RU2426794C1 - Method of bioassay of substances contained in fluid mediums (including nanoparticles) - Google Patents
Method of bioassay of substances contained in fluid mediums (including nanoparticles) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2426794C1 RU2426794C1 RU2010112330/10A RU2010112330A RU2426794C1 RU 2426794 C1 RU2426794 C1 RU 2426794C1 RU 2010112330/10 A RU2010112330/10 A RU 2010112330/10A RU 2010112330 A RU2010112330 A RU 2010112330A RU 2426794 C1 RU2426794 C1 RU 2426794C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- analyzed
- substances
- biological activity
- distilled water
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биологии и медицине, может быть использовано в экологии, фармакологии и ветеринарии.The invention relates to biology and medicine, can be used in ecology, pharmacology and veterinary medicine.
Известен оперативный способ определения качества воды и токсичности растворенных в ней веществ (см. заявку № CN 101131384, опубл. 27.02.08 и патент № UA 24287, опубл 25.06.07) биотестированием с помощью люминометрии, который реализован в отечественном приборе «Биотоке-10». При использовании этого способа в исследуемую пробу помещаются специальные люминесцирующие морские бактерии или трансгенные бактерии кишечной палочки, обладающие способностью к люминесценции. Воздействие токсикантов исследуемой пробы на бактерии в процессе их инкубирования в этой пробе приводит к изменению интенсивности люминесценции. Сравнение измеренной интенсивности с интенсивностью люминесценции тех же бактерий в контрольной пробе жидкости (например, дистиллированной воде) позволяет определить степень токсичности анализируемой пробы. При необходимости в исследуемую и контрольную пробы могут добавляться вспомогательные вещества, необходимые для создания оптимальных условий для тестовых бактерий и для сравнения проб - в частности, поваренная соль и соляная кислота, выравнивающая рН для сравниваемых жидкостей.A known operational method for determining the quality of water and toxicity of substances dissolved in it (see application No. CN 101131384, publ. 02/27/08 and patent No. UA 24287, publ. 06/25/07) by biotesting using luminometry, which is implemented in the domestic device "Biotoke-10 ". When using this method, special luminescent marine bacteria or transgenic E. coli bacteria with luminescence ability are placed in the test sample. The effect of toxicants of the test sample on bacteria during their incubation in this sample leads to a change in the luminescence intensity. Comparison of the measured intensity with the luminescence intensity of the same bacteria in a control sample of the liquid (for example, distilled water) allows us to determine the degree of toxicity of the analyzed sample. If necessary, auxiliary substances necessary for creating optimal conditions for test bacteria and for comparing the samples, in particular table salt and hydrochloric acid, equalizing the pH for the compared liquids, can be added to the test and control samples.
Известен также оперативный способ определения биологической активности воды (патенты РФ №2377562, опубл. 27.12.09 и №2377563, опубл. 27.12.09) биотестированием с помощью стимуляции электрическими импульсами препарата нервных клеток в физрастворе. Здесь у тестовых нервных клеток в процессе инкубирования регистрируют постсинаптические потенциалы, которые могут быть разными при различной биологической активности воды, использованной для приготовления физраствора.There is also known an operational method for determining the biological activity of water (RF patents No. 2377562, publ. 12/27/09 and No. 2377563, publ. 12/27/09) by biotesting by stimulation of nerve cell preparation with electric pulses in saline. Here, test synaptic potentials are recorded in test nerve cells during incubation, which can be different for different biological activities of the water used to prepare saline solution.
Недостатками указанных известных способов являются дефицитность и ограниченный выбор тестовых объектов. Для получения объективных заключений о потенциальной токсичности и биологической активности анализируемых проб для биосферы необходимы сведения об их воздействии на разные виды тестовых клеток, включая растительные и животные, что невозможно для данных способов. Кроме того, второй из указанных способов сложен для исполнения и поэтому имеет ограниченную применимость.The disadvantages of these known methods are the scarcity and limited selection of test objects. To obtain objective conclusions about the potential toxicity and biological activity of the analyzed samples for the biosphere, information is needed on their effect on different types of test cells, including plant and animal cells, which is impossible for these methods. In addition, the second of these methods is difficult to execute and therefore has limited applicability.
Известен способ оценки биологической активности наночастиц по степени их влияния на скорость реакции окисления биологических структур и молекул, определяемую по интенсивности хемилюминесценции, волюмометрически, барометрически и т.п. (Радилов А.С., Глушкова А.В., Дулов С.А. Экспериментальная оценка токсичности и опасности наноразмерных материалов, журнал «Нанотехнологии и охрана здоровья», 2009 г., том 1, №3(1), с.48; Мелихов И.В., Тенденции развития нанохимии, «Российский химический журнал», 2002 г., том XL VI, №5, с.7-14.). Первый из указанных вариантов технической реализации этого способа подобен рассмотренной выше люминометрии бактерий, его недостатком является то, что способностью к люминесценции обладают лишь очень немногие структуры и молекулы, т.е возможности его применения ограничены.A known method for assessing the biological activity of nanoparticles by the degree of their influence on the oxidation rate of biological structures and molecules, determined by the intensity of chemiluminescence, volumetric, barometric, etc. (Radilov A.S., Glushkova A.V., Dulov S.A. Experimental Assessment of Toxicity and Danger of Nanoscale Materials, Journal of Nanotechnology and Health, 2009, Volume 1, No. 3 (1), p. 48 ; Melikhov IV, Trends in the development of nanochemistry, Russian Chemical Journal, 2002, volume XL VI, No. 5, pp. 7-14.). The first of the indicated options for the technical implementation of this method is similar to the bacterium luminometry discussed above, its drawback is that only very few structures and molecules have the ability to luminescence, i.e., the possibilities for its use are limited.
Наиболее близким и принятым за прототип является способ определения качества воды (патент РФ 2123692, опубл. 20.12.98) биотестированием с помощью микроэлектрофореза культуры растительных клеток, в качестве которых используются водоросли. В процессе инкубирования воздействие растворенных токсикантов анализируемой пробы на эти клетки приводит к изменениям их электрического заряда и дзета-потенциала. При помещении пробы с клетками в электрофоретическую камеру на них накладывается переменное электрическое поле, в котором клетки совершают колебания с амплитудами, пропорциональными их зарядам. Качество и уровень токсичности воды (или, конкретнее, токсичности растворенных в ней веществ) определяют сравнением средней амплитуды колебаний клеточных популяций в контрольной (дистиллированная вода) и анализируемой пробах.The closest and accepted as a prototype is a method for determining water quality (RF patent 2123692, publ. 20.12.98) by biotesting using microelectrophoresis of a culture of plant cells, which are used as algae. During the incubation, the effect of the dissolved toxicants of the analyzed sample on these cells leads to changes in their electric charge and zeta potential. When a sample with cells is placed in an electrophoretic chamber, an alternating electric field is applied to them, in which the cells oscillate with amplitudes proportional to their charges. The quality and level of toxicity of water (or, more specifically, the toxicity of substances dissolved in it) is determined by comparing the average amplitude of fluctuations of cell populations in the control (distilled water) and the analyzed samples.
Недостатком данного способа является нестабильный уровень амплитуды колебаний клеток в контрольной пробе - дистиллированной воде, который зависит от партии используемых клеток и, возможно, от режима их высушивания у изготовителя. Эта нестабильность затрудняет однозначную оценку результата анализа. Недостатками также являются длительный период ручных измерений амплитуд колебаний клеток (5-7 мин), в течение которого их заряды могут изменяться и без воздействия токсикантов, и ограниченность получаемой при этом статистической выборки (10-15 клеток), что влияет на точность и достоверность результата. Кроме того, объективность анализа с помощью данного метода для биосферы в целом ограничена из-за ограниченности выбора тестовых клеток (сушеные водоросли) и недостаточной информативности (одна измеряемая величина), что может быть важно при сравнении качественно различных токсикантов, воздействующих на разные звенья клеточного метаболизма.The disadvantage of this method is the unstable level of the amplitude of cell vibrations in the control sample — distilled water, which depends on the batch of cells used and, possibly, on the manufacturer’s drying regime. This instability makes it difficult to unambiguously evaluate the result of the analysis. The disadvantages are also the long period of manual measurements of cell vibration amplitudes (5-7 min), during which their charges can change without exposure to toxicants, and the limited statistical sample obtained (10-15 cells), which affects the accuracy and reliability of the result . In addition, the objectivity of the analysis using this method for the biosphere as a whole is limited due to the limited choice of test cells (dried algae) and lack of information (one measured value), which can be important when comparing qualitatively different toxicants that affect different parts of the cellular metabolism .
Задачей заявленного изобретения является создание способа, повышающего достоверность и точность анализа, а также его применимость по отношению к разным токсикантам, наночастицам и разным типам живых клеток на единой инструментально-методической основе.The objective of the claimed invention is the creation of a method that increases the reliability and accuracy of the analysis, as well as its applicability to different toxicants, nanoparticles and different types of living cells on a single instrumental basis.
Поставленная задача решается тем, что для определения биологической активности веществ, растворенных в жидкости (в частности, для определения качества воды), и диспергированных в ней наночастиц (например, наночастиц серебра) используется нижеописанным образом метод клеточного электрофореза, реализованный, например, в приборном комплексе «Цито-Эксперт». В ходе анализа выбранный вид живых тестовых клеток (растительные, животные, клетки обитателей водоемов, микроорганизмы и т.д.) помещают в анализируемую жидкость и для сравнения в дистиллированную воду, добавляя в содержащие их сосуды при необходимости минимальные количества вспомогательных веществ (например, для клеток человеческой крови - сахарозу или соли фосфорной кислоты в определенной коцентрации) для обеспечения стабильной жизнедеятельности тестовых клеток в процессе их инкубирования и анализа. Затем воздействуют на них переменным электрическим полем в электрофоретической камере комплекса, измеряют амплитуду их колебаний под действием поля и долю подвижных клеток относительно их общего числа, определяют их адаптацию и выживаемость совокупно как по зависимости амплитуд их колебаний и доли подвижных клеток от концентрации веществ в анализируемой жидкой среде, так и по зависимости тех же параметров от времени инкубирования клеток в жидкой среде, при этом для сравнения амплитуд используют показатель токсичности, однозначно учитывающий уровни амплитуд колебаний клеток в дистиллированной воде и анализируемой пробе, который вычисляется по формуле:The problem is solved in that to determine the biological activity of substances dissolved in a liquid (in particular, to determine the quality of water) and nanoparticles dispersed in it (for example, silver nanoparticles), the method of cell electrophoresis is used as described below, implemented, for example, in an instrument complex “Cyto-Expert”. During the analysis, the selected type of living test cells (plant, animal, cells of the inhabitants of reservoirs, microorganisms, etc.) are placed in the analyzed liquid and, for comparison, in distilled water, adding to the vessels containing them, if necessary, the minimum amounts of auxiliary substances (for example, for human blood cells - sucrose or salts of phosphoric acid in a certain concentration) to ensure stable vital activity of test cells during their incubation and analysis. Then they are exposed to an alternating electric field in the electrophoretic chamber of the complex, the amplitude of their vibrations under the influence of the field and the proportion of mobile cells relative to their total number are measured, their adaptation and survival are determined together as the dependence of the amplitudes of their vibrations and the proportion of mobile cells on the concentration of substances in the analyzed liquid environment, and according to the dependence of the same parameters on the time of incubation of cells in a liquid medium, in this case, a toxicity indicator is used to compare amplitudes, clearly take into account yvayuschy levels oscillation amplitudes cells in distilled water and test sample, which is calculated by the formula:
где Т - показатель токсичности;where T is an indicator of toxicity;
Ак - амплитуда колебаний клеток в дистиллированной воде;And to is the amplitude of cell vibrations in distilled water;
Ап - амплитуда колебаний клеток в анализируемой среде.And p is the amplitude of cell vibrations in the analyzed medium.
Далее по показателю токсичности определяют биологическую активность анализируемых веществ.Further, the biological activity of the analyzed substances is determined by the toxicity index.
Значения Т в диапазоне 0-20 единиц характеризуют малую степень биологической активности содержащихся в жидкости веществ, в диапазоне 20-60 ед. - среднюю степень, и 60-100 ед. - высокую, при этом значению Т=100 соответствует полное отсутствие колебаний клеток в электрическом поле, т.е. обнуление их заряда, что может означать их гибель или переход в сублетальное состояние.The values of T in the range of 0-20 units characterize a small degree of biological activity of substances contained in the liquid, in the range of 20-60 units. - an average degree, and 60-100 units. - high, while the value T = 100 corresponds to the complete absence of cell vibrations in the electric field, i.e. zeroing their charge, which may mean their death or transition to a sublethal state.
Также при необходимости для большей информативности анализа при разных концентрациях растворенных веществ и временах инкубирования клеток в жидкости дополнительно измеряют силу тока, протекающего через анализируемую среду, и сравнивают с той же величиной для дистиллированной воды.Also, if necessary, for greater informativeness of the analysis at different concentrations of dissolved substances and the incubation times of cells in the liquid, the current flowing through the analyzed medium is additionally measured and compared with the same value for distilled water.
Предлагаемый способ, во-первых, обладает более широкими возможностями по спектру анализируемых объектов, который включает как ионы либо молекулы растворенных веществ, так и наночастицы различного происхождения. Хотя механизмы воздействия этих объектов на тестовые клетки могут существенно различаться, заряд клеток служит интегральным маркером такого воздействия.The proposed method, firstly, has greater capabilities in the spectrum of the analyzed objects, which includes both ions or molecules of dissolved substances, and nanoparticles of various origins. Although the mechanisms of action of these objects on test cells can vary significantly, cell charge serves as an integral marker of such an effect.
Во-вторых, предлагаемый способ представляет возможность проведения оперативного анализа каждого вида анализируемых объектов на нескольких существенно различных видах клеток (например, на микроводорослях и клетках крови человека и животных), и с определением нескольких количественных показателей для каждого вида клеток, обеспечивая таким образом максимальную информативность анализа, позволяющую дифференцировать разные виды токсикантов и удовлетворяя основному правилу биотестирования - использованию нескольких видов тестовых объектов для получения адекватного вывода о степени токсичности и биологической активности анализируемой среды по отношению к биосфере. Если анализируемая среда угнетает тестовые клетки, показатель токсичности (Т) положителен, если стимулирует - отрицателен. Показатель токсичности (Т) и доля подвижных клеток характеризуют биологическое воздействие анализируемой среды, а сила протекающего тока - ее физико-химическое состояние.Secondly, the proposed method provides the ability to conduct an operational analysis of each type of analyzed objects on several significantly different types of cells (for example, microalgae and blood cells of humans and animals), and with the determination of several quantitative indicators for each type of cell, thus providing maximum information analysis, which allows differentiating different types of toxicants and satisfying the basic rule of biotesting - the use of several types of test objects comrade to obtain an adequate output of toxicity and biological activity of the medium to be analyzed with respect to the biosphere. If the analyzed medium inhibits the test cells, the toxicity index (T) is positive, if it stimulates, it is negative. The toxicity index (T) and the proportion of mobile cells characterize the biological effect of the analyzed medium, and the strength of the current flow - its physicochemical state.
Сочетание оперативности, информативности, технической простоты исполнения и малой затратности способа обеспечивают ему преимущества по сравнению с используемыми в данный момент на практике методами контроля биологической активности жидких сред, в том числе общей токсичности вод и биологической активности суспензий наночастиц.The combination of efficiency, informativeness, technical simplicity of execution and low cost of the method provides him with advantages compared to currently used in practice methods of controlling the biological activity of liquid media, including the general toxicity of water and the biological activity of suspensions of nanoparticles.
Предлагаемый способ может быть реализован с помощью автоматизированного приборного комплекса «Цито-Эксперт», структурная схема которого показана на фиг.1.The proposed method can be implemented using the automated instrument complex "Cyto-Expert", the structural diagram of which is shown in figure 1.
На фиг.2.1 и 2.2 изображена зависимость показателя токсичности (Т) от концентрации для водных растворов токсикантов ZnSO4 и K2Cr2O7 (для сравнения там же показана токсичность этих растворов для трансгенных бактерий кишечной палочки, измеренная методом люминометрии на приборе «Биотоке-10»).Figure 2.1 and 2.2 show the dependence of the toxicity index (T) on concentration for aqueous solutions of the toxicants ZnSO 4 and K 2 Cr 2 O 7 (for comparison, the toxicity of these solutions for transgenic bacteria of Escherichia coli, measured by the luminometry method on the Biotok device, is also shown there -10").
На фиг.3 показана зависимость Т и доли подвижных клеток от концентрации для водной суспензии наночастиц серебра (размер наночастиц 11±4 нм).Figure 3 shows the dependence of T and the proportion of mobile cells on the concentration for an aqueous suspension of silver nanoparticles (nanoparticle size 11 ± 4 nm).
На фиг.4.1 и 4.2 - зависимость Т и доли подвижных клеток от времени для двух концентраций наночастиц серебра.In figures 4.1 and 4.2 - the dependence of T and the proportion of mobile cells from time to time for two concentrations of silver nanoparticles.
Способ определения биологической активности веществ, содержащихся в жидкости в виде ионов, молекул, либо диспергированных в ней наночастиц выполняется следующим образом. В пробирку с анализируемой средой (пробой воды или суспензией наночастиц) помещается необходимое количество тестовых клеток, например, микроводорослей спирулина, хлорелла, либо клеток крови. (В последнем случае в анализируемую среду предварительно вносится сахароза до получения изотонического раствора с весовой концентрацией сахарозы 10,3%). Количество тестовых клеток в пробирке должно быть достаточным для проведения статистического анализа видеозаписей микроэлектрофореза, а именно, в поле зрения микроскопа должно наблюдаться 60-250 клеток. Аналогичные операции производятся с контрольной пробиркой, содержащей дистиллированную воду. Полученные смеси перемешиваются и инкубируются определенное время, затем поочередно 35-40 мкл каждой из них помещаются в электрофоретическую камеру, которая устанавливается под объектив лабораторного микроскопа. На электроды камеры от исполнительного блока подается напряжение в пределах 10-30 В, тестовые клетки подвергаются воздействию электрического поля и совершают колебательные движения, амплитуда которых пропорциональна их зарядам. Приспособительные и защитные реакции клеток на воздействие анализируемой среды приводят к изменениям зарядов клеток, что отражается на их перемещениях. Движения клеток записываются видеокамерой, например, MYscope 130 в память компьютера за 10-20 с и хранятся там до обработки. Анализ производится через заданные промежутки времени, полученные видеофайлы затем обрабатываются автоматической программой с выдачей всех вышеуказанных параметров и построением указанных зависимостей. Например, доля подвижных клеток - отношение числа подвижных в электрическом поле клеток к их общему числу, умноженное на 100% - определяется автоматически при компьютерном анализе изображений клеток на видеозаписи процесса микроэлектрофореза. Использование этого показателя позволяет обеспечить максимальную точность анализа, особенно, когда временной или концентрационный ход основного показателя Т может быть истолкован неоднозначно. Затем, при необходимости, анализ повторяют, разбавив анализируемую жидкость дистиллированной водой в нужное количество раз и поместив туда тестовые клетки. После выполнения анализов, на основании их результатов делаются выводы о степени токсичности и биологической активности веществ, содержащихся в анализируемой жидкости. При анализе результатов исследований следует учитывать, что адаптация тестовых клеток в данный момент описывается текущим значением показателя токсичности (Т), их выживаемость изменением Т с течением времени и с ростом концентрации анализируемого вещества. Поскольку измеряемая амплитуда и определяемый ею показатель Т проявляют естественную вариативность с течением времени (см. иллюстрацию на Фиг.4), связанную с известным чередованием фаз угнетения и восстановления показателей физиологического состояния разных живых объектов при токсическом воздействии, совокупная оценка этих показателей позволяет обеспечить необходимую достоверность результатов анализа. При необходимости для большей информативности анализа дополнительно измеряют силу тока, протекающего через анализируемую среду и сравнивают с той же величиной для дистиллированной воды. Силу тока измеряют для обеспечения разносторонности оценки биологической активности применительно к кинетике процесса воздействия токсиканта на клетки. При этом воздействии возможно постепенное отделение от клеток адсорбированных на их мембранах белков, ферментов и других контаминантов. Кроме того, при сублетальных концентрациях токсиканта начинается распад отдельных (самых слабых) клеток с разрывом клеточной мембраны и смешиванием клеточной цитоплазмы с раствором. Все это приводит к естественному изменению физико-химических характеристик раствора, в частности - его проводимости. Измерение силы тока позволяет получить информацию об этих деталях процесса токсического воздействия и повысить достоверность результатов анализа.A method for determining the biological activity of substances contained in a liquid in the form of ions, molecules, or nanoparticles dispersed in it is performed as follows. The required number of test cells, for example, microalgae of spirulina, chlorella, or blood cells, is placed in a test tube with the analyzed medium (a sample of water or a suspension of nanoparticles). (In the latter case, sucrose is preliminarily added to the analyzed medium to obtain an isotonic solution with a sucrose weight concentration of 10.3%). The number of test cells in a test tube should be sufficient for statistical analysis of video recordings of microelectrophoresis, namely, 60-250 cells should be observed in the field of view of the microscope. Similar operations are performed with a control tube containing distilled water. The resulting mixtures are mixed and incubated for a certain time, then 35-40 μl of each of them are placed in an electrophoretic chamber, which is installed under the lens of a laboratory microscope. A voltage in the range of 10-30 V is applied to the electrodes of the camera from the executive unit, the test cells are exposed to an electric field and make oscillatory movements, the amplitude of which is proportional to their charges. Adaptive and protective responses of cells to the influence of the analyzed medium lead to changes in cell charges, which affects their movements. The cell movements are recorded by a video camera, for example, MYscope 130 in the computer's memory for 10-20 s and stored there until processing. The analysis is performed at specified intervals, the resulting video files are then processed by an automatic program with the issuance of all the above parameters and the construction of these dependencies. For example, the proportion of motile cells — the ratio of the number of motile cells in the electric field to their total number multiplied by 100% —is determined automatically by computer analysis of cell images in a video recording of the microelectrophoresis process. Using this indicator allows you to ensure maximum accuracy of the analysis, especially when the time or concentration course of the main indicator T can be interpreted ambiguously. Then, if necessary, the analysis is repeated by diluting the analyzed liquid with distilled water the required number of times and placing test cells there. After the analysis, based on their results, conclusions are drawn about the degree of toxicity and biological activity of substances contained in the analyzed fluid. When analyzing the results of studies, it should be borne in mind that the adaptation of test cells is currently described by the current value of the toxicity index (T), their survival by a change in T over time and with an increase in the concentration of the analyte. Since the measured amplitude and the indicator T determined by it exhibit natural variability over time (see the illustration in Figure 4), associated with the known alternation of the phases of inhibition and restoration of the physiological state of different living objects under toxic effects, the combined assessment of these indicators allows us to provide the necessary reliability analysis results. If necessary, for more informative analysis, the strength of the current flowing through the analyzed medium is additionally measured and compared with the same value for distilled water. The current strength is measured to provide a versatile assessment of biological activity in relation to the kinetics of the process of exposure of the toxicant to cells. With this effect, a gradual separation of proteins, enzymes, and other contaminants adsorbed on their membranes from cells is possible. In addition, at sublethal concentrations of the toxicant, the decay of individual (weakest) cells begins with rupture of the cell membrane and mixing of the cell cytoplasm with the solution. All this leads to a natural change in the physicochemical characteristics of the solution, in particular, its conductivity. Measurement of current allows you to obtain information about these details of the toxic effects and increase the reliability of the analysis results.
Например, по графикам зависимости Т от концентрации для двух традиционных модельных токсикантов (Фиг.2.1 и 2.2) можно видеть, что для хлореллы они оба малотоксичны до концентрации примерно 1,5 мг/л, а при концентрациях 1,5-2,5 мг/л обладают средней степенью токсичности - от 20 до 40 единиц. Для спирулины средней степенью токсичности обладает только сульфат цинка в том же диапазоне концентраций, а вот бихромат калия оказывает на нее небольшое стимулирующее воздействие при концентрациях 0,6-0,8 мг/л, воздействие средней степени - при концентрациях 0,8-1,7 мг/л, и вызывает сильную стимуляцию при концентрациях 1,7-2,0 мг/л. Ход кривых при сравнительных измерениях для трансгенных бактерий качественно подобен кривым для хлореллы. Из этого примера видна важная роль использования нескольких тестовых объектов для получения достоверных данных при анализе биологической активности токсических веществ.For example, according to the graphs of T versus concentration for two traditional model toxicants (Figs. 2.1 and 2.2), it can be seen that for chlorella they are both low toxic to a concentration of about 1.5 mg / L, and at concentrations of 1.5-2.5 mg / l have an average degree of toxicity - from 20 to 40 units. For spirulina, only zinc sulfate in the same concentration range has an average toxicity level, but potassium dichromate has a small stimulating effect on it at concentrations of 0.6-0.8 mg / l, an average degree effect - at concentrations of 0.8-1, 7 mg / l, and causes strong stimulation at concentrations of 1.7-2.0 mg / l. The course of the curves in comparative measurements for transgenic bacteria is qualitatively similar to the curves for chlorella. This example shows the important role of using several test objects to obtain reliable data in the analysis of the biological activity of toxic substances.
Далее, на Фиг.3 показаны зависимости доли подвижных клеток хлореллы и средней амплитуды их колебаний от концентрации наночастиц серебра в дистиллированной воде. Эти наночастицы малотоксичны для клеток при концентрациях ниже 2·10-8 М и обладают средней токсичностью при более высоких концентрациях вплоть до 10-4 М, что вполне согласуется с данными других исследований. При этом значение Т почти не меняется в диапазоне концентраций от 10-6 до 10-4 М, т.е. при увеличении концентрации в 100 раз (!), из чего мог бы быть сделан ложный вывод о том, что в этом диапазоне чувствительность клеток к возрастанию концентрации токсиканта практически теряется. Однако кривая для доли подвижных клеток, измеренной одновременно с амплитудой, показывает, что эта доля непрерывно падает с ростом концентрации в указанном диапазоне, что подтверждает сохранение чувствительности клеток и адекватность анализа. Отсюда видна важность совокупного сопоставления изменений разных клеточных показателей под воздействием биологически активного вещества.Further, Fig. 3 shows the dependences of the fraction of mobile chlorella cells and the average amplitude of their oscillations on the concentration of silver nanoparticles in distilled water. These nanoparticles have low toxicity for cells at concentrations below 2 · 10 -8 M and have moderate toxicity at higher concentrations up to 10 -4 M, which is consistent with other studies. Moreover, the value of T almost does not change in the concentration range from 10 -6 to 10 -4 M, i.e. with an increase in concentration by a factor of 100 (!), from which a false conclusion could be made that in this range the sensitivity of cells to an increase in the concentration of the toxicant is practically lost. However, the curve for the proportion of motile cells, measured simultaneously with the amplitude, shows that this fraction continuously decreases with increasing concentration in the indicated range, which confirms the preservation of cell sensitivity and the adequacy of the analysis. From here, the importance of the aggregate comparison of changes in different cellular parameters under the influence of a biologically active substance is visible.
На Фиг.4.1 и 4.2 приведены зависимости тех же показателей хлореллы в зависимости от времени инкубирования с наночастицами для двух разных концентраций. Воздействие наночастиц на клетки, судя по всему, разделяется на несколько стадий, начинающихся с осаждения наночастиц на поверхность клеток через некоторое время после смешивания клеточной среды с анализируемой жидкостью. В процессе воздействия возникают защитные и приспособительные реакции клеток, что отражается на измеряемых характеристиках. По графикам видно, что в целом токсичность наночастиц для данных клеток и в самом деле остается преимущественно в пределах среднего уровня, однако в некоторые моменты она может достигать и более высокого уровня, особенно при высокой концентрации наночастиц (10-4 М) с 10-й по 16-ю и с 23-й по 26-ю мин после смешивания. Этот факт детализирует и уточняет вывод, сделанный после анализа Фиг.3. Он также демонстрирует возможность применения заявленного способа для контроля протекания клеточных процессов при токсическом воздействии анализируемых веществ на тестовые клетки. При этом поведение доли подвижных клеток, изменяющейся на Фиг.4.1 и 4.2 в противофазе со средней амплитудой их колебаний, подтверждает сделанные выводы о биологической активности наночастиц серебра и расширяет информативность анализа.Figures 4.1 and 4.2 show the dependences of the same chlorella parameters depending on the time of incubation with nanoparticles for two different concentrations. The effect of nanoparticles on the cells seems to be divided into several stages, starting with the deposition of nanoparticles on the cell surface some time after mixing the cell medium with the analyzed fluid. In the process of exposure, protective and adaptive cell reactions occur, which affects the measured characteristics. According to the graphs, in general, the toxicity of nanoparticles for these cells actually remains predominantly within the average level, but at some points it can reach a higher level, especially at a high concentration of nanoparticles (10 -4 M) from the 10th on the 16th and from the 23rd to the 26th min after mixing. This fact details and clarifies the conclusion made after the analysis of Figure 3. It also demonstrates the possibility of using the inventive method to control the course of cellular processes during the toxic effects of analytes on test cells. In this case, the behavior of the proportion of mobile cells, which changes in Figs. 4.1 and 4.2 in antiphase with an average amplitude of their oscillations, confirms the conclusions made about the biological activity of silver nanoparticles and expands the information content of the analysis.
При необходимости максимального ускорения анализа возможно смешивание двух-трех видов тестовых клеток для одновременной видеофиксации воздействия на них анализируемой жидкости, соответственно с двух-трехкратной последующей обработкой полученного видеофайла. Например, может использоваться смесь суспензий клеток крови и хлореллы, в этом случае для обеспечения жизнедеятельности клеток крови, как уже указывалось выше, в жидкость предварительно добавляется сахароза или соли фосфорной кислоты, присутствие которых нормально переносится клетками хлореллы.If necessary, to speed up the analysis, it is possible to mix two or three types of test cells for simultaneous video recording of the impact of the analyzed fluid on them, respectively, with two to three times subsequent processing of the resulting video file. For example, a mixture of suspensions of blood cells and chlorella can be used, in this case, to ensure the vital activity of blood cells, as mentioned above, sucrose or phosphoric acid salts are added to the liquid, the presence of which is normally transferred by chlorella cells.
В зависимости от постановки аналитической задачи возможно также определение биологической активности веществ, содержащихся в других жидкостях, обеспечивающих стабильное существование тестовых клеток на период инкубации и анализа - например, в глицерине, маннитоле, их смесях с водой и т.д.Depending on the setting of the analytical task, it is also possible to determine the biological activity of substances contained in other liquids that ensure the stable existence of test cells for the period of incubation and analysis - for example, in glycerol, mannitol, their mixtures with water, etc.
Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает точную количественную оценку биологической активности практически любого растворимого вещества или находящегося в суспензии при его воздействии на разные виды природных живых клеток. Ближайшие аналоги не позволяют получить точную оценку. Для практической токсикологии данное изобретение дает возможность оперативно, объективно и в деталях определять степень воздействия на биосферу как растворенных токсикантов, так и пылевидных, а также коллоидных наноматериалов на единой инструментально-методической основе, что может эффективно способствовать стандартизации анализов на токсичность и оперативному созданию относительно недорогого оборудования и технологий для экологического и производственного контроля.Thus, the proposed method provides an accurate quantitative assessment of the biological activity of almost any soluble substance or that is in suspension when it is exposed to different types of natural living cells. The closest analogues do not allow to get an accurate estimate. For practical toxicology, this invention makes it possible to quickly, objectively and in detail determine the degree of impact on the biosphere of both dissolved toxicants and pulverized, as well as colloidal nanomaterials on a single instrumental and methodical basis, which can effectively contribute to the standardization of toxicity analyzes and the rapid creation of relatively inexpensive equipment and technologies for environmental and industrial control.
Claims (4)
где Т - показатель токсичности;
Ак - средняя амплитуда колебаний клеток в дистиллированной воде;
Ап - средняя амплитуда колебаний клеток в анализируемой пробе,
далее по показателю токсичности определяют биологическую активность веществ.1. The method of determining the biological activity of substances contained in liquid media, including the placement of test cells in the analyzed liquid medium, exposure to them by alternating voltage, measuring the average amplitude of their vibrations at different concentrations of the medium and comparison with the average amplitude of the test cells in distilled water, different the fact that they additionally measure the proportion of motile cells and determine their adaptation and survival cumulatively according to the dependence of the motile cell fraction and the average amplitude of their vibration s on the concentration of substances in a liquid medium and analyzed on the time of incubation of test cells therein, wherein the amplitude comparison is used for toxicity index, calculated according to the formula
where T is an indicator of toxicity;
And to is the average amplitude of cell vibrations in distilled water;
And p is the average amplitude of cell vibrations in the analyzed sample,
further on the indicator of toxicity determine the biological activity of substances.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010112330/10A RU2426794C1 (en) | 2010-03-30 | 2010-03-30 | Method of bioassay of substances contained in fluid mediums (including nanoparticles) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010112330/10A RU2426794C1 (en) | 2010-03-30 | 2010-03-30 | Method of bioassay of substances contained in fluid mediums (including nanoparticles) |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2426794C1 true RU2426794C1 (en) | 2011-08-20 |
Family
ID=44755834
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010112330/10A RU2426794C1 (en) | 2010-03-30 | 2010-03-30 | Method of bioassay of substances contained in fluid mediums (including nanoparticles) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2426794C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2587630C1 (en) * | 2015-04-13 | 2016-06-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Пензенский государственный университет" (ФГБОУ ВПО "Пензенский государственный университет") | Method of determining cytotoxicity of nanomaterials based on zinc oxide |
| RU2711990C1 (en) * | 2019-01-09 | 2020-01-23 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "ДАГЕСТАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" | Method of determining genotoxicity of nanoparticles |
-
2010
- 2010-03-30 RU RU2010112330/10A patent/RU2426794C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| http://www.ecolog.ucoz.ru/publ/5-1-0-82. Экологические нормы. Правила. Информация. N 1, 2007. [Найдено в Интернет 22.10.2010.]. * |
| http://www.strf.ru/science.aspx?CatalogId=222&d-no=10129 –. ГЕНЕРАЛОВ В. Экспресс-система для анализа клеток. Наука и техника 08.06.2006. [Найдено в Интернет 22.10.2010.]. * |
| МЕЛИХОВ И.В. Тенденции развития нанохимии. Российский химический журнал. 2002, т. XLVI, N5, с.7-14. РАМБИДИ Н.Г., БЕРЕЗКИН А.В. Физические и химические основы нанотехнологий. - М.: Физматлит*, 2008, с.438. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2587630C1 (en) * | 2015-04-13 | 2016-06-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Пензенский государственный университет" (ФГБОУ ВПО "Пензенский государственный университет") | Method of determining cytotoxicity of nanomaterials based on zinc oxide |
| RU2711990C1 (en) * | 2019-01-09 | 2020-01-23 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "ДАГЕСТАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" | Method of determining genotoxicity of nanoparticles |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Buerk | Biosensors: Theory and applications | |
| Porterfield | Measuring metabolism and biophysical flux in the tissue, cellular and sub-cellular domains: recent developments in self-referencing amperometry for physiological sensing | |
| Lead et al. | Diffusion coefficients of humic substances in agarose gel and in water | |
| RU2514115C2 (en) | Apparatus and method for determining toxicity of liquid media | |
| CN103940883B (en) | Preparation method, application, device and detection method of disposable microbial film sensor capable of rapidly detecting water body biotoxicity | |
| Lee et al. | Determination of serotonin concentration in single human platelets through single-entity electrochemistry | |
| CN112067764B (en) | Method for evaluating skin inflammation relieving or repairing effect of cosmetic | |
| Moon et al. | Dual electrochemical microsensor for real-time simultaneous monitoring of nitric oxide and potassium ion changes in a rat brain during spontaneous neocortical epileptic seizure | |
| Umar et al. | Application of algae-biosensor for environmental monitoring | |
| RU2426794C1 (en) | Method of bioassay of substances contained in fluid mediums (including nanoparticles) | |
| Campos et al. | Use of a voltammetric electronic tongue for detection and classification of nerve agent mimics | |
| Opoka et al. | Development and validation of an anodic stripping voltammetric method for determination of Zn 2+ ions in brain microdialysate samples | |
| Fan et al. | Quantifying the extent of calcification of a coccolithophore using a coulter counter | |
| JP2022540349A (en) | Point-of-Care (POC) Diagnostic Test for Absolute Neutrophil Function (ANF) An Oxidase-Based Chemiluminescent Assay of Phagocytic Leukocytes in Whole Blood and Body Fluids Applicable for Point-of-Care (POC) Measurement | |
| CN104007154A (en) | Redox hydrosol, preparation method and application of integrated microbial electrode for rapid detection of water body biotoxicity | |
| CN106124647A (en) | A kind of method with Parallel artificial membrane's saturated model prediction pesticide bio-concentration factor | |
| Yasukawa et al. | Detection of the oxygen consumption rate of migrating zebrafish by electrochemical equalization systems | |
| RU92539U1 (en) | ANALYZER FOR DETERMINING THE TOTAL ANTIOXIDANT ACTIVITY OF BIOLOGICAL OBJECTS | |
| RU2224997C1 (en) | Volt-ampere method determining summary activity of antioxidants | |
| Shapiro | Estimation of membrane potential by flow cytometry | |
| Kunasakaran et al. | The effects of pH and cell density to the responses of immobilized cyanobacteria for copper detection | |
| Merchant | Miniaturization of a chloride ion assay for use in a microtiter format | |
| Matorin et al. | Biotesting of water toxicity according to the ratio of microalgae consumption by daphnia detected with chlorophyll fluorescence | |
| Asif et al. | Biosensors for Intracellular and Less Invasive Measurements Based on Nanostructured Metal Oxides | |
| EP3538664A1 (en) | Competition test of an enzyme substrate with internal compensation for enzyme activity |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140331 |