RU2431202C1

RU2431202C1 - Method of obtaining bilayer lipid membranes (blm)

Info

Publication number: RU2431202C1
Application number: RU2010113947/15A
Authority: RU
Inventors: Олег Вячеславович Батищев (RU); Олег Вячеславович Батищев; Андрей Владимирович Инденбом (RU); Андрей Владимирович Инденбом
Original assignee: Учреждение Российской академии наук Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН (ИФХЭ РАН)
Priority date: 2010-04-09
Filing date: 2010-04-09
Publication date: 2011-10-10

Abstract

FIELD: physics.

SUBSTANCE: two lipid monolayers are fed into holes in a partition which separates two half-cells filled with aqueous electrolyte solution, on the surface of which there is a lipid layer in an organic solvent. The partition used is coating glass with an amorphous surface obtained by treating glass with 3,3,3-trifluoropropyltrimethoxy silane.

EFFECT: use of the method enables to obtain BLM with high controlled tension, high capacitance and stability, which is a result of the absence of solvent microlenses in the membrane and absence of a meniscus around the membrane with excess lipid in the solvent.

Description

Изобретение относится к области биологии, в частности к методам создания искусственных систем для моделирования мембран биологических клеток, и может быть использовано для медико-биологических исследований и скрининга лекарственных препаратов.The invention relates to the field of biology, in particular to methods for creating artificial systems for modeling the membranes of biological cells, and can be used for biomedical research and drug screening.

Плоские бислойные липидные мембраны (БЛМ) являются давно известной удобной системой для моделирования клеточных мембран. Они позволяют изучать их электрохимические свойства, такие как распределение электрического потенциала, адсорбция ионов, строение двойного электрического слоя, влияние внешних электрических полей, ионный транспорт, а также процессы слияния, деления и т.п. [Tien H.T. Bilayer Lipid membranes (BLM): Theory and Practice. - New York: Marcel Dekker Inc. - 1974. - 655 p.].Flat bilayer lipid membranes (BLMs) have long been a known convenient system for modeling cell membranes. They allow one to study their electrochemical properties, such as the distribution of electric potential, ion adsorption, the structure of the double electric layer, the influence of external electric fields, ion transport, as well as the processes of fusion, fission, etc. [Tien H.T. Bilayer Lipid membranes (BLM): Theory and Practice. - New York: Marcel Dekker Inc. - 1974. - 655 p.].

Все известные на сегодняшний день методы получения БЛМ сводятся к двум основным: первый - нанесение на отверстие в тефлоновой перегородке капельки раствора липида в неполярном органическом растворителе (метод Мюллера-Рудина) [Mueller P., Rudin D.O., Tien H.Ti., Wescott W.С. Nature - 1962. - V.194. - P.979-980], второй - ведение двух монослоев на отверстии в тефлоновой перегородке, разделяющей две полуячейки (метод Монтала) [Takagi M., Azuma K., Kishimoto U. Annu. Rep. Biol. Works Fac. Sci. Osaka Univ. - 1965. - V.13. - P.107-110; Montal M., Mueller P. Proc. Nat. Acad. Sci. USA - 1972. - V.69. - P.3561-3566]. Однако оба эти метода имеют один значительный недостаток - наличие микролинз растворителя в центральной гидрофобной области мембраны и избытка раствора липида в окаймляющем мембрану мениске [White S.H., Petersen D.C., Simon S., Yafuso M. Biophys. J. - 1976. - V.16. - P.481-489; Chanturiya A.N. Биол. мембраны - 1996. - T.13. - C.216-221]. Присутствие растворителя в мениске приводит к неконтролируемому значению натяжения мембран, что затрудняет изучение ее механических параметров и может препятствовать встраиванию в них многих трансмембранных белков [Gennis R.B., Jonas A. Ann. Rev. Biophys. Bioen. - 1977. - V.6. - P.195-238]. Это послужило причиной поиска возможных путей минимизации количества растворителя в БЛМ. Так, существует целый ряд работ, в которых описаны различные модификации методик формирования мембран, подразумевающие использование высокомолекулярных растворителей, почти не образующих микролинз [White S.H. Biophys. J. - 1978. - V.23. - P.337-347], вымораживание растворителя из мениска [White S.H. Biochim. Biophys. Acta - 1974. - V.356. - P.8-17] или изменение экспериментальной системы [Vodyanoy V., Murphy R.B. Biochim. Biophys. Acta - 1982. - V.687. - P.189-194]. Однако каждая из этих модификаций вносит свои ограничения в применимость данной модельной системы и полностью не избавляет БЛМ от микролинз растворителя. Таким образом, получить удобную модель плоской липидной мембраны, не содержащей растворитель ни в мениске, ни в самом бислое, так и не удалось.All currently known methods for obtaining BLM are reduced to two main ones: the first is the application of a droplet of a solution of a lipid in a nonpolar organic solvent to the hole in the Teflon partition (Mueller-Rudin method) [Mueller P., Rudin DO, Tien H. Ti., Wescott W .FROM. Nature - 1962. - V.194. - P.979-980], the second - the maintenance of two monolayers at the hole in the Teflon partition separating the two half-cells (Montala method) [Takagi M., Azuma K., Kishimoto U. Annu. Rep. Biol. Works Fac. Sci. Osaka Univ. - 1965. - V.13. - P.107-110; Montal M., Mueller P. Proc. Nat. Acad. Sci. USA - 1972. - V.69. - P.3561-3566]. However, both of these methods have one significant drawback - the presence of solvent microlenses in the central hydrophobic region of the membrane and an excess of lipid solution in the meniscus bordering the membrane [White S.H., Petersen D.C., Simon S., Yafuso M. Biophys. J. - 1976. - V.16. - P. 481-489; Chanturiya A.N. Biol. membranes - 1996. - T.13. - C.216-221]. The presence of solvent in the meniscus leads to an uncontrolled value of the membrane tension, which complicates the study of its mechanical parameters and may prevent the incorporation of many transmembrane proteins into them [Gennis R. B., Jonas A. Ann. Rev. Biophys. Bioen - 1977. - V.6. - P.195-238]. This led to the search for possible ways to minimize the amount of solvent in the BLM. So, there are a number of works that describe various modifications of the methods of membrane formation, implying the use of high molecular weight solvents that almost do not form microlenses [White S.H. Biophys. J. - 1978. - V.23. - P.337-347], freezing out the solvent from the meniscus [White S.H. Biochim. Biophys. Acta - 1974. - V.356. - P.8-17] or a change in the experimental system [Vodyanoy V., Murphy R.B. Biochim. Biophys. Acta - 1982. - V.687. - P.189-194]. However, each of these modifications introduces limitations to the applicability of this model system and does not completely eliminate BLM from solvent microlenses. Thus, it was not possible to obtain a convenient model of a flat lipid membrane that does not contain a solvent in the meniscus or in the bilayer itself.

Известен способ [Takagi M., Azuma K., Kishimoto U. Annu. Rep. Biol. Works Fac. Sci. Osaka Univ. - 1965. - V.13. - P.107-110; Montal M., Mueller P. Proc. Nat. Acad. Sci. USA - 1972. - V.69. - P.3561-3566] (прототип) получения плоских БЛМ, осуществляющийся следующим образом. Две тефлоновые полуячейки, содержащие водный раствор электролита, разделены тефлоновой перегородкой с отверстием 0,1-1,0 мм в диаметре. На поверхность водного раствора в ячейках добавляют раствор липида в летучем органическом растворителе (пентан или гексан). После испарения растворителя уровни жидкости в полуячейках, первоначально находившиеся ниже отверстия, поочередно поднимают вверх. В результате алкильные цепи липидных молекул противоположных монослоев приходят в контакт на отверстии в перегородке, формируя липидный бислой.The known method [Takagi M., Azuma K., Kishimoto U. Annu. Rep. Biol. Works Fac. Sci. Osaka Univ. - 1965. - V.13. - P.107-110; Montal M., Mueller P. Proc. Nat. Acad. Sci. USA - 1972. - V.69. - P.3561-3566] (prototype) obtaining flat BLM, as follows. Two Teflon half cells containing an aqueous electrolyte solution are separated by a Teflon partition with an opening of 0.1-1.0 mm in diameter. A solution of a lipid in a volatile organic solvent (pentane or hexane) is added to the surface of the aqueous solution in the cells. After evaporation of the solvent, the liquid levels in the half-cells, initially located below the opening, are successively raised upward. As a result, the alkyl chains of lipid molecules of opposite monolayers come into contact at the hole in the septum, forming a lipid bilayer.

Электрическая емкость таких БЛМ имеет величину не выше 0,7 мкФ/см², что является результатом присутствия неполярного растворителя в теле мембраны, а натяжение составляет 1-2 мН/м и определяется окружающим их мениском с растворителем.The electric capacitance of such BLM has a value of no higher than 0.7 μF / cm ² , which is the result of the presence of a non-polar solvent in the body of the membrane, and the tension is 1-2 mN / m and is determined by the surrounding meniscus with the solvent.

Таким образом, недостатками прототипа являются низкое значение натяжения мембраны и невозможность получения БЛМ с фиксированным значением натяжения, нестабильность БЛМ из-за использования в качестве перегородки мягких полимерных пленок, что не позволяет проводить экспериментальные манипуляции с пленками. В результате всего этого исключается возможность получения мембран с наперед заданными свойствами, и, следовательно, затрудняется изучение ее механических параметров, исследование влияния на них молекулярной геометрии липидов, состава водных растворов, электрического поля и т.д., а также служит препятствием для встраивания в БЛМ многих трансмембранных белков.Thus, the disadvantages of the prototype are the low value of the membrane tension and the impossibility of obtaining BLM with a fixed tension value, the instability of the BLM due to the use of soft polymer films as a partition, which does not allow experimental manipulations with the films. As a result of all this, the possibility of obtaining membranes with predetermined properties is excluded, and, therefore, it is difficult to study its mechanical parameters, study the influence on them of the molecular geometry of lipids, the composition of aqueous solutions, electric field, etc., and also serves as an obstacle to incorporation into BLM of many transmembrane proteins.

Цель изобретения - получение БЛМ, обладающих высоким контролируемым значением натяжения, высокой электрической емкостью, стабильностью, а также упрощение способа получения БЛМ. Благодаря достижению этой цели облегчается изучение механических параметров БЛМ, встраивание в них трансмембранных белков, а следовательно, расширяются возможности использования мембран для решения целого ряда исследовательских задач и автоматизации процесса получения мембран.The purpose of the invention is to obtain BLM with a high controlled value of tension, high electrical capacity, stability, as well as simplifying the method of obtaining BLM. The achievement of this goal facilitates the study of the mechanical parameters of BLM, the incorporation of transmembrane proteins into them, and, therefore, the possibilities of using membranes to solve a number of research problems and automate the process of obtaining membranes are expanded.

Цель достигается тем, что в качестве основы для формирования БЛМ используют тонкую стеклянную пластинку с амфифобной поверхностью, что достигается путем фторсиликонизации стекла, т.е. обработкой его поверхности 3,3,3-трифторпропилтриметоксисиланом.The goal is achieved in that a thin glass plate with an amphiphobic surface is used as the basis for the formation of BLM, which is achieved by glass fluorosiliconization, i.e. surface treatment with 3,3,3-trifluoropropyltrimethoxysilane.

Неожиданность решения задачи получения БЛМ, не содержащих растворитель, обусловлена прежде всего выбором необычного материала для получения перегородок, на отверстиях в которых и формируются мембраны. Ранее для этих целей использовались только неполярные полимерные материалы, преимущественно тефлон. Его выбор обусловлен высокой химической стойкостью и гидрофобностью. Однако в присутствии амфифильных молекул липидов поверхность тефлона становится смачиваемой водой. Модифицировать поверхность полимеров для улучшения их свойств весьма проблематично. Оригинальным решением этой проблемы является использование стеклянных пластинок для создания перегородок. Стекло позволяет легко модифицировать свою поверхность, меняя гидрофобно-липофобные свойства в широком диапазоне путем создания химически привитого слоя различных молекул. Кроме того, стекло обладает высокой твердостью по сравнению с полимерами, что повышает стабильность получаемых мембран.The unexpectedness of the solution to the problem of obtaining solvent-free BLM is primarily due to the choice of an unusual material for obtaining partitions, on the holes in which membranes are formed. Previously, only non-polar polymeric materials, mainly Teflon, were used for these purposes. His choice is due to the high chemical resistance and hydrophobicity. However, in the presence of amphiphilic lipid molecules, the teflon surface becomes wettable by water. Modifying the surface of polymers to improve their properties is very problematic. An original solution to this problem is to use glass plates to create partitions. Glass allows you to easily modify its surface, changing the hydrophobic-lipophobic properties in a wide range by creating a chemically grafted layer of various molecules. In addition, glass has a high hardness compared to polymers, which increases the stability of the resulting membranes.

Второй важной оригинальной идеей, позволившей решить поставленную задачу получения мембран, не содержащих растворитель, является создание на поверхности стекол покрытий, обладающих не только гидрофобными, но и липофобными свойствами. Тем самым удалось препятствовать адсорбции на поверхности амфифильных молекул липидов, что позволило сохранить свойство несмачиваемости поверхности водой и в их присутствии, т.е. краевой угол смачивания оставался выше 90 градусов.The second important original idea, which allowed us to solve the problem of obtaining solvent-free membranes, is to create coatings on the glass surface that have not only hydrophobic, but also lipophobic properties. Thus, it was possible to prevent the adsorption on the surface of amphiphilic lipid molecules, which made it possible to preserve the surface non-wettability property in water and in their presence, i.e. the wetting angle remained above 90 degrees.

Согласно уравнению Юнга краевой угол капли θ определяется равновесием трех сил на границах раздела твердое тело-воздух (γ_тв-в), твердое тело-жидкость (γ_тв-ж) и жидкость-воздух (γ_ж-в):According to the Young's equation droplet contact angle θ determined by the balance of three forces at the interfaces solid-air _{(γ-TV in)} solid-liquid (γ _tv-f) and the liquid-to-air (γ _w-c):

Две первые из упомянутых сил направлены вдоль поверхности, а последняя - под наклоном по касательной к поверхности капли. Согласно приведенному уравнению в балансе всех трех сил γ_ж-в участвует в виде своей горизонтальной проекции. Изменение какой-либо из этих сил, т.е. межфазного натяжения на соответствующей границе, должно приводить к изменению краевого угла смачивания. При наличии на поверхности капли монослоя липида величина γ_ж-в будет соответствовать поверхностному натяжению липидного монослоя, а γ_тв-в и γ_тв-ж определяются адсорбцией молекул липида на гидрофобной поверхности. Амфифобизация поверхности приводит к значительному снижению адсорбции на ней различных веществ, в частности липидов, соответственно величины γ_тв-ж и γ_тв-в в присутствии липидов на такой поверхности не будут заметно меняться. Однако молекулы липидов, в силу своей амфифильной природы адсорбируясь на поверхности воды, неизбежно понижают ее поверхностное натяжение (величину γ_ж-в). В результате должен меняться баланс трех сил, определяющих краевой угол смачивания. Но если исходная его величина близка к 90°, сила γ_ж-в в области края капли направлена вертикально и при уменьшении никак не скажется на балансе сил, а соответственно и на самом краевом угле. Именно поэтому для формирования БЛМ, не содержащих растворитель, необходимо выполнение двух условий: 1) амфифобная поверхность, 2) краевой угол смачивания ее чистой водой не ниже 90°.The first two of the mentioned forces are directed along the surface, and the last is tilted obliquely to the surface of the drop. According to the above equation, in the balance of all three forces γ _g- v participates in the form of its horizontal projection. A change in any of these forces, i.e. interfacial tension at the corresponding boundary should lead to a change in the wetting angle. If there is a lipid monolayer on the droplet surface, the γ _g-in value will correspond to the surface tension of the lipid monolayer, and γ _t-in and γ _{t-g are} determined by the adsorption of lipid molecules on the hydrophobic surface. Amphiphobization of the surface leads to a significant decrease in the adsorption of various substances, in particular lipids, on it, respectively, the values of γ _solid and γ _solid in the presence of lipids on such a surface will not noticeably change. However, lipid molecules, by virtue of their amphiphilic nature, are adsorbed on the surface of the water and inevitably lower its surface tension (γ _g-c ). As a result, the balance of the three forces determining the contact angle should change. But if its initial value is close to 90 °, the force γ _w-in the region of the edge of the droplet is directed vertically and, with a decrease, will not affect the balance of forces, and, accordingly, the edge angle itself. That is why for the formation of solvent-free BLMs, two conditions must be met: 1) an amphiphobic surface, 2) the contact angle of wetting it with clean water is not lower than 90 °.

Способ осуществляется следующим образом: перегородки для формирования БЛМ изготовляют из покровных стекол толщиной около 100 мкм, в которых путем химического травления в плавиковой кислоте получают круглые отверстия диаметром 150-400 мкм. Для очистки и активации поверхности стекла применяется метод обработки плазмой водяных паров [Krishnamurthy V., Kamel I.H. J. Mater. Sci. - 1989. - V.24. - P.3345-3352]. Обработка покровных стекол плазмой водяных паров производится в течение 30-40 минут непосредственно перед дальнейшей химической модификацией (фторсиликонизацией).The method is as follows: the partitions for the formation of BLM are made from coverslips with a thickness of about 100 microns, in which round holes with a diameter of 150-400 microns are obtained by chemical etching in hydrofluoric acid. To clean and activate the surface of the glass, the method of plasma treatment of water vapor is used [Krishnamurthy V., Kamel I.H. J. Mater. Sci. - 1989. - V.24. - P.3345-3352]. Processing the coverslips with water vapor plasma is carried out for 30-40 minutes immediately before further chemical modification (fluorosiliconization).

Фторсиликонизация осуществляется путем обработки стекол 2% раствором (по объему) 3,3,3-трифторпропилтриметоксисилана в толуоле. После этого стеклянные образцы троекратно промываются толуолом для удаления остатков фторсилоксана, не связавшихся с поверхностью, и прогреваются в сушильном шкафу в течение 30 минут при температуре 120 градусов Цельсия. При такой обработке поверхность стекла приобретает амфифобные свойства, т.е. становится как гидрофобной, так и липофобной. В результате такой обработки краевые углы смачивания поверхности стекол как водой, так и октаном становятся близкими к 90°.Fluorosiliconization is carried out by treating the glasses with a 2% solution (by volume) of 3,3,3-trifluoropropyltrimethoxysilane in toluene. After that, the glass samples are washed three times with toluene to remove residual fluorosiloxane that did not bind to the surface, and are heated in an oven for 30 minutes at a temperature of 120 degrees Celsius. With this treatment, the glass surface acquires amphiphobic properties, i.e. becomes both hydrophobic and lipophobic. As a result of this treatment, the wetting angles of the glass surface with both water and octane become close to 90 °.

Бислойные липидные мембраны, не содержащие растворитель, формируют методом сведения двух монослоев [Takagi M., Azuma K., Kishimoto U. Annu. Rep. Biol. Works Fac. Sci. Osaka Univ. - 1965. - V.13. - P.107-110; Montal M., Mueller P. Proc. Nat. Acad. Sci. USA - 1972. - V.69. - P.3561-3566] в ячейке, разделенной на два отсека (полуячейки), амфифобизированным покровным стеклом с отверстием. Полуячейки наполняют 0,1 М раствором KCl в дважды дистиллированной воде так, чтобы уровень жидкости находился немного ниже отверстия в стеклянной перегородке. Для образования монослоя липида на поверхность воды в каждую полуячейку наносится необходимое количество раствора дифитаноилфосфатидилхолина (ДФФХ) в гексане концентрацией 1 г/л. Монослои сводят путем поочередного поднятия уровней жидкости в полуячейках выше отверстия через 15 мин после нанесения раствора липида. Это время необходимо для достижения полного испарения растворителя и растекания липида. При этом скорость поднятия уровня жидкости в полуячейках не должна превышать 0,1 мм/с. Подъем уровня во второй полуячейке останавливают около нижней кромки отверстия для спонтанного формирования БЛМ. Сформированная таким образом мембрана имеет удельную емкость 0,86 мкФ/см², что свидетельствует об отсутствии неполярного растворителя в теле мембраны. Полученная величина хорошо согласуется с рассчитанной емкостью плоского конденсатора, заполненного средой с диэлектрисеской проницаемостью, равной 2, и толщиной, соответствующей длине двух углеводородных радикалов использованного липида (ДФФХ), определяющих толщину неполярной области мембраны. Методом выдувания мембраны под действием перепада гидростатического давления было измерено натяжение полученной мембраны. Оно составило 4,3 мН/м, тогда как натяжение мембраны, полученной известным методом, составляет 1-2 мН/м.Solvent-free bilayer lipid membranes are formed by mixing two monolayers [Takagi M., Azuma K., Kishimoto U. Annu. Rep. Biol. Works Fac. Sci. Osaka Univ. - 1965. - V.13. - P.107-110; Montal M., Mueller P. Proc. Nat. Acad. Sci. USA - 1972. - V.69. - P.3561-3566] in a cell divided into two compartments (half-cells) with an amphiphobized coverslip with a hole. Half-cells are filled with a 0.1 M KCl solution in twice distilled water so that the liquid level is slightly below the hole in the glass partition. To form a lipid monolayer, the required amount of a solution of diphanyanphosphatidylcholine (DPPC) in hexane with a concentration of 1 g / l is applied to the water surface in each half-cell. Monolayers are reduced by alternately raising the liquid levels in half cells above the hole 15 minutes after applying the lipid solution. This time is necessary to achieve complete evaporation of the solvent and the spreading of the lipid. At the same time, the rate of liquid level rise in half cells should not exceed 0.1 mm / s. The level rise in the second half-cell is stopped near the lower edge of the hole for the spontaneous formation of BLM. The membrane thus formed has a specific capacity of 0.86 μF / cm ² , which indicates the absence of a non-polar solvent in the body of the membrane. The obtained value is in good agreement with the calculated capacity of a flat capacitor filled with a medium with a dielectric constant of 2 and a thickness corresponding to the length of two hydrocarbon radicals of the used lipid (DPPC), which determine the thickness of the non-polar region of the membrane. By blowing the membrane under the influence of a hydrostatic pressure drop, the tension of the obtained membrane was measured. It amounted to 4.3 mN / m, while the tension of the membrane obtained by the known method is 1-2 mN / m.

Таким образом, получаемые предложенным нами способом БЛМ позволяют исследовать процесс слияния липидных бислоев без паразитного вклада, создаваемого микролинзами растворителя; отсутствие мениска с избытком липида в растворителе позволяет исследовать влияние молекулярной геометрии липидов, состава водного раствора, электрического поля и др. на механические параметры мембран; использование твердого неорганического материала для перегородок с отверстием повышают стабильность получаемых мембран по сравнению с мембранами на перегородках из мягких полимерных пленок (тефлон, полиэтилен и др.).Thus, the BLM obtained by our proposed method allows us to study the process of fusion of lipid bilayers without the parasitic contribution created by solvent microlenses; the absence of a meniscus with an excess of lipid in the solvent allows us to study the effect of the molecular geometry of lipids, the composition of the aqueous solution, electric field, etc. on the mechanical parameters of the membranes; the use of solid inorganic material for partitions with a hole increases the stability of the resulting membranes compared to membranes on partitions made of soft polymer films (Teflon, polyethylene, etc.).

Предложенный способ формирования мембран прост, т.к. не требуется предварительная обработка кромок отверстия липидным раствором или высокомолекулярными углеводородами [Takagi M., Azuma K., Kishimoto U. Annu. Rep. Biol. Works Fac. Sci. Osaka Univ. - 1965. - V.13. - P.107-110; Montal M., Mueller P. Proc. Nat. Acad. Sci. USA - 1972. - V.69. - P.3561-3566], что делает возможным его автоматизацию для создания установок по скринингу биологически активных веществ и лекарственных препаратов.The proposed method of forming membranes is simple, because no pretreatment of the hole edges with a lipid solution or high molecular weight hydrocarbons is required [Takagi M., Azuma K., Kishimoto U. Annu. Rep. Biol. Works Fac. Sci. Osaka Univ. - 1965. - V.13. - P.107-110; Montal M., Mueller P. Proc. Nat. Acad. Sci. USA - 1972. - V.69. - P.3561-3566], which makes it possible to automate it to create installations for screening biologically active substances and drugs.

Claims

A method for producing bilayer lipid membranes (BLM), including processing glass coverslips 100 microns thick with hydrofluoric acid and water vapor plasma to obtain holes with a diameter of 150-400 microns, processing with a 2% solution (by volume) of 3,3,3-trifluoropropyltrimethoxysilane in toluene , heating in an oven for 30 minutes at a temperature of 120 ° C; Further, the formation of lipid membranes is carried out in a cell divided into two compartments with an amphiphobized coverslip with an aperture by filling with a 0.1 M KCl solution in twice distilled water so that the liquid level is slightly lower than the aperture in the glass partition, applying the required amount of diphitanoylphosphatidylcholine solution to the water surface (DPPC) in hexane with a concentration of 1 g / l in each half-cell, mixing monolayers by alternately raising the liquid levels in the half-cells above the hole through 15 mi after applying the lipid solution, wherein the rate of raising the liquid level in the half-cell should not exceed 0.1 mm / s, raising the level in the second half-cell is stopped near the opening to the bottom edge of the spontaneous formation of BLM.