RU2441667C1

RU2441667C1 - New type of carrier particles (platforms) for production of active complexes

Info

Publication number: RU2441667C1
Application number: RU2010150332/15A
Authority: RU
Inventors: Иосиф Григорьевич Атабеков (RU); Иосиф Григорьевич Атабеков; Ольга Вячеславовна Карпова (RU); Ольга Вячеславовна Карпова; Михаил Петрович Кирпичников (RU); Михаил Петрович Кирпичников; Николай Александрович Никитин (RU); Николай Александрович Никитин; Марина Владимировна Архипенко (RU); Марина Владимировна Архипенко; Сергей Николаевич Чирков (RU); Сергей Николаевич Чирков
Original assignee: Иосиф Григорьевич Атабеков; Ольга Вячеславовна Карпова; Михаил Петрович Кирпичников; Николай Александрович Никитин; Сергей Николаевич Чирков
Priority date: 2010-12-09
Filing date: 2010-12-09
Publication date: 2012-02-10

Abstract

FIELD: biology, medicine, nanotechnology.

SUBSTANCE: group of inventions is referred to the area of biology, medicine, nanotechnology and involves processing of new platform carriers for formation of complexes with biologically active compounds. The proposed platform carriers are of spherical shape and are made by the way of thermal reconfiguration of structure of tobacco mosaic virus (TMV) or another tobamovirus or another plant virus with spiral structure or their fragments. The platform carriers are also produced by the way of thermal reconfiguration of coat protein of TMV group virus (tobamoviruses) or another phytovirus with spiral structure or their fragments. There were also proposed the compositions containing the platform-carrier of said spherical carrier connected with the alien protein or another biologically active compound. The advantages of new platform carriers include the simplicity and quickness of production, possibility to get spherical particles of regulated sizes, long term storage, absence of aggregation and preservation of spherical shape during its storage, centrifugation and resedimentation, the convenience of spherical particles shape for formation of complexes with target compound.

EFFECT: important feature of a new carrier platform is the capability to adsorb on the surface and to form compositions with different structurally and functionally alien proteins/antigens.

3 cl, 6 ex, 10 dwg

Description

Область применения изобретенияThe scope of the invention

Настоящее изобретение связано, прежде всего, с получением нового типа биогенных частиц-платформ (носителей) для формирования биологически активных комплексов и их использования в медицине, ветеринарии, растениеводстве, иммунологии и вирусологии. Целью изобретения является создание путем кратковременной термоденатурации спиральных вирусов нового универсального и доступного типа сферических наночастиц (СЧ), платформ-носителей для получения биологически активных комплексов путем внеклеточной сборки СЧ с биологически активными компонентами (белки, в том числе вакцинные белки, эпитопы, ферменты, антитела, антибиотики, лекарственные препараты) на поверхности указанных СЧ.The present invention is primarily associated with the preparation of a new type of biogenic platform particles (carriers) for the formation of biologically active complexes and their use in medicine, veterinary medicine, crop production, immunology and virology. The aim of the invention is the creation by short-term thermal denaturation of spiral viruses of a new universal and affordable type of spherical nanoparticles (MF), carrier platforms for the production of biologically active complexes by extracellular assembly of MF with biologically active components (proteins, including vaccine proteins, epitopes, enzymes, antibodies , antibiotics, drugs) on the surface of these midrange.

Настоящее изобретение имеет прямое отношение к производству биологически активных комплексных препаратов путем in vitro сборки вакцинных композиций, состоящих из СЧ-платформ, поверхность которых связана с чужеродными антигенами/эпитипами целевого патогена. В соответствии с этим аспектом настоящего изобретения на основе СЧ были созданы композиции, представляющие собой антигенно активные комплексы сферических частиц-платформ с чужеродными белками или эпитопами, упакованными на поверхности всех сферических частиц-платформ. Таким образом, описанные выше СЧ могут применяться для создания нано- и микрокомпозиций частиц-платформ нового типа с чужеродными целевыми белками, эпитопами, ферментами, антителами, антибиотиками, синтетическими полимерами, металлами и другими объектами. Указанные комплексы могут быть использованы для получения вакцинных и диагностических препаратов для борьбы с вирусными заболеваниями и болезнями иной природы.The present invention is directly related to the production of biologically active complex preparations by in vitro assembly of vaccine compositions consisting of midrange platforms, the surface of which is associated with foreign antigens / epitypes of the target pathogen. In accordance with this aspect of the present invention, compositions based on the midrange have been developed which are antigenically active complexes of spherical platform particles with foreign proteins or epitopes packed on the surface of all spherical platform particles. Thus, the MF described above can be used to create nano- and microcomposites of a new type of platform particles with foreign target proteins, epitopes, enzymes, antibodies, antibiotics, synthetic polymers, metals, and other objects. These complexes can be used to obtain vaccines and diagnostic preparations for combating viral diseases and diseases of a different nature.

Сборка композиций осуществляется за счет уникальной способности СЧ адсорбировать разнообразные целевые белки (ЦБ) с последующей отмывкой комплекса и фиксацией ЦБ на поверхности СЧ с применением формальдегида. В изобретении показана способность СЧ образовывать композиции с различными структурно и функционально неродственными белками. При необходимости рассмотренные СЧ-носители могут образовывать комплексы с металлами, синтетическими полимерами и другими соединениями.The composition is assembled due to the unique ability of MF to adsorb a variety of target proteins (CBs), followed by washing the complex and fixing the CB on the surface of the MF using formaldehyde. The invention shows the ability of SC to form compositions with various structurally and functionally unrelated proteins. If necessary, the considered MF carriers can form complexes with metals, synthetic polymers, and other compounds.

ТерминологияTerminology

Технические и научные термины, использованные в описании изобретения, имеют тот же смысл и значение, которые обычно применяются в соответствующих областях науки и техники. Термины «платформа, носитель» относятся к описываемым в настоящем изобретении сферическим частицам. Термин «сферические наночастицы» (СНЧ) относится к сферическим частицам размером до 100 нм и, в частности, с диаметром, близким к 53 нм (СНЧ, образованные индивидуальными частицами ВТМ). Термин «сферические микрочастицы» (СМЧ) относится к сферическим частицам большего размера (800 нм и более). Термин «сферические частицы» (СЧ) относится к обоим типам сферических частиц платформ-носителей. Термин «мини-СНЧ» относится к СНЧ, имеющим размеры менее 35-40 нм. Термин «частицы неправильной формы» (ЧНФ) относится к подклассу частиц, который включает незрелые частицы неодинакового размера и неправильной формы, полученные при температуре около 90°С. Термины «гетерологичный», «чужеродный», «целевой» (например, «гетерологичные» или «целевые» белки) - это белки, антигенно-неродственные белкам СЧ, использованные в составе комплекса (композиции) с СЧ-носителем. Чужеродные белки обычно (но не обязательно) закодированы не в геноме вируса, из которого получают СЧ, а в геноме другого вируса или альтернативного патогена, отличного от вируса (бактерии, грибы и т.п.). Термин «химерный» геном относится к геному вируса, содержащего ген «слитый» с целым чужеродным геном или его частью. Производные термины: «химерный вирус» и «химерный белок». Термины «антигенная детерминанта», «эпитоп» обозначают антигенно-активные фрагменты/полипептиды, индуцирующие продукцию антител. Термин «вакциноген» соответствует термину «вакцинный белок», т.е. белок, индуцирующий защитную вакцинную реакцию. Термин «композиция» в настоящем изобретении подразумевает комплексы, состоящие из СЧ-носителя и биологически активного компонента (белок/ антиген, эпитоп и др.).Technical and scientific terms used in the description of the invention have the same meaning and meaning, which are usually applied in the relevant fields of science and technology. The terms "platform, carrier" refer to the spherical particles described in the present invention. The term "spherical nanoparticles" (VLF) refers to spherical particles up to 100 nm in size and, in particular, with a diameter close to 53 nm (VLFs formed by individual TMV particles). The term “spherical microparticles” (SMP) refers to larger spherical particles (800 nm or more). The term “spherical particles” (MF) refers to both types of spherical particles of carrier platforms. The term “mini-ELF” refers to ELFs having sizes less than 35-40 nm. The term “irregularly shaped particles” (NNF) refers to a subclass of particles that includes immature particles of uneven size and irregular shape obtained at a temperature of about 90 ° C. The terms “heterologous”, “foreign”, “target” (for example, “heterologous” or “target” proteins) are proteins that are antigenically unrelated to the midrange proteins used in the complex (composition) with the midrange carrier. Foreign proteins are usually (but not necessarily) encoded not in the genome of the virus from which the MF is obtained, but in the genome of another virus or an alternative pathogen other than the virus (bacteria, fungi, etc.). The term "chimeric" genome refers to the genome of a virus containing the gene "fused" with a whole foreign gene or part thereof. Derived terms: "chimeric virus" and "chimeric protein." The terms “antigenic determinant”, “epitope” mean antigenically active fragments / polypeptides that induce antibody production. The term "vaccinogen" corresponds to the term "vaccine protein", i.e. a protein that induces a protective vaccine response. The term “composition” in the present invention means complexes consisting of an MF carrier and a biologically active component (protein / antigen, epitope, etc.).

Уровень техникиState of the art

Известны работы по созданию композиций с использованием вирусов, основанные на конструировании химерных вирусных геномов. В таких случаях в ген белка оболочки (БО) или в другой вирусный ген вставляется ген или фрагмент гена целевого белка (ЦБ). Образуемые при репликации химерного генома химерные вирусные частицы выступают в качестве носителя (платформы), связанной с экспонированным на ее поверхности биологически активным целевым компонентом.Known work on creating compositions using viruses, based on the construction of chimeric viral genomes. In such cases, the gene or fragment of the target protein (CB) gene is inserted into the envelope protein (BO) gene or another viral gene. Chimeric viral particles formed during replication of the chimeric genome act as a carrier (platform) associated with the biologically active target component exposed on its surface.

Известно, что геномы нативных частиц ВТМ и ряда других вирусов растений и животных применялись для получения химерных вирусов-вакцин с помощью методов генной инженерии. Частицы химерного рекомбинантного вируса, несущие на своей поверхности чужеродные эпитопы, получают путем слияния гена белка оболочки с чужеродным эпитопом в составе полноразмерного вирусного генома либо путем сборки in vitro вирусоподобных частиц (ВПЧ) из химерных субъединиц типа "БО-чужеродный эпитоп" (Bendahmane, M., Koo, M., Karrer, E., Beachy R.N. 1999. Display ofepitopes on the surface of tobacco mosaic virus: impact of charge and isoelectric point of the epitope on virus-host interactions. J. Molec. Biol. 290, 9-20; Smith M.L., Lindbo J.A., Dillard-Telm S., Brosio P.M., Lasnikk A.B., McCormick A.A., Nguen L.V., Palmer K.E.,2006. Modified tobacco mosaic virus particles as scaffords for display of protein antigens for vaccine applications. Virology 348,475-488; Tailor K.M., Porta C., Lin Т., Johnson J.E., Parker P.J., and Lomonossov G.P. 1999. Protein-dependent processing of peptides presented on the surface of cowpea mosaic virus. Biol. Chem. 380, 387-392; Turpen H.T. et al. VS Patent 5,977,438, Nov. 1999. Production of peptides in plants as viral coat protein fusions; Gleba Yu., Klimyuk V., Marillonnet S. 2007. Viral vectors for expression of proteins in plants. Curr. Opinion In Biotechnology 18,1-8; Denis J. et al. 2007. Immunogenicity of papaya mosaic virus-like particles fused to hepatitis С virus epitope: evidence for the critical function of multimerization, Virology 363, 59-68; McCormick A.A. and Palmer K.E. 2008 Genetically engineered Tobacco mosaic virus as nanoparticle vaccines. Expert Rev Vaccines. 7(1), 33-41; Leclerc D. 2007. Proteosome-Independent histocompatibility complex class 1 cross-presentation mediated by papaya mosaic virus-like particles leads to expansion of specific human Т cells. J.Virol. 81, 1319-1326; Leclerc, D. 2010, Immunogenic affinity-conjugated antigen systems based on Papaya Mosaic Virus and used thereof. US Patent Application Publication, 2010/0047264 A1, Feb.25; Steinmetz N.F., Lin Т., Lomonossoff G.P. and Johnson J.E. 2009. Structure-based engineering of an icosahedral virus for nanomedicine and nanotechnology. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 327, 23-58); Leclerc, D. 2010, Immunogenic affinity-conjugated antigen systems based on Papaya Mosaic Virus and used thereof. US Patent Application Publication, 2010/0047264 A1, Feb.25).It is known that the genomes of native particles of TMV and a number of other plant and animal viruses were used to obtain chimeric vaccine viruses using genetic engineering methods. Chimeric recombinant virus particles carrying foreign epitopes on their surface are obtained by fusion of the envelope protein gene with a foreign epitope as part of a full-sized viral genome or by in vitro assembly of virus-like particles (HPV) from chimeric subunits of the BO-alien epitope type (Bendahmane, M ., Koo, M., Karrer, E., Beachy RN 1999. Display ofepitopes on the surface of tobacco mosaic virus: impact of charge and isoelectric point of the epitope on virus-host interactions. J. Molec. Biol. 290, 9 -20; Smith ML, Lindbo JA, Dillard-Telm S., Brosio PM, Lasnikk AB, McCormick AA, Nguen LV, Palmer KE, 2006. Modified tobacco mosaic virus particles as scaffords for display of protein antigens for vaccine applic ations. Virology 348,475-488; Tailor KM, Porta C., Lin T., Johnson JE, Parker PJ, and Lomonossov GP 1999. Protein-dependent processing of peptides presented on the surface of cowpea mosaic virus. Biol. Chem. 380, 387-392; Turpen HT et al. VS Patent 5,977,438, Nov. 1999. Production of peptides in plants as viral coat protein fusions; Gleba Yu., Klimyuk V., Marillonnet S. 2007. Viral vectors for expression of proteins in plants. Curr. Opinion In Biotechnology 18.1-8; Denis J. et al. 2007. Immunogenicity of papaya mosaic virus-like particles fused to hepatitis C virus epitope: evidence for the critical function of multimerization, Virology 363, 59-68; McCormick A.A. and Palmer K.E. 2008 Genetically engineered Tobacco mosaic virus as nanoparticle vaccines. Expert Rev Vaccines. 7 (1), 33-41; Leclerc D. 2007. Proteosome-Independent histocompatibility complex class 1 cross-presentation mediated by papaya mosaic virus-like particles leads to expansion of specific human T cells. J. Virol. 81, 1319-1326; Leclerc, D. 2010, Immunogenic affinity-conjugated antigen systems based on Papaya Mosaic Virus and used thereof. US Patent Application Publication, 2010/0047264 A1, Feb. 25; Steinmetz N.F., Lin T., Lomonossoff G.P. and Johnson J.E. 2009. Structure-based engineering of an icosahedral virus for nanomedicine and nanotechnology. Curr. Top Microbiol. Immunol. 327, 23-58); Leclerc, D. 2010, Immunogenic affinity-conjugated antigen systems based on Papaya Mosaic Virus and used thereof. US Patent Application Publication, 2010/0047264 A1, Feb. 25).

При конструировании химерных вирусов методами генетической инженерии в реакции обратной транскрипции на матрице геномной вирусной РНК получают кДНК-копию гена БО. Полученную кДНК размножают с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Продукт ПЦР (ген БО) клонируют в бактериальной плазмиде. Аналогичным образом получают кДНК, кодирующую фрагмент целевого белка (ЦБ). Затем обе ДНК объединяют in vitro («сливают»), одновременно добавляя к конструкции ряд элементов, обеспечивающих эффективную экспрессию полученного гена в бактериальных клетках и возможность очистки рекомбинантного белка из лизата. Полученной плазмидой заражают клетки Escherichia coli. В результате экспрессии рекомбинантного гена образуется БО вируса, слитый с ЦБ («фьюжен-белок»), который собирается в вирусоподобные частицы (ВПЧ) непосредственно в клетках бактерий в силу способности БО к самосборке. ВПЧ выделяют из клеточного лизата (обычно с помощью дорогостоящей аффинной хроматографии) и используют по назначению.When constructing chimeric viruses by genetic engineering in a reverse transcription reaction on a genomic viral RNA template, a cDNA copy of the BO gene is obtained. The resulting cDNA is propagated by polymerase chain reaction (PCR). The PCR product (BO gene) is cloned into a bacterial plasmid. Similarly receive cDNA encoding a fragment of the target protein (CB). Then both DNAs are combined in vitro (“fused”), while at the same time adding to the construct a number of elements that ensure efficient expression of the obtained gene in bacterial cells and the possibility of purification of the recombinant protein from the lysate. The resulting plasmid infects Escherichia coli cells. As a result of expression of the recombinant gene, a BO of the virus is formed, fused with CB (“fusion protein”), which is assembled into virus-like particles (HPV) directly in bacterial cells due to the BO's ability to self-assemble. HPV is isolated from the cell lysate (usually using expensive affinity chromatography) and is used as intended.

Хотя в этом описании опущены многие важные детали, можно видеть, что получение каждого вида рекомбинантного вируса, несущего химерный БО, это сложный, длительный и трудоемкий процесс. Тем не менее, этот подход применяется, так как иным образом зафиксировать ЦБ на интактных вирусных частицах нельзя.Although many important details are omitted in this description, it can be seen that obtaining each type of recombinant virus carrying a chimeric BO is a complex, lengthy and laborious process. Nevertheless, this approach is used, since it is impossible to fix the CB in other way on intact viral particles.

Недостатки применения рекомбинантных химерных вирусов:The disadvantages of using recombinant chimeric viruses:

1. Создание химерных структур требует применения трудоемких методов генной инженерии и значительного времени (около 5-10 месяцев) для модификации вирусного генома и конструирования молекул химерного вирусного БО, соединенного (слитого) с чужеродными антигенами/эпитопами.1. The creation of chimeric structures requires the use of laborious methods of genetic engineering and considerable time (about 5-10 months) to modify the viral genome and construct molecules of the chimeric viral BO linked (fused) with foreign antigens / epitopes.

2. Недостатком применения морфологически немодифицированных спиральных химерных вирусов является высокая степень гетерогенности и агрегации в растворе. При рабочих концентрациях 0,1-10,0 мг/мл в суспензии ВТМ и других спиральных вирусов формируются крупные линейные и латеральные агрегаты вирусных частиц (фиг.1) и даже паракристаллические частицы.2. The disadvantage of using morphologically unmodified helical chimeric viruses is a high degree of heterogeneity and aggregation in solution. At working concentrations of 0.1-10.0 mg / ml, large linear and lateral aggregates of viral particles (Fig. 1) and even paracrystalline particles are formed in a suspension of TMV and other spiral viruses.

3. При накоплении в растении химерные вирусы обычно неспособны заражать его системно и также генетически нестабильны, т.е. химерный вирус ревертируют в вирус дикого типа в процессе репликации. Нередко уже в первом пассаже химерные вирусы теряют инсерции, утрачивают инфекционность или функцию транспорта (Porta С., Spall V.E., Loveland J., Johnson J.T., Parker P.J., Lomonossoff G.P. 1994. Development of cowpea mosaic virus as a highyielding system for the presentation of foreign peptides. Virology, 202, 949-955; Tailor K.M., Porta C., Johnson J.T., Parker P.J., Lomonossoff G.P. 1999. Position-dependent processing of peptides presented on the surface of cowpea mosaic virus. Biol. Chem. 380, 387-392; Bong-Nam Chung, T.Canto, P.Palukaitis 2007, Stability of recombinant plant viruses containing genes of unrelated plant viruses, J. Gen. Virol. 88,1347-1355).3. When chimeric viruses accumulate in a plant, they are usually unable to infect it systemically and are also genetically unstable, that is, the chimeric virus is converted into wild-type virus during replication. Often in the first passage, chimeric viruses lose their insertion, lose their infectivity or transport function (Porta C., Spall VE, Loveland J., Johnson JT, Parker PJ, Lomonossoff GP 1994. Development of cowpea mosaic virus as a highyielding system for the presentation of foreign peptides. Virology, 202, 949-955; Tailor KM, Porta C., Johnson JT, Parker PJ, Lomonossoff GP 1999. Position-dependent processing of peptides presented on the surface of cowpea mosaic virus. Biol. Chem. 380, 387 -392; Bong-Nam Chung, T.Canto, P. Palukaitis 2007, Stability of recombinant plant viruses containing genes of unrelated plant viruses, J. Gen. Virol. 88,1347-1355).

Мы не рассматриваем способы, основанные на сшивании ЦБ и носителя белковой природы с помощью бифункциональных реагентов, поскольку они приводят к формированию агрегатов неконтролируемого размера и состава и, как правило, к существенной инактивации ЦБ как антигена.We do not consider methods based on crosslinking CB and a protein carrier using bifunctional reagents, since they lead to the formation of aggregates of uncontrolled size and composition and, as a rule, to substantial inactivation of CB as an antigen.

Известны также так называемые, аффинно-конъюгированные антигенные системы. Такие системы включают: 1) рекомбинантные вирусы с БО, несущим участок связывания чужеродного целевого белка. В этих случаях ген вирусного белка оболочки следует генетически модифицировать в составе полногеномной копии или в изолированном гене БО введением вставок или делеций для получения афинных участков связывания целевых субстанций белковой природы. Например, с использованием рекомбинантьного ВТМ вводили реактивный лизин в N-концевой участок БО ВТМ для связывания с биотином вирусной частицы. В независимых опытах получали зеленый флуоресцентный белок (целевой белок), ковалентно связанный со стрептавидином. В результате специфического авидин-биотин-взаимодействия получали частицы вируса, декорированного целевым белком-антигеном (ЗФБ) (J.A.Lindbo. O.H.Wooster, Kenneth E. Palmer, K.Y.Owensboro, Mark L., Smith D.C.A. Modified tobacco mosaic virus particles as scaffolds for display of protein antigens for vaccine applicftions. US Patent Pub. No. 2009/0053261 A1, Feb.26, 2009; Lindbo JA, Palmer KE, Owensboro KY, Smith ML. Эта система включает этап аффинной сборки композиций на основе взаимодействия химически модифицированного рекомбинантного вируса-носителя и модифицированного чужеродного антигена. Несмотря на существенную разницу, эта система относительно близка заявляемому изобретению и может быть рассмотрена в качестве прототипа. Аффинно-коньюгированные антигенные системы рассматриваются также в более позднем патенте (Leclerc, D. 2010, Immunogenic affinity-conjugated antigen systems based on Papaya Mosaic Virus and used thereof. US Patent Application Publication, 2010/0047264 A1, Feb.25).The so-called affinity conjugated antigenic systems are also known. Such systems include: 1) recombinant viruses with BO carrying the binding site of a foreign target protein. In these cases, the envelope viral protein gene should be genetically modified as part of a full-genome copy or in an isolated BO gene by inserting inserts or deletions to obtain affinity binding sites for target substances of a protein nature. For example, using recombinant TMV, reactive lysine was introduced into the N-terminal portion of the BV TMV to bind the viral particle to biotin. In independent experiments, a green fluorescent protein (target protein) covalently linked to streptavidin was obtained. As a result of specific avidin-biotin interaction, virus particles decorated with the target protein antigen (PBS) were obtained (JALindbo. OHWooster, Kenneth E. Palmer, KYOwensboro, Mark L., Smith DCA Modified tobacco mosaic virus particles as scaffolds for display of protein antigens for vaccine applicftions. US Patent Pub. No. 2009/0053261 A1, Feb. 26, 2009; Lindbo JA, Palmer KE, Owensboro KY, Smith ML. This system includes the affinity assembly step of compositions based on the interaction of a chemically modified recombinant virus -carrier and modified foreign antigen. Despite the significant difference, this system is relatively close The invention and can be considered as a prototype. Affine-conjugated antigenic systems are also discussed in a later patent (Leclerc, D. 2010, Immunogenic affinity-conjugated antigen systems based on Papaya Mosaic Virus and used thereof. US Patent Application Publication, 2010 / 0047264 A1, Feb.25).

Недостатки применения аффинно-коньюгированных систем: 1) относительно невысокая биологическая активность, 2) сложность и многоступенчатость процедуры, включающей: а) приготовление модифицированного биотином БО вируса, б) получение биотин- либо стрептавидин-меченного целевого белка/антигена с последующей в) обязательной трехстадийной очисткой, то есть отделением биотин-меченного БО от модифицированных стрептавидином молекул ЦБ и выделение комплекса «вирус-биотин-стрептавидин-ЦБ)».Disadvantages of using affinity-conjugated systems: 1) relatively low biological activity, 2) the complexity and multi-stage procedure, including: a) preparation of a modified biotin BO virus, b) obtaining biotin or streptavidin-labeled target protein / antigen, followed by c) mandatory three-stage purification, that is, separation of biotin-labeled BO from streptavidin-modified CB molecules and isolation of the virus-biotin-streptavidin-CB complex).

3) Пользование этой системой осложняется генетической нестабильностью и другими трудностями, характерными для накопления химерных вирусов, рассмотренными выше.3) The use of this system is complicated by genetic instability and other difficulties characteristic of the accumulation of chimeric viruses, discussed above.

4) Другим недостатком аффинно-коньюгированных антигенных систем является отсутствие универсальности - строгая специфичность взаимодействия двух ее компонентов: модифицированной платформы-носителя (БО вируса) и модифицированного целевого белка (например, антигена). В определенных опытах высокая специфичность взаимодействия носителя с целевым белком полезна, облегчая очистку создаваемой композиции от ненужных примесей. Однако в предлагаемом изобретении (то есть при условиях отсутствия примесей за счет применения высокой степени очистки обоих компонентов композиции) специфичность резко ограничила бы возможности носителя (СЧ) одним типом целевого белка/антигена. Между тем преимуществом СЧ является их уникальная способность адсорбировать очень разные белки. Ниже показана способность СЧ.4) Another disadvantage of affinity-conjugated antigenic systems is the lack of universality - the strict specificity of the interaction of its two components: a modified carrier platform (BO virus) and a modified target protein (for example, antigen). In certain experiments, the high specificity of the interaction of the carrier with the target protein is useful, facilitating the purification of the created composition from unnecessary impurities. However, in the present invention (that is, under conditions of the absence of impurities due to the use of a high degree of purification of both components of the composition), specificity would sharply limit the capabilities of the carrier (MF) to one type of target protein / antigen. Meanwhile, the advantage of MF is their unique ability to adsorb very different proteins. The midrange ability is shown below.

5. В отличие от прототипа СЧ могут образовывать композиции с различными структурно и функционально неродственными белками. Более того, помимо белков, СЧ способны адсорбировать химические вещества другой природы, например ионы металлов, что в принципе невозможно при использовании способа, заявленного в прототипе. Так, пример 3 в заявке показывает, что СЧ связывают ионы уранила.5. Unlike the prototype, MFs can form compositions with various structurally and functionally unrelated proteins. Moreover, in addition to proteins, MFs are capable of adsorbing chemicals of a different nature, for example, metal ions, which is impossible in principle when using the method claimed in the prototype. So, example 3 in the application shows that MF bind uranyl ions.

Таким образом, важным результатом изобретения является простой быстрый и доступный способ получения универсальных носителей (платформ) для быстрой и простой сборки вне клетки различных видов комплексов и иммуногенных композиций.Thus, an important result of the invention is a simple fast and affordable way to obtain universal carriers (platforms) for quick and easy assembly outside the cell of various types of complexes and immunogenic compositions.

Аннотацияannotation

Известно, что ВТМ высоко термостабилен (Lauffer, M.A., and Price, W.С. (1940) Thermal denaturation of tobacco mosaic virus. J. Biol. Chem. 133, 1-15), обнаружили, что температурная инактивация ВТМ тесно связана с денатурацией БО. Более 50 лет назад было показано, что при нагревании до 98°С палочки ВТМ преобразуются в шаровидные структуры с объемом, близким к объему исходной палочки вируса (Hart, R.G. (1956) Morphological changes accompanying thermal denaturation of Tobacco mosaic virus. Biochim. Biophys. Acta 20, 388-389). Эти исследования никогда не были продолжены или подтверждены.TMV is known to be highly thermostable (Lauffer, MA, and Price, W.C. (1940) Thermal denaturation of tobacco mosaic virus. J. Biol. Chem. 133, 1-15), and it was found that thermal inactivation of TMV is closely related to denaturation of BO. More than 50 years ago, it was shown that, when heated to 98 ° C, TMV rods are transformed into spherical structures with a volume close to the volume of the original virus coli (Hart, RG (1956) Morphological changes accompanying thermal denaturation of Tobacco mosaic virus. Biochim. Biophys. Acta 20, 388-389). These studies have never been continued or confirmed.

В настоящем изобретении мы изучили более детально феномен термоденатурации БО ВТМ, условия образования сферических частиц (СЧ), их свойства и способность служить наноплатформой для образования нанокомплексов. Термическое превращение спиральных частиц в СЧ показано на примере пяти разных тобамовирусов. Кроме того, в настоящем изобретении продемонстрировано, что другие вирусы растений со спиральной структурой (потексвирусы, гордеивирусы) способны при нагревании генерировать СЧ. Аналогичные СЧ образуются также при термической денатурации белка оболочки (БО) ВТМ в отсутствие РНК.In the present invention, we have studied in more detail the phenomenon of thermodenaturation of BH VTM, the conditions for the formation of spherical particles (MF), their properties and the ability to serve as a nanoplatform for the formation of nanocomplexes. The thermal transformation of spiral particles into the midrange is illustrated by five different tobamoviruses. In addition, the present invention has demonstrated that other plant viruses with a helical structure (potexviruses, hordeiviruses) are capable of generating MF when heated. Similar MFs are also formed during thermal denaturation of the envelope protein (BO) of TMV in the absence of RNA.

Уникальная способность платформы-носителя СЧ формировать композиции с различными структурно и функционально неродственными белками показана на примере ряда чужеродных белков.The unique ability of the MF carrier platform to form compositions with various structurally and functionally unrelated proteins is shown by the example of a number of foreign proteins.

Преимущества СЧ-платформ для создания биологически активных композиций, несущих на своей поверхности чужеродные эпитопы в сравнении с химерными вирусами - вакцинами и вакцинами других типов: 1) Быстрое получение комплексов из СЧ и биологически активных компонентов (например, белков-вакциногенов) на основе «блочной» сборки in vitro; 2) Указанный подход исключает возможность рекомбинации и реверсии патогена; 3) СЧ и иммуногенные комплексы, полученные на основе термоденатурации вирусов растений, биологически безопасны, так как растения и животные не имеют общих патогенов; 4) Процедура получения СЧ-платформ основана на нагревании вируса при 94°С или 98°С, то есть не требует дополнительной стерилизации; 5) Иммуногенные комплексы, полученные на основе СЧ будут антигенно полностью стабильны, так как они генетически инертны; 6) Фитовирусы-доноры СЧ-типа тобамовирусов, потексвирусов и гордеивирусов могут быть выделены простыми процедурами с выходом вируса 2-10 г/кг зараженных листьев, зависимым от вида вируса и растения-хозяина; 7) Важным преимуществом СЧ является их способность адсорбировать на своей поверхности очень разные типы белков, образуя биологически активные композиции.Advantages of midrange platforms for creating biologically active compositions bearing foreign epitopes on their surface in comparison with chimeric viruses - vaccines and other types of vaccines: 1) Rapid production of complexes from midrange and biologically active components (for example, vaccine proteins) based on “block” "In vitro assembly; 2) This approach eliminates the possibility of recombination and reversal of the pathogen; 3) MF and immunogenic complexes obtained on the basis of thermal denaturation of plant viruses are biologically safe, since plants and animals do not have common pathogens; 4) The procedure for producing midrange platforms is based on heating the virus at 94 ° C or 98 ° C, that is, it does not require additional sterilization; 5) Immunogenic complexes obtained on the basis of MF will be antigenically completely stable, since they are genetically inert; 6) MF-type donor phytoviruses of tobamoviruses, potexviruses and hordeiviruses can be isolated by simple procedures with the release of the virus 2-10 g / kg of infected leaves, depending on the type of virus and the host plant; 7) An important advantage of MFs is their ability to adsorb very different types of proteins on their surface, forming biologically active compositions.

Предлагаемые СЧ не были описаны в литературе в качестве наноплатформ и являются новым универсальным типом носителей. Это существенно расширяет ассортимент возможных композиций. СЧ уникальны как платформы-носители. Следовательно, любой биологически активный комплекс, основанный на СЧ-платформе (связанной с антигеном, эпитопом, целевым белком или другим материалом), является оригинальным.The proposed MFs have not been described in the literature as nanoplatforms and are a new universal type of carrier. This significantly expands the range of possible compositions. MFs are unique as carrier platforms. Therefore, any biologically active complex based on the midrange platform (associated with an antigen, epitope, target protein or other material) is original.

Описание изобретенияDescription of the invention

Основными задачами настоящего изобретения являлись: (1) создание и описание свойств наноплатформ-носителей нового типа на основе термоденатурации и структурной перестройки спиральных вирусных наночастиц и (2) создание методом внеклеточной сборки нанокомпозиций, состоящих из указанных выше СЧ-платформ-носителей, несущих на поверхности чужеродный биологически активный компонент (антиген, эпитоп, фермент и т.д.).The main objectives of the present invention were: (1) the creation and description of the properties of a new type of carrier nanoplatforms based on thermal denaturation and structural rearrangement of spiral viral nanoparticles and (2) the creation of nanocompositions consisting of the aforementioned medium-frequency carrier platforms on the surface using the extracellular assembly method foreign biologically active component (antigen, epitope, enzyme, etc.).

(I) В рассмотренных выше публикациях в качестве платформы применялись рекомбинантные химерные вирусы либо их компоненты. При этом морфология и общая архитектура химерных вирусов воспроизводила морфологию нативного вируса. Химерные геномы при репликации продуцируют химерные вирусные частицы, внешне не отличающиеся от нативных. Химерная форма природной оболочки вируса (химерный капсид) служит в качестве платформы, либо она создается при сборке химерного структурного белка («коровый» нуклеокапсид вируса гепатита В).(I) In the above publications, recombinant chimeric viruses or their components were used as a platform. Moreover, the morphology and general architecture of chimeric viruses reproduced the morphology of the native virus. Chimeric genomes during replication produce chimeric viral particles that do not appear to be different from native ones. The chimeric form of the natural envelope of the virus (chimeric capsid) serves as a platform, or it is created during the assembly of a chimeric structural protein (“core” hepatitis B virus nucleocapsid).

В отличие от этого СЧ-платформы, описанные в настоящем изобретении, образованы в результате глубокой денатурации БО и одновременной структурной перестройки исходного спирального вируса. Субъединицы вирусного БО денатурируют при нагревании и в зависимости от концентрации вируса и температуры продуцируют смесь СЧ-гетерогенных по размерам.In contrast, the midrange platforms described in the present invention are formed as a result of deep denaturation of BO and simultaneous structural rearrangement of the original helical virus. The subunits of viral BO denature when heated and, depending on the concentration of the virus and temperature, produce a mixture of midrange heterogeneous in size.

В настоящем изобретении разработан метод, позволяющий контролировать размеры указанных СЧ. Показано, что их размеры зависят от концентрации нативного ВТМ, используемого для термоденатурации. Так, средний диаметр СЧ, образуемых нативным ВТМ в концентрации 0,1, 1 и 10 мг/мл, составляет соответственно 50-160, 100-350 и 250-800 нм. Этот феномен позволяет регулировать размеры СЧ (см. фиг.2b, c, d и фиг.3).The present invention has developed a method that allows you to control the size of these midrange. It was shown that their sizes depend on the concentration of native TMV used for thermodenaturation. So, the average diameter of the MF formed by native TMV at a concentration of 0.1, 1 and 10 mg / ml is 50-160, 100-350 and 250-800 nm, respectively. This phenomenon allows you to adjust the size of the midrange (see fig.2b, c, d and Fig.3).

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения описан метод, позволяющий получить незрелые промежуточные формы СЧ. Указанные незрелые частицы (НЧ) в избытке формируются при 90°С и представляют собой частицы неправильной формы (ЧНФ) и различных размеров (фиг.2а). Отличительное свойство НЧ - их способность превращаться в зрелые СЧ при нагревании до 94-98°С.In accordance with another aspect of the present invention, a method is described for obtaining immature intermediate forms of midrange. These immature particles (NPs) are formed in excess at 90 ° C and are particles of irregular shape (CNF) and various sizes (figa). A distinctive feature of NPs is their ability to turn into mature midrange when heated to 94-98 ° С.

ВТМ можно диссоциировать на белок оболочки и нуклеиновую кислоту с последующей самосборкой вирусных наноструктур in vitro. Самосборка (реполимеризация) низкомолекулярного БО тобамовирусов может осуществляться в отсутствие РНК. Реполимеризации БО протекает ступенчато с образованием серии промежуточных белковых агрегатов возрастающих размеров и заканчивается сборкой вирусоподобных частиц (ВПЧ) (Butler, P.J.G. (1999) Self-assembly of tobacco mosaic virus: the role of intermediate aggregate in generating both specificity and speed. Philos. Trans. R. Soc. 354, 537-550).TMV can be dissociated into envelope protein and nucleic acid, followed by self-assembly of viral nanostructures in vitro. Self-assembly (repolymerization) of low molecular weight BOT tobamoviruses can be carried out in the absence of RNA. Repolymerization of BO proceeds stepwise with the formation of a series of intermediate protein aggregates of increasing size and ends with the assembly of virus-like particles (HPV) (Butler, PJG (1999) Self-assembly of tobacco mosaic virus: the role of intermediate aggregate in generating both specificity and speed. Philos. Trans R. Soc. 354, 537-550).

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен метод, позволяющий использовать для получения СЧ не только препараты нативного вируса, но также и препараты разных форм вирусного БО, не содержащие РНК (фиг.4 и Пример 1), включая ВПЧ (фиг.4а), 20S дисковидные агрегаты БО ВТМ (фиг.4b), А-белок, тример субъединиц (фиг.4с), и мономеры БО ВТМ (фиг.4d). Итак, указанные СЧ образуются при термоденатурации нативного вируса и также разных форм БО, включая мелкие агрегаты (тример субъединиц) и даже индивидуальные субъединицы БО. Трансформация свободных от РНК форм БО в СЧ происходит одноступенчато, без образования промежуточных продуктов. Полученные результаты схематически представлены на фиг.5.In accordance with another aspect of the present invention, a method is proposed that allows using not only native virus preparations, but also preparations of various forms of viral BO that do not contain RNA (FIG. 4 and Example 1), including HPV (FIG. 4a), for obtaining MF 20S discoid aggregates of BW VTM (Fig. 4b), A protein, trimer of subunits (Fig. 4c), and monomers of BO VTM (Fig. 4d). So, these MFs are formed during thermal denaturation of the native virus and also various forms of BO, including small aggregates (trimer of subunits) and even individual BO subunits. The transformation of RNA-free forms of BO into MF occurs in one step, without the formation of intermediate products. The results obtained are schematically presented in figure 5.

Вирусы со спиральной структурой частиц (спиральные вирусы)Spiral Particle Viruses (Spiral Viruses)

Группа тобамовирусов включает 10 основных (наиболее изученных) антигенно-родственных видов палочковидных вирусов со сходной структурой частиц (СМ1, ААВ Descriptions of plant viruses No. 184, 1977, Tobamovirus group; Fauquet CM et al. 2005; Virus taxonomy, Academic Press.). Структурная и функциональная близость белков оболочки группы ВТМ отчетливо проявляется в опытах по комплементации штаммов и видов тобамовирусов. В условиях смешанного заражения формируются «фенотипически смешанные» вирусные частицы, состоящие из белковых субъединиц обоих вирусов-партнеров (Atabekov, JG, Schaskolskaya, ND, Atabekova, TI (1970) Reproduction of temperature-sensitive strains of TMV under restrictive conditions in the presence of temperature-resistant helper strain И.Г.Атабеков, Т.И.Атабекова. Биол.науки, 1972, 8, 116-119. Специфичность белок-белок и белок-РНК взаимодействия при созревании вируса табачной мозаики в условиях смешанной инфекции. Atabekov, J.G., Malyshenko, S.I., Morozov, S.Yu., Taliansky, M.E., Solovyev, A.G., Agranovsky, A.A., Shapka, N.A. (1999) Identification and study of tobacco mosaic virus movement function by complementation tests Philos Trans R Soc LondBBio Sci 354, 629-635.The tobamovirus group includes 10 main (most studied) antigen-related species of rod-shaped viruses with a similar particle structure (CM1, AAB Descriptions of plant viruses No. 184, 1977, Tobamovirus group; Fauquet CM et al. 2005; Virus taxonomy, Academic Press.) . The structural and functional affinity of the proteins of the TMV group envelope is clearly manifested in experiments on the complementation of tobamovirus strains and species. Under conditions of mixed infection, "phenotypically mixed" viral particles are formed, consisting of protein subunits of both partner viruses (Atabekov, JG, Schaskolskaya, ND, Atabekova, TI (1970) Reproduction of temperature-sensitive strains of TMV under restrictive conditions in the presence of temperature-resistant helper strain I. G. Atabekov, T. I. Atabekova Biol. Sciences, 1972, 8, 116-119. Specificity of protein-protein and protein-RNA interactions upon maturation of the tobacco mosaic virus under conditions of mixed infection. Atabekov, JG, Malyshenko, SI, Morozov, S. Yu., Taliansky, ME, Solovyev, AG, Agranovsky, AA, Shapka, NA (1999) Identification and study of tobacco mosaic virus movement function by complementation tests Phil os Trans R Soc LondBBio Sci 354, 629-635.

Известны также более экзотические тобамовирусы, например вирусы кактуса, или австралийские штаммы, мягкие штаммы ВТМ U2 и U5, а также множество условно летальных штаммов ВТМ. Несмотря на различия в спектре растений-хозяев, контролируемых геном транспорта, молекулярная организация частиц тобамовирусов очень близка, так как определяется геном белка оболочки.More exotic tobamoviruses are also known, for example, cactus viruses, or Australian strains, soft TMV strains U2 and U5, as well as many conditionally lethal TMV strains. Despite the differences in the spectrum of host plants controlled by the transport gene, the molecular organization of the tobamovirus particles is very close, as it is determined by the coat protein gene.

В настоящем изобретении для изготовления СЧ использовали:In the present invention for the manufacture of MF used:

1. Пять разных тобамовирусов, включая обычный (vulgare) вирус табачной мозаики (ВТМ), вирус мозаики томатов (ВМТом), вирус зеленой крапчатой мозаики огурца (ВЗКМО), вирус растений семейства крестоцветных (крВТМ), вирус мозаики долихоса (Dolichos enation mosaic virus, ВТМ бобовых).1. Five different tobamoviruses, including the common (vulgare) tobacco mosaic virus (TMV), tomato mosaic virus (VMTOM), green speckled mosaic virus (VZKMO), cruciferous plant virus (krVTM), dolichos mosaic virus (Dolichos enation mosaic virus) , TMV bean).

Типовой тобамовирус -ВТМ- палочковидный вирус со спиральной структурой диаметром 18 нм и длиной 300 нм. Оболочка вируса состоит из идентичных белковых субъединиц, упакованных в виде спирали (Klug, A. (1999) The tobacco mosaic virus particle: structure and assembly. Philos. Trans. R. Soc. 354, 531-536). (Klug, 1999; Butler, 1999; Zaitlin and Israel, 1975).A typical tobamovirus, BTM, is a rod-shaped virus with a helical structure with a diameter of 18 nm and a length of 300 nm. The viral envelope consists of identical protein subunits packed in a spiral (Klug, A. (1999) The tobacco mosaic virus particle: structure and assembly. Philos. Trans. R. Soc. 354, 531-536). (Klug, 1999; Butler, 1999; Zaitlin and Israel, 1975).

Вирусы группы потексвирусов (вирус Х картофеля, вирус мозаики альтернантеры) (Atabekov et al. 2007. Potato virus X: structure, disassembly, reconstitution, Molec, Plant Pathol. 8, 667-675). Вирус X вирус картофеля (ХВК) - типовой представитель группы потексвирусов и другие потексвирусы. ХВК представляет собой гибкие нитевидные вирионы со спиральной структурой длиной 515 и диаметром 13.5 нм.Potex virus viruses (potato virus X, alternantanere mosaic virus) (Atabekov et al. 2007. Potato virus X: structure, disassembly, reconstitution, Molec, Plant Pathol. 8, 667-675). Virus X potato virus (CVC) is a typical representative of the potexvirus group and other potexviruses. PVI is a flexible filiform virions with a spiral structure 515 long and 13.5 nm in diameter.

Вирус группы гордеивирусов (вирус штриховатой мозаики ячменя. Типовой представитель - вирус штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ) представлен жесткими палочковидными частицами со спиральной структурой.) (Atabekov JG, Novikov VK. Barley stripe mosaic virus, In «Descriptions of Plant Viruses», C.N.I.A.B.B. Coupar Pertshire, 1971.A virus of the hordeivirus group (barley mosaic virus of barley. A typical representative is the barley mosaic virus of barley (HMLA) represented by rigid rod-shaped particles with a spiral structure.) (Atabekov JG, Novikov VK. Barley stripe mosaic virus, In “Descriptions of Plant Viruses”, CNIABB Coupar Pertshire, 1971.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения показано, что, помимо тобамовирусов, другие спиральные вирусы растений могут также быть превращены в СЧ. В частности, на фиг.6 и 7 показаны СЧ, полученные при термоденатурации ВШМЯ и ХВК соответственно. Идентичные данные были получены при термоденатурации еще одного потексвируса - вируса мозаики альтернантеры.In accordance with another aspect of the present invention, it is shown that, in addition to tobamoviruses, other spiral plant viruses can also be converted into MFs. In particular, in Figs. 6 and 7, the MF obtained by thermodenaturation of GSOM and CVC, respectively, is shown. Identical data were obtained during thermal denaturation of yet another potexvirus - the alternator mosaic virus.

(II). Способность СЧ служить универсальной платформой-носителем для сборки комплексов с чужеродными белками(Ii) The ability of the midrange to serve as a universal carrier platform for the assembly of complexes with foreign proteins

В изобретении существенно упрощен способ получения носителя (платформы) и композиций на его основе. Носитель (СЧ) получают путем кратковременного (10 сек) прогревания суспензии ВТМ при температуре 98°С. Далее смесь СЧ-носителя и целевого белка (ЦБ) инкубируют при комнатной температуре 15 мин для адсорбции ЦБ на СЧ. Затем пробы центрифугируют для отмывания носителя от ЦБ, не связавшегося с частицами. Вся процедура сборки комплекса осуществляется в течение одного часа.In the invention, a significantly simplified method for producing a carrier (platform) and compositions based on it. Carrier (MF) is obtained by short-term (10 sec) heating a suspension of TMV at a temperature of 98 ° C. Next, a mixture of MF carrier and the target protein (CB) is incubated at room temperature for 15 min to adsorb CB on the MF. Then the samples are centrifuged to wash the carrier from the Central Bank, not bound to particles. The entire assembly procedure of the complex is carried out within one hour.

Поверхность СЧ обладает высокой сорбционной способностью в отношении веществ различной химической природы. Это свойство СЧ иллюстрируется данными Таблицы: более 50% ФИТЦ-меченного БО ХВК адсорбируется на СЧ до фиксации комплекса формальдегидом. Все формы СЧ водонерастворимы и могут быть быстро осаждены низкоскоростным центрифугированием (10 мин при 10000 g), т.к. существуют в виде коллоидных растворов или стабильных суспензий (в зависимости от размеров СЧ). В таких же условиях большая часть ЦБ остается связана с поверхностью СЧ (см. Таблицу) и впоследствии фиксируется формальдегидом в составе композиции «СЧ-ЦБ». В отличие от СЧ ФИТЦ-меченный БО ХВК не адсорбируется на нативном ВТМ.The surface of the midrange has a high sorption ability with respect to substances of various chemical nature. This property of MF is illustrated by the data in the Table: more than 50% of the FITC-labeled BO PVX is adsorbed on MF before the complex is fixed with formaldehyde. All forms of MF are water insoluble and can be precipitated quickly by low-speed centrifugation (10 min at 10,000 g), because exist in the form of colloidal solutions or stable suspensions (depending on the size of the midrange). Under the same conditions, most of the CB remains bound to the surface of the midrange (see table) and is subsequently fixed with formaldehyde in the composition of the midrange-central bank. Unlike MF, the FITC-labeled BO PVX is not adsorbed on native TMV.

АДСОРБЦИЯ БО^ФИТЦ ХВК НА ПОВЕРХНОСТИ СЧAdsorption BO ^FITC PVX on the surface of the MF (НАТИВНЫЙ ВТМ НЕ ФОРМИРУЕТ КОМПЛЕКС С БО^ФИТЦ ХВК)(NATIVE VTM DOES NOT FORM A COMPLEX WITH BO ^FITZ HVK) ВТМ+БО^ФИТЦ ХВКVTM + BO ^FITZ HVK СЧ+БО^ФИТЦХВКSCH + BO ^FITZ HVK ОД₄₉₅ исходной инкубационной смесиOD _{495 of the} initial incubation mixture 0,90.9 0,90.9 ОД₄₉₅ осадка после ЦФ (10000 g)OD ₄₉₅ precipitate after CF (10000 g) осадка нетno sediment 0,50.5 ОД₄₉₅ супернатанта после ЦФ (10000 g)OD ₄₉₅ supernatant after CF (10000 g) 0,90.9 0,40.4 ОД₄₉₅ осадка после ЦФ (100000 g)OD ₄₉₅ precipitate after CF (100000 g) 00 н/оbut ОД₄₉₅ супернатанта после ЦФ (100000 g)OD ₄₉₅ supernatant after CF (100000 g) 0,90.9 н/оbut н/о - не определялиn / a - not determined ПримечаниеNote ВТМ и СЧ инкубировали в воде с флуоресцентно-меченым белком оболочки Х вируса картофеля (БО^ФИТЦ ХВК). Проба содержала ВТМ или СЧ в количестве 50 мкг и БО^ФИТЦХВК (в избытке) - 20 мкг.TMV and MF were incubated in water with a fluorescently labeled potato virus X envelope protein (BO ^FITC CVC). The sample contained TMV or MF in an amount of 50 μg and BO ^FITC CVC (in excess) - 20 μg. Инкубационную смесь выдерживали при комнатной температуре 15 минут. Пробы центрифугировали для того, чтобы освободиться от не связавшегося с частицами флуоресцентного белка, осадок и супернатант спектрофотометрировали при длине волны 495 нм (максимуме адсорбции флуоресцеинизотиоцианата (ФИТЦ)).The incubation mixture was kept at room temperature for 15 minutes. Samples were centrifuged in order to free themselves of a fluorescent protein that did not bind to particles, the precipitate and supernatant were spectrophotometrically at a wavelength of 495 nm (maximum adsorption of fluorescein isothiocyanate (FITC)).

В изобретении показано, что чужеродные белки/антигены способны связываться с поверхностью СЧ-платформ, создавая биологически активные композиции. В соответствии с этим аспектом изобретения представлено схематическое изображение исходного СЧ-носителя и композиции СЧ, связанного с чужеродным антигеном (фиг.8а). На основе СЧ-носителей-наноплатформ в изобретении получена модельная система - активная композиция СЧ с чужеродным белком - зеленым флуоресцентным белком медузы (ЗФБ) (фиг.8б: Пример 3). Комплексы «СЧ-ЗФБ» стабилизировали с применением 0,05% формальдегида (Пример 4). Указанная композиция представляет собой СЧ-платформы, поверхность которых покрыта молекулами ЗФБ (фиг.8а и фиг.8б). Чужеродный белок в составе комплекса с СЧ сохраняет антигенную активность (реагирует со специфическими антителами) активность (фиг.8б).The invention shows that foreign proteins / antigens are able to bind to the surface of midrange platforms, creating biologically active compositions. In accordance with this aspect of the invention, a schematic representation of an initial midrange carrier and a midrange composition associated with a foreign antigen is provided (Fig. 8a). Based on the midrange-carriers-nanoplatforms, the invention provides a model system — an active midrange composition with a foreign protein — the green fluorescent jellyfish protein (ZBF) (Fig. 8b: Example 3). The SCH-ZFB complexes were stabilized using 0.05% formaldehyde (Example 4). The specified composition is a midrange platform, the surface of which is covered with ZFB molecules (figa and figb). A foreign protein in the complex with MF retains antigenic activity (reacts with specific antibodies) activity (Fig.8b).

Другой пример образования композиции СЧ с чужеродным белком представлен на фиг.9 (Пример 5). Фиг.9 иллюстрирует, что поверхность всех СЧ-платформ покрыта молекулами БО ХВК, меченными флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ).Another example of the formation of an MF composition with a foreign protein is shown in Fig. 9 (Example 5). Figure 9 illustrates that the surface of all midrange platforms is coated with BVC BO molecules labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC).

Другой пример образования композиции СЧ с чужеродным белком представлен на фиг.10 (Пример 6). Фиг.10 иллюстрирует образование комплекса «СЧ-носитель полиэпитоп А вируса краснухи». Для образования комплекса с СЧ была использована антигенная детерминанта А гликопротеида Е1 вируса краснухи.Another example of the formation of an MF composition with a foreign protein is shown in FIG. 10 (Example 6). Figure 10 illustrates the formation of the complex "Mid-carrier polyepitope A rubella virus." For the formation of a complex with MF, the antigenic determinant A of the rubella virus glycoprotein E1 was used.

Полностью аналогичные результаты были получены при адсорбции на СЧ эпитопов БО вируса оспы слив (ВОС12 и ВОС10), «слитыми» с БО ХВК, эпитопом М2е вируса гриппа, «слитого» с дегидрофолатредуктазой (DHFR) и тетраэпитопом гемагглютинина гриппа А человека.Completely similar results were obtained upon adsorption onto the MF of epitopes of BO of smallpox virus plum virus (BOC12 and BOC10), “fused” with BO PVA, epitope M2e of influenza virus “fused” with dehydrofolate reductase (DHFR) and tetraepitope of human influenza A hemagglutinin.

При использовании СЧ, образованных при нагревании вируса семейства крестоцветных (крВТМ), для получения композиций с чужеродными белками были получены такие же результаты, как в случае использования СЧ, образованных при нагревании ВТМ (vulgare).When using MFs generated by heating the cruciferous virus (krVTM) to obtain compositions with foreign proteins, the same results were obtained as in the case of using MFs generated by heating VTM (vulgare).

Достоинства СЧ как платформ-носителей при создании композиций с биологически активными молекулами.Advantages of MF as carrier platforms for creating compositions with biologically active molecules.

1. Уникальная способность СЧ адсорбировать на своей поверхности разные чужеродные белки, сильно отличающиеся по структуре и функциональным свойствам, делает этот новый тип платформ-носителей исключительно привлекательным для производства биологически активных композиций.1. The unique ability of MFs to adsorb various foreign proteins on its surface, which differ greatly in structure and functional properties, makes this new type of carrier platform extremely attractive for the production of biologically active compositions.

2. Достоинством применения СЧ-платформ является также доступность вируса-донора СЧ. Вирус-донор СЧ аккумулируется в листьях зараженных растений в очень больших количествах. Выход ВТМ может достигать 10 г на 1 кг свежей листовой массы растений табака (Zaitlin, M. and Israel, H.W. (1975) Tobacco mosaic virus (type strain). C.M.I./A.A.B. Descriptions of Plant Viruses №151).2. The advantage of using midrange platforms is also the availability of the midrange donor virus. MF donor virus accumulates in leaves of infected plants in very large quantities. The TMV yield can reach 10 g per 1 kg of fresh leaf mass of tobacco plants (Zaitlin, M. and Israel, H.W. (1975) Tobacco mosaic virus (type strain). C.M.I./A.A.B. Descriptions of Plant Viruses No. 151).

3. Достоинством применения СЧ в качестве платформы-носителя является простота выделения очищенного вирусного препарата в граммовых количествах; простота и скорость изготовления стерильных СЧ нагреванием очищенного вируса при 94-98°С.3. The advantage of using MF as a carrier platform is the simplicity of isolating the purified viral preparation in gram quantities; the simplicity and speed of manufacturing sterile MF by heating the purified virus at 94-98 ° C.

4. Достоинством применения СЧ-платформ является возможность получения СЧ нужного размера при определенной концентрации вируса.4. The advantage of using midrange platforms is the ability to get the midrange of the right size at a certain concentration of the virus.

5. Достоинством применения СЧ-платформ является возможность быстрого осаждения при отмывке и переосаждениях СЧ низкоскоростным центрифугированием (10 мин при 10000 g). Это исключает необходимость длительных циклов ультрацентрифугирования, применяемых в работе с рекомбинантными/химерными вирусами.5. The advantage of using midrange platforms is the possibility of rapid deposition during washing and redeposition of midrange by low-speed centrifugation (10 min at 10,000 g). This eliminates the need for long ultracentrifugation cycles used in the work with recombinant / chimeric viruses.

6. Достоинством указанных СЧ является их исключительно высокая стабильность. В настоящем изобретении показано, что СЧ сохраняют форму, размеры и уровень агрегации: при замораживании (-20°С) и последующем оттаивании; при повторном нагревании до 98°С и охлаждении; при осаждении центрифугированием (10000 g) и ресуспендировании осадка; при хранении в течение, минимум, 6-ти месяцев в условиях 4°С в воде. В процессе термической транзиции «ВТМ-СЧ» не происходит деградации БО СЧ, хотя происходит необратимая денатурация БО. Молекулярная масса БО нативного ВТМ и белка, выделяемого из СЧ, идентичны.6. The advantage of these midrange systems is their extremely high stability. In the present invention it is shown that the MF retain the shape, size and level of aggregation: upon freezing (-20 ° C) and subsequent thawing; by reheating to 98 ° C and cooling; during centrifugal precipitation (10,000 g) and resuspension of the precipitate; when stored for at least 6 months at 4 ° C in water. In the process of thermal transition “VTM-MF”, BO MF does not degrade, although irreversible denaturation of BO occurs. The molecular weight of BO of native TMV and the protein secreted from MF are identical.

7. Достоинством СЧ-платформ является их биологическая безопасность, что весьма очевидно, так как растения и человек не имеют общих патогенов. Кроме того, получение СЧ сопряжено со стерилизацией препаратов нагреванием до 94-98°С. Препараты СЧ не содержат РНК и структурно отличаются от известных в настоящее время вирусов.7. The advantage of midrange platforms is their biological safety, which is very obvious, since plants and humans do not have common pathogens. In addition, the production of MF is associated with the sterilization of drugs by heating to 94-98 ° C. MF preparations do not contain RNA and are structurally different from currently known viruses.

8. Достоинством применения СЧ-платформ является их способность адсорбировать на своей поверхности белковые объекты разной природы и электростатических свойств с образованием композиций.8. The advantage of using midrange platforms is their ability to adsorb protein objects of different nature and electrostatic properties to form compositions on their surface.

9. Достоинством применения СЧ-платформ является простота и скорость формирования композиций на основе сборки комплексов вне клетки и последующей их стабилизации формальдегидом.9. The advantage of using midrange platforms is the simplicity and speed of formation of compositions based on the assembly of complexes outside the cell and their subsequent stabilization with formaldehyde.

10. Достоинством применения СЧ-платформ при необходимости получения иммуногенных вакцинных композиций будет являться неизменность антигенной специфичности вследствие их абсолютной генетической инертности.10. The advantage of using midrange platforms, if necessary, to obtain immunogenic vaccine compositions will be the immutability of antigenic specificity due to their absolute genetic inertness.

Предлагаемые СЧ не были описаны в литературе в качестве наноплатформ и являются новым универсальным типом носителей. Это существенно расширяет ассортимент возможных композиций. СЧ уникальны как платформы-носители.The proposed MFs have not been described in the literature as nanoplatforms and are a new universal type of carrier. This significantly expands the range of possible compositions. MFs are unique as carrier platforms.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

Фиг.1 представляет электронные микрофотографии линейно и латерально агрегированных частиц вируса табачной мозаики. Негативное контрастирование 2% уранилацетатом.Figure 1 is an electron micrograph of linearly and laterally aggregated tobacco mosaic virus particles. Negative contrast with 2% uranyl acetate.

Фиг.2 представляет электронные микрофотографии, иллюстрирующие две стадии образования СЧ из ВТМ: (а) незрелые частицы неправильной формы (ЧНФ) и различного размера, являющиеся предшественниками для образования СЧ. ЧНФ образуются при нагревании ВТМ (0,1 мг/мл) до 90°С. Дальнейшее нагревание до 94-98°С приводит к полному превращению ЧНФ в зрелые СЧ (b-d), размер которых определяется исходной концентрацией ВТМ. Концентрация вируса: (b) 0,1 мг/мл; (с) 1,0 мг/мл; (d) 10 мг/мл. Стрелки указывают на «мономеры» СЧ. Окрашивание 2% уранилацетатом.Figure 2 is an electron micrograph illustrating two stages of the formation of MF from VTM: (a) immature particles of irregular shape (ChNP) and various sizes, which are precursors for the formation of MF. CNFs are formed by heating TMV (0.1 mg / ml) to 90 ° C. Further heating to 94-98 ° C leads to the complete conversion of NNF to mature MF (b-d), the size of which is determined by the initial concentration of TMV. Virus concentration: (b) 0.1 mg / ml; (c) 1.0 mg / ml; (d) 10 mg / ml. The arrows indicate the "monomers" of the midrange. Staining with 2% uranyl acetate.

Фиг.3 иллюстрирует зависимость размера СЧ от концентрации ВТМ, нагреваемого до 98°С. Концентрация нативного ВТМ: (а) 0,1 мг/мл; (b) 1,0 мг/мл; (с) 10 мг/мл. Сканирующая электронная микроскопия.Figure 3 illustrates the dependence of the size of the midrange on the concentration of TMV, heated to 98 ° C. The concentration of native TMV: (a) 0.1 mg / ml; (b) 1.0 mg / ml; (c) 10 mg / ml. Scanning electron microscopy.

Фиг.4 представляет электронные микрофотографии гетерогенной смеси СЧ, образующихся при нагревании различных форм белка оболочки ВТМ, не содержащих вирусной РНК: (а) спиральных вирусоподобных частиц (1 мг/мл, 65°С); (b) 20S дисков из белка оболочки (1 мг/мл, 65°С); (с) А белка (0,1 мг/мл, 65°С); (d) индивидуальных субъединиц белка оболочки (0,1 мг/мл, Трис-буфер, pH 14; 98°С). Стрелки указывают на «мини»-СЧ. Окрашивание 2% уранилацетатом.Figure 4 is an electron micrograph of a heterogeneous mixture of MFs generated by heating various forms of TMV coat protein that do not contain viral RNA: (a) spiral virus-like particles (1 mg / ml, 65 ° C); (b) 20S disks from protein coat (1 mg / ml, 65 ° C); (c) A protein (0.1 mg / ml, 65 ° C); (d) individual subunits of the envelope protein (0.1 mg / ml, Tris buffer, pH 14; 98 ° C). Arrows indicate a “mini” midrange. Staining with 2% uranyl acetate.

Фиг.5 схематически изображает образование СЧ из нативного ВТМ и из различных лишенных РНК форм белка оболочки ВТМ. Цифры показывают концентрацию нативного ВТМ (слева) или белка оболочки (справа), нагретых до 94°С или до 65°С соответственно. Размеры СЧ приведены в нанометрах.Figure 5 schematically depicts the formation of MF from native TMV and from various RNA-free forms of the TMV coat protein. The numbers show the concentration of native TMV (left) or envelope protein (right) heated to 94 ° C or to 65 ° C, respectively. The dimensions of the midrange are given in nanometers.

Фиг.6 иллюстрирует СЧ, полученные из гордеивируса штриховатой мозаики ячменя нагреванием вируса при 98°С.Figure 6 illustrates the MF obtained from the barley mosaic hordeivirus of barley by heating the virus at 98 ° C.

Фиг.7 иллюстрирует СЧ, полученные из потексвируса Х картофеля нагреванием вируса при 98°С. Сканирующая электронная микроскопия.Fig.7 illustrates the MF obtained from poteksvirus X potato by heating the virus at 98 ° C. Scanning electron microscopy.

Фиг.8а представляет схематическое изображение связывания модельного зеленого флуоресцентного белка медузы (ЗФБ) с СЧ-платформой; Фото 8б иллюстрирует результаты эксперимента по связыванию флуоресцирующих молекул ЗФБ с поверхностью СЧ-наноплатформы. Размер метки 5 мкм. Флуоресцентная микроскопия.Fig. 8a is a schematic representation of the binding of a model green fluorescent jellyfish protein (PBS) to the midrange platform; Photo 8b illustrates the results of an experiment on the binding of fluorescent ZFB molecules to the surface of a midrange nanoplatform. Label size 5 microns. Fluorescence microscopy.

Фиг.9 иллюстрирует, что поверхность всех СЧ-платформ покрыта молекулами БО ХВК, (а) меченными флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ); (б) контроль, проходящий свет. Размер метки 3 мкм. Конфокальная микроскопия.Figure 9 illustrates that the surface of all midrange platforms is coated with BVC BO molecules, (a) labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC); (b) control passing light. Label size 3 microns. Confocal microscopy.

Фиг.10 иллюстрирует, что тетраэпитоп белка Е1 вируса краснухи, связанный с поверхностью СЧ-платформы, выявляется первичными мышиными антителами к белку Е1 и вторичными куриными антимышиными антителами, конъюгированными с флуорофором Алекса 488 зеленым. Размер метки 3 мкм. Флуоресцентная микроскопия.Figure 10 illustrates that the rubella virus E1 protein tetraepitope bound to the surface of the midrange platform is detected by primary mouse anti-E1 protein antibodies and secondary chicken anti-mouse antibodies conjugated with Alexa 488 green fluorophore. Label size 3 microns. Fluorescence microscopy.

ПРИМЕРЫEXAMPLES

Пример 1Example 1

Препаративное выделение вирусов и получение различных форм агрегатов БО ВТМThe preparative isolation of viruses and the receipt of various forms of aggregates of BV TM

ВТМ был изолирован из системно-инфицированных листьев Nicotiana tabacum L. cv. Samsun методом дифференциального центрифугирования, как описано ранее (Novikov, V.K. and Atabekov, J.G. (1970). A study of the mechanism controlling the host range of plant virus. I Virus - specific receptors of Chenopodium amaranticolor. Virology 41, 101-107).TMV was isolated from systemically infected leaves of Nicotiana tabacum L. cv. Samsun by differential centrifugation as previously described (Novikov, V.K. and Atabekov, J.G. (1970). A study of the mechanism controlling the host range of plant virus. I Virus - specific receptors of Chenopodium amaranticolor. Virology 41, 101-107).

Тобамовирус зеленой крапчатой мозаики огурца (ВЗКО) (синонимы: огуречный вирус 3 - ОВ 3, огуречный вирус 4 - OB 4) структурно сходен и антигенно родственен ВТМ, но поражает в основном растения из семейства тыквенных Cucurbitaceae. Для выделения вируса листья растений огурца Cucumis sativus L., зараженные OB 3, 4, гомогенизировали в двух объемах (объем/вес) 0,1 М фосфатного буфера pH 7,8. Гомогенат прогревали 15-20 мин при 58°С, сок отжимали. К экстракту добавляли 1/8 объема от объема гомогената хлороформа и встряхивали в течение 30 мин. После центрифугирования при 4000 об/мин в течение 30 мин водную фазу супернатанта отбирали, добавляли полиэтиленгликоль (ПЭГ 6000) до конечной концентрации 3% и NaCl до 0,2 М и оставляли на ночь при 40°С для формирования осадка. В ряде случаев к супернатанту добавляли 0,5% тритон Х-100. После центрифугирования в течение 15 мин при 15000 об/мин супернатант отбрасывали, а осадок растворяли в 0,02 М Трис-HCl буфере 0,001 М ЭДТА, pH 7,5. Затем центрифугировали 15 мин при 15000 об/мин, супернатант собирали, а экстракцию из осадка повторяли еще 2 раза.Tobamovirus of green speckled cucumber mosaic (VZKO) (synonyms: cucumber virus 3 - OB 3, cucumber virus 4 - OB 4) is structurally similar and antigenically related to TMV, but it mainly affects plants from the Cucurbitaceae pumpkin family. To isolate the virus, the leaves of cucumis sativus L. cucumber plants infected with OB 3, 4 were homogenized in two volumes (volume / weight) of 0.1 M phosphate buffer, pH 7.8. The homogenate was heated for 15-20 minutes at 58 ° C, the juice was squeezed. 1/8 volume of the volume of chloroform homogenate was added to the extract and shaken for 30 minutes. After centrifugation at 4000 rpm for 30 min, the aqueous phase of the supernatant was removed, polyethylene glycol (PEG 6000) was added to a final concentration of 3% and NaCl to 0.2 M and left overnight at 40 ° C to form a precipitate. In some cases, 0.5% Triton X-100 was added to the supernatant. After centrifugation for 15 min at 15,000 rpm, the supernatant was discarded and the precipitate was dissolved in 0.02 M Tris-HCl buffer 0.001 M EDTA, pH 7.5. Then it was centrifuged for 15 min at 15,000 rpm, the supernatant was collected, and the extraction from the precipitate was repeated 2 more times.

Все полученные супернатанты объединяли и центрифугировали 2 часа при 45000 об/мин (центрифуга Spinco L-50, ротор Ti-50). Иногда для первичного концентрирования осадка к супернатанту добавляли ПЭГ (м.м. 6000) до конечной концентрации 3% и NaCl до 0,2 М и оставляли на ночь для формирования осадка. В этом случае процесс ультрацентрифугирования не проводили. Полученные в обоих случаях осадки растворяли в 0,02 М Трис-HCl буфере, дополненном 0,001 М ЭДТА, pH 7,6, центрифугировали 20 мин при 5000-7000 об/мин, осадок отбрасывали, а в супернатанте спектрофотометрически определяли концентрацию вируса исходя из коэффициента поглощения при l=1 см: Е^0,1% _{260 нм}=2,2. Кроме того, в каждом случае контролировали соотношение поглощения раствора вируса при 260 и 280 нм. Если отношение D₂₆₀/D₂₈₀ равнялось 1,2, то выделенный раствор считали пригодным для дальнейшего анализа. Полученные препараты вирусных частиц исследовали под электронным микроскопом Hitachi-7 при инструментальном увеличении 20000. Контрастирование проводили 2% уранилацетатом. Препараты ОВ 3, 4 содержали палочковидные частицы длиной 300 нм и шириной 17-18 нм, идентичные ВТМ. При концентрации ПЭГ, равной 1%, и концентрации NaCl, равной 0,2 М, можно осадить частицы длиной 300 нм. В присутствии 2% ПЭГ и 0,2 М NaCl осаждаются частицы промежуточной длины 60-100 нм, а при 3% ПЭГ и 0,5 М NaCl осаждаются частицы длиной около 40 нм. Очищенные препараты ОВ 3, 4 хранили в 0,02 М Трис-HCl (pH 7,6) буфере с добавление 0,001 М ЭДТА при 4°С.All supernatants obtained were combined and centrifuged for 2 hours at 45,000 rpm (Spinco L-50 centrifuge, Ti-50 rotor). Sometimes, for the initial concentration of the precipitate, PEG (mm 6000) was added to the supernatant to a final concentration of 3% and NaCl to 0.2 M and left overnight to form a precipitate. In this case, the ultracentrifugation process was not carried out. The precipitates obtained in both cases were dissolved in 0.02 M Tris-HCl buffer supplemented with 0.001 M EDTA, pH 7.6, centrifuged for 20 min at 5000-7000 rpm, the precipitate was discarded, and the virus concentration was determined spectrophotometrically based on the coefficient absorbance at l = 1 cm: E ^0.1% _{260 nm} = 2.2. In addition, in each case, the absorbance ratio of the virus solution was controlled at 260 and 280 nm. If the ratio of D ₂₆₀ / D _{280 was} 1.2, then the selected solution was considered suitable for further analysis. The resulting preparations of viral particles were examined under a Hitachi-7 electron microscope at an instrumental magnification of 20,000. Contrast was performed with 2% uranyl acetate. OV preparations 3, 4 contained rod-shaped particles 300 nm long and 17-18 nm wide, identical to VTM. At a PEG concentration of 1% and a NaCl concentration of 0.2 M, particles with a length of 300 nm can be precipitated. In the presence of 2% PEG and 0.2 M NaCl, particles of intermediate length 60-100 nm are deposited, and with 3% PEG and 0.5 M NaCl, particles with a length of about 40 nm are deposited. The purified preparations of OB 3, 4 were stored in 0.02 M Tris-HCl (pH 7.6) buffer with the addition of 0.001 M EDTA at 4 ° C.

Аналогичные методы применялись для препаративного выделения вируса мозаики томатов (ВМТом), вируса зеленой крапчатости огурца (ВЗКО), вируса крестоцветных ВКР и вируса бобовых (Dolichos enation mosaic).Similar methods were used for the preparative isolation of tomato mosaic virus (BMT), cucumber green mottled virus (VZKO), cruciferous SRS virus and legume virus (Dolichos enation mosaic).

Вирусный БО был выделен с использованием ацетатного метода (Fraenkel-Conrat, Н. (1957). Degradation of tobacco mosaic virus with acetic acid. Virology 4, 1-4) А белок был получен в 10 мМ Tris-HCl при pH в интервале от 7.8 до 8.0. Диски (дископодобные агрегаты) из БО ВТМ были получены в 50 мМ Na-фосфатном буфере, pH 7.0. Сборка (полимеризация) БО в спиралевидные частицы (ВПЧ) проводилась в 100 мМ Na-фосфатном буфере, pH 5.8-6.0 при комнатной температуре в течение ночи. Полученные препараты агрегатов, дисков и ВПЧ контролировали с помощью ПЕМ.Viral BO was isolated using the acetate method (Fraenkel-Conrat, N. (1957). Degradation of tobacco mosaic virus with acetic acid. Virology 4, 1-4) A protein was obtained in 10 mM Tris-HCl at a pH ranging from 7.8 to 8.0. Disks (disk-like aggregates) from BW VTM were obtained in 50 mM Na-phosphate buffer, pH 7.0. Assembly (polymerization) of BO into spiral particles (HPV) was carried out in 100 mM Na-phosphate buffer, pH 5.8–6.0 at room temperature overnight. The resulting preparations of aggregates, disks, and HPV were monitored by PEM.

Пример 2Example 2

Получение СЧ и их анализ с помощью методов просвечивающей и сканирующей электронной микроскопииObtaining midrange and their analysis using transmission and scanning electron microscopy

Исходный раствор вируса табачной мозаики (ВТМ) разводили до нужной концентрации (необходимой для получения СЧ заданного размера) и распределяли по 50 мкл в полипропиленовых тонкостенных пробирках (для ПЦР) на 0,5 мл. Чтобы предотвратить испарения раствора (а следовательно, изменение [увеличение] концентрации вируса во время термической обработки), на поверхность раствора вируса осторожно наносили 30 мкл минерального масла. Далее пробирки помещали в ячейки термоциклера «Терцик» (ДНК-Технология, Россия) и запускали программу, регулирующую температуру в каждой ячейке:The initial solution of the tobacco mosaic virus (TMV) was diluted to the desired concentration (necessary to obtain an MF of a given size) and distributed 50 μl in polypropylene thin-walled tubes (for PCR) per 0.5 ml. To prevent evaporation of the solution (and consequently, a change [increase] in virus concentration during heat treatment), 30 μl of mineral oil was carefully applied to the surface of the virus solution. Next, the tubes were placed in the cells of the Tertsik thermal cycler (DNA-Technology, Russia) and a program was launched that regulates the temperature in each cell:

1. В течение 90 секунд ячейка плавно нагревается с 10 до 94°С.1. Within 90 seconds, the cell heats up smoothly from 10 to 94 ° C.

2. Поддержание в ячейке температуры 94°С в течение 10 секунд.2. Maintaining a temperature of 94 ° C in the cell for 10 seconds.

3. Плавное охлаждение ячейки термоциклера в течение 90 секунд до 10°С.3. Smooth cooling of the thermal cycler cell for 90 seconds to 10 ° C.

Все СЧ, используемые в работе, получали именно по этой программе. Однако третий этап программы не является обязательным. Необходимым условием получения СЧ является выполнение первых двух пунктов программы. По окончании работы термоциклера пробирки вынимали из прибора, масло осторожно удаляли с поверхности раствора ВТМ. Далее для очистки полученных СЧ пробирки центрифугировали при 1000 g в течение 5 минут. Надосадочную жидкость отбирали, осадок ресуспендировали в 50 мкл воды (Milli-Q). Все операции с пробирками до и после получения шариков проводили при комнатной температуре.All midrange used in the work received exactly this program. However, the third phase of the program is optional. A prerequisite for obtaining the midrange is the implementation of the first two points of the program. At the end of the thermal cycler, the tubes were removed from the device, the oil was carefully removed from the surface of the TMV solution. Further, to clean the resulting MF, the tubes were centrifuged at 1000 g for 5 minutes. The supernatant was collected, the pellet was resuspended in 50 μl of water (Milli-Q). All operations with tubes before and after receiving the balls were carried out at room temperature.

Процесс перехода (превращения) нативного ВТМ в СЧ изучали с помощью ПЕМ и СЕМ. Образцы для микроскопии были приготовлены, как описано ранее (Kaftanova A.S., Kiselev N.A., Novikov V.K., Atabekov J.G. (1975) Structure of products of protein reassembly and reconstitution of potato virus X. Virology 65, 283-287). Цифровое изображение получали при помощи камеры Gatan Erlangshen ES500W с использованием программного обеспечения Gatan Digital Micrograph™. Для СЕМ образец помещали на предметный столик и высушивали на воздухе при комнатной температуре, затем образцы помещали в ионно-напылительную установку IB-3 Ion Coater (Eico, Japan) и ионизировали поверхность напылением золота с палладием. Анализ проводили при помощи сканирующего электронного микроскопа JSM-6380LA (JEOL, Japan) при 80 кВ.The process of transition (conversion) of native TMV to MF was studied using PEM and CEM. Samples for microscopy were prepared as described previously (Kaftanova A.S., Kiselev N.A., Novikov V.K., Atabekov J.G. (1975) Structure of products of protein reassembly and reconstitution of potato virus X. Virology 65, 283-287). A digital image was obtained using a Gatan Erlangshen ES500W camera using Gatan Digital Micrograph ™ software. For CEM, the sample was placed on a stage and dried in air at room temperature, then the samples were placed in an IB-3 Ion Coater (Eico, Japan) and the surface was ionized by sputtering with palladium gold. The analysis was performed using a JSM-6380LA scanning electron microscope (JEOL, Japan) at 80 kV.

Пример 3Example 3

Препарат зеленого флуоресцентного белка (ЗФБ)Green Fluorescent Protein (PBS)

Зеленый флуоресцентный белок (ЗФБ), содержащий на N-конце шесть остатков гистидина (His₆), а на С-конце 5 остатков аргинина (Arg), был экспрессирован в бактериях и выделен, как описано ранее (Karpova O.V., Ivanov K.I., Rodionova N.P., Dorokhov Yu.L., Atabekov J.G. (1997) Nontranslatability and dissimilar behavior in plants and protoplasts of viral RNA and movement protein complexes formed in vitro. Virology. 31, 230(1), 11-21; Zayakina O.V., Arkhipenko M.V., Kozlovsky S.V, Nikitin N.A., Smimov A.V., Susi P., Rodionova N.P., Karpova O.V. and Atabekov J.G. (2008) Mutagenic analysis of Potato Virus X movement protein (TGBp1) and the coat protein (CP): in vitro TGBp1-CP binding and viral RNA translation activation. Molecular Plant Pathology 9 (1), 37-44). Для получения антигенных комплексов СЧ инкубировали с рекомбинантным белком в соотношении 100 мкг СЧ на 2 мкг белка при комнатной температуре в течение 10 минут. Данное соотношение было определено при последовательном добавлении рекомбинантного белка ЗФБ (50 мкг/мл) к СЧ (100 мкг/мл) до начала агрегации, которая детектировалась методом динамического светорассеивания.Green fluorescent protein (PBS), containing six histidine residues at the N-terminus (His ₆ ), and 5 arginine residues (Arg) at the C-terminus, was expressed in bacteria and isolated as previously described (Karpova OV, Ivanov KI, Rodionova NP, Dorokhov Yu.L., Atabekov JG (1997) Nontranslatability and dissimilar behavior in plants and protoplasts of viral RNA and movement protein complexes formed in vitro. Virology. 31, 230 (1), 11-21; Zayakina OV, Arkhipenko MV , Kozlovsky SV, Nikitin NA, Smimov AV, Susi P., Rodionova NP, Karpova OV and Atabekov JG (2008) Mutagenic analysis of Potato Virus X movement protein (TGBp1) and the coat protein (CP): in vitro TGBp1-CP binding and viral RNA translation activation. Molecular Plant Pathology 9 (1), 37-44). To obtain antigenic complexes, MFs were incubated with recombinant protein in a ratio of 100 μg MF per 2 μg of protein at room temperature for 10 minutes. This ratio was determined by sequentially adding the recombinant protein ZFB protein (50 μg / ml) to MF (100 μg / ml) before the start of aggregation, which was detected by dynamic light scattering.

Полученный рекомбинантный ЗФБ, содержащий в С-конце 5 остатков аргинина (Arg), был использован в качестве модельного антигенаThe resulting recombinant PBS containing 5 arginine residues (Arg) at the C-terminus was used as a model antigen

Ген рекомбинантного белка сконструирован на основе плазмиды pQE31,The recombinant protein gene is constructed on the basis of plasmid pQE31,

6His отмечены подчеркиванием,6His underlined,

Полужирным - стартовый кодон гена ЗФБ,Bold - start codon of the gene ZFB,

Курсивом отмечены 5 остатков Arg.5 Arg residues are in italics.

Пять остатков Arg были добавлены к рекомбинантной молекуле с целью повышения суммарного положительного заряда ЗФБ. Можно было ожидать усиления электростатического взаимодействия между модельным антигеном и СЧ. Для получения антигенных комплексов СЧ инкубировали с ЗФБ в соотношении 50 мкг СЧ на 1 мкг белка в воде, образование комплекса выявляли с помощью флуоресцентной микроскопии.Five Arg residues were added to the recombinant molecule in order to increase the total positive charge of the ZFB. An increase in the electrostatic interaction between the model antigen and the midrange could be expected. To obtain antigenic complexes, MFs were incubated with PBS in the ratio of 50 μg MF per 1 μg of protein in water, the formation of the complex was detected using fluorescence microscopy.

Пример 4Example 4

Образование комплекса «СЧ - зеленый флуоресцентный белок» (СЧ - ЗФБ); флуоресцентная микроскопияThe formation of the complex "MF - green fluorescent protein" (MF - ZFB); fluorescence microscopy

СЧ инкубировали с ЗФБ в воде при комнатной температуре в течение 10 мин. Образование комплекса «СЧ-чужеродный эпитоп» происходило благодаря электростатическому взаимодействию. В ряде экспериментов образованный комплекс стабилизировали 0,05% формальдегидом (10 мин при комнатной температуре). Избыток формальдегида удаляли центрифугированием СЧ (10000 g).MFs were incubated with PBS in water at room temperature for 10 minutes. The formation of the MF-alien epitope complex occurred due to electrostatic interaction. In a number of experiments, the complex formed was stabilized with 0.05% formaldehyde (10 min at room temperature). Excess formaldehyde was removed by centrifugation of the midrange (10,000 g).

Суспензию полученных комплексов наносили на покровные стекла, предварительно обработанные поли-L-лизином, и инкубировали в течение двух часов при комнатной температуре. Для фиксации образцов их обрабатывали в течение 15 мин 4% параформальдегида при комнатной температуре, затем отмывали водой в течение 5 минут, после чего образцы заключали между покровными и предметными стеклами при использовании фотозащитной добавки 1,4 диазобицикло-[2,2,2]октана (DABCO), инкубировали 30 минут при +4°С. Полученные препараты анализировали при помощи флуоресцентного микроскопа Axiovert 200M (Carl Zeiss, Germany), снабженного интегрированной камерой ORCAII-ERG2 (Hamamatsu, Japan). Образование комплекса СЧ с рекомбинантным ЗФБ продемонстрировано на фиг.8а и 8б.A suspension of the obtained complexes was applied to coverslips pretreated with poly-L-lysine and incubated for two hours at room temperature. To fix the samples, they were treated for 15 min with 4% paraformaldehyde at room temperature, then washed with water for 5 minutes, after which the samples were enclosed between coverslips and slides using a sun protection additive of 1,4 diazobicyclo- [2,2,2] octane (DABCO), incubated for 30 minutes at + 4 ° C. The resulting preparations were analyzed using an Axiovert 200M fluorescence microscope (Carl Zeiss, Germany) equipped with an integrated ORCAII-ERG2 camera (Hamamatsu, Japan). The formation of a complex of midrange with recombinant ZFB shown in figa and 8b.

Пример 5Example 5

Образование комплекса «СЧ-ФИТЦ-меченный белок оболочки Х вируса картофеля»The formation of the complex "SC-FITZ-labeled protein of the membrane X of the potato virus"

Белок оболочки (БО) Х-вируса картофеля (ХВК) выделяли обработкой вирусной суспензии в Трис-HCl буфере, pH 7.5 нейтральным солевым раствором LiCl, доводя его до конечной концентрации 2 М, помещали на -20°С на ночь, центрифугировали при 10000 g. Супернатант диализовали против тридистилированной воды. Белок после диализа ультрацентрифугировали при 100000 g. К 1 мг БО ХВК с концентрацией 1 мг/мл добавляли 18 мкг флуоресцеина изотиоцианата (ФИТЦ) и инкубировали 24 часа при 4°С, диализовали против воды для освобождения от несвязавшейся флуоресцентной метки. Полученный белок, меченный ФИТЦ, использовали для образования комплекса с СЧ-носителем. Для этого 50 мкг СЧ инкубировали с 1 мкг белка в воде. Комплекс стабилизировали добавлением формальдегида до концентрации 0.05% (10 минут, 20°С). Связывание СЧ с БО фиксировали с помощью флуоресцентного микроскопа (LeicaDRMB), снабженного интегрированной камерой ORCAII-ERG2 (Hamamatsu, Japan).The potato X virus envelope protein (BO) (CVC) was isolated by treating the virus suspension in Tris-HCl buffer, pH 7.5 with neutral saline solution of LiCl, bringing it to a final concentration of 2 M, placed at -20 ° C overnight, centrifuged at 10,000 g . The supernatant was dialyzed against distilled water. The protein after dialysis was ultracentrifuged at 100,000 g. To 1 mg BO PVA with a concentration of 1 mg / ml was added 18 μg of fluorescein isothiocyanate (FITC) and incubated for 24 hours at 4 ° C, dialyzed against water to clear the unbound fluorescence label. The resulting protein labeled with FITC was used to form a complex with an MF carrier. For this, 50 μg of MF were incubated with 1 μg of protein in water. The complex was stabilized by the addition of formaldehyde to a concentration of 0.05% (10 minutes, 20 ° C). The binding of MF to BO was recorded using a fluorescence microscope (LeicaDRMB) equipped with an integrated ORCAII-ERG2 camera (Hamamatsu, Japan).

Образование комплекса СЧ с ФИТЦ-меченным белком оболочки вируса Х картофеля ХВК показано на фиг.9.The formation of a complex of MF with the FITC-labeled coat protein of the virus X potato PVA is shown in Fig.9.

Пример 6Example 6

Образование комплекса «СЧ-носитель полиэпитоп А вируса краснухи»The formation of the complex "mid-carrier polyepitope A rubella virus"

Для образования комплекса с СЧ была использована антигенная детерминанта А гликопротеида Е1 вируса краснухи.For the formation of a complex with MF, the antigenic determinant A of the rubella virus glycoprotein E1 was used.

Ниже приведена аминокислотная последовательность (32 аминокислотных остатка) эпитопа А гликопротеида Е1:The following is the amino acid sequence (32 amino acid residues) of the E1 glycoprotein E epitope A:

Область эпитопа А обозначена полужирным шрифтом.The epitope region A is indicated in bold.

Рекомбинантный белок (мол. масса около 21-22 кД), содержащий на N-конце шесть аминокислотных остатков гистидина (His₆) и представляющий собой четыре повтора эпитопа А (полиэпитоп А) Е1 гликопротеида, был сконструирован на базе плазмиды pQE-BT-4A. Полиэпитоп А в составе комплекса с СЧ выявляли методом иммунофлуоресценции.A recombinant protein (molecular weight about 21-22 kDa), containing six amino acid residues of histidine (His ₆ ) at the N-terminus and representing four repeats of the epitope A (polyepitope A) E1 glycoprotein, was constructed on the basis of plasmid pQE-BT-4A . Polyepitope A in the complex with MF was detected by immunofluorescence.

Комплекс СЧ-полиэпитоп А инкубировали при комнатной температуре 2 часа на покровных стеклах, предварительно обработанных поли-L-лизином. Для фиксации образцов их обрабатывали в течение 15 минут 4% параформальдегида при комнатной температуре, затем проводились три отмывки водой по 5 минут каждая. После отмывки образцы инкубировали в течение 30 минут в растворе, состоящем из 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), фосфатного буфера (PBS, состав: 7 мМ Na₂HPO₄, 1.5 мМ KH₂PO₄, pH 7.4, 137 мМ NaCl, 2.7 мМ KCl) и 0.05% твин-20. Далее препараты инкубировали с первичными мышиными антителами к гликопротеиду Е1 вируса краснухи в течение 30 минут во влажной камере в PBS с 0.25% БСА и 0.05% твин-20. Контрольные образцы инкубировали в блокирующем растворе без добавления первичных антител. Несвязавшиеся антитела отмывали раствором для отмывки (PBS с 0.25% БСА и 0.05% твин-20) на качалке 3 раза по 5 минут. Связывание первичных антител с антигенными комплексами детектировалось при помощи вторичных противомышиных антител, конъюгированных с флуорофором Alexa-488 (Molecular Probes, Eugene, OR). Co вторичными антителами инкубацию проводили в течение 30 минут во влажной камере, от несвязавшихся антител отмывались 3 раза по 5 минут в растворе для отмывки и один раз в PBS в течение 5 минут. После этого образцы заключали между покровными и предметными стеклами при использовании фотозащитной добавки 1,4 диазобицикло-[2,2,2]октана (DABCO), инкубировали 30 минут при +4°С. Полученные препараты анализировали при помощи флуоресцентного микроскопа (LeicaDRMB), снабженного интегрированной камерой ORCAII-ERG2 (Hamamatsu, Japan).The MF-polyepitope A complex was incubated at room temperature for 2 hours on coverslips pretreated with poly-L-lysine. To fix the samples, they were treated for 15 minutes with 4% paraformaldehyde at room temperature, then three washes with water were carried out for 5 minutes each. After washing, the samples were incubated for 30 minutes in a solution consisting of 1% bovine serum albumin (BSA), phosphate buffer (PBS, composition: 7 mm Na ₂ HPO ₄ , 1.5 mm KH ₂ PO ₄ , pH 7.4, 137 mm NaCl, 2.7 mM KCl) and 0.05% tween-20. Further, the preparations were incubated with primary mouse antibodies to rubella virus E1 glycoprotein for 30 minutes in a humid chamber in PBS with 0.25% BSA and 0.05% tween-20. Control samples were incubated in blocking solution without the addition of primary antibodies. Unbound antibodies were washed with a washing solution (PBS with 0.25% BSA and 0.05% tween-20) on a shaker 3 times for 5 minutes. The binding of primary antibodies to antigenic complexes was detected using secondary anti-mouse antibodies conjugated with Alexa-488 fluorophore (Molecular Probes, Eugene, OR). Co secondary antibodies were incubated for 30 minutes in a humid chamber, and unbound antibodies were washed 3 times for 5 minutes in a washing solution and once in PBS for 5 minutes. After that, the samples were enclosed between coverslips and slides using a photoprotective additive of 1,4 diazobicyclo [2.2.2] octane (DABCO), incubated for 30 minutes at + 4 ° C. The resulting preparations were analyzed using a fluorescence microscope (LeicaDRMB) equipped with an integrated ORCAII-ERG2 camera (Hamamatsu, Japan).

Образование комплекса СЧ с полиэпитопом А вируса краснухи продемонстрировано на фиг.10.The formation of a complex of MF with the rubella virus polyepitope A is shown in FIG. 10.

Claims

1. A spherical carrier platform for the formation of complexes with biologically active compounds, obtained by thermal restructuring of the structure of the tobacco mosaic virus (TMV) or another tobamovirus or other plant virus with a spiral structure or fragments thereof.

2. A spherical carrier platform for biologically active compounds, obtained by thermal reorganization of the preparation of the protein of the coat of the TMV virus group (tobamoviruses) or another phytovirus with a spiral structure or their fragments.

3. A composition comprising, as a platform carrier, a spherical carrier according to claim 1 or 2, coupled to a foreign protein or other biologically active compound.