RU2427624C1 - Method of lactic bacteria freezing - Google Patents
Method of lactic bacteria freezing Download PDFInfo
- Publication number
- RU2427624C1 RU2427624C1 RU2010120515/10A RU2010120515A RU2427624C1 RU 2427624 C1 RU2427624 C1 RU 2427624C1 RU 2010120515/10 A RU2010120515/10 A RU 2010120515/10A RU 2010120515 A RU2010120515 A RU 2010120515A RU 2427624 C1 RU2427624 C1 RU 2427624C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- freezing
- lactic acid
- gelatin
- acid bacteria
- liquid nitrogen
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам замораживания молочнокислых бактерий.The invention relates to the field of biotechnology, in particular to methods for freezing lactic acid bacteria.
Любая практическая область применения микроорганизмов нуждается в стабильных, долгоживущих, максимально специализированных и экологически безопасных культурах этих микроорганизмов. В настоящее время в России производятся лиофилизированные закваски и бактериальные концентраты. Их применение в производстве кисломолочных продуктов требует восстановление активности клеток; при непосредственном внесении в смесь для сквашивания увеличивается время сквашивания, что нерентабельно для производителя.Any practical field of application of microorganisms needs stable, long-lived, highly specialized and environmentally friendly cultures of these microorganisms. Currently, lyophilized starter cultures and bacterial concentrates are produced in Russia. Their use in the production of dairy products requires the restoration of cell activity; when directly added to the fermentation mixture, the fermentation time increases, which is unprofitable for the manufacturer.
В настоящее время широко используются закваски прямого внесения (ЗПВ), они вносятся непосредственно в смесь для сквашивания и не нуждаются в активации. ЗПВ, реализуемые в стране, имеют исключительно зарубежное происхождение. Вместе с тем, сведения об использовании методов криозамораживания бактерий для длительного сохранения носят ограниченный характер.At present, direct application starter cultures (LES) are widely used; they are introduced directly into the fermentation mixture and do not need to be activated. EPZs sold in the country are exclusively of foreign origin. At the same time, information on the use of cryo-freezing methods of bacteria for long-term preservation is limited.
На практике используют эмпирические подходы для подбора режимов замораживания конкретных объектов, так как выживаемость и стойкость микроорганизмов при замораживании в среде жидкого азота зависит от ряда факторов. Например: вид клеток и их концентрация в суспензии (чувствительность бактерий к замораживанию и оттаиванию сильно варьирует в зависимости от их принадлежности к тому или иному виду. Немаловажное значение имеют физико-химический свойства, количественное содержание бактерий и ряд других свойств микробной биомассы, подлежащей замораживанию); состав защитной среды для криозамораживания (для сохранения микроорганизмов при замораживании существенным является выбор защитной среды, природы и химического строения присутствующего в ней криопротектора и физико-химических особенностей его взаимодействия с компонентами жидкой и твердой фаз клетки); режим охлаждения (при замораживании происходит образование микрокристаллов льда внутри и снаружи клеток. Характер этих изменений зависит от свойств продукта и криопротектора, но главным образом, от скорости охлаждения. При медленном охлаждении происходит образование внеклеточного льда, приводящее к обезвоживанию клетки до того, как будет достигнута точка замерзания цитоплазмы. При быстром охлаждении клетки быстрее замораживаются изнутри, медленнее обезвоживаются, что приводит к образованию кристаллов льда внутри клетки. Наилучший эффект достигается обычно при замораживании в среде жидкого азота при температуре - 196°С. Одним из преимуществ быстрого охлаждения является то, что в этих условиях действие концентрированных солевых растворов после выделения льда занимает менее продолжительный период до достижения их эвтектической точки); режим хранения (при температуре - 40°С хранение замороженных микроорганизмов оказывается весьма успешным. Лучшие результаты достигаются при хранении при температуре от -80 до -100°С в сжиженных парах азота или в жидком азоте при температуре - 196°С).In practice, empirical approaches are used to select the freezing regimes for specific objects, since the survival and resistance of microorganisms during freezing in liquid nitrogen depends on a number of factors. For example: the type of cells and their concentration in suspension (the sensitivity of bacteria to freezing and thawing varies greatly depending on their belonging to a particular species. Physicochemical properties, the quantitative content of bacteria and a number of other properties of the microbial biomass to be frozen are of no small importance) ; the composition of the protective environment for cryo-freezing (to preserve microorganisms during freezing, it is essential to choose a protective environment, the nature and chemical structure of the cryoprotectant present in it and the physicochemical features of its interaction with the components of the liquid and solid phases of the cell); cooling mode (during freezing, microcrystals of ice are formed inside and outside the cells. The nature of these changes depends on the properties of the product and cryoprotectant, but mainly on the cooling rate. During slow cooling, the formation of extracellular ice occurs, leading to dehydration of the cell before it is reached the freezing point of the cytoplasm. With rapid cooling, the cells freeze faster inside, slower dehydration, which leads to the formation of ice crystals inside the cell. fect is usually achieved by freezing in liquid nitrogen at - 196 ° C. One of the advantages of rapid cooling is that in these conditions the action of concentrated salt solutions after separation of the ice takes a shorter period to reach their eutectic point).; storage mode (storage of frozen microorganisms is very successful at a temperature of -40 ° C. The best results are achieved when stored at -80 to -100 ° C in liquefied nitrogen vapor or in liquid nitrogen at a temperature of -196 ° C).
Криопротекторы - вещества, способные предотвращать развитие повреждений биологических объектов при охлаждении, замораживании и последующем отогреве. Механизм защитного действия криопротекторов основан, главным образом, на их способности создавать более прочные связи с молекулами воды, чем связи молекул воды между собой, что препятствует формированию правильной кристаллической решетки льда и задерживает начало роста кристаллов. Криопротекторы могут оказывать на клетки токсическое действие, величина которого зависит от температуры и длительности экспозиции клеток с криопротектором. Поэтому, как правило, сразу после оттаивания удаляют криопротектор из клеток и среды путем последовательных отмываний и центрифугирования. При создании защитных сред для производства бактериальных концентратов, используемых в пищевой промышленности, в качестве криозащитных веществ должны применяться соединения, имеющие статус пищевых.Cryoprotectants are substances that can prevent the development of damage to biological objects during cooling, freezing and subsequent heating. The mechanism of the protective action of cryoprotectants is mainly based on their ability to create stronger bonds with water molecules than bonds between water molecules, which prevents the formation of a regular ice crystal lattice and delays the onset of crystal growth. Cryoprotectors can have a toxic effect on cells, the magnitude of which depends on the temperature and duration of exposure of cells with a cryoprotectant. Therefore, as a rule, immediately after thawing, the cryoprotectant is removed from the cells and the medium by successive laundering and centrifugation. When creating protective environments for the production of bacterial concentrates used in the food industry, compounds having food status should be used as cryoprotective substances.
Известен способ замораживания бактерий в гранулах, для этого готовят стерильный 10%-ный раствор желатины на 0,86% NaCl. Суспензию микробных клеток смешивают с расплавленным 10%-ным раствором желатины в отношении 1:1. Присутствие желатины в растворе позволяет формировать при замораживании желатиновые шарики с достаточным количеством клеток. Через подготовленный таким образом раствор с клетками продувают азот для создания анаэробных условий. Далее при помощи дозатора суспензию клеток раскапывают по 50 и/или 100 мкл на охлажденную в парах жидкого азота фторопластовую пластину. Замороженные гранулы "сбрасывают" в жидкий азот, собирают в находящиеся в азоте промаркированные пластиковые пробирки с завинчивающимися крышками и переносят на хранение в сосуды Дьюара с жидким азотом (криохранилище) (см. патент РФ №2123044).A known method of freezing bacteria in granules, for this prepare a sterile 10% solution of gelatin on 0.86% NaCl. A suspension of microbial cells is mixed with a molten 10% solution of gelatin in a ratio of 1: 1. The presence of gelatin in the solution allows the formation of gelatin balls with a sufficient number of cells during freezing. Nitrogen is purged through the cell solution prepared in this way to create anaerobic conditions. Next, using a dispenser, a suspension of cells is instilled into 50 and / or 100 μl onto a fluoroplastic plate cooled in liquid nitrogen vapor. Frozen granules are "dumped" into liquid nitrogen, collected in labeled plastic tubes with screw caps in nitrogen and transferred to storage in Dewar vessels with liquid nitrogen (cryostorage) (see RF patent No. 2123044).
Недостатком данного способа является то, что предусмотрено хранение в среде жидкого азота, а это требует наличие криохранилищ, и не применимо при производстве бактериальных концентратов.The disadvantage of this method is that it provides for storage in liquid nitrogen, and this requires cryostorages, and is not applicable in the production of bacterial concentrates.
Наиболее близким к заявленному по совокупности существенных признаков является способ замораживания бактерий, предусматривающий отделение бактерий центрифугированием, смешивание суспензии бактерий с защитной средой в соотношении 1:1, содержащей глицерин, сахарозу, лимоннокислый натрий, замораживание полученной смеси в жидком азоте в виде гранул. Бактериальный концентрат, полученный этим способом, сохраняет свою активность в течение 6 месяцев при температуре не выше -18°С (см. авторское свидетельство СССР №457727).Closest to the claimed combination of essential features is a method of freezing bacteria, which involves the separation of bacteria by centrifugation, mixing a suspension of bacteria with a protective medium in a 1: 1 ratio containing glycerin, sucrose, sodium citrate, and freezing the resulting mixture in liquid nitrogen in the form of granules. The bacterial concentrate obtained in this way retains its activity for 6 months at a temperature of no higher than -18 ° C (see USSR author's certificate No. 457727).
Недостаток этого изобретения заключается в том, что происходит слипание гранул в процессе хранения.The disadvantage of this invention is that the adhesion of the granules during storage occurs.
Задачей изобретения является создание способа замораживания молочнокислых бактерий, обеспечивающего исключение слипания гранул молочнокислых бактерий.The objective of the invention is to provide a method for freezing lactic acid bacteria, ensuring the exclusion of adhesion of granules of lactic acid bacteria.
Поставленная задача достигается путем создания способа замораживания молочнокислых бактерий, предусматривающего смешивание в соотношении 1:1 молочнокислых бактерий с защитной средой, содержащей глицерин и лимоннокислый натрий, замораживание полученной смеси в жидком азоте в виде гранул, отличием которого согласно изобретению является то, что защитную среду готовят на основе фосфатного буфера с рН 7,2, дополнительно вводят в нее лактозу и желатин, при следующем соотношении компонентов мас.%:The problem is achieved by creating a method of freezing lactic acid bacteria, providing for mixing in a 1: 1 ratio of lactic acid bacteria with a protective medium containing glycerin and sodium citrate, freezing the resulting mixture in liquid nitrogen in the form of granules, the difference of which according to the invention is that the protective medium is prepared based on a phosphate buffer with a pH of 7.2, lactose and gelatin are additionally introduced into it, in the following ratio of components wt.%:
Целесообразно, чтобы после смешивания молочнокислых бактерий с защитной средой полученную смесь выдерживали при температуре от 17 до 27°С в течение 15-20 минут, затем еще раз перемешивали и подавали на замораживание.It is advisable that after mixing the lactic acid bacteria with a protective medium, the resulting mixture was kept at a temperature of 17 to 27 ° C for 15-20 minutes, then it was mixed again and served for freezing.
При реализации заявленного способа достигается технический результат, заключающийся в улучшении реологических свойств бактериального концентрата и повышении его стойкости при хранении за счет внесения дополнительных компонентов, в частности желатина, выдержки после смешивания биомассы с защитной средой, для взаимодействия проникающего криопротектора (глицерин) с микробной клеткой, а также определение оптимальных соотношений компонентов защитной среды.When implementing the claimed method, a technical result is achieved, which consists in improving the rheological properties of the bacterial concentrate and increasing its storage stability due to the addition of additional components, in particular gelatin, exposure after mixing the biomass with a protective medium, for the interaction of the penetrating cryoprotectant (glycerin) with a microbial cell, as well as determining the optimal proportions of components of the protective environment.
Заявленный способ осуществляют следующим образом.The claimed method is as follows.
Получают суспензию молочнокислых бактерий. Для этого молочнокислые бактерии, после центрифугирования смешивают с защитной средой, которая основана на фосфатном буфере с рН 7,2 с добавлением глицерина (в %) 15-20, лактозы 10-40, лимоннокислого натрия 1-10, желатина 1-10, при этом биомассу с защитной средой смешивают в соотношении 1:1, выдерживают, затем перемешивают и подают на замораживание в жидком азоте в виде гранул. Замораживание длится не более одного часа.A suspension of lactic acid bacteria is obtained. For this, lactic acid bacteria, after centrifugation, are mixed with a protective medium, which is based on phosphate buffer with a pH of 7.2 with the addition of glycerol (in%) 15-20, lactose 10-40, sodium citrate 1-10, gelatin 1-10, with this biomass with a protective environment is mixed in a ratio of 1: 1, kept, then mixed and served for freezing in liquid nitrogen in the form of granules. Freezing lasts no more than one hour.
Полученную биомассу после смешивания с защитной средой целесообразно выдерживать в течение 15-20 минут при температуре от 17 до 27°С, затем еще раз перемешивают и замораживают в виде гранул в жидком азоте в течении 30 минут. После чего расфасовывают в полистирольные стаканчики и хранят при температуре -40°С, но не выше -18°С.The resulting biomass after mixing with a protective environment, it is advisable to withstand for 15-20 minutes at a temperature of from 17 to 27 ° C, then mix again and freeze in the form of granules in liquid nitrogen for 30 minutes. Then packaged in polystyrene cups and stored at a temperature of -40 ° C, but not higher than -18 ° C.
Использование в качестве криопротекторов глицерина, лактозы, лимоннокислого натрия в предложенном соотношении обеспечивает наиболее полное сохранение микроорганизмов. Внесение желатина предотвращает слипание гранул в процессе хранения. Предложенные криопротекторы нетоксичны для организма человека и разрешены к применению, поэтому не требуется процедура удаления криопротектора из клеток и среды путем последовательных отмываний и центрифугирования. Полученные результаты свидетельствуют, что описанный метод криозамораживания молочнокислых бактерий в среде жидкого азота и при последующем хранении при температуре -40°С, но не выше -18°С, позволяет сохранять жизнеспособность микроорганизмов в полученном бактериальном концентрате молочнокислых бактерий и обеспечить его стабильность в хранении.The use of glycerol, lactose, sodium citrate as cryoprotectants in the proposed ratio provides the most complete conservation of microorganisms. The introduction of gelatin prevents the adhesion of the granules during storage. The proposed cryoprotectants are non-toxic to the human body and are approved for use, therefore, the procedure for removing the cryoprotectant from cells and the medium by successive washing and centrifugation is not required. The results obtained indicate that the described method of cryo-freezing lactic acid bacteria in liquid nitrogen and subsequent storage at a temperature of -40 ° C, but not higher than -18 ° C, allows you to maintain the viability of microorganisms in the resulting bacterial concentrate of lactic acid bacteria and ensure its storage stability.
Пример 1. Для получения 1000 см3 защитной среды берут 400 см3 фосфатного буфера, растворяют в нем 350 грамм лактозы смешанной с 5 граммами желатина, 5 грамм лимоннокислого натрия, добавляют 150 см3 глицерина, доводят до метки фосфатным буфером. Полученную после центрифугирования биомассу смешивают с защитной средой в соотношении 1:1, выдерживают 15-20 минут при температуре от 17 до 27°С, затем еще раз перемешивают и замораживают в виде гранул в жидком азоте в течении 30 минут. После чего расфасовывают в полистирольные стаканчики по 160±5 грамм (доза внесения на 1 тонну сквашиваемой смеси), после чего хранят при температуре -40°С, но не выше -18°С. Замороженный концентрат содержит 300-500 млрд КОЕ/см3. При хранении замороженного концентрата в течение 6 месяцев при температуре -40°С, но не выше -18°С, количество клеток было в пределах 270-470 млрд КОЕ/см3, гранулы не слиплись и поэтому оставались в виде отдельных гранул весь срок хранения.Example 1. To obtain 1000 cm 3 of a protective medium, 400 cm 3 of phosphate buffer are taken, 350 grams of lactose mixed with 5 grams of gelatin, 5 grams of sodium citrate are dissolved in it, 150 cm 3 of glycerol are added, adjusted to the mark with phosphate buffer. The biomass obtained after centrifugation is mixed with a protective medium in a 1: 1 ratio, incubated for 15-20 minutes at a temperature of 17 to 27 ° C, then mixed again and frozen in the form of granules in liquid nitrogen for 30 minutes. Then, 160 ± 5 grams are packaged in polystyrene cups (dose per 1 ton of fermented mixture), and then stored at a temperature of -40 ° C, but not higher than -18 ° C. Frozen concentrate contains 300-500 billion CFU / cm 3 . When storing the frozen concentrate for 6 months at a temperature of -40 ° C, but not higher than -18 ° C, the number of cells was in the range of 270-470 billion CFU / cm 3 , the granules did not stick together and therefore remained as separate granules for the entire storage period .
Пример 2. Для получения защитной среды смешивают 20% лактозы, 10% водного раствора желатина, 5% лимоннокислого натрия, и 20% глицерина, доводят до 100% фосфатным буфером, приготовленном на основе однозамещенного фосфорнокислого калия с рН 7,2. Полученную после центрифугирования биомассу смешивают с защитной средой в соотношении 1:1, выдерживают 15-20 минут при температуре от 17 до 27°С, затем еще раз перемешивают и замораживают в виде гранул в жидком азоте в течение 30 минут. После чего расфасовывают в полистирольные стаканчики по 160±5 грамм (доза внесения на 1 тонну сквашиваемой смеси) и хранят при температуре -40°С. Замороженный концентрат содержит 300-500 млрд КОЕ/см3. При хранении замороженного концентрата в течение 6 месяцев при температуре -40°С количество клеток было в пределах 270-470 млрд КОЕ/см3, гранулы не слиплись и поэтому оставались в виде отдельных гранул весь срок хранения.Example 2. To obtain a protective environment, 20% of lactose, 10% aqueous solution of gelatin, 5% sodium citrate, and 20% glycerol are mixed, adjusted to 100% phosphate buffer, prepared on the basis of monosubstituted potassium phosphate with a pH of 7.2. The biomass obtained after centrifugation is mixed with a protective medium in a 1: 1 ratio, kept for 15-20 minutes at a temperature of 17 to 27 ° C, then mixed again and frozen in the form of granules in liquid nitrogen for 30 minutes. Then packaged in polystyrene cups of 160 ± 5 grams (dose per 1 ton of fermented mixture) and stored at a temperature of -40 ° C. Frozen concentrate contains 300-500 billion CFU / cm 3 . When storing the frozen concentrate for 6 months at a temperature of -40 ° C, the number of cells was in the range of 270-470 billion CFU / cm 3 , the granules did not stick together and therefore remained in the form of separate granules for the entire storage period.
Таким образом, предлагаемый способ замораживания молочнокислых бактерий позволяет получать бактериальный концентрат молочнокислых бактерий с высоким содержанием молочнокислых бактерий, стойкий в хранении, что представляет большой интерес для отечественной биотехнологии в решении практических задач при производстве бактериальных концентратов.Thus, the proposed method of freezing lactic acid bacteria allows you to get a bacterial concentrate of lactic acid bacteria with a high content of lactic acid bacteria, stable in storage, which is of great interest for domestic biotechnology in solving practical problems in the production of bacterial concentrates.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010120515/10A RU2427624C1 (en) | 2010-05-24 | 2010-05-24 | Method of lactic bacteria freezing |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010120515/10A RU2427624C1 (en) | 2010-05-24 | 2010-05-24 | Method of lactic bacteria freezing |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2427624C1 true RU2427624C1 (en) | 2011-08-27 |
Family
ID=44756741
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010120515/10A RU2427624C1 (en) | 2010-05-24 | 2010-05-24 | Method of lactic bacteria freezing |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2427624C1 (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019211458A1 (en) | 2018-05-04 | 2019-11-07 | Chr. Hansen A/S | Improved recovery of nitrate reductase activity |
| RU2737321C1 (en) * | 2019-12-20 | 2020-11-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью" Федерального медико-биологического агентства | Method of preserving bacteria in faecal microbiota and bacterial cultures grown on dense agarized nutrient or differential media in low temperature using composite medium for freezing |
| RU2767340C2 (en) * | 2017-03-27 | 2022-03-17 | Биогайа Аб | Lactic acid bacteria, methods and their application |
| RU2800686C1 (en) * | 2022-09-15 | 2023-07-26 | Общество с ограниченной ответственностью "БИОМ ТЕХНОЛОГИИ" | Method of cryopreservation of vaginal microbiota |
-
2010
- 2010-05-24 RU RU2010120515/10A patent/RU2427624C1/en not_active IP Right Cessation
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2767340C2 (en) * | 2017-03-27 | 2022-03-17 | Биогайа Аб | Lactic acid bacteria, methods and their application |
| US11730780B2 (en) | 2017-03-27 | 2023-08-22 | Biogaia Ab | Lactic acid bacteria, methods and uses thereof |
| WO2019211458A1 (en) | 2018-05-04 | 2019-11-07 | Chr. Hansen A/S | Improved recovery of nitrate reductase activity |
| CN112352042A (en) * | 2018-05-04 | 2021-02-09 | 科·汉森有限公司 | Enhanced recovery of nitrate reductase activity |
| US12004547B2 (en) | 2018-05-04 | 2024-06-11 | Chr. Hansen A/S | Recovery of nitrate reductase activity |
| RU2737321C1 (en) * | 2019-12-20 | 2020-11-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью" Федерального медико-биологического агентства | Method of preserving bacteria in faecal microbiota and bacterial cultures grown on dense agarized nutrient or differential media in low temperature using composite medium for freezing |
| RU2800686C1 (en) * | 2022-09-15 | 2023-07-26 | Общество с ограниченной ответственностью "БИОМ ТЕХНОЛОГИИ" | Method of cryopreservation of vaginal microbiota |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hambling | Survival of the respiratory syncytial virus during storage under various conditions | |
| CN104145943B (en) | A kind of frozen protection liquid of people's umbilical cord China Tong Shi glue tissue and preparation and application thereof | |
| Hubalek | Protectants used in the cryopreservation of microorganisms | |
| ES2273854T3 (en) | PRESERVATION AND STORAGE MEDIA FOR BIOLOGICAL MATERIALS. | |
| CN105961374A (en) | Cell cryopreservation fluid | |
| WO2012098358A1 (en) | Freeze drying method | |
| CN102726366B (en) | Organ preservation solution and method for preparing same | |
| AU2001268057A1 (en) | Preservation and storage medium for biological materials | |
| CN104762209B (en) | Photobacterium phosphoreum freeze-dried powder and preparation method thereof | |
| Qiao et al. | Effects of natural deep eutectic solvents on lactic acid bacteria viability during cryopreservation | |
| EA010855B1 (en) | Frozen lactic acid bacteria culture of individual pellets | |
| JP2006230396A (en) | Cell preservative liquid | |
| RU2427624C1 (en) | Method of lactic bacteria freezing | |
| Béal et al. | Freezing of probiotic bacteria | |
| CN103271131B (en) | Fresh-keeping reagent for aquatic products of ocean-going vessel, and preparation method and applications of reagent | |
| CN1261563C (en) | Method for freeze-drying and ultra low temperature storing ginseng callus cell | |
| CN107027741B (en) | Human sperm freezing protection solution without yolk and preservation method | |
| KR101687448B1 (en) | instant immersion freezing liquid and manucturing method thereof | |
| CN105505778B (en) | The ultralow temperature method for preserving of the original parent species of Pleurotus eryngii | |
| CN104212733A (en) | Photosynthetic bacterium freeze-drying protective agent | |
| RU2737321C1 (en) | Method of preserving bacteria in faecal microbiota and bacterial cultures grown on dense agarized nutrient or differential media in low temperature using composite medium for freezing | |
| CN115005199A (en) | Cryopreservation solution and cryopreservation method for natural killer cells and application of cryopreservation solution and cryopreservation method | |
| Morichi | Preservation of lactic acid bacteria by freeze-drying | |
| CN103103143A (en) | Nitrifying bacteria preservation method | |
| CN112625910A (en) | Low-temperature protective agent capable of automatically setting core |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180525 |