RU2434943C2

RU2434943C2 - BIOSENSOR FOR DETECTION OF HYDROGEN PEROXIDE IN LIVE CELLS, POSSESSING HIGHER STABILITY TO pH CHANGE

Info

Publication number: RU2434943C2
Application number: RU2009117714/10A
Authority: RU
Inventors: Всеволод Вадимович Белоусов (RU); Всеволод Вадимович Белоусов
Original assignee: Российская Федерация, от имени которой выступает Федеральное Агентство по науке и инновациям; Закрытое акционерное общество "ЕВРОГЕН"
Priority date: 2009-05-12
Filing date: 2009-05-12
Publication date: 2011-11-27
Also published as: RU2009117714A

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention relates to isolated nucleic acid, encoding protein with activity of fluorescent biosensor for hydrogen peroxide detection, expression vector, containing said nucleic acid, cell of E.coli, producing protein, encoded by said nucleic acid, and isolated protein, with activity of fluorescent biosensor for hydrogen peroxide detection. Isolated protein, with activity of fluorescent biosensor for hydrogen peroxide detection, has amino acid sequence, presented in form SEQ ID NO: 2. Expression vector contains nucleic acid, encoding protein with activity of fluorescent biosensor for hydrogen peroxide detection, under control of regulatory elements, necessary for expression of nucleic acid in host cell. Cell of E.coli is modifies due to introduction into it of nucleic acid, encoding protein with activity of fluorescent biosensor for hydrogen peroxide detection, functionally connected with regulatory sequence.

EFFECT: claimed invention is applied for detection of hydrogen peroxide inside live cells.

4 cl, 3 dwg, 3 ex

Description

1. Область изобретения1. Field of invention

Данное изобретение относится в основном к области биологии и химии. В частности, изобретение направлено на биосенсоры для детекции пероксида водорода, сконструированные на базе флуоресцентных белков.This invention relates mainly to the field of biology and chemistry. In particular, the invention is directed to biosensors for the detection of hydrogen peroxide, constructed on the basis of fluorescent proteins.

2. Уровень техники2. The level of technology

Флуоресцентные белки, включая зеленый флуоресцентный белок (Green Fluorescent Protein, GFP), его мутанты и гомологи, сегодня широко известны благодаря их интенсивному использованию в качестве флуоресцентных маркеров in vivo в биомедицинских исследованиях, что детально рассмотрено Lippincott-Schwartz и Patterson в Science (2003) 300(5616): 87-91.Fluorescent proteins, including green fluorescent protein (Green Fluorescent Protein, GFP), its mutants and homologs, are now widely known for their intensive use as in vivo fluorescent markers in biomedical research, as discussed in detail by Lippincott-Schwartz and Patterson in Science (2003) 300 (5616): 87-91.

Флуоресцентные белки - это белки, которые способны к флуоресценции при облучении светом подходящей длины волны. Флуоресцентные свойства этих белков обусловлены взаимодействием двух или более аминокислотных остатков, а не флуоресценцией какого-либо одного аминокислотного остатка.Fluorescent proteins are proteins that are capable of fluorescence when exposed to light of a suitable wavelength. The fluorescence properties of these proteins are due to the interaction of two or more amino acid residues, and not the fluorescence of any one amino acid residue.

GFP гидромедузы Aequorea aequorea (синоним A.victoria) был описан Johnson et al. в J Cell Comp Physiol. (1962), 60: 85-104, как часть биолюминесцентной системы медузы, где GFP играет роль вторичного эммитера, преобразовывающего синий свет от фотобелка экворина в зеленый свет. кДНК, кодирующая A.victoria GFP, была клонирована Prasher et al. (Gene (1992), 111(2): 229-33). Оказалось, что этот ген может быть гетерологично экспрессирован в практически любом организме благодаря уникальной способности GFP самостоятельно образовывать хромофор (Chalfie et al., Science 263 (1994), 802-805). Эти сведения открывают широкие перспективы для использования GFP в клеточной биологии, в качестве генетически кодируемой флуоресцирующей метки.GFP hydromedusa Aequorea aequorea (synonym for A.victoria) has been described by Johnson et al. at J Cell Comp Physiol. (1962), 60: 85-104, as part of a bioluminescent jellyfish system, where GFP plays the role of a secondary emitter that converts blue light from an equorin photo protein to green light. cDNA encoding A.victoria GFP was cloned by Prasher et al. (Gene (1992), 111 (2): 229-33). It turned out that this gene can be heterologically expressed in almost any organism due to the unique ability of GFP to independently form a chromophore (Chalfie et al., Science 263 (1994), 802-805). This information opens up wide prospects for the use of GFP in cell biology as a genetically encoded fluorescent label.

GFP был использован в широком спектре приложений, включая исследование экспрессии генов и локализацию белков (Chalfie et al., Science 263 (1994), 802-805, and Heim et al. in Proc. Nat. Acad. Sci. (1994), 91: 12501-12504), как инструмент для визуализации внутриклеточного распределения органелл (Rizzuto et al., Curr. Biology (1995), 5: 635-642), для визуализации транспорта белков по секреторному пути (Kaether and Gerdes, FEBS Letters (1995), 369: 267-271).GFP has been used in a wide range of applications, including gene expression studies and protein localization (Chalfie et al., Science 263 (1994), 802-805, and Heim et al. In Proc. Nat. Acad. Sci. (1994), 91 : 12501-12504), as a tool for visualizing the intracellular distribution of organelles (Rizzuto et al., Curr. Biology (1995), 5: 635-642), for visualizing protein transport along the secretory pathway (Kaether and Gerdes, FEBS Letters (1995) 369: 267-271).

Были проведены многочисленные исследования для улучшения свойств GFP и для производства GFP-реактивов, пригодных и оптимизированных для различных исследовательских целей. Были разработаны новые версии GFP, такие как ДНК "гуманизированного" GFP, белковый продукт которой имеет повышенный синтез в клетках млекопитающих (Haas, et al., Current Biology (1996), 6: 315-324; Yang, et al., Nucleic Acids Research (1996), 24: 4592-4593). Один такой гуманизированный белок, мутант GFP, представляет собой "усиленный зеленый флуоресцирующий белок" (EGFP), имеющий две аминокислотные замены: F64L и S65T (Heim et al., Nature 373 (1995), 663-664). Другие мутанты являются синими, циановыми и желто-зелеными спектральными вариантами GFP. Сегодня GFP-подобные белки включают более 120 флуоресцентных и окрашенных гомологов GFP. Сходство этих белков с GFP варьирует от 80-90% до менее чем 25% идентичности аминокислотной последовательности. Исследование внутриклеточных процессов с помощью генетически кодируемых нанобиосенсоров становятся все более популярным, так как только такие сенсоры могут дать информацию об изменении исследуемого параметра непосредственно в живой системе. Такие биосенсоры могут быть использованы как в фундаментальных исследованиях сигнальных путей организма, так и при тестировании токсических и лекарственных препаратов на модельных клеточных линиях или организмах. В сравнении с химическими и физическими методами регистрации биологически активных субстанций биосенсорами, требующими экзогенно добавляемых красителей, субстратов или кофакторов, генетически кодируемые нанобиосенсоры относятся к классу безреагентных и многоразовых сенсоров. Наиболее эффективным подходом к разработке генетически кодируемых сенсоров стало использование флуоресцентных белков в качестве передатчиков информации (Suslova and Chudakov, Trends Biotechnol. 23(12) (2005), 605-13. Флуоресцентные белки представляют собой уникальное семейство - структурно родственных белков, которые способны формировать хромофор автокаталитически без привлечения внешних субстратов или кофакторов. Под действием индуцирующего света хромофор производит флуоресценцию, легко детектируемую с помощью современного лабораторного оборудования (спектрофлуориметр, флуоресцентный микроскоп, флуоресцентно-активируемый клеточный сортер, планшетный флуориметр). Один из наиболее перспективных подходов основан на использовании флуоресцентных белков, подвергнутых т.н. круговой пермутации (кпФБ). N и С-концы таких белков соединены друг с другом, а новые N и С-концы сформированы вблизи хромофора флуоресцентного белка. В результате круговой пермутации кпФБ приобретает способность реагировать на конформационные перестройки в области новых N и С-концов изменением спектра флуоресценции (наносенсоры с использованием обычных флуоресцентных белков оказались малочувствительными). Эффективность кпФБ на основе зеленого флуоресцентного белка (GFP) из Aequorea victoria была продемонстрирована на примере сенсора на ионы кальция (Nagai et al., Proc Nati Acad Sci USA. 98(6) (2001), 197-202. кпФБ был также использован для изготовления сенсора на пероксид водорода (Belousov et. al., Nat Methods.(2006); 3(4), 281-286). К основным недостаткам кпФБ на основе GFP из Aequorea victoria является их низкая рН стабильность. Биосенсор для детекции пероксида водорода HyPer был создан путем встраивания последовательности ДНК, кодирующей кпФБ, полученный из желтого флуоресцентного белка EYFP, в последовательность ДНК, кодирующую регуляторный домен белка OxyR, с последующей экспрессией в прокариотических и эукариотических клетках. Интенсивность возбуждения протонированной формы хромофора кпФБ в составе HyPer падает с увеличением показателя рН среды, в то время как интенсивность возбуждения депротонированной формы хромофора растет с увеличением показателя рН. Таким образом увеличение показателя рН среды действует на флуоресценцию HyPer так же, как увеличение концентрации H₂O₂. Наибольшее изменение интенсивностей возбуждения HyPer в зависимости от рН наблюдается в области 6,5-8, что близко к физиологическим значениям. рК хромофора cpYFP в составе HyPer составляет 8,5 (Belousov et. al., Nat Methods.(2006); 3(4), 281-286).Numerous studies have been conducted to improve the properties of GFP and to produce GFP reagents suitable and optimized for a variety of research purposes. New versions of GFP have been developed, such as humanized GFP DNA, whose protein product has increased synthesis in mammalian cells (Haas, et al., Current Biology (1996), 6: 315-324; Yang, et al., Nucleic Acids Research (1996), 24: 4592-4593). One such humanized protein, the GFP mutant, is an "enhanced green fluorescent protein" (EGFP) having two amino acid substitutions: F64L and S65T (Heim et al., Nature 373 (1995), 663-664). Other mutants are blue, cyan, and yellow-green spectral variants of GFP. Today, GFP-like proteins include more than 120 fluorescent and stained GFP homologs. The similarity of these proteins to GFP varies from 80-90% to less than 25% amino acid sequence identity. The study of intracellular processes using genetically encoded nanobiosensors is becoming increasingly popular, since only such sensors can provide information about changes in the studied parameter directly in a living system. Such biosensors can be used both in basic research of the signaling pathways of the body, and in testing toxic and drug preparations on model cell lines or organisms. Compared with chemical and physical methods for recording biologically active substances with biosensors requiring exogenously added dyes, substrates, or cofactors, genetically encoded nanobiosensors belong to the class of non-reagent and reusable sensors. The most effective approach to the development of genetically encoded sensors has been the use of fluorescent proteins as information transmitters (Suslova and Chudakov, Trends Biotechnol. 23 (12) (2005), 605-13. Fluorescent proteins are a unique family of structurally related proteins that can form the chromophore is autocatalytically without the use of external substrates or cofactors Under the influence of inducing light, the chromophore produces fluorescence that is easily detectable using modern laboratory equipment (sp one of the most promising approaches is based on the use of fluorescent proteins subjected to the so-called circular permutation (cPFB). The N and C-ends of such proteins are connected to each other, and the fluorescence microscope, fluorescence microscope, fluorescence-activated cell sorter, plate fluorimeter the new N and C ends are formed near the chromophore of the fluorescent protein. As a result of circular permutation, cpFB acquires the ability to respond to conformational rearrangements in the region of new N and C ends by changing the fluorescence spectrum (nanoparticle Sensors using conventional fluorescent proteins were found to be insensitive). The efficacy of green fluorescent protein (GFP) cfPB from Aequorea victoria has been demonstrated using a calcium ion sensor (Nagai et al., Proc Nati Acad Sci USA. 98 (6) (2001), 197-202. CfFB was also used for manufacturing a hydrogen peroxide sensor (Belousov et. al., Nat Methods. (2006); 3 (4), 281-286). The main disadvantages of cFPB based on GFP from Aequorea victoria are their low pH stability. Biosensor for hydrogen peroxide detection HyPer was created by inserting a DNA sequence encoding eppB derived from the yellow fluorescent EYFP protein in a sequence DNA encoding the regulatory domain of the OxyR protein, followed by expression in prokaryotic and eukaryotic cells.The excitation intensity of the protonated form of the cpPB chromophore in HyPer decreases with increasing pH, while the intensity of excitation of the deprotonated chromophore form increases with increasing pH. Thus, an increase in the pH of the medium affects the fluorescence of HyPer in the same way as an increase in the concentration of H ₂ O ₂ . The largest change in HyPer excitation intensities depending on pH is observed in the range of 6.5–8, which is close to physiological values. The pK chromophore pK in the HyPer composition is 8.5 (Belousov et. al., Nat Methods. (2006); 3 (4), 281-286).

3. Раскрытие изобретения3. Disclosure of invention

Настоящее изобретение обеспечивает выделенные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих новый флуоресцентный биосенсор для детекции пероксида водорода, обладающий улучшенными показателями устойчивости к изменениям рН среды. В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота настоящего изобретения получена методами генной инженерии. В некоторых воплощениях выделенные нуклеиновые кислоты настоящего изобретения кодируют флуоресцентный биосенсор для детекции пероксида водорода (SEQ ID NO: 02), флуоресцентная основа которого представляет собой зеленый флуоресцентный белок из Aequorea macrodactila, подвергнутый круговой пермутации, как в SEQ ID NO: 04 (cp-macGFP). Молекулы нуклеиновых кислот, которые отличаются от представленных нуклеотидных последовательностей вследствие вырожденности генетического кода, также входят в рамки настоящего изобретения. В других воплощениях также обеспечиваются векторы, включающие нуклеиновую кислоту настоящего изобретения. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает кассеты экспрессии, включающие нуклеиновую кислоту настоящего изобретения и регуляторные элементы, необходимые для экспрессии нуклеиновой кислоты в выбранной клетке-хозяине. Кроме того, также обеспечиваются клетки, стабильные клеточные линии, трансгенные животные и трансгенные растения, включающие нуклеиновые кислоты, векторы или экспрессионные кассеты настоящего изобретения. В других воплощениях обеспечиваются функциональные флуоресцентные биосенсоры настоящего изобретения, которые кодируются нуклеиновыми кислотами, указанными выше. Кроме того, обеспечиваются набор, содержащий нуклеиновые кислоты, или векторы, или экспрессионные кассеты, включающие указанные нуклеиновые кислоты настоящего изобретения.The present invention provides isolated nucleic acid molecules encoding a novel fluorescent biosensor for detecting hydrogen peroxide, having improved resistance to changes in pH. In some embodiments, the nucleic acid of the present invention is obtained by genetic engineering methods. In some embodiments, the isolated nucleic acids of the present invention encode a fluorescent biosensor for detecting hydrogen peroxide (SEQ ID NO: 02), the fluorescent base of which is a green fluorescent protein from Aequorea macrodactila, subjected to circular permutation, as in SEQ ID NO: 04 (cp-macGFP ) Nucleic acid molecules that differ from the presented nucleotide sequences due to the degeneracy of the genetic code are also included in the scope of the present invention. In other embodiments, vectors comprising the nucleic acid of the present invention are also provided. In addition, the present invention provides expression cassettes comprising the nucleic acid of the present invention and regulatory elements necessary for expression of the nucleic acid in a selected host cell. In addition, cells, stable cell lines, transgenic animals and transgenic plants including nucleic acids, vectors or expression cassettes of the present invention are also provided. In other embodiments, the functional fluorescent biosensors of the present invention are provided, which are encoded by the nucleic acids indicated above. In addition, a kit comprising nucleic acids or vectors or expression cassettes comprising said nucleic acids of the present invention is provided.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

Фигура 1 показывает принципиальную схему строения биосенсора для детекции пероксида водорода.Figure 1 shows a schematic diagram of the structure of a biosensor for the detection of hydrogen peroxide.

Фигура 2 иллюстрирует зависимость спектра возбуждения флуоресценции биосенсора, экспрессируемого в цитоплазме клеток E.coli от концентрации добавленного пероксида водорода.Figure 2 illustrates the dependence of the fluorescence excitation spectrum of a biosensor expressed in the cytoplasm of E. coli cells on the concentration of added hydrogen peroxide.

Фигура 3 иллюстрирует график зависимости флуоресценции биосенсора для детекции пероксида водорода от изменений рН среды.Figure 3 illustrates a graph of the dependence of the fluorescence of the biosensor for the detection of hydrogen peroxide from changes in pH of the medium.

Фигура 4 иллюстрирует нуклеотидную и аминокислотную последовательности биосенсора для детекции пероксида водорода SEQ ID NO: 01 и SEQ ID NO: 02 соотвественно.Figure 4 illustrates the nucleotide and amino acid sequences of a biosensor for the detection of hydrogen peroxide SEQ ID NO: 01 and SEQ ID NO: 02, respectively.

Фигура 5 иллюстрирует нуклеотидную и аминокислотную последовательности зеленого флуоресцентного белка из Aequorea macrodactila, подвергнутого круговой пермутации, SEQ ID NO: 03 и SEQ ID NO: 04 соотвественно.Figure 5 illustrates the nucleotide and amino acid sequences of a green fluorescent protein from Aequorea macrodactila subjected to circular permutation, SEQ ID NO: 03 and SEQ ID NO: 04, respectively.

4. Осуществление изобретения4. The implementation of the invention

Для более полного раскрытия вышеперечисленных характеристик настоящего изобретения ниже предлагается детальное описание изобретения, кратко сформулированного выше, в виде ссылок на воплощения, некоторые из которых проиллюстрированы дополнительными чертежами. При этом следует отметить, что прилагаемые чертежи иллюстрируют лишь типичные воплощения настоящего изобретения и, следовательно, не должны быть восприняты в качестве ограничения объема изобретения, которое может допускать другие в равной степени эффективные воплощения.To more fully disclose the above characteristics of the present invention, a detailed description of the invention, summarized above, in the form of links to embodiments, some of which are illustrated by additional drawings, is provided below. It should be noted that the accompanying drawings illustrate only typical embodiments of the present invention and, therefore, should not be construed as limiting the scope of the invention, which may allow other equally effective embodiments.

Если подвести итог вышеуказанному, настоящее изобретение направлено на молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют биосенсор для детекции пероксида водорода (SEQ ID NO: 02), флуоресцентная основа которого представляет собой зеленый флуоресцентный белок из Aequorea macrodactila, подвергнутый круговой пермутации, как в SEQ ID NO: 04 (cp-macGFP). Молекулы нуклеиновых кислот, представляющие интерес, получены методами генной инженерии. Белок, представляющий интерес, включает биосенсор для детекции пероксида водорода, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1. Также обеспечиваются клетки-хозяева, стабильные клеточные линии и трансгенные организмы, содержащие указанные молекулы нуклеиновых кислот. Указанные белковые и нуклеотидные композиции применяются в приложениях детекции пероксида водорода внутри живых клеток.To summarize the above, the present invention is directed to nucleic acid molecules that encode a biosensor for the detection of hydrogen peroxide (SEQ ID NO: 02), the fluorescent base of which is a green fluorescent protein from Aequorea macrodactila, subjected to circular permutation, as in SEQ ID NO: 04 (cp-macGFP). The nucleic acid molecules of interest are obtained by genetic engineering methods. The protein of interest includes a biosensor for detecting hydrogen peroxide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Host cells, stable cell lines and transgenic organisms containing these nucleic acid molecules are also provided. These protein and nucleotide compositions are used in hydrogen peroxide detection applications inside living cells.

Молекулы нуклеиновых кислотNucleic acid molecules

Настоящее изобретение обеспечивает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие флуоресцентный биосенсор для детекции пероксида водорода, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Как здесь используется, молекула нуклеиновой кислоты - это молекула ДНК, такая как геномная ДНК или кДНК молекула, или молекула РНК, такая как молекула мРНК. Как здесь используется, термин "кДНК" относится к нуклеиновым кислотам, которые обладают размещением элементов последовательности, найденным в нативных зрелых видах мРНК, где элементы последовательности - это экзоны и 5' и 3' некодирующие области. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая флуоресцентный биосенсор, может быть синтезирована из подходящих нуклеозидтрифосфатов или выделена из биологических источников. Оба метода основаны на хорошо известных в данной области протоколах. Например, доступность информации о последовательности аминокислот или информации о нуклеотидной последовательности дает возможность изготовить выделенные молекулы нуклеиновых кислот настоящего изобретении с помощью олигонуклеотидного синтеза. В случае информации о последовательности аминокислот несколько нуклеиновых кислот, отличающихся друг от друга вследствие вырожденности генетического кода, может быть синтезировано. Методы выбора вариантов кодонов для требуемого хозяина хорошо известны в данной области. Синтетические олигонуклеотиды могут быть приготовлены с помощью фосфорамидитного метода, и полученные конструкты могут быть очищены с помощью методов, хорошо известных в данной области, таких как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), или других методов, как описано, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Ed., (1989) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, и по инструкции, описанной в, например, United States Dept. of HHS, National Institute of Health (NIH) Guidelines for Recombinant DNA Research. Длинные двухцепочечные молекулы ДНК настоящего изобретения могут быть синтезированы за следующие стадии: несколько меньших фрагментов с необходимой комплементарностью, которые содержат подходящие концы, способные к когезии с соседним фрагментом, могут быть. Соседние фрагменты могут быть сшиты с помощью ДНК-лигазы или метода, основанного на ПЦР. Нуклеиновая кислота, кодирующая биосенсор или его фрагмент, может быть выделена любым из многих известных методов. Кроме того, также обеспечиваются вырожденные варианты нуклеиновых кислот, которые кодируют биосенсор настоящего изобретения. Вырожденные варианты нуклеиновых кислот включают замены кодонов нуклеиновой кислоты на другие кодоны, кодирующие те же самые аминокислоты. В частности, вырожденные варианты нуклеиновых кислот создаются, чтобы увеличить экспрессию в клетке-хозяине. В этом воплощении кодоны нуклеиновой кислоты, которые не являются предпочтительными или являются менее предпочтительными в генах клетки-хозяина, заменены кодонами, которые обильно представлены в кодирующих последовательностях генов в клетке-хозяине, где указанные замененные кодоны кодируют ту же самую аминокислоту. Особенный интерес представляют гуманизированные версии нуклеиновых кислот настоящего изобретения. Как здесь используется, термин "гуманизированный" относится к заменам, сделанным в последовательности нуклеиновой кислоты для оптимизации кодонов для экспрессии белка в клетках млекопитающих (человека) (Yang et al., Nucleic Acids Research (1996) 24: 4592-4593). См. также Патент США №5795737, который описывает гуманизацию белков, раскрытие которого здесь включено ссылкой. Примеры вырожденных вариантов, представляющих интерес, описаны более подробно в экспериментальной части, ниже. Заявленные нуклеиновые кислоты могут быть выделены и получены по существу в очищенной форме. По существу очищенная форма означает, что нуклеиновые кислоты являются по меньшей мере приблизительно на 50% чистыми, обычно по меньшей мере приблизительно на 90% чистыми, и обычно являются "рекомбинантными", то есть фланкированы одним или более нуклеотидов, с которыми она обычно не связана в хромосоме, встречающейся в природе в ее естественном организме-хозяине. Также обеспечиваются вектор и другие конструкции нуклеиновой кислоты, содержащие заявленные нуклеиновые кислоты. Подходящие векторы включают вирусные и невирусные векторы, плазмиды, космиды, фаги и т.д., предпочтительно плазмиды, и используются для клонирования, амплификации, экспрессии, переноса и т.д., последовательности нуклеиновой кислоты настоящего изобретения в подходящего хозяина. Выбор подходящего вектора является понятным для квалифицированного специалиста в данной области, и много таких векторов доступны коммерчески. Для приготовления конструкции полноразмерная нуклеиновая кислота или ее часть обычно вставляются в вектор посредством прикрепления ДНК-лигазой к расщепленному ферментами рестрикции сайту в векторе. Альтернативно, желательная нуклеотидная последовательность может быть вставлена гомологичной рекомбинацией in vivo, обычно, присоединением гомологичных участков к вектору на флангах желательной нуклеотидной последовательности. Гомологичные участки добавляются лигированием олигонуклеотидов или полимеразной цепной реакцией с использованием праймеров, включающих, например, как гомологичные участки, так и часть желательной нуклеотидной последовательности. Также обеспечиваются кассеты экспрессии или системы, использованные inter alia для получения заявленных хромогенных или флуоресцентных белков или химерных белков на их основе или для репликации заявленных молекул нуклеиновой кислоты. Кассета экспрессии может существовать как внехромосомный элемент или может быть включена в геном клетки в результате введения указанной кассеты экспрессии в клетку. Для экспрессии генный продукт, кодируемый нуклеиновой кислотой изобретения, экспрессируется в любой удобной системе экспрессии, включая, например, бактериальные системы, дрожжевые, насекомых, земноводных или клетки млекопитающих. В экспрессионном векторе указанная нуклеиновая кислота является функционально связанной с регуляторной последовательностью, которая может включить промоторы, энхансеры, терминаторы, операторы, репрессоры и индукторы. Методы изготовления кассет экспрессии или систем для экспрессии желаемого продукта известны специалистам, квалифицированным в данной области. Клеточные линии, которые устойчиво экспрессируют белки настоящего изобретения, могут быть выбраны способами, известными в данной области (например, котрансфекция с селектируемым маркером, таким как dhfr, gpt, неомицин, гигромицин, что делает возможным выявление и выделение транфецированных клеток, которые содержат ген, включенный в геном). Вышеописанные системы экспрессии могут использоваться в прокариотических или эукариотических хозяевах. Для получения белка могут использоваться клетки-хозяева, такие как E.coli, B.subtilis, S.cerevisiae, клетки насекомого в комбинации с бакуловирусными векторами, или клетки высшего организма, такого как позвоночные, например COS 7 клетки, HEK 293, CHO, ооциты Xenopus и т.д. Если используется любая вышеупомянутая клетка-хозяин или другие подходящие клетки-хозяева или организмы для репликации и/или экспрессии нуклеиновых кислот изобретения, то полученная реплицированная нуклеиновая кислота, экспрессированный белок или полипептид находятся в рамках притязания изобретения как продукт клетки-хозяина или организма. Продукт может быть выделен подходящим способом, известным в данной области. Также обеспечиваются короткие фрагменты ДНК заявленных нуклеиновых кислот, которые применяются как праймеры для ПЦР, гибридизационные скрининговые пробы и т.д. Длинные фрагменты ДНК применяются для получения кодируемых полипептидов, как ранее описано. Однако для использования в геометрических реакциях амплификации, таких как геометрическая ПЦР, используется пара коротких фрагментов ДНК, то есть праймеров. Точная последовательность праймера не является критической для изобретения, но для большинства применений праймеры будут гибридизоваться с заявленной последовательностью в условиях строгости, как известно в данной области. Предпочтительно выбрать пару праймеров, которые дадут продукт амплификации по меньшей мере приблизительно из 50 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере приблизительно из 100 нуклеотидов, и могут простираться на полную последовательность нуклеиновой кислоты. Алгоритмы отбора последовательностей праймеров обычно известны и доступны в коммерческих пакетах программ. Праймеры для амплификации гибридизуются с комплементарными цепочками ДНК и будут затравлять встречные реакции амплификации. Молекулы нуклеиновых кислот настоящего изобретения также могут применяться для определения экспрессии гена в биологическом образце. Способ, в котором исследуются клетки на наличие специфических нуклеотидных последовательностей, таких как геномная ДНК или РНК, хорошо отработан в данной области. Кратко, выделяют ДНК или мРНК из образца клетки. мРНК может быть амплифицирована ОТ-ПЦР с использованием обратной транскриптазы для формирования комплементарной цепочки ДНК, с последующей амплификацией с помощью полимеразной цепной реакции с использованием праймеров, специфических для заявленных последовательностей ДНК. Альтернативно, образец мРНК отделяют с помощью гель-электрофореза, переносят на подходящий носитель, например нитроцеллюлозу, нейлон и т.д., и затем тестируют фрагментом заявленной ДНК в качестве пробы. Могут также использоваться другие способы, такие как анализы сшивания олигонуклеотидов, гибридизация in situ и гибридизация ДНК-пробами, иммобилизованными на твердый чип. Обнаружение мРНК, гибридизующейся с заявленной последовательностью, указывает на экспрессию гена в образце.The present invention provides nucleic acid molecules encoding a fluorescence biosensor for detecting hydrogen peroxide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. As used here, a nucleic acid molecule is a DNA molecule, such as a genomic DNA or cDNA molecule, or an RNA molecule, such as mRNA molecule. As used here, the term "cDNA" refers to nucleic acids that possess a sequence of sequence elements found in native mature types of mRNA, where sequence elements are exons and 5 'and 3' non-coding regions. A nucleic acid molecule encoding a fluorescent biosensor can be synthesized from suitable nucleoside triphosphates or isolated from biological sources. Both methods are based on protocols well known in the art. For example, the availability of amino acid sequence information or nucleotide sequence information enables the production of isolated nucleic acid molecules of the present invention using oligonucleotide synthesis. In the case of amino acid sequence information, several nucleic acids that differ from each other due to the degeneracy of the genetic code can be synthesized. Methods for selecting codon variants for a desired host are well known in the art. Synthetic oligonucleotides can be prepared using the phosphoramidite method, and the resulting constructs can be purified using methods well known in the art, such as high performance liquid chromatography (HPLC), or other methods as described, for example, in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ^nd Ed., (1989) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, and according to the instructions described in, for example, United States Dept. of HHS, National Institute of Health (NIH) Guidelines for Recombinant DNA Research. The long double-stranded DNA molecules of the present invention can be synthesized in the following stages: several smaller fragments with the necessary complementarity, which contain suitable ends capable of cohesion with the neighboring fragment, can be. Neighboring fragments can be crosslinked using a DNA ligase or PCR based method. A nucleic acid encoding a biosensor or fragment thereof can be isolated by any of many known methods. In addition, degenerate nucleic acid variants that encode the biosensor of the present invention are also provided. Degenerate nucleic acid variants include substitutions of nucleic acid codons with other codons encoding the same amino acids. In particular, degenerate nucleic acid variants are created to increase expression in the host cell. In this embodiment, nucleic acid codons that are not preferred or less preferred in the genes of the host cell are replaced by codons that are abundantly represented in the coding sequences of the genes in the host cell, where said replaced codons encode the same amino acid. Of particular interest are humanized versions of the nucleic acids of the present invention. As used herein, the term “humanized” refers to substitutions made in a nucleic acid sequence to optimize codons for protein expression in mammalian (human) cells (Yang et al., Nucleic Acids Research (1996) 24: 4592-4593). See also US Patent No. 5,795,737, which describes the humanization of proteins, the disclosure of which is incorporated herein by reference. Examples of degenerate variants of interest are described in more detail in the experimental part below. The claimed nucleic acids can be isolated and obtained essentially in purified form. Essentially purified form means that the nucleic acids are at least about 50% pure, usually at least about 90% pure, and are usually "recombinant", that is, flanked by one or more nucleotides to which it is not normally associated on the chromosome found naturally in its natural host organism. A vector and other nucleic acid constructs containing the claimed nucleic acids are also provided. Suitable vectors include viral and non-viral vectors, plasmids, cosmids, phages, etc., preferably plasmids, and are used for cloning, amplification, expression, transfer, etc., of the nucleic acid sequence of the present invention in a suitable host. The selection of a suitable vector is understandable to a person skilled in the art, and many such vectors are commercially available. To prepare the construct, a full-length nucleic acid or part thereof is usually inserted into the vector by attaching a DNA ligase to a restriction enzyme-cleaved site in a vector. Alternatively, the desired nucleotide sequence can be inserted by in vivo homologous recombination, usually by attaching homologous regions to a vector on the flanks of the desired nucleotide sequence. Homologous regions are added by ligation of oligonucleotides or by polymerase chain reaction using primers, including, for example, both homologous regions and part of the desired nucleotide sequence. Also provided are expression cassettes or systems used inter alia to produce the claimed chromogenic or fluorescent proteins or chimeric proteins based on them or to replicate the claimed nucleic acid molecules. The expression cassette may exist as an extrachromosomal element or may be incorporated into the genome of a cell as a result of introducing said expression cassette into the cell. For expression, the gene product encoded by the nucleic acid of the invention is expressed in any convenient expression system, including, for example, bacterial systems, yeast, insects, amphibians, or mammalian cells. In the expression vector, said nucleic acid is operably linked to a regulatory sequence, which may include promoters, enhancers, terminators, operators, repressors and inducers. Methods for making expression cassettes or systems for expressing a desired product are known to those skilled in the art. Cell lines that stably express the proteins of the present invention can be selected by methods known in the art (e.g., cotransfection with a selectable marker such as dhfr, gpt, neomycin, hygromycin, which makes it possible to identify and isolate transfected cells that contain the gene, included in the genome). The above expression systems can be used in prokaryotic or eukaryotic hosts. To obtain the protein, host cells, such as E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae, insect cells in combination with baculovirus vectors, or cells of a higher organism such as vertebrates, for example COS 7 cells, HEK 293, CHO, can be used. Xenopus oocytes, etc. If any of the aforementioned host cells or other suitable host cells or organisms are used to replicate and / or express the nucleic acids of the invention, the resulting replicated nucleic acid, expressed protein or polypeptide is within the scope of the invention as a product of the host cell or organism. The product may be isolated by a suitable method known in the art. Also provided are short DNA fragments of the claimed nucleic acids, which are used as primers for PCR, hybridization screening samples, etc. Long DNA fragments are used to obtain encoded polypeptides, as previously described. However, for use in geometric amplification reactions, such as geometric PCR, a pair of short DNA fragments, i.e. primers, are used. The exact primer sequence is not critical to the invention, but for most applications, the primers will hybridize to the claimed sequence under stringent conditions, as is known in the art. It is preferable to select a pair of primers that will give an amplification product of at least about 50 nucleotides, preferably at least about 100 nucleotides, and can extend to the entire nucleic acid sequence. Primer sequence selection algorithms are commonly known and available in commercial software packages. Amplification primers hybridize with complementary strands of DNA and will seed the counter amplification reactions. The nucleic acid molecules of the present invention can also be used to determine gene expression in a biological sample. A method in which cells are examined for the presence of specific nucleotide sequences, such as genomic DNA or RNA, is well established in the art. Briefly, DNA or mRNA is isolated from a cell sample. mRNA can be amplified by RT-PCR using reverse transcriptase to form a complementary strand of DNA, followed by amplification using a polymerase chain reaction using primers specific for the claimed DNA sequences. Alternatively, the mRNA sample is separated by gel electrophoresis, transferred to a suitable carrier, such as nitrocellulose, nylon, etc., and then tested with a fragment of the claimed DNA as a sample. Other methods may also be used, such as oligonucleotide crosslinking assays, in situ hybridization, and hybridization with DNA probes immobilized on a solid chip. Detection of mRNA hybridizing with the claimed sequence indicates gene expression in the sample.

БелкиSquirrels

Также обеспечивается в соответствии с заявленным изобретением флуоресцентный биосенсор. Заявленный биосенсор флуоресцентный обладает способностью к детектируемой флуоресценции. Заявленный биосенсор обладает зеленой флуоресценцией, то есть он имеет пики возбуждения флуоресценции в диапазоне от приблизительно 350 до 500 нм, тогда как пик эмиссии заявленного биосенсора лежит в пределах от приблизительно 470 до 550 нм.A fluorescent biosensor is also provided in accordance with the claimed invention. The claimed fluorescence biosensor has the ability to detect fluorescence. The claimed biosensor has green fluorescence, that is, it has peaks of fluorescence excitation in the range from about 350 to 500 nm, while the emission peak of the claimed biosensor is in the range from about 470 to 550 nm.

ТрансформантыTransformants

Нуклеиновые кислоты настоящего изобретения могут быть использованы для получения трансформатов, включая трансгенных организмов или сайт-специфичных генных изменений в клеточных линиях. Трансгенные клетки, заявленные в изобретении, содержат одну или более нуклеиновых кислот, заявленных по настоящему изобретению, в качестве трансгена. Для целей изобретения любая приемлемая клетка-хозяин может быть использована, включая прокариотические (например, Escherichia coli, Streptomyces sp., Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus и т.д.) или эукариотические клетки-хозяева. Трансгенный организм, заявленный по изобретению, может быть прокариотическим или эукариотическим организмом, включая бактерии, цианобактирии, грибы, растения и животные, в которых одна или больше клеток организма содержат гетерогенную нуклеиновую кислоту, заявленную по изобретению, введенную посредством вмешательства человека, такими способами как технологии трансгеноза, которые известны в данной области. Выделенная нуклеиновая кислота настоящего изобретения может быть введена в хозяина способами, известными в данной области, например инфицированием, трансфекцией, трансформацией или трансконъюгацией. Способы переноса молекулы нуклеиновой кислоты (то есть ДНК) в такие организмы широко известны и обеспечиваются в ссылках, таких как Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3nd Ed., (2001) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY). В одном воплощении трансгенный организм может быть прокариотическим организмом.The nucleic acids of the present invention can be used to obtain transformers, including transgenic organisms or site-specific gene changes in cell lines. The transgenic cells of the invention comprise one or more nucleic acids of the invention as a transgene. For the purposes of the invention, any suitable host cell can be used, including prokaryotic (e.g., Escherichia coli, Streptomyces sp., Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus, etc.) or eukaryotic host cells. A transgenic organism of the invention may be a prokaryotic or eukaryotic organism, including bacteria, cyanobacteria, fungi, plants and animals in which one or more cells of the body contain a heterogeneous nucleic acid of the invention, introduced by human intervention, by methods such as technology transgenosis, which are known in the art. The isolated nucleic acid of the present invention can be introduced into the host by methods known in the art, for example, infection, transfection, transformation or trans-conjugation. Methods for transferring a nucleic acid molecule (i.e., DNA) into such organisms are widely known and provided in references such as Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3nd Ed., (2001) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY). In one embodiment, the transgenic organism may be a prokaryotic organism.

Способы трансформации прокариотических хозяев хорошо описаны в данной области (например, см. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995) John Wiley & Sons, Inc). В другом воплощении трансгенными организмами могут быть грибы, например дрожжи. Дрожжи широко используются как носители для экспрессии гетерогенного гена (например, см. Goodey et al., Yeast biotechnology, D R Berry et al., eds, (1987) Allen and Unwin, London, pp. 401-429) и King et al. Molecular and Cell Biology of Yeasts, E F Walton and G T Yarronton, eds, Blackie, Glasgow (1989) pp. 107-133). Несколько типов дрожжевых векторов доступны, включая интегративные векторы, которые требуют рекомбинации с геномом хозяина для их поддержки, и автономно реплицирующиеся плазмидные векторы. Другой организм хозяина является животным. Трансгенные животные могут быть получены трансгенными способами, известными в данной области, и обеспечиваются в ссылках, таких как Pinkert, Transgenic Animal Technology: a Laboratory Handbook, 2nd edition (2203) San Diego: Academic Press; Gersenstein and Vintersten, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd ed, (2002) Nagy A. (Ed), Cold Spring Harbor Laboratory; Blau et al., Laboratory Animal Medicine, 2nd Ed., (2002) Fox J.G., Anderson L.C., Loew F.M., Quimby F.W. (Eds), American Medical Association, American Psychological Association; Gene Targeting: A Practical Approach by Alexandra L. Joyner (Ed.) Oxford University Press; 2nd edition (2000). Например, трансгенные животные могут быть получены гомологичной рекомбинацией, где изменяется эндогенный локус. Альтернативно, конструкция нуклеиновой кислоты включается случайным образом в геном. Векторы для устойчивого включения включают плазмиды, ретровирусы и другие животные вирусы, YAC и т.п. Нуклеиновые кислоты могут быть введены в клетку непосредственно или опосредованно, введением в прекурсор клетки, путем намеренной генетической манипуляции, такой как микроинъекция или инфицирование рекомбинантным вирусом или рекомбинантным вирусным вектором и т.п. Термин «генетическая манипуляция» не включает классическое скрещивание или оплодотворение in vitro, а предпочтительно является направленным на введение рекомбинантных молекул нуклеиновых кислот. Эти молекулы нуклеиновой кислоты могут быть включены в хромосому, или они являются внехромосомными реплицирующими ДНК. Конструкции ДНК для гомологичной рекомбинации будут содержать по меньшей мере часть нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, где ген имеет желательную генетическую модификацую(ции) и включает области гомологии с целевым локусом. Конструкциям ДНК для произвольного включения не обязательно содержать область гомологии с медиатором рекомбинации. Легко могут быть включены маркеры для положительной и отрицательной селекции. Способы получения клеток, имеющих целевые генные модификации, через гомологическую комбинацию известны в данной области. Для различных способов трансфекции клеток млекопитающих, см. Keown et al., Meth. Enzymol. (1990) 185: 527-537. Для эмбриональных стволовых (ЭС) клеток могут быть использованы ЭС клеточные линии, или эмбриональные клетки могут быть получены непосредственно от хозяина, такого как мышь, крыса, морская свинка и т.д. Такие клетки выращиваются на подходящем фибропласт-питающем слое или в присутствии фактора ингибирования лейкемии (LIF). Трансформированные ЭС или эмбриональные клетки могут быть использованы для получения трансгенных животных с помощью подходящего способа, описанного в данной области. Трансгенные животные могут быть любыми животными, не относящимися к человеку, включая млекопитающее, не относящееся к человеку (например, мышь, крыса), птица или амфибия и т.д., и использованы в функциональном исследовании, скрининге лекарственного средства и т.п. Характерные примеры использования трансгенных животных включают те, которые описанные ниже. Также могут быть получены трансгенные растения. Способы получения трансгенных растительных клеток и растений описаны в патентах США №№5767367; 5750870; 5739409; 5689049; 5689045; 5674731; 5656466; 5633155; 5629470; 5595896; 5576198; 5538879; 5484956; раскрытия которых включены сюда ссылкой. Способы получения трансгенных растений также рассмотрены в Plant Biochemistry and Molecular Biology (eds. Lea and Leegood, John Wiley & Sons) (1993) pp.275-295 и в Plant Biotechnology and Transgenic Plants (eds. Oksman-Caldentey and Barz), (2002) 719 p. Например, эмбриогенные эксплантаты, содержащие соматические клетки, могут использоваться для получения трансгенного хозяина. После сбора клеток или тканей экзогенная ДНК, представляющая интерес, вводится в растительные клетки, при этом известен для такого введения ряд различных способов. При наличии выделенных протопластов возникает возможность для введения через ДНК-опосредованные протоколы передачи гена, включая инкубацию протопластов с очищенной ДНК, такой как плазмида, содержащая целевую экзогенную последовательность, представляющую интерес, в присутствии поливалентных катионов (например, PEG или PLO); или электропорацию протопластов в присутствии выделенной ДНК, включающей целевую экзогенную последовательность. Протопласты, которые успешно включили экзогенную ДНК, затем отбираются, выращиваются в каллус и в конечном счете вводятся в трансгенное растение при контакте с подходящими количествами и отношениями стимулирующих факторов, таких как ауксины и цитокины. Другие подходящие способы получения растения могут использоваться, такие как применение "генной пушки", или Agrobacterium-опосредованная трансформация, которые доступны для квалифицированных специалистов в данной области. Следующие примеры предлагаются в качестве иллюстративных, но не ограничивающих.Methods for transforming prokaryotic hosts are well described in the art (e.g., see Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995) John Wiley & Sons, Inc). In another embodiment, the transgenic organisms may be fungi, for example, yeast. Yeast is widely used as a carrier for expressing a heterogeneous gene (e.g. see Goodey et al., Yeast biotechnology, DR Berry et al., Eds, (1987) Allen and Unwin, London, pp. 401-429) and King et al. Molecular and Cell Biology of Yeasts, E F Walton and G T Yarronton, eds, Blackie, Glasgow (1989) pp. 107-133). Several types of yeast vectors are available, including integrative vectors that require recombination with the host genome to support them, and autonomously replicating plasmid vectors. Another host organism is an animal. Transgenic animals can be obtained by transgenic methods known in the art and are provided in references such as Pinkert, Transgenic Animal Technology: a Laboratory Handbook, 2nd edition (2203) San Diego: Academic Press; Gersenstein and Vintersten, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd ed, (2002) Nagy A. (Ed), Cold Spring Harbor Laboratory; Blau et al., Laboratory Animal Medicine, 2nd Ed., (2002) Fox J.G., Anderson L.C., Loew F.M., Quimby F.W. (Eds), American Medical Association, American Psychological Association; Gene Targeting: A Practical Approach by Alexandra L. Joyner (Ed.) Oxford University Press; 2nd edition (2000). For example, transgenic animals can be obtained by homologous recombination, where the endogenous locus changes. Alternatively, the nucleic acid construct is randomly incorporated into the genome. Vectors for sustainable incorporation include plasmids, retroviruses and other animal viruses, YAC, and the like. Nucleic acids can be introduced into a cell directly or indirectly, by introducing into a cell precursor, by intentional genetic manipulation, such as microinjection or infection with a recombinant virus or recombinant viral vector and the like. The term “genetic manipulation” does not include classical cross-fertilization or in vitro fertilization, but is preferably directed to the introduction of recombinant nucleic acid molecules. These nucleic acid molecules may be included in the chromosome, or they are extrachromosomal replicating DNA. DNA constructs for homologous recombination will contain at least a portion of the nucleic acid of the present invention, where the gene has the desired genetic modification (s) and includes homology regions with a target locus. DNA constructs for arbitrary incorporation do not necessarily contain a region of homology with a recombination mediator. Markers for positive and negative selection can easily be included. Methods for producing cells having targeted gene modifications through a homologous combination are known in the art. For various methods for transfecting mammalian cells, see Keown et al., Meth. Enzymol. (1990) 185: 527-537. For embryonic stem (ES) cells, ES cell lines can be used, or embryonic cells can be obtained directly from a host, such as a mouse, rat, guinea pig, etc. Such cells are grown on a suitable fibroblast-feeding layer or in the presence of leukemia inhibition factor (LIF). Transformed ES or embryonic cells can be used to obtain transgenic animals using a suitable method described in this field. Transgenic animals can be any non-human animal, including a non-human mammal (e.g., mouse, rat), bird or amphibian, etc., and used in functional research, drug screening, and the like. Representative examples of the use of transgenic animals include those described below. Transgenic plants can also be obtained. Methods for producing transgenic plant cells and plants are described in US patent No. 5767367; 5,750,870; 5,739,409; 5,689,049; 5,689,045; 5,674,731; 5656466; 5,633,155; 5,629,470; 5,595,896; 5,576,198; 5,538,879; 5,484,956; disclosures of which are incorporated herein by reference. Methods for producing transgenic plants are also discussed in Plant Biochemistry and Molecular Biology (eds. Lea and Leegood, John Wiley & Sons) (1993) pp. 275-295 and Plant Biotechnology and Transgenic Plants (eds. Oksman-Caldentey and Barz), ( 2002) 719 p. For example, embryogenic explants containing somatic cells can be used to produce a transgenic host. After collecting cells or tissues, exogenous DNA of interest is introduced into the plant cells, and a number of different methods are known for this introduction. In the presence of isolated protoplasts, it becomes possible to introduce through DNA-mediated gene transfer protocols, including incubating protoplasts with purified DNA, such as a plasmid containing the desired exogenous sequence of interest in the presence of polyvalent cations (eg, PEG or PLO); or electroporation of protoplasts in the presence of isolated DNA, including the target exogenous sequence. Protoplasts that successfully incorporate exogenous DNA are then selected, grown in callus and ultimately introduced into the transgenic plant in contact with suitable amounts and ratios of stimulatory factors such as auxins and cytokines. Other suitable plant production methods may be used, such as the use of a "gene gun", or Agrobacterium-mediated transformation, which are available to those skilled in the art. The following examples are provided as illustrative but not limiting.

ПримерыExamples

Пример 1Example 1

Получение биосенсора для детекции пероксида водорода с улучшенной pH-стабильностью.Obtaining a biosensor for the detection of hydrogen peroxide with improved pH stability.

Фрагмент (80-305 a.o.) OxyR был амплифицирован с геномной ДНК E.coli с помощью праймеров np1 и пр2 и заклонирован в вектор pQE-30 (Qiagen) по сайтам BamHI и HindIII. Затем с помощью праймеров пр3 и пр4 были амплифицированы фрагменты с 80 а.о. по 205 а.о. и с помощью пр5 и пр6 фрагменты с 206 а.о. по 305 а.о. В качестве флуоресцентного ядра для биосенсора был использован флуоресцентный белок гидроида Aequorea macrodactyla, macGFP. Этот белок обладает двумя пиками поглощения (398 и 480 нм) и пиком эмиссии 510 нм. Выбор macGFP был обусловлен тем, что, как правило, хромофоры зеленых флуоресцентных белков не обладают такой выраженной pH-зависимостью, как хромофоры желтых флуоресцентных белков. Клонированный в pQE-30 и экспресированный в клетках E.coli XLlBlue macGFP обладал недостаточной флуоресценцией, в т.ч. потому, что хромофор не достаточно быстро формировался при 37°С. Для улучшения флуоресцентных свойств белка провели случайный мутагенез (прA1 и прB2) и по результатам скрининга был отобран клон Mut2-3 с заменами S65C, N144S, F220L, F223S, K238R, который обладал самой яркой флуоресценцией, быстро созревающим хромофором и не олигомеризовался. На основе Mut2-3 был получен круговой пермутант macGFP (cp-macGFP). Для этого фрагмент macGFP A (1-145 а.о.) был амплифицирован с помощью прA1 и прA2, фрагмент B (145-239 а.о.) с помощью прВ1 и прВ2. прА2 и прВ1 имели комплиментарный участок, кодирующий линкер между исходными C- и N-концами пермутанта, и амплифицированные с помощью этих праймеров фрагменты могут отжигаться друг на друга в комплиментарной области. Фрагменты A и B экстрагировали из реакционной смеси для ПЦР, смешивали и проводили 3-5 циклов. После этого в реакционную смесь добавляли концевые для пермутанта праймеры прA1 и прB2, содержащие рестрикционные сайты BamHI и HindIII, и проводили еще несколько циклов реакции. Кроме прA2 и прB2 для амплификации всего гена cp-macGFP использовали прA2' и прB2', содержащие вырожденные последовательности в областях концевых линкеров. Все четыре праймера сочетали попарно. Таким образом достигали эффекта случайного мутагенеза концевых линкеров. Полученную таким образом библиотеку круговых пермутантов macGFP клонировали в вектор pEN-30 (Qiagen) по сайтам BamHI и HindIII. pEN-30 не содержит последовательности из 4-х гистидинов, которые, предположительно, могли повлиять на фолдинг пермутированного белка. В результате круговой пермутации macGFP потерял способность к флуоресценции, поэтому провели случайный мутагенез самого белка и C-концевых последовательностей, которые в дальнейшем стали линкерами между С-концом cp-macGFP и C-концевым фрагментом OxyR. Отобрали наиболее яркие клоны 2, 6 и 7, у которых флуоресценция появлялась раньше, чем у остальных: клон 2: (Ser-Ala-Gly)-cp-macGFP-(His-Gly); клон 6: (Ser-Ala-Gly)-cp-macGFP-(Ser-Asp); клон 7: (Ser-Ala-Gly)-cp-macGFP-(His-Asn). В качестве флуоресцентного ядра для конструирования сенсора использовали смесь всех трех клонов (2-го, 6-го и 7-го), подвергнутую предварительно случайному мутагенезу (кроме участка первого линкера, который остался неизменным по отношению к HyPer). Объединение двух фрагментов ДНК OxyR с ДНК cp-macGFP проводили методом «overlap extention», причем cp-macGFP был предварительно подвергнут случайному мутагенезу (пр9 и пр10). Полученную после случайного мутагенеза и «overlap extention» библиотеку фрагментов клонировали в pQE-30 по сайтам BamHI и HindIII и экспрессировали в E.coli. Из полученной таким образом библиотеки клонов сенсора OxyR-macGFP клоны для дальнейшей работы отобрали по следующим критериям: способность формировать хромофор при экспрессии в E.coli на 37°C и высокий динамический диапазон (при полном окислении пик 480 нм увеличивается в 1,5 раз и более). По вышеуказанным критериям были отобраны клоны 2, 3 и 4. Из них клон 3 (хромофор: 65Cys-66Tyr-67Gly: линкер B: His-Gly) обладал максимальным динамическим диапазоном, т.е. при полном окислении пик, соответствующий депротонированной форме хромофора, увеличивался в 2 раза. Но этот клон не достаточно быстро формировал хромофор при 37°C. Клон 3 был взят в качестве исходного для следующего раунда случайного мутагенеза (пр9 и пр10). Из полученной в результате библиотеки был отобран клон 3.3, обладающий, помимо замен исходного клона 3, заменами I68V (классическая замена, ускоряющая созревание хромофора) и K52R. При полном окислении пик, соответствующий депротонированной форме хромофора клона 3,3, увеличивался в 2,2 раза. Кроме того, хромофор этого белка формировался при 37°C. Для этого белка произвели измерение рН-зависимости.Fragment (80-305 a.o.) OxyR was amplified with E. coli genomic DNA using np1 and pr2 primers and cloned into pQE-30 vector (Qiagen) at the BamHI and HindIII sites. Then, using primers pr3 and pr4, fragments with 80 aa were amplified. 205 a.o. and using pr5 and pr6 fragments with 206 aa 305 a.o. As the fluorescent core for the biosensor, the fluorescent protein hydride Aequorea macrodactyla, macGFP was used. This protein has two absorption peaks (398 and 480 nm) and an emission peak of 510 nm. The choice of macGFP was due to the fact that, as a rule, the chromophores of green fluorescent proteins do not have such a pronounced pH dependence as the chromophores of yellow fluorescent proteins. Cloned in pQE-30 and expressed in E. coli XLlBlue macGFP cells had insufficient fluorescence, including because the chromophore was not formed quickly enough at 37 ° C. In order to improve the fluorescent properties of the protein, random mutagenesis (prA1 and prB2) was performed and, according to the results of the screening, clone Mut2-3 was selected with the substitutions S65C, N144S, F220L, F223S, K238R, which had the brightest fluorescence, rapidly ripening chromophore and did not oligomerize. Based on Mut2-3, the circular permutant macGFP (cp-macGFP) was obtained. For this, the macGFP A fragment (1-145 aa) was amplified using prA1 and prA2, fragment B (145-239 aa) using prB1 and prB2. prA2 and prB1 had a complementary region encoding a linker between the initial C- and N-ends of the permutant, and fragments amplified by these primers can be annealed on each other in the complementary region. Fragments A and B were extracted from the PCR reaction mixture, mixed, and 3-5 cycles were performed. After that, priMant-end primers prA1 and prB2 containing restriction sites BamHI and HindIII were added to the reaction mixture, and several more reaction cycles were carried out. In addition to prA2 and prB2, amplification of the entire cp-macGFP gene was performed using prA2 'and prB2' containing degenerate sequences in the regions of terminal linkers. All four primers were combined in pairs. Thus, the effect of random mutagenesis of terminal linkers was achieved. The thus obtained library of circular permutants macGFP was cloned into the pEN-30 vector (Qiagen) at the BamHI and HindIII sites. pEN-30 does not contain a sequence of 4 histidines, which, presumably, could affect the folding of the permuted protein. As a result of circular permutation, macGFP lost its fluorescence ability; therefore, random mutagenesis of the protein itself and C-terminal sequences was carried out, which later became linkers between the C-terminus of cp-macGFP and the C-terminal OxyR fragment. The most striking clones 2, 6 and 7 were selected, in which fluorescence appeared earlier than in the rest: clone 2: (Ser-Ala-Gly) -cp-macGFP- (His-Gly); clone 6: (Ser-Ala-Gly) -cp-macGFP- (Ser-Asp); clone 7: (Ser-Ala-Gly) -cp-macGFP- (His-Asn). A mixture of all three clones (2nd, 6th, and 7th) subjected to preliminary random mutagenesis (except for the portion of the first linker that remained unchanged with respect to HyPer) was used as a fluorescent core for constructing the sensor. The combination of two OxyR DNA fragments with cp-macGFP DNA was performed using the "overlap extention" method, and cp-macGFP was previously subjected to random mutagenesis (pr9 and pr10). The fragment library obtained after random mutagenesis and overlap extention was cloned into pQE-30 at the BamHI and HindIII sites and expressed in E. coli. From the library of OxyR-macGFP sensor clones obtained in this way, clones were selected for further work according to the following criteria: the ability to form a chromophore when expressed in E. coli at 37 ° C and a high dynamic range (with full oxidation, the peak of 480 nm increases by 1.5 times and more). According to the above criteria, clones 2, 3, and 4 were selected. Of these, clone 3 (chromophore: 65Cys-66Tyr-67Gly: linker B: His-Gly) had a maximum dynamic range, i.e. with complete oxidation, the peak corresponding to the deprotonated form of the chromophore increased by 2 times. But this clone did not quickly form a chromophore at 37 ° C. Clone 3 was taken as the starting point for the next round of random mutagenesis (pr9 and pr10). Clone 3.3 was selected from the resulting library, possessing, in addition to replacing the original clone 3, the substitutions I68V (classical replacement accelerating chromophore maturation) and K52R. With complete oxidation, the peak corresponding to the deprotonated form of the chromophore of clone 3.3 increased by 2.2 times. In addition, the chromophore of this protein was formed at 37 ° C. For this protein, the pH dependence was measured.

Пример 2Example 2

Измерение pH-стабильности клона 3.3.Measurement of pH stability of clone 3.3.

Клетки E.coli, экспрессирующие клон 3.3, осаждали 20 минут при скорости 4000 об/мин на холоду (4 C°) и суспендировали в буфере I (125 мМ NaCl, 40 мМ Tris-HCl, 5 мМ 2-меркаптоэтанола, pH 7,5) из расчета 1,5 мл буфера I на осадок, полученный из 50 мл клеток в жидкой LB. Затем клетки разрушали ультразвуком с помощью прибора Sonic Dismembrator (Fisher Scientific), мощность 10 Вт, центрифугировали 10 мин при скорости 12000 об/мин и температуре 4 C°. Супернатант переносили в пробирки с предварительно уравновешенной буфером I металл-афинной смолой TALON (Clontech) из расчета 500 мкл смолы на 1000-1200 мкл супернатанта. Пробирки помещали в шейкер (скорость 40 об/мин) и инкубировали 20-25 мин. После этого смолу промывали 3-4 раза 1000 мкл буфера I. Для элюции использовали буфер II (125 мМ NaCl, 40 мМ Tris-HCl, 5 мМ 2-меркаптоэтанола, 200 мМ имидазола, pH 7,5). Элюцию проводили 20-25 мин в шейкере, белок с 500 мкл смолы элюировали 300-350 мкл буфера II. Все манипуляции осуществляли на холоду, все буферы и смолу предварительно охлаждали, выделенный белок хранили на 4 C° до 24 часов. Аликвоту очищенного белка, смешанного с 1 мл буфера, помещали в кювету для флуориметра. Использовали набор буферов с pH 5,8; 6,0; 6,4; 7,0; 7,5; 7,8; 8,0; 8,3; 8,8; 9,0; 10,0. Для белка в каждом буфере снимали спектр возбуждения с 380 нм до 490 нм при эмиссии 510 нм. Затем строили график зависимости интенсивности спектра возбуждения хромофора в депротонированной форме (480 нм) от показателя pH буфера. По сравнению с HyPer (Pk 8,6) флуоресценция клона 3.3 имеет pK 6,4 (Фигура 3). pK - величина pH, при которой интенсивность флуоресценции хромофора составляет 50% от максимальной. Таким образом, при физиологических pH хромофор белка OxyR-cpmacGFP гораздо ярче, чем хромофор HyPer. В диапазоне pH 6,8-7,8 флуоресценция HyPer изменяется в 5 раз, тогда как клона 3.3 - в 1,3 раза. В диапазоне 7,5-8 клон 3.3 меняет интенсивность флуоресценции в 1,09 раз (против 1,7 раз в HyPer), что делает его идеальным сенсором для изменений уровня пероксида водорода в матриксе митохондрий. Таким образом, клон 3.3 имеет существенно лучшие показатели pH-стабильности по сравнению с HyPer. Именно этот белок был выбран для дальнейшего использования в качестве биосенсора настоящего изобретения.E. coli cells expressing clone 3.3 were besieged for 20 minutes at 4000 rpm in the cold (4 ° C) and suspended in buffer I (125 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl, 5 mM 2-mercaptoethanol, pH 7, 5) based on 1.5 ml of buffer I per precipitate obtained from 50 ml of cells in liquid LB. Then the cells were destroyed by ultrasound using a Sonic Dismembrator (Fisher Scientific), power 10 W, centrifuged for 10 min at a speed of 12000 rpm and a temperature of 4 ° C. The supernatant was transferred into tubes with TALON metal-affinity resin (Clontech) pre-equilibrated with buffer I at the rate of 500 μl of resin per 1000-1200 μl of supernatant. The tubes were placed in a shaker (speed 40 rpm) and incubated for 20-25 minutes. After that, the resin was washed 3-4 times with 1000 μl of buffer I. Buffer II was used for elution (125 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl, 5 mM 2-mercaptoethanol, 200 mM imidazole, pH 7.5). Elution was carried out for 20-25 min in a shaker, protein with 500 μl of resin was eluted with 300-350 μl of buffer II. All manipulations were carried out in the cold, all buffers and resin were pre-cooled, the isolated protein was stored at 4 ° C for up to 24 hours. An aliquot of the purified protein mixed with 1 ml of buffer was placed in a fluorimeter cuvette. Used a set of buffers with a pH of 5.8; 6.0; 6.4; 7.0; 7.5; 7.8; 8.0; 8.3; 8.8; 9.0; 10.0 For the protein in each buffer, the excitation spectrum was recorded from 380 nm to 490 nm with an emission of 510 nm. Then, we plotted the intensity of the chromophore excitation spectrum in deprotonated form (480 nm) versus the pH of the buffer. Compared to HyPer (Pk 8.6), the fluorescence of clone 3.3 has a pK of 6.4 (Figure 3). pK is the pH value at which the chromophore fluorescence intensity is 50% of the maximum. Thus, at physiological pH, the chromophore of the OxyR-cpmacGFP protein is much brighter than the HyPer chromophore. In the pH range of 6.8-7.8, HyPer fluorescence changes 5 times, while clone 3.3 - 1.3 times. In the range of 7.5–8, clone 3.3 changes the fluorescence intensity by 1.09 times (versus 1.7 times in HyPer), which makes it an ideal sensor for changes in the level of hydrogen peroxide in the mitochondrial matrix. Thus, clone 3.3 has significantly better pH stability compared to HyPer. It was this protein that was selected for further use as a biosensor of the present invention.

Пример 3Example 3

Исследование чувствительности сенсора OxyR-macGFP.Sensitivity study of the OxyR-macGFP sensor.

Минимальная концентрация H₂O₂, вызывающая изменение флуоресценции в суспензии бактериальных клеток, экспрессирующих OxyR-cpmacGFP или HyPer, составляла 5 мкМ, при концентрации 50 мкМ весь белок переходил в окисленную форму. Такие же данные были ранее получены для белка OxyR, экспресированного в Е.coli, а также для НуРег (Belousov et.al., Nat Methods.(2006); 3(4), 281-286). Это говорит о том, что связанный с регулятороным доменом OxyR cp-macGFP, по всей видимости, не влияет на фолдинг OxyR и не влияет на чувствительность OxyR к H₂O₂.The minimum concentration of H ₂ O ₂ , causing a change in fluorescence in a suspension of bacterial cells expressing OxyR-cpmacGFP or HyPer, was 5 μM; at a concentration of 50 μM, the whole protein turned into an oxidized form. The same data were previously obtained for the OxyR protein expressed in E. coli, as well as for WellReg (Belousov et.al., Nat Methods. (2006); 3 (4), 281-286). This suggests that cp-macGFP bound to the OxyR regulatory domain does not seem to affect the folding of OxyR and does not affect the sensitivity of OxyR to H ₂ O ₂ .

Все публикации и патентные заявки, цитируемые в настоящем описании, вводятся в настоящее описание посредством ссылки, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка была конкретно и отдельно введена посредством ссылки. Цитирование любой публикации приводится в соответствии с контекстом и интерпретацией по настоящему изобретению и не должно истолковываться как признание любой такой публикации прототипом данного изобретения.All publications and patent applications cited in the present description, are introduced into the present description by reference, as if each individual publication or patent application was specifically and separately introduced by reference. The citation of any publication is in accordance with the context and interpretation of the present invention and should not be construed as recognition of any such publication as a prototype of the present invention.

ОпределенияDefinitions

Различные термины, относящиеся к биологическим молекулам настоящего изобретения, используются выше и также в описании, и в формуле изобретения. Как здесь используется, термин "флуоресцентный биосенсор" означает белок, который обладает способностью к флуоресценции; например, он может проявлять низкую, среднюю или интенсивную флуоресценцию при облучении светом с подходящей для возбуждения длиной волны. Флуоресцентное свойство этого белка представляет собой такое свойство, которое является результатом работы хромофора, образующегося путем автокаталитической циклизации двух или более аминокислотных остатков в полипептидной цепи. Как таковые флуоресцентные биосенсоры настоящего изобретения не включают белки, которые обладают флуоресценцией за счет отдельных флуоресцирующих остатков, таких как триптофан, тирозин и фенилаланин. Флуоресцентное свойство этих белков изменяет свои спектральные характеристики при взаимодействии с пероксидом водорода. Как здесь используется, термин "GFP" относится к зеленому флуоресцентному белку из Aequorea victoria, включая варианты GFP, известные из уровня техники, сконструированные для обеспечения большей флюоресценции или флуоресценции в других цветовых областях. Последовательность дикого типа GFP была раскрыта в Prasher et al. (1992, Gene 111: 229-33). Как здесь используется, термин "выделенный" означает молекулу или клетку, которые находятся в среде, отличной от среды, в которой молекула или клетка находятся в естественных условиях. Как здесь используется, "скорость созревания" относится к скорости формирования зрелого флуоресцентного белка (то есть флуоресцентного белка, способного продуцировать флуоресценцию) после трансляции. Скорость созревания можно охарактеризовать полупериодом созревания. Было показано, что созревание флуоресцентного белка включает две стадии: (1) Фолдинг белка, что означает формирование белковых бета-слоев с центральной альфа-спиралью, содержащей аминокислоты, которые будут формировать хромофор. Эта стадия обычно характеризуется константой скорости примерно 10^(-2)s^(-1) или полупериодом от нескольких секунд до десятков секунд; (2) Созревание хромофора, когда белковая цепь подвергается циклизации и дегидротации. Эта стадия обычно характеризуется константой скорости примерно 10^(-4)s^(-1) или полупериодом длиной в несколько минут. Таким образом, эта более медленная стадия является лимитирующей в созревании зеленого флуоресцентного белка (Reid BG, Flynn GC. Biochemistry. 1997 V.36(22), PP.6786-6791).Various terms relating to the biological molecules of the present invention are used above and also in the description and in the claims. As used here, the term "fluorescent biosensor" means a protein that has the ability to fluorescence; for example, it may exhibit low, medium, or intense fluorescence when irradiated with light at a suitable wavelength for excitation. The fluorescent property of this protein is such a property, which is the result of the work of a chromophore formed by autocatalytic cyclization of two or more amino acid residues in a polypeptide chain. As such, the fluorescent biosensors of the present invention do not include proteins that exhibit fluorescence due to individual fluorescent residues such as tryptophan, tyrosine and phenylalanine. The fluorescent property of these proteins changes their spectral characteristics when interacting with hydrogen peroxide. As used here, the term "GFP" refers to a green fluorescent protein from Aequorea victoria, including GFP variants known in the art, designed to provide greater fluorescence or fluorescence in other color areas. The wild-type GFP sequence has been disclosed in Prasher et al. (1992, Gene 111: 229-33). As used here, the term "isolated" means a molecule or cell that is in an environment other than the environment in which the molecule or cell is in vivo. As used herein, “ripening rate” refers to the rate of formation of a mature fluorescent protein (i.e., a fluorescent protein capable of producing fluorescence) after translation. Ripening rate can be characterized by a half-period of maturation. It has been shown that maturation of a fluorescent protein involves two stages: (1) Protein folding, which means the formation of protein beta layers with a central alpha helix containing amino acids that will form the chromophore. This stage is usually characterized by a rate constant of about 10 ^(-2) s ^(-1) or a half-period from a few seconds to tens of seconds; (2) Maturation of the chromophore when the protein chain undergoes cyclization and dehydration. This stage is usually characterized by a rate constant of about 10 ^(-4) s ^(-1) or a half-period of several minutes in length. Thus, this slower stage is limiting in the maturation of green fluorescent protein (Reid BG, Flynn GC. Biochemistry. 1997 V.36 (22), PP.6786-6791).

Claims

1. The selected nucleic acid encoding a protein with activity of a fluorescent biosensor for the detection of hydrogen peroxide, having the amino acid sequence presented in the form of SEQ ID NO: 2.

2. An expression vector that contains the nucleic acid according to claim 1 under the control of regulatory elements necessary for expression of the nucleic acid in the host cell.

3. An E. coli cell producing a protein encoded by a nucleic acid according to claim 1, by introducing into it a nucleic acid according to claim 1, operably linked to a regulatory sequence.

4. The selected protein with the activity of a fluorescent biosensor for the detection of hydrogen peroxide, having the amino acid sequence presented in the form of SEQ ID NO: 2.