RU2435597C1 - Method for producing cytochrome c - Google Patents
Method for producing cytochrome c Download PDFInfo
- Publication number
- RU2435597C1 RU2435597C1 RU2010121217/15A RU2010121217A RU2435597C1 RU 2435597 C1 RU2435597 C1 RU 2435597C1 RU 2010121217/15 A RU2010121217/15 A RU 2010121217/15A RU 2010121217 A RU2010121217 A RU 2010121217A RU 2435597 C1 RU2435597 C1 RU 2435597C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cytochrome
- solution
- cation exchanger
- unosphere
- extract
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, к области получения лекарственных белковых препаратов, а именно к способу получения цитохрома С из мышц сердца млекопитающих - свиней, крупного рогатого скота и лошадей.The invention relates to biotechnology, to the field of obtaining medicinal protein preparations, and in particular to a method for producing cytochrome C from the heart muscles of mammals - pigs, cattle and horses.
Цитохром С представляет собой фермент, катализирующий окислительно-восстановительные реакции, в качестве простетической группы содержит гем-атом железа. Благодаря гему цитохром С служит переносчиком электронов (Ю.А.Овчинников. Биоорганическая химия. М.: Химия, 1987, с.815).Cytochrome C is an enzyme that catalyzes redox reactions; it contains an iron heme atom as a prosthetic group. Due to the heme, cytochrome C serves as an electron carrier (Yu.A. Ovchinnikov. Bioorganic chemistry. M: Chemistry, 1987, p. 815).
Цитохром С широко используется в медицине и ветеринарии в качестве лекарственного препарата, а также в виде реактива в биохимии и биотехнологии.Cytochrome C is widely used in medicine and veterinary medicine as a drug, as well as a reagent in biochemistry and biotechnology.
Изобретение может использоваться при получении цитохрома С в промышленных масштабах.The invention can be used to obtain cytochrome C on an industrial scale.
Цитохром С может быть выделен из разнообразных видов природного сырья: дрожжей, риса, мышц сердца млекопитающих (лошадей, крупного рогатого скота, свиней, собак, кроликов, человека), птиц (голубей, пингвинов), сердец лососевых и других. Известны способы получения цитохрома С, включающие выделение из мышц сердца млекопитающих, предпочтительно крупного рогатого скота, путем экстракции и сорбционной очистки экстракта с использованием алюмосиликата магния (F.Okumura and al. Chem. Soc. Japan. V.49, №1, p.65, 1975) или карбоксильных катионитов типа Амберлит ХЕ-64 (В.Hagihara and al. J. Biochem. V.45, №8, p.551, 1975) и КМДМ (Л.К.Шатаева, Н.Н.Кузнецова, Г.Э.Елькин. Карбоксильные катиониты в биологии. - Л.: Наука, 1979, с.285). Данные сорбенты характеризуются малой емкостью и сложностью при промышленном применении карбоксильных катионитов из-за разницы в степени набухания в Н+ и Na+-форме.Cytochrome C can be isolated from various types of natural raw materials: yeast, rice, heart muscles of mammals (horses, cattle, pigs, dogs, rabbits, humans), birds (pigeons, penguins), salmon hearts, and others. Known methods for producing cytochrome C, including the isolation from the muscles of the heart of mammals, preferably cattle, by extraction and sorption purification of the extract using magnesium aluminum silicate (F. Okumura and al. Chem. Soc. Japan. V.49, No. 1, p. 65, 1975) or carboxyl cation exchangers of the Amberlit XE-64 type (B. Hagihara and al. J. Biochem. V.45, No. 8, p.551, 1975) and KMDM (L.K. Shataeva, N.N. Kuznetsova , G.E. Yelkin, Carboxylic cation exchangers in biology. - L .: Nauka, 1979, p. 285). These sorbents are characterized by low capacity and complexity in the industrial use of carboxylic cation exchangers due to the difference in the degree of swelling in the H + and Na + form.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения цитохрома С из мышц сердца крупного рогатого скота (RU 2096464, опубл. 20.11.97, бюл. №32), включающий экстракцию предварительно обезжиренных и измельченных сердец крупного рогатого скота разбавленным раствором сильной кислоты при pH 3,9-4,2 в течение 1,5-2 ч при 10-15°С с последующей фильтрацией. Экстракт после фильтрации подщелачивают до pH 6,8-7.4, отделяют образовавшийся осадок. Непосредственно из него ведут сорбцию на карбоксильном катионите в Na+-форме. Элюцию целевого продукта ведут 10-12% водным раствором сульфата аммония с pH 9,0-9,8. Из элюата при pH 7,2-7,5 осаждают балластные белки добавлением сульфата аммония в количестве 0,5 г/мл. Из надосадочной жидкости осаждают цитохром С действием 20% раствором трихлоруксусной кислоты (ТХУ) с получением осадка, который отделяют, растворяют в минимальном количестве воды и диализуют против изотонического раствора хлористого натрия до полного удаления иона SO4 2-.Closest to the proposed invention is a method for producing cytochrome C from the heart muscles of cattle (RU 2096464, publ. 11/20/97, bull. No. 32), including the extraction of pre-fat and ground cattle hearts with a dilute solution of strong acid at pH 3, 9-4.2 for 1.5-2 hours at 10-15 ° C followed by filtration. After filtration, the extract is made alkaline to pH 6.8-7.4, and the precipitate formed is separated. Sorption on the carboxylic cation exchanger in the Na + form is carried out directly from it. The elution of the target product is 10-12% aqueous solution of ammonium sulfate with a pH of 9.0 to 9.8. Ballast proteins are precipitated from the eluate at a pH of 7.2-7.5 by the addition of ammonium sulfate in an amount of 0.5 g / ml. Cytochrome C is precipitated from the supernatant with a 20% trichloroacetic acid (TCA) solution to obtain a precipitate that is separated, dissolved in a minimal amount of water and dialyzed against an isotonic sodium chloride solution until the SO 4 2- ion is completely removed.
В прототипе используют катионит, представляющий собой сополимер метакриловой кислоты и N,N-гексаметилендиметакриламида, получаемый в виде блоков, который перед использованием требует предварительной обработки: измельчения, обработки 1 н. едким натром, затем 1 н. соляной кислотой, отмывки и сушки. Коэффициент набухания в воде Кнаб.=5,0, в буферном растворе с pH 6,8 Кнаб.=10,0, при переходе в слабокислую область Кнаб.=4,0. Полученный карбоксильный катионит хранится в H+-форме. Для выделения цитохрома С его необходимо переводить в Na+-форму действием избытка 1 н. едкого натра с последующим отмыванием водой до pH на выходе колонки 7,0-8,5 и уравновешиванием солевым раствором ионной силы 0,1 (5,6 г/л хлористого натрия или 5 г/л сульфата аммония). При этом набухаемость сорбента меняется в несколько раз (2-3 раза), что приводит к значительным неудобствам при промышленном выделении цитохрома С, так как требует использования колонн увеличенного размера.The prototype uses cation exchange resin, which is a copolymer of methacrylic acid and N, N-hexamethylene dimethacrylamide, obtained in the form of blocks, which before use requires preliminary processing: grinding, processing 1 N. sodium hydroxide, then 1 N. hydrochloric acid, washing and drying. The coefficient of swelling in water Knab. = 5.0, in a buffer solution with a pH of 6.8 Knab. = 10.0, with the transition to a slightly acidic region Knab. = 4.0. The resulting carboxyl cation exchange resin is stored in the H + form. To isolate cytochrome C, it must be converted to the Na + form by the action of an excess of 1 N. sodium hydroxide, followed by washing with water to pH at the column outlet 7.0-8.5 and equilibrating with ionic solution of 0.1 ion strength (5.6 g / l sodium chloride or 5 g / l ammonium sulfate). The swelling of the sorbent varies several times (2-3 times), which leads to significant inconvenience in the industrial isolation of cytochrome C, as it requires the use of larger columns.
Указанный сорбент имеет невысокую емкость сорбции по целевому продукту и низкую механическую прочность.The specified sorbent has a low sorption capacity for the target product and low mechanical strength.
Отсутствие правильной сферической формы гранул катионита замедляет скорость проведения процесса в динамическом режиме сорбции и десорбции.The absence of the correct spherical shape of the cation exchanger granules slows down the speed of the process in the dynamic mode of sorption and desorption.
Кроме того, в описанном способе отсутствует сорбция цитохрома С непосредственно из экстракта при pH 3,9-4,2, так как карбоксильные катиониты в этой области не диссоциируют. Поэтому требуется дополнительная стадия - подщелачивание экстракта до pH 6,8-7,4.In addition, in the described method there is no sorption of cytochrome C directly from the extract at a pH of 3.9-4.2, since carboxyl cation exchangers in this region do not dissociate. Therefore, an additional stage is required - alkalization of the extract to a pH of 6.8-7.4.
Недостатком указанного способа получения цитохрома С является также невысокая степень чистоты цитохрома С, показатель чистоты (Е550/280) цитохрома С в элюате (отношение экстинкции раствора цитохрома С при длине волны 550 нм и раствора цитохрома С при длине волны 280 нм) составляет около 0,58, это требует использования повышенного количества сульфата аммония (0,5 г/мл) для осаждения балластных белков при дополнительном подкислении элюата до pH 7,2-7,5, что значительно сокращает эффективность и экономичность технологического процесса.The disadvantage of this method of producing cytochrome C is also the low degree of purity of cytochrome C, the purity index (E 550/280 ) of cytochrome C in the eluate (the extinction ratio of a solution of cytochrome C at a wavelength of 550 nm and a solution of cytochrome C at a wavelength of 280 nm) is about 0 , 58, this requires the use of increased amounts of ammonium sulfate (0.5 g / ml) to precipitate ballast proteins with additional acidification of the eluate to a pH of 7.2-7.5, which significantly reduces the efficiency and economy of the process.
Таким образом, задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ получения цитохрома С из экстракта с использованием высокостабильных гранульных макропористых сорбентов, обеспечивающих высокую емкость и обратимость сорбции, что делает их наиболее предпочтительными при использовании в промышленных масштабах.Thus, the object of the present invention is to provide a method for producing cytochrome C from an extract using highly stable granular macroporous sorbents providing high capacity and reversibility of sorption, which makes them most preferred when used on an industrial scale.
Результатом настоящего изобретения является: сокращение технологического процесса, увеличение емкости по целевому продукту, повышение степени чистоты цитохрома С.The result of the present invention is: a reduction in the technological process, an increase in the capacity of the target product, an increase in the degree of purity of cytochrome C.
Согласно настоящему изобретению предложен сорбционный способ получения цитохрома С из экстракта с использованием катионита нового поколения UNOsphere™ S (UNOsphere Polymer Technology, производства «Bio-Rad» USA) - имеющий в качестве функциональных групп SO3-группы. На заключительных стадиях получения цитохрома С применяют диафильтрацию и ультрафильтрацию в тангенциальном потоке на мембранах с пределом исключения по молекулярной массе 5 кДа фирмы Millipore или Sartorius.The present invention provides a sorption method for producing cytochrome C from an extract using a new generation of cation exchange resin UNOsphere ™ S (UNOsphere Polymer Technology, manufactured by Bio-Rad USA), which has SO 3 groups as functional groups. At the final stages of the preparation of cytochrome C, diafiltration and ultrafiltration in a tangential flow on membranes with a molecular weight exclusion limit of 5 kDa from Millipore or Sartorius are used.
Для достижения указанного результата предложен способ, который включает в себя следующие стадии.To achieve this result, a method is proposed that includes the following steps.
Из сердец свиней, крупного рогатого скота или лошадей после обезжиривания и удаления из них связок, сосудов путем измельчения получают фарш. Полученный фарш экстрагируют 2,5% раствором кислоты трихлоруксусной при температуре 10-15°С, при pH 3,9-4,2. После отделения от фарша непосредственно ведут сорбцию целевого продукта из отфильтрованного экстракта на катионите UNOsphere™ S, уравновешенном стартовым буферным раствором при pH 3,9-4,2. После завершения сорбции катионит UNOsphere™ S промывают стартовым буферным раствором. Удаление балластных белков с колонки проводят 80 мМ раствором трис (Трис (гидроксиметил)аминометан). Элюцию цитохрома С с катионита UNOsphere™ S проводят раствором сульфата аммония с концентрацией 0,3 М. Из элюата осаждают балластные белки добавлением сухого сульфата аммония из расчета 0,270 г/мл. Для отделения цитохрома С от сульфата аммония проводят диализ против воды или диафильтрацию в тангенциальном потоке на мембранах с пределом исключения 5 кДа, на этих же мембранах ультрафильтрацией осуществляют концентрирование цитохрома С.From the hearts of pigs, cattle or horses after degreasing and removing ligaments and blood vessels from them, minced meat is obtained by grinding. The resulting minced meat is extracted with a 2.5% trichloroacetic acid solution at a temperature of 10-15 ° C, at a pH of 3.9-4.2. After separation from the minced meat, the target product is directly sorbed from the filtered extract on UNOsphere ™ S cation exchange resin balanced with starting buffer solution at pH 3.9-4.2. After sorption is completed, UNOsphere ™ S cation exchange resin is washed with a starting buffer solution. The removal of ballast proteins from the column is carried out with an 80 mM Tris (Tris (hydroxymethyl) aminomethane) solution. Elution of cytochrome C from UNOsphere ™ S cation exchanger is carried out with a solution of ammonium sulfate with a concentration of 0.3 M. Ballast proteins are precipitated from the eluate by adding dry ammonium sulfate at a rate of 0.270 g / ml. To separate cytochrome C from ammonium sulfate, dialysis against water or diafiltration in a tangential flow on membranes with an exclusion limit of 5 kDa is carried out, cytochrome C is concentrated by ultrafiltration on these membranes.
Для уравновешивания колонки наиболее оптимальным оказался буферный раствор, содержащий 2 мМ лимонной кислоты и 1,5 мМ трис, также возможно использование других буферных растворов при данном значении pH. Для удаления балластных белков с катионита оптимальным является раствор триса с концентрацией 80 мМ, при более низких концентрациях не полностью вымываются балластные белки, более высокие концентрации не оказывают существенного влияния на количество удаленных балластных белков. Установлено, что для элюции цитохрома С с катионита наиболее оптимальным является раствор сульфата аммония с концентрацией 0,3 М, низкие концентрации сульфата аммония не полностью элюируют целевой продукт с катионита, при более высоких концентрациях с катионита частично элюируются примесные белки, что существенно снижает степень чистоты целевого продукта.To balance the column, the most optimal solution was a buffer solution containing 2 mM citric acid and 1.5 mM Tris; it is also possible to use other buffer solutions at a given pH value. To remove ballast proteins from cation exchange resin, a tris solution with a concentration of 80 mM is optimal, at lower concentrations ballast proteins are not completely washed out, higher concentrations do not significantly affect the number of removed ballast proteins. It was found that for elution of cytochrome C with cation exchange resin the solution of ammonium sulfate with a concentration of 0.3 M is the most optimal, low concentrations of ammonium sulfate do not completely elute the target product from cation exchange resin, impurity proteins partially partially elute from cation exchange resin, which significantly reduces the degree of purity target product.
Использование указанного катионита UNOsphere™ S позволяет непосредственно вести сорбцию цитохрома С из экстракта (при pH экстракта), позволяет значительно сократить технологический процесс за счет увеличения скорости процесса сорбции и десорбции, использовать меньший объем катионита за счет большей емкости и существенно повысить степень чистоты цитохрома С. Использование диафильтрации и концентрирования цитохрома С ультрафильтрацией на заключительных стадиях очистки позволяет значительно повысить эффективность и экономичность процесса за счет снижения расхода реактивов и времени проведения процесса.The use of the indicated UNOsphere ™ S cation exchanger allows direct sorption of cytochrome C from the extract (at the pH of the extract), significantly reduces the process by increasing the rate of sorption and desorption, use a smaller volume of cation exchanger due to its larger capacity and significantly increase the purity of cytochrome C. The use of diafiltration and concentration of cytochrome C ultrafiltration in the final stages of purification can significantly increase the efficiency and efficiency of the process and by reducing the consumption of reagents and of the process time.
Настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами.The present invention is illustrated by the following examples.
Пример 1Example 1
2,6 кг фарша, полученного из сердечных мышц свиней после удаления сосудов, связок и измельчения, отмывают водой от остатков крови, экстрагируют 2,5% кислоты трихлоруксусной. Экстракцию ведут 2 ч при 10-15°С. Экстракт отделяют от исходного сырья фильтрованием через ватно-марлевый фильтр с последующим центрифугированием при n=3000 об/мин в течение 10 мин; pH полученного экстракта 4,1. Всего получают 2750 мл экстракта. Полученный экстракт пропускают через катионит UNOsphere™ S уравновешенным стартовым буферным раствором, содержащим 2 мМ лимонной кислоты и 1,5 мМ трис, pH 4,0. Объем колонки 49 мл (диаметр 2,5 см, высота слоя сорбента 7,5 см, количество сорбента 37 мл). Сорбцию ведут при скорости пропускания раствора 2240 мл/ч. Время сорбции около 1,2 ч. Затем катионит UNOsphere™ S промывают 230 мл стартовым буферным раствором. Время промывки 0,1 ч. Для удаление балластных белков с колонки пропускают 750 мл 80 мМ раствора трис при скорости 750 мл/час. Время промывки 1 ч. Элюцию цитохрома С проводят раствором сульфата аммония с концентрацией 0,3 М. Скорость подачи элюирующего раствора 75 мл/ч. Время элюции 1,2 ч. Элюат отбирают фракциями. Фракции, окрашенные в красный цвет, объединяют. Объем фракций около 46 мл. Показатель чистоты цитохрома С (E550/280) составляет 0,92, выход 220 мг цитохрома С или 84,7 мг/кг исходного сырья.2.6 kg of minced meat obtained from the heart muscle of pigs after removal of blood vessels, ligaments and grinding, washed with water from blood residues, extracted with 2.5% trichloroacetic acid. Extraction is carried out for 2 hours at 10-15 ° C. The extract is separated from the feedstock by filtration through a cotton-gauze filter, followed by centrifugation at n = 3000 rpm for 10 minutes; The pH of the obtained extract is 4.1. A total of 2750 ml of extract is obtained. The resulting extract was passed through UNOsphere ™ S cation exchanger with a balanced starting buffer solution containing 2 mM citric acid and 1.5 mM Tris, pH 4.0. The column volume is 49 ml (diameter 2.5 cm, the height of the sorbent layer 7.5 cm, the amount of sorbent 37 ml). Sorption is carried out at a transmission rate of 2240 ml / h. The sorption time is about 1.2 hours. Then, UNOsphere ™ S cation exchange resin is washed with 230 ml of starting buffer solution. A washing time of 0.1 hours. To remove ballast proteins from the column, 750 ml of an 80 mM Tris solution is passed at a rate of 750 ml / hour. The washing time is 1 hour. Elution of cytochrome C is carried out with a solution of ammonium sulfate with a concentration of 0.3 M. The flow rate of the eluting solution is 75 ml / h. Elution time 1.2 hours. The eluate is collected in fractions. Red colored fractions are combined. The volume of fractions is about 46 ml. The purity index of cytochrome C (E 550/280 ) is 0.92, the yield of 220 mg of cytochrome C or 84.7 mg / kg of feedstock.
В объединенные фракции при перемешивании порциями добавляют сухой сульфат аммония в количестве 12,42 г. Раствор выдерживают 15-30 мин. Центрифугированием удаляют осадок балластных белков. На этой стадии показатель чистоты цитохрома С составляет (E550/280) выход 212 мг цитохрома С или 81,62 мг/кг исходного сырья.Dry ammonium sulfate in the amount of 12.42 g was added in portions with stirring in portions. The solution was kept for 15-30 minutes. By centrifugation, the precipitate of ballast proteins is removed. At this stage, the purity index of cytochrome C is (E 550/280 ) the yield of 212 mg of cytochrome C or 81.62 mg / kg of feedstock.
Пример 2Example 2
Выполняется в условиях примера 1. Для отделения цитохрома С от ионов сульфата аммония проводят диализ против воды. Показатель чистоты цитохрома С (E550/280) - 1,15. Выход 205 мг цитохрома С или 78,9 мг/кг исходного сырья.It is carried out under the conditions of example 1. To separate cytochrome C from ions of ammonium sulfate, dialysis is performed against water. The purity index of cytochrome C (E 550/280 ) is 1.15. Yield 205 mg of cytochrome C or 78.9 mg / kg of feedstock.
Пример 3Example 3
Выполняется в условиях примера 1. После удаления балластных белков, для отделения цитохрома С от ионов сульфата аммония проводят диафильтрацию. Для этого раствор цитохрома С в количестве 138 мл (объединенные фракции 3хзагрузок) пропускают на ультрафильтрационной установке в режиме диафильтрации в тангенциальном потоке через мембраны фирмы Millipore (кассета типа Pellicon XL) или Sartorius (кассета типа Vivaflow 50) с пределом исключения по молекулярной массе 5 кДа. Собирают 150 мл раствора, содержащего целевой продукт.It is carried out under the conditions of example 1. After removing the ballast proteins, diafiltration is carried out to separate cytochrome C from ammonium sulfate ions. To do this, a 138 ml cytochrome C solution (combined fractions of 3 x loads) is passed through a ultrafiltration unit in a diafiltration mode in a tangential flow through membranes from Millipore (Pellicon XL type cassette) or Sartorius (Vivaflow 50 type cassette) with a molecular weight exclusion limit 5 kDa. Collect 150 ml of a solution containing the desired product.
Показатель чистоты цитохрома С (E550/280) - 1,2. Выход 210 мг цитохрома С или 80,7 мг/кг исходного сырья (в пересчете на одну загрузку).The purity index of cytochrome C (E 550/280 ) is 1.2. Yield 210 mg of cytochrome C or 80.7 mg / kg of feedstock (calculated per load).
Пример 4Example 4
Выполняется в условиях примера 1 и 2. Раствор цитохрома С после диализа концентрируют методом ультрафильтрации. Для этого раствор цитохрома С в количестве 180 мл (объединенные фракции 3х загрузок после диализа) пропускают на ультрафильтрационной установке в тангенциальном потоке через мембраны фирмы Millipore (кассета типа Pellicon XL) или Sartorius (кассета типа Vivaflow 50) с пределом исключения по молекулярной массе 5 кДа. Получают 50 мл раствора, содержащего целевой продукт.It is carried out under the conditions of examples 1 and 2. The solution of cytochrome C after dialysis is concentrated by ultrafiltration. For this, a cytochrome C solution in an amount of 180 ml (combined fractions of 3 x downloads after dialysis) is passed on a ultrafiltration unit in a tangential flow through membranes from Millipore (Pellicon XL type cartridge) or Sartorius (Vivaflow 50 type cartridge) with a molecular weight exclusion limit of 5 kDa. Get 50 ml of a solution containing the target product.
Показатель чистоты цитохрома С (E550/280) - 1,18. Выход 200 мг цитохрома С или 77,0 мг/кг исходного сырья (в пересчете на одну загрузку).The purity index of cytochrome C (E 550/280 ) is 1.18. Yield 200 mg of cytochrome C or 77.0 mg / kg of feedstock (calculated per load).
Пример 5Example 5
Выполняется в условиях примера 1 и 3. Цитохром С после диафильтрации концентрируют методом ультрафильтрации. 150 мл раствор цитохрома С (объединенные фракции 3х загрузок после диафильтрации) пропускают на ультрафильтрационной установке в тангенциальном потоке через мембраны фирмы Millipore (кассета типа Pellicon XL) или Sartorius (кассета типа Vivaflow 50) с пределом исключения по молекулярной массе 5 кДа. Получают 50 мл раствора, содержащего целевой продукт.It is carried out under the conditions of examples 1 and 3. Cytochrome C after diafiltration is concentrated by ultrafiltration. A 150 ml cytochrome C solution (combined fractions of 3 x batch after diafiltration) is passed through a ultrafiltration unit in a tangential flow through Millipore membranes (Pellicon XL type cartridge) or Sartorius (Vivaflow 50 type cartridge) with an exclusion limit of 5 kDa. Get 50 ml of a solution containing the target product.
Показатель чистоты цитохрома С (E550/280) - 1,21. Выход 208 мг цитохрома С или 80,0 мг/кг исходного сырья (в пересчете на одну загрузку).The purity index of cytochrome C (E 550/280 ) is 1.21. Yield 208 mg of cytochrome C or 80.0 mg / kg of feedstock (calculated per load).
Примеры 6-15 по стадиям выполнены в условиях примера 1, 2, 3, 4 и 5. Все экспериментальные данные представлены в таблице.Examples 6-15 in stages performed in the conditions of example 1, 2, 3, 4 and 5. All experimental data are presented in the table.
При этом индекс А означает сырье из сердечных мышц свиньи по примеру 1, 2, 3, 4 и 5; Б -. сырье из сердечных мышц крупного рогатого скота; В - сырье из сердечных мышц лошади.Moreover, the index A means raw material from the heart muscle of the pig according to example 1, 2, 3, 4 and 5; B -. raw materials from the heart muscle of cattle; In - raw materials from the heart muscle of a horse.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010121217/15A RU2435597C1 (en) | 2010-05-27 | 2010-05-27 | Method for producing cytochrome c |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010121217/15A RU2435597C1 (en) | 2010-05-27 | 2010-05-27 | Method for producing cytochrome c |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2435597C1 true RU2435597C1 (en) | 2011-12-10 |
Family
ID=45405472
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010121217/15A RU2435597C1 (en) | 2010-05-27 | 2010-05-27 | Method for producing cytochrome c |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2435597C1 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2528061C1 (en) * | 2013-05-29 | 2014-09-10 | Павел Андреевич Канаев | Method of production of cytochrome c |
| CN109694408A (en) * | 2017-10-20 | 2019-04-30 | 中蓝晨光化工研究设计院有限公司 | A kind of ion-exchange purification method of cromoci |
| RU2745443C1 (en) * | 2020-06-10 | 2021-03-25 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Московский эндокринный завод" | Method for obtaining agent with antihypoxic, regenerative activity |
-
2010
- 2010-05-27 RU RU2010121217/15A patent/RU2435597C1/en active IP Right Revival
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Hagihara B. and al. J. Biochemistry. - 1958, v.45, N8, p.551. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2528061C1 (en) * | 2013-05-29 | 2014-09-10 | Павел Андреевич Канаев | Method of production of cytochrome c |
| CN109694408A (en) * | 2017-10-20 | 2019-04-30 | 中蓝晨光化工研究设计院有限公司 | A kind of ion-exchange purification method of cromoci |
| RU2745443C1 (en) * | 2020-06-10 | 2021-03-25 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Московский эндокринный завод" | Method for obtaining agent with antihypoxic, regenerative activity |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103992385B (en) | Pseudosciaena crocea swim bladder antioxidant collagen peptide and preparation method and application thereof | |
| JP3731150B2 (en) | Purification method of cartilage-type proteoglycan | |
| CN105153297B (en) | Method for separating and purifying α 2-macroglobulin from Cohn component IV precipitate | |
| CN115385986B (en) | Small molecule peptide with xanthine oxidase inhibitory activity and application thereof | |
| CN116589533A (en) | Euphausia superba small molecule active peptide, and preparation method and application thereof | |
| CN1566162A (en) | Heparin sodium and its preparing process | |
| RU2435597C1 (en) | Method for producing cytochrome c | |
| CN107190040B (en) | Antioxidant peptide of penaeus japonicus and preparation method thereof | |
| CN103848929B (en) | A kind of high efficiency extraction technique of heparin sodium | |
| JP2014501741A (en) | Method for extracting human serum albumin from the grain of transgenic rice | |
| EP1732397A2 (en) | Purified extract of an alpha-amylase inhibitor from phytoemagglutinin-essentially free beans, process for its extraction and compositions containing it | |
| CN110183550B (en) | Preparation process of fine heparin sodium | |
| RU2528061C1 (en) | Method of production of cytochrome c | |
| CN115124591B (en) | Spirulina platensis phycocyanin angiotensin converting enzyme inhibitory peptide and preparation method and application thereof | |
| CN109929049B (en) | Method for removing heavy metal in acidic polysaccharide | |
| CN104928337B (en) | Navodon septentrionalis fish skin zinc chelating peptide | |
| RU2612813C1 (en) | Method of producing heparin | |
| RU2230325C2 (en) | Method for preparing purified preparation of botulinic toxin type a | |
| CN1250567C (en) | Method of purifying calcium ion-binding protein | |
| CN104419695B (en) | The preparation of the bionical affinitive material of chymotrypsinogen and chymotrypsin purification process | |
| CN104762357B (en) | Preparation method of thamnaconus modestus fish skin zinc chelating peptide | |
| CN111560413B (en) | Method for preparing shellfish high F value oligopeptide by using metal organic framework material | |
| RU2745443C1 (en) | Method for obtaining agent with antihypoxic, regenerative activity | |
| RU2096464C1 (en) | Method of cytochrome c preparing | |
| CN110964100B (en) | Method for extracting high-purity phycocyanin and co-producing polysaccharide from spirulina |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20130530 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140528 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20171204 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20180824 |