Dyad Cycler (BioRad, США). Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в Трис-ацетатном буфере (40 мМ Трис-ацетат, 1 мМ ЭДТА, рН 7,6) в 1,8%-ном агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл бромида этидия (фиг.1). В результате были подобраны оптимальные условия ОТ-ПЦР (34-37-40 циклов), при которых получали увеличение количества продуктов ПЦР с увеличением числа циклов (фиг.2). Все реакции амплификации повторяли трижды.PCR was performed on a RTS-220 DNA Engine Dyad Cycler amplifier (BioRad, USA). Amplification products were analyzed by Tris acetate buffer electrophoresis (40 mM Tris acetate, 1 mM EDTA, pH 7.6) in a 1.8% agarose gel containing 0.5 μg / ml ethidium bromide (FIG. 1 ) As a result, optimal RT-PCR conditions were selected (34-37-40 cycles), under which an increase in the number of PCR products with an increase in the number of cycles was obtained (Fig. 2). All amplification reactions were repeated three times.

Результаты анализа продуктов амплификации документировали с помощью системы документации гелей ChemiDoc XRS (BioRad, США) и оценивали интенсивность флуоресценции полос после электрофоретического разделения продуктов ПЦР с помощью программного обеспечения QuantityOne 4.6.2 (BioRad, США).The results of the analysis of amplification products were documented using the ChemiDoc XRS gel documentation system (BioRad, USA) and the fluorescence intensity of the bands after electrophoretic separation of PCR products was estimated using QuantityOne 4.6.2 software (BioRad, USA).

Продукты амплификации с праймерами RHOV_F и RHOV_R клонировали в векторе pCR®-Blunt (Invitogen, США) и определяли их нуклеотидную последовательность. Определенные нуклеотидные последовательности клонированных продуктов амплификации полностью совпадали с последовательностями фрагмента кДНК RHOV между последовательностями, соответствующей и комплементарной последовательностям праймеров RHOV_F и RHOV_R соответственно. Определение нуклеотидных последовательностей клонированных продуктов амплификации проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye Terminator v.3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant.Amplification products with primers RHOV_F and RHOV_R were cloned in pCR®-Blunt vector (Invitogen, USA) and their nucleotide sequence was determined. The determined nucleotide sequences of the cloned amplification products completely coincided with the sequences of the RHOV cDNA fragment between the sequences corresponding to and complementary to the sequences of primers RHOV_F and RHOV_R, respectively. The nucleotide sequences of the cloned amplification products were determined using the ABI PRISM® BigDye Terminator v.3.1 reagent kit, followed by analysis of the reaction products on an ABI PRISM 3100-Avant automated DNA sequencer.

Пример 6. Определение уровня транскрипции гена RHOV в образцах нормальных и опухолевых тканей легкихExample 6. Determination of the level of transcription of the RHOV gene in samples of normal and tumor lung tissue

Протокол определения уровня транскрипцииProtocol for determining the level of transcription

1. В отдельной стерильной микроцентрифужной пробирке объемом 0,5-1,5 мл приготавливали мастер-микс, смешав все компоненты ПЦР, кроме матрицы. Мастер-микс готовили из расчета 3 реакционных смеси объемом 20 мкл для каждого образца + 1 дополнительная реакционная смесь объемом 20 мкл (контроль).1. In a separate sterile microcentrifuge tube with a volume of 0.5-1.5 ml, a master mix was prepared by mixing all the PCR components except the matrix. The master mix was prepared from the calculation of 3 reaction mixtures with a volume of 20 μl for each sample + 1 additional reaction mixture with a volume of 20 μl (control).

Состав мастер-микса (76 мкл):The composition of the master mix (76 μl):

ПЦР-растворительPCR solvent 40,0 мкл40.0 μl праймер RHOV_F, 45 мкМprimer RHOV_F, 45 μM 0,8 мкл0.8 μl праймер RHOV_R, 43 мкМprimer RHOV_R, 43 μm 0,8 мкл0.8 μl стерильная деионизованная водаsterile deionized water 34,4 мкл.34.4 μl.

2. В отдельной пробирке стрипа (контроль), помеченной для проведения 40 циклов амплификации, смешивали 19 мкл мастер-микса и 1 мкл стерильной деионизованной воды.2. In a separate strip tube (control), labeled for 40 amplification cycles, 19 μl of the master mix and 1 μl of sterile deionized water were mixed.

3. К оставшемуся объему мастер-микса (57 мкл) добавляли 3 мкл матрицы, перемешивали несколько раз пипетированием или легким постукиванием пальцем по пробирке, центрифугировали в течение 5-10 сек в настольной центрифуге при скорости 10000-16000g.3. 3 μl of the matrix was added to the remaining volume of the master mix (57 μl), mixed several times by pipetting or lightly tapping the tube with a finger, centrifuged for 5-10 seconds in a benchtop centrifuge at a speed of 10000-16000g.

4. По 20 мкл реакционной смеси переносили в пробирки стрипа, помеченные для проведения 34, 37 и 40 циклов амплификации.4. 20 μl of the reaction mixture was transferred into test tubes of the strip, labeled for 34, 37 and 40 amplification cycles.

5. Крышки пробирок закрывали и реакционную смесь осаждали центрифугированием в течение 5-10 сек в настольной центрифуге при скорости 10000-16000g.5. The caps of the tubes were closed and the reaction mixture was besieged by centrifugation for 5-10 seconds in a benchtop centrifuge at a speed of 10000-16000g.

6. Пробирки помещали в амплификатор и проводили 34, 37 и 40 циклов реакции амплификации.6. The tubes were placed in an amplifier and 34, 37 and 40 cycles of the amplification reaction were performed.

7. После завершения реакции амплификации 10 мкл продуктов амплификации наносили на 1,8%-ный агарозный гель, содержащий 0,5 мг/л бромида этидия. Также на гель наносили маркер молекулярных масс ДНК, позволяющий оценить размер продуктов амплификации (использовали 50 bp Ladder, производства Fermentas, Литва). Гель-электрофорез проводили в ТАЕ-буфере, содержащем 0,5 мг/л бромида этидия. Длина разделения составляет 3-4 см геля. После гель-электрофореза визуализацию продуктов амплификации и их документирование проводили в ультрафиолете при длине волны 302 им с помощью системы документации гелей ChemiDoc XRS (BioRad, США).7. After completion of the amplification reaction, 10 μl of the amplification products was applied to a 1.8% agarose gel containing 0.5 mg / L ethidium bromide. A DNA molecular weight marker was also applied to the gel, which allows one to estimate the size of amplification products (50 bp Ladder, manufactured by Fermentas, Lithuania). Gel electrophoresis was performed in TAE buffer containing 0.5 mg / L ethidium bromide. The separation length is 3-4 cm of the gel. After gel electrophoresis, the amplification products were visualized and documented in ultraviolet at a wavelength of 302 using the ChemiDoc XRS gel documentation system (BioRad, USA).

Пример 7. Результаты анализа уровня транскрипции гена RHOVExample 7. The results of the analysis of the level of transcription of the RHOV gene

Авторы продемонстрировали, что в 22 парах опухоль/норма (76%) уровень транскрипции RHOV повышен в опухолях по сравнению с условной нормой (2 пары; 7%) либо в норме транскрипт не обнаруживается (20 пар). При этом в 18 из 22 образцов опухолей транскрипт RHOV детектировали уже после 34 циклов амплификации. В 4 образцах транскрипт RHOV детектировали лишь после 40 циклов амплификации. В 7 парах образцов (24%) транскрипция гена RHOV не была обнаружена ни в опухолях, ни в прилежащих к ним тканях. В прилежащих к опухоли тканях транскрипция RHOV была обнаружена лишь в 2 индивидуальных образцах, при этом транскрипт детектировали лишь после 40 циклов амплификации (см. таблицу 1). Полученные данные свидетельствуют о том, что увеличенный уровень транскрипа гена RHOV является характерной чертой опухолей легких (Р<0.0001).The authors demonstrated that in 22 tumor / norm pairs (76%), the level of RHOV transcription was increased in tumors compared to the conventional norm (2 pairs; 7%) or the transcript was not found to be normal (20 pairs). In 18 of 22 tumor samples, the RHOV transcript was detected after 34 amplification cycles. In 4 samples, the RHOV transcript was detected only after 40 amplification cycles. In 7 pairs of samples (24%), transcription of the RHOV gene was not detected either in tumors or in adjacent tissues. In tissues adjacent to the tumor, RHOV transcription was detected only in 2 individual samples, while the transcript was detected only after 40 amplification cycles (see table 1). The data obtained indicate that an increased transcript level of the RHOV gene is a characteristic feature of lung tumors (P <0.0001).

Таблица 1Table 1 Характеристика клинических образцов и изменение уровня транскрипта гена RHOV в образцах ПРЛ с центральной и периферической локализацией опухоли и АКЛ по сравнению с условной нормойCharacterization of clinical samples and a change in the level of the RHOV gene transcript in PRL samples with central and peripheral localization of the tumor and AKL compared to the conventional norm Тип опухолиTumor type № образцаSample No. Описание опухолевых образцовDescription of tumor samples Изменение уровня транскрипции гена RHOV в опухоли по сравнению с условной нормойChanges in the level of transcription of the RHOV gene in a tumor compared to a conventional norm TNMTNM СтадияStage ОроговениеKeratinization Центральный ПРЛCentral PRL 4four T1N0M0T1N0M0 II -- н.д.n.d. 99 н.д.n.d. 80/0580/05 ++++++ 98/0598/05 IAIA ++ ++++++ 2121 T3N0M0T3N0M0 IIII -- н.д.n.d. 2626 ++++++ 497497 ++++++ 300/05300/05 ++ 66 IIBIIB ++++++ 90/0590/05 T2N1M0T2N1M0 IIBIIB -- ++++++ 77 T3N0M0T3N0M0 IIII ++ ++++++ 1313 ++++++ 15fifteen н.д.n.d. 77/0577/05 ++++++ 55 IIBIIB ++++++ 228/05
290/05228/05
290/05 T3N1M0T3N1M0 IIIIII -- ++ 466466 T3N2M0T3N2M0 ++ ++++++ 14fourteen н.д.n.d. Периферический ПРЛPeripheral PRL 475475 T1N0M0T1N0M0 II -- ++++++ 22 T2N0M0T2N0M0 IBIB -- ++++++ 451451 T3N0M0T3N0M0 IIII ++ ++++++ 476476 IIII -- н.д.n.d. 452452 IIII ++ ++++++ 301/05301/05 T3N1M0T3N1M0 IIIIII ++ ++++++ АКЛAKL 311/05311/05 T2N1M0T2N1M0 IIII н.д.n.d. ++++++ 304/05304/05 T3N0M0T3N0M0 IIII н.д.n.d. ++ 406406 IIII н.д.n.d. ++ 477477 IIII н.д.n.d. н.д.n.d. +++ - уровень транскрипта гена RHOV повышен в опухоли (транскрипт детектируется начиная с 34-го цикла амплификации)
+ - уровень транскрипта гена RHOV повышен в опухоли (транскрипт детектируется начиная с 40-го цикла амплификации)
н.д. - транскрипт гена RHOV не детектируется в опухоли и норме.
TNM - клинико-морфологическая классификация опухолей:
Т0-Т4 - категории, отражающие местное распространение первичной опухоли; N0-N3 - категории, отражающие различную степень метастатического поражения регионарных лимфатических узлов; М0-М1 - характеризуют наличие отдаленных метастазов.
А - отсутствие метастазов, В - поражение одиночных лимфатических узлов, н.д. - нет данных.+++ - the level of the RHOV gene transcript is increased in the tumor (the transcript is detected starting from the 34th amplification cycle)
+ - the RHOV gene transcript level is increased in the tumor (the transcript is detected starting from the 40th amplification cycle)
n.d. - the transcript of the RHOV gene is not detected in the tumor and normal.
TNM - clinical and morphological classification of tumors:
T0-T4 - categories reflecting the local distribution of the primary tumor; N0-N3 - categories reflecting a different degree of metastatic lesion of regional lymph nodes; M0-M1 - characterize the presence of distant metastases.
A - lack of metastases, B - lesion of single lymph nodes, n.d. - there is no data.

Представленное выше подробное описание изобретения и конкретных вариантов его осуществления, приведенных в примерах со ссылками на фигуры, предназначено исключительно для более полного уяснения сущности заявленного изобретения, но не для его ограничения. Специалисту будет ясно, что могут быть сделаны различные изменения, которые, тем не менее, будут соответствовать сущности и объему настоящего изобретения, которые определяются прилагаемой формулой изобретения.The above detailed description of the invention and specific embodiments of it, given in the examples with reference to the figures, is intended solely to more fully understand the essence of the claimed invention, but not to limit it. It will be apparent to one skilled in the art that various changes may be made, which, however, will be consistent with the spirit and scope of the present invention, which are defined by the appended claims.

Claims

1. A method for the diagnosis of non-small cell lung cancer, comprising the following stages:
a) obtaining the initial pair of tissue samples from the patient, where one of the samples was obtained from tissue suspected of cancer, and the second was obtained from adjacent histologically normal (conditionally normal) tissue;
b) isolation and purification of RNA preparations from the initial pair of samples;
c) synthesis of single-stranded or double-stranded cDNA on an RNA template using oligonucleotide primers;
d) normalization of the cDNA concentration of the marker gene according to the control gene, the transcription level of which is constant in normal conditions and in lung cancer;
d) conducting a quantitative or semi-quantitative reaction of amplification of the cDNA fragment of the marker gene using the cDNA obtained in stage c) as a matrix and a pair of gene-specific oligonucleotide primers;
f) comparing the amount of the amplified cDNA fragment of the marker gene for the sample obtained from the tissue presumably affected by the cancer with the amount of the amplified cDNA fragment for the sample obtained from normal tissue, where the indicated amounts of the amplified cDNA fragment reflect the level of transcription of the marker gene, with the change in the gene transcription the marker serves as a diagnostic sign of non-small cell lung cancer;
characterized in that the marker gene is the RHOV gene, and a change in the transcription of the marker gene is an increase in the transcription of the RHOV gene.

2. The method according to claim 1, in which non-small cell lung cancer is squamous cell cancer.

3. The method according to claim 1, in which non-small cell lung cancer is an adenocarcinoma.

4. The method according to claim 1, in which the oligonucleotide primers used for the synthesis of single-stranded or double-stranded cDNA are oligo (dT) -containing primers.

5. The method according to claim 1, in which the oligonucleotide primers used for the synthesis of single-stranded or double-stranded cDNA are random hexanucleotide primers.

6. The method according to claim 1, in which the oligonucleotide primers used for the synthesis of single-stranded or double-stranded cDNA are a combination of oligo (dT) -containing primers and random hexanucleotide primers.

7. The method according to claim 1, in which the oligonucleotide primers used for the synthesis of single-stranded or double-stranded cDNA are gene-specific primers.

8. The method according to claim 1, in which the GAPDH gene encoding the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase protein is used as a control gene.

9. The method according to claim 1, in which the amplification reaction of the RHOV cDNA fragment is a real-time polymerase chain reaction (PCR).

10. The method according to claim 1, wherein the amplification reaction of the RHOV cDNA fragment is a standard reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).

11. The method according to claim 1, in which the sequence of gene-specific oligonucleotide primers are SEQ ID NO: 1 and 2.

12. A kit for the implementation of the polymerase chain reaction for determining the level of transcription of the RHOV gene in accordance with the method according to any one of claims 1 to 11, containing primers characterized by the sequences of SEQ ID NO: 1 and 2.