RU2418855C1

RU2418855C1 - Medium for cultivation of multipotent stromal cells from human adipose tissue and method of cultivation of said cells with its application

Info

Publication number: RU2418855C1
Application number: RU2010116668/10A
Authority: RU
Inventors: Елена Викторовна Парфенова (RU); Елена Викторовна Парфенова; Всеволод Арсеньевич Ткачук (RU); Всеволод Арсеньевич Ткачук; Ксения Андреевна Рубина (RU); Ксения Андреевна Рубина; Наталья Игоревна Калинина (RU); Наталья Игоревна Калинина; Вероника Юрьевна Сысоева (RU); Вероника Юрьевна Сысоева
Original assignee: ООО "Генная и клеточная терапия"
Priority date: 2010-04-29
Filing date: 2010-04-29
Publication date: 2011-05-20

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: described is medium for cultivation of stromal cells from adipose tissue (SCAT) with application of AdvanceSTEM™ medium with addition of 10% patient's autologous blood serum. Also claimed is method of cultivation of said cells with application of described medium. The invention makes it possible to obtain in vitro culture of autologous cells of adipose tissue, characterised by high level of proliferative activity, low apoptotic index, higher viability and safety with complete preservation of multipotent properties of cultivated cells, i.e. their ability to differentiate in various directions: adipogenic, chondrogenic, osteogenic and endothelial.

EFFECT: invention can be used in cell transplantology tissue engineering in order to obtain quality cell material for treatment of a number of human diseases, such as cardiovascular diseases, damage to the nervous system, urologic, gynecologic diseases and infertility, periodontal diseases, bone apparatus defects, arthropathy, burns, and for correction of age changes and skin defects in dermatocosmetology.

2 cl, 5 dwg, 6 ex

Description

Настоящее изобретение относится к области клеточной биологии и может быть использовано в клеточной трансплантологии и тканевой инженерии с целью получения качественного клеточного материала для лечения целого ряда заболеваний человека, таких как сердечно-сосудистые заболевания, повреждения нервной системы, урологические, гинекологические заболевания и бесплодие, заболевания пародонта, дефекты костного аппарата, заболевания суставов, ожоги, а также для коррекции возрастных изменений и кожных дефектов в дерматокосметологии. Предлагается среда для культивирования стромальных клеток из жировой ткани (СКЖТ) и способ культивирования этих клеток с ее применением. Изобретение позволяет получить in vitro культуру аутологичных клеток жировой ткани, отличающуюся повышенной жизнеспособностью и безопасностью при полном сохранении мультипотентных свойств культивированных клеток, т.е. их способности дифференцироваться в различных направлениях: адипогенном, хондрогенном, остеогенном, нейральном и эндотелиальном.The present invention relates to the field of cell biology and can be used in cell transplantology and tissue engineering in order to obtain high-quality cellular material for the treatment of a number of human diseases, such as cardiovascular diseases, nervous system damage, urological, gynecological diseases and infertility, periodontal diseases , defects in the bone apparatus, joint diseases, burns, as well as for the correction of age-related changes and skin defects in dermatocosmetology. A medium is proposed for the cultivation of stromal cells from adipose tissue (SCLC) and a method for culturing these cells with its use. The invention allows to obtain an in vitro culture of autologous adipose tissue cells, characterized by increased viability and safety while fully preserving the multipotent properties of the cultured cells, i.e. their ability to differentiate in different directions: adipogenic, chondrogenic, osteogenic, neural and endothelial.

Уровень техникиState of the art

Стромальные клетки из жировой ткани человека (СКЖТ) обладают свойствами, во многом сходными со свойствами наиболее изученных на данный момент взрослых стволовых клеток - мезенхимных клеток костного мозга (МККМ) (Трактуев и др., 2006; Lee et al., 2004). В настоящее время известно, что СКЖТ могут дифференцироваться в эпителиальные и нейрональные клетки (Zhao et al., 2003), эндотелиальные и гладкомышечные клетки (Yeh et al., 2003; Wijelath et al., 2004), а также способны дифференцироваться в кардиомиоцитарном (Yeh et al. 2003), адипогенном, хондрогенном и остеогенном направлениях (Zuk et al., 2002). СКЖТ могут быть легко выделены в результате ферментативной обработки образцов жировой ткани, полученной в результате косметической липосакции или в ходе хирургического удаления жирового отложения. Культивирование изолированных СКЖТ приводит к получению гомогенной популяции мультипотентных стромальных фибробластоподобных клеток (Zuk et al., 2002). В большинстве протоколов выделения и культивирования СКЖТ используется среда с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) или фетальной бычьей сыворотки (ФБС). Эти сыворотки содержат необходимый коктейль факторов роста, гормонов и витаминов, стимулирующих клеточную адгезию и пролиферацию в условиях культивирования in vitro (Mazlyzam et al., 2004; Liu et al., 2004; Llames et al., 2004). В то же время накапливается все больше сведений о том, что клетки, выращенные с использованием сывороток животных, потенциально небезопасны, в частности, существует риск заражения прионами или вирусами культуры клеток при культивировании с использованием сывороток животных (Doerr et al., 2003), а также возможность иммунной реакции со стороны организма реципиента (Spees et al., 2004; Sundin et al., 2007). Кроме того, было показано, что длительное культивирование в присутствии ФБС значительно изменяет свойства клеток различного происхождения. Так, мезенхимные клетки костного мозга, культивированные в присутствии ФБС, характеризуются нестабильностью транскриптома, включая изменение экспрессии генов, ответственных за регуляцию клеточного цикла, апоптоз и клеточную адгезию (Shahdadfar et al., 2005).Stromal cells from human adipose tissue (SCL) have properties that are largely similar to the properties of the most studied adult stem cells - bone marrow mesenchymal cells (BCC) (Traktuev et al., 2006; Lee et al., 2004). Currently, it is known that SLCT can differentiate into epithelial and neuronal cells (Zhao et al., 2003), endothelial and smooth muscle cells (Yeh et al., 2003; Wijelath et al., 2004), and are also able to differentiate in cardiomyocytic ( Yeh et al. 2003), adipogenic, chondrogenic and osteogenic directions (Zuk et al., 2002). SZHT can be easily allocated as a result of enzymatic processing of samples of adipose tissue obtained as a result of cosmetic liposuction or during the surgical removal of body fat. The cultivation of isolated SZHT results in a homogeneous population of multipotent stromal fibroblast-like cells (Zuk et al., 2002). Most protocols for the isolation and cultivation of SCLT use a medium supplemented with fetal calf serum (ETS) or fetal bovine serum (FBS). These sera contain the necessary cocktail of growth factors, hormones and vitamins that stimulate cell adhesion and proliferation in vitro cultivation (Mazlyzam et al., 2004; Liu et al., 2004; Llames et al., 2004). At the same time, more and more information is accumulating that cells grown using animal sera are potentially unsafe, in particular, there is a risk of infection by prions or viruses of cell culture when cultured using animal sera (Doerr et al., 2003), and also the possibility of an immune response from the recipient's body (Spees et al., 2004; Sundin et al., 2007). In addition, it was shown that long-term cultivation in the presence of PBS significantly changes the properties of cells of various origins. Thus, bone marrow mesenchymal cells cultured in the presence of PBS are characterized by transcriptome instability, including changes in the expression of genes responsible for cell cycle regulation, apoptosis, and cell adhesion (Shahdadfar et al., 2005).

В связи с этим в последние годы предпринимаются попытки исключить из культуральных сред для выращивания стволовых клеток сыворотки животных и найти им адекватную замену. В частности, хорошие результаты в этом плане дает применение собственной (аутологичной) сыворотки крови пациента. Так, показано, например, что мезенхимные клетки костного мозга при культивировании с использованием аутологичной сыворотки активно пролиферируют в культуре, сохраняя при этом стабильный геном и транскриптом, мультипотентность и способность дифференцироваться в нескольких направлениях (Shahdadfar et al., 2005; Mazlyzam et al., 2000); а фибробласты - способность синтезировать компоненты внеклеточного матрикса (коллаген I и III типа, фибронектин и эластин) до поздних пассажей в культуре (патент РФ №2382077).In this regard, in recent years, attempts have been made to exclude animal serum from culture media for growing stem cells and to find an adequate replacement for them. In particular, the use of the patient's own (autologous) blood serum gives good results in this regard. For example, it has been shown, for example, that bone marrow mesenchymal cells during cultivation using autologous serum actively proliferate in culture, while maintaining a stable genome and transcript, multipotency and the ability to differentiate in several directions (Shahdadfar et al., 2005; Mazlyzam et al., 2000); and fibroblasts - the ability to synthesize the components of the extracellular matrix (type I and III collagen, fibronectin and elastin) until late passages in culture (RF patent No. 2382077).

Что касается СКЖТ, то, во-первых, число работ, предлагающих использование для их культивирования питательной среды с добавлением аутологичной сыворотки (АС), весьма ограничено, во-вторых, авторы этих работ, как правило, экспериментируют с различными средами, содержащими животную сыворотку, и ограничиваются лишь указанием на возможность (или предпочтительность) замены ФБС аутологичной сывороткой, и в-третьих, в опубликованных работах, связанных с применением АС-содержащих сред для культивирования СКЖТ, информация о качестве получаемой при этом культуры либо отсутствует, либо носит фрагментарный характер, (см., например, опубликованные заявки США 20080159998 и 20100008992).As for SCLC, firstly, the number of works suggesting the use of a culture medium with the addition of autologous serum (AS) for their cultivation is very limited, and secondly, the authors of these works, as a rule, experiment with various media containing animal serum , and are limited only to indicating the possibility (or preference) of replacing PBS with autologous serum, and thirdly, in published works related to the use of AS-containing media for culturing SQT, quality information obtained with this culture is either absent or fragmented (see, for example, published applications US 20080159998 and 20100008992).

Наиболее близкими к решениям, предлагаемым в настоящем изобретении, являются культуральная среда и способ культивирования стромальных клеток жировой ткани, описанные в работе О.В.Повещенко с соавт., опубликованной в Бюллетене СО РАМН (№5 (133), 90-95) в 2008 г. Авторами предложено использование для получения культуры СКЖТ известной питательной среды DMEM, содержащей антибиотик и антимикотик, в комбинации с 10-20%-ной (предпочтительно 10%-ной) АС. При этом делается вывод о том, что замена ФБС на АС не оказывает отрицательно воздействия на такие свойства, как уровень пролиферации клеток и сроки образования ими субконфлюентного слоя. С точки зрения качества получаемой культуры внимание акцентируется, главным образом, на повышении безопасности ее применения в клеточной трансплантологии.Closest to the solutions proposed in the present invention are the culture medium and method for culturing stromal cells of adipose tissue described in the work of O.V. Poveshchenko et al., Published in the Bulletin of the SB RAMS (No. 5 (133), 90-95) in 2008. The authors proposed the use of a well-known DMEM nutrient medium containing antibiotic and antimycotics in combination with 10-20% (preferably 10%) AS for the production of SCL culture. In this case, it is concluded that the replacement of PBS with AS does not adversely affect such properties as the level of cell proliferation and the timing of their formation of a subconfluent layer. From the point of view of the quality of the resulting culture, attention is mainly focused on improving the safety of its use in cell transplantology.

К сожалению, названный прототип, как и ряд других аналогов предлагаемого изобретения, оставляет открытым вопрос о таких важнейших функциональных характеристиках культивированных в предлагаемых условиях СКЖТ, как уровень апоптоза, степень сохранности недифференцированного состояния, потенциал в плане способности дифференцироваться в различных направлениях при индукции в соответствующих средах и т.д. Между тем предпринятая нами попытка получения клеток из жировой ткани человека путем культивирования их согласно прототипу, а именно в среде DMEM, содержащей антибиотик и антимикотик, с 10% аутологичной сывороткой показала, что СКЖТ, поддерживаемые в этих условиях, в целом демонстрируют сравнительно невысокий уровень пролиферативной активности, а получаемая культура частично утрачивает свою мультипотентность, в частности, обладает пониженной способностью к дифференцировке в остеогенном направлении. Кроме того, оказалось, что в условиях индукции дифференцировки в остеогенном направлении культура клеток, выращенная с использованием среды DMEM, характеризуется довольно низким уровнем пролиферативной активности и, по существу, представляет собой популяцию переживающих дифференцирующихся клеток с низким уровнем клеточных делений.Unfortunately, the aforementioned prototype, as well as a number of other analogues of the present invention, leaves open the question of the most important functional characteristics of cultured in the proposed conditions of SCLC, such as the level of apoptosis, the degree of preservation of the undifferentiated state, the potential in terms of the ability to differentiate in different directions during induction in the corresponding environments etc. Meanwhile, our attempt to obtain cells from human adipose tissue by culturing them according to the prototype, namely in a DMEM medium containing an antibiotic and antimycotic with 10% autologous serum, showed that SZhT supported under these conditions, in general, demonstrate a relatively low level of proliferative activity, and the resulting culture partially loses its multipotency, in particular, has a reduced ability to differentiate in the osteogenic direction. In addition, it turned out that under conditions of induction of differentiation in the osteogenic direction, a cell culture grown using DMEM medium is characterized by a rather low level of proliferative activity and, in essence, is a population of surviving differentiating cells with a low level of cell divisions.

В связи с этим представлялось существенным решить задачу улучшения качественных показателей культуры, особенно в части поддержания ее мультипотентности, сохраняя при этом прочие преимущества, которые обеспечивает выращивание культуры без применения животных сывороток.In this regard, it seemed essential to solve the problem of improving the quality indicators of the culture, especially in terms of maintaining its multipotency, while preserving the other advantages that the culture is grown without the use of animal sera.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Поставленная задача была решена путем выбора оптимальной комбинации питательной среды с аутологичной сывороткой. По нашим данным, наилучшие результаты в плане решаемой проблемы повышения качественных показателей культуры СКЖТ, выращиваемой в присутствии аутологичной сыворотки, дает использование питательной среды AdvanceSTEM^TM, содержащей антибиотик и антимикотик, с добавлением 10%-ной АС.The problem was solved by choosing the optimal combination of culture medium with autologous serum. According to our data, the best results in terms of the problem of improving the quality indicators of a culture of high fat culture, grown in the presence of autologous serum, give the use of nutrient medium AdvanceSTEM ^TM , containing antibiotic and antimycotic, with the addition of 10% AS.

Среда AdvanceSTEM^TM рекомендована фирмой-производителем (HyClone) как основная питательная среда для культивирования некоторых видов недифференцированных мезенхимных стволовых клеток, в частности клеток, происходящих из жировой ткани (http://www.thermo.com). Следует, однако, отметить, что эта среда не получила пока широкого практического применения, поэтому ее свойства и особенности изучены недостаточно. В настоящей работе были определены функциональные характеристики СКЖ, культивируемых в среде AdvanceSTEM^TM (HyClone)/ Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) с добавлением 10% сыворотки крови донора жировой ткани (аутологичной сыворотки), и основные показатели качества получаемой в результате культуры, а также проведено сравнение некоторых из них с соответствующими характеристиками, определенными для клеток, выращиваемых в среде DMEM с теми же дополнительными компонентами (согласно прототипу). При этом было установлено, чтоAdvanceSTEM ^{TM is} recommended by the manufacturer (HyClone) as the main nutrient medium for the cultivation of certain types of undifferentiated mesenchymal stem cells, in particular cells derived from adipose tissue (http://www.thermo.com). However, it should be noted that this environment has not yet received wide practical application, therefore its properties and features have not been studied enough. In this work, we determined the functional characteristics of SQF cultured in AdvanceSTEM ^™ (HyClone) / Antibiotic / Antimycotic Solution 100x (HyClone) medium with the addition of 10% blood serum from an adipose tissue donor (autologous serum), and the main quality indicators of the resulting culture, and some of them were also compared with the corresponding characteristics determined for cells grown in DMEM medium with the same additional components (according to the prototype). It was found that

а) пролиферативная активность СКЖ при культивировании в среде AdvanceSTEM^TM с 10% аутологичной сывороткой (по изобретению) достоверно выше, чем при выращивании их в среде DMEM с 10% АС (по прототипу) (пример 3, фиг.1);a) the proliferative activity of SCR during cultivation in AdvanceSTEM ^™ medium with 10% autologous serum (according to the invention) is significantly higher than when growing them in DMEM medium with 10% AS (according to the prototype) (example 3, figure 1);

б) повышение уровня пролиферации СКЖ, культивируемых в среде по изобретению, не влечет за собой повышения уровня апоптоза (пример 4, фиг.2);b) an increase in the level of proliferation of SCF cultured in the medium according to the invention does not entail an increase in the level of apoptosis (example 4, figure 2);

в) клетки получаемой в предлагаемых условиях культуры полностью сохраняют свои мультипотентные свойства и демонстрируют (в соответствующих дифференцировочных средах) способность к дифференцировке в адипогенном, хондрогенном, остеогенном и эндотелиальном направлениях (пример 5, фиг.3);c) the cells obtained under the proposed culture conditions fully retain their multipotent properties and demonstrate (in the corresponding differentiating media) the ability to differentiate in adipogenic, chondrogenic, osteogenic and endothelial directions (example 5, figure 3);

г) культура, получаемая при выращивании клеток в среде AdvanceSTEM^TM с 10% аутологичной сывороткой, характеризуется значительно более высоким потенциалом в плане индукции остеогенной дифференцировки и способности клеток к пролиферации в этих условиях, чем культура, выращенная в среде DMEM+AC согласно прототипу (пример 6, фиг.4 и фиг.5).d) the culture obtained by growing cells in AdvanceSTEM ^TM medium with 10% autologous serum is characterized by a significantly higher potential for the induction of osteogenic differentiation and the ability of cells to proliferate under these conditions than the culture grown in DMEM + AC medium according to the prototype (example 6, FIG. 4 and FIG. 5).

Отдельно следует отметить, что наблюдаемый факт существенного (в сравнении с прототипом) повышения способности СКЖ, культивируемых по изобретению, к остеогенной дифференцировке с сохранением высокого пролиферативного потенциала клеток в условиях ее индукции является неожиданным, поскольку питательная среда AdvanceSTEM^TM не демонстрирует никаких преимуществ в плане влияния на эти показатели по сравнению с DMEM (это с очевидностью следует из сравнения свойств культур, выращенных в DMEM+ФБС и AdvanceSTEM^TM+ФБC на фиг.5). С этой точки зрения высокий потенциал СКЖТ в плане индукции остеогенной дифференцировки и пролиферации в этих условиях, проявляющийся при использовании комбинации AdvanceSTEM^TM с аутологичной сывороткой, представляется неожиданным техническим результатом, достигаемым при реализации данного изобретения.Separately, it should be noted that the observed fact of a significant (in comparison with the prototype) increase in the ability of SKZh cultured according to the invention to osteogenic differentiation while maintaining a high proliferative potential of cells under conditions of its induction is unexpected, since the AdvanceSTEM ^TM nutrient medium does not show any advantages in terms of influence these indicators compared with DMEM (this obviously follows from a comparison of the properties of crops grown in DMEM + PBS and AdvanceSTEM ^TM + PBS in figure 5). From this point of view, the high potential of SZHT in terms of the induction of osteogenic differentiation and proliferation under these conditions, manifested when using a combination of AdvanceSTEM ^™ with autologous serum, seems to be an unexpected technical result achieved by the implementation of this invention.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

Фиг.1 - Сравнительный анализ пролиферативной активности стромальных клеток жировой ткани, культивированных в среде AdvanceSTEM^TM (HyClone)/Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone) (Adv+FBS) или 10% аутологичной сыворотки крови пациентов (Adv+auto), или в среде DMEM (HyClone)/Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone) (DMEM+FBS) или 10% аутологичной сыворотки крови пациентов (DMEM+auto).Figure 1 - Comparative analysis of the proliferative activity of adipose stromal cells cultured in AdvanceSTEM ^™ (HyClone) / Antibiotic / Antimycotic Solution 100x (HyClone) supplemented with 10% fetal bovine serum (HyClone) (Adv + FBS) or 10% autologous serum patient blood (Adv + auto), or in DMEM (HyClone) / Antibiotic / Antimycotic Solution 100x (HyClone) supplemented with 10% fetal bovine serum (HyClone) (DMEM + FBS) or 10% autologous patient blood serum (DMEM + auto )

Фиг.2 - Цитофлуориметрический анализ. Распределение живых и апоптических клеток в популяции стромальных клеток из жировой ткани человека, культивированных в среде AdvanceSTEM^TM (HyClone)/ Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) с добавлением фетальной бычьей сыворотки (А) или аутологичной сыворотки крови пациентов (В). Распределение СКЖТ по фазам клеточного цикла при культивировании с ФБС (Б) или АС (Г).Figure 2 - Cytofluorimetric analysis. Distribution of living and apoptotic cells in a population of stromal cells from human adipose tissue cultured in AdvanceSTEM ^™ (HyClone) / Antibiotic / Antimycotic Solution 100x (HyClone) supplemented with fetal bovine serum (A) or autologous blood serum of patients (B). Distribution of SQT along the phases of the cell cycle upon cultivation with PBS (B) or AS (D).

Фиг.3 - Индукция дифференцировки стромальных клеток жировой ткани, культивированных в среде AdvanceSTEM^TM (HyClone)/ Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) с добавлением аутологичной сыворотки крови пациентов, в адипоцитарном (А), хондрогенном (Б), остеогенном (В) и эндотелиальном (Г) направлениях.Figure 3 - Induction of differentiation of adipose stromal cells cultured in AdvanceSTEM ^™ (HyClone) / Antibiotic / Antimycotic Solution 100x (HyClone) medium with the addition of autologous patient blood serum, in adipocytic (A), chondrogenic (B), osteogenic (B) and endothelial (G) directions.

Фиг.4 - Иммунофлуоресцентное окрашивание на маркер остеогенной дифференцировки (остеокальцин) и маркер пролиферирующих клеток (Ki-67) культур клеток СКЖТ при индукции остеогенной дифференцировки в течение 7 дней, полученных в среде AdvanceSTEM^TM с добавлением фетальной бычьей сыворотки (Adv + FBS) или аутологичной сыворотки крови пациентов (Adv + auto), или в среде DMEM с добавлением фетальной бычьей сыворотки (DMEM + FBS) или аутологичной сыворотки крови пациентов (DMEM + auto).Figure 4 - Immunofluorescence staining for an osteogenic differentiation marker (osteocalcin) and a proliferating cell marker (Ki-67) of SCLC cell cultures by induction of osteogenic differentiation for 7 days, obtained in AdvanceSTEM ^TM supplemented with fetal bovine serum (Adv + FBS) or autologous blood serum of patients (Adv + auto), or in DMEM supplemented with fetal bovine serum (DMEM + FBS) or autologous serum of patients (DMEM + auto).

Фиг.5 - Сравнительный анализ пролиферативной активности стромальных клеток жировой ткани в условиях индукции остеогенной дифференцировки при культивировании в среде AdvanceSTEM^TM (HyClone)/Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) с добавлением фетальной бычьей сыворотки (HyClone) (Adv+FBS) или аутологичной сыворотки крови пациентов (Adv + auto), или в среде DMEM (HyClone)/Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) с добавлением фетальной бычьей сыворотки (HyClone) (DMEM+FBS) или аутологичной сыворотки крови пациентов (DMEM + auto).Figure 5 - Comparative analysis of the proliferative activity of stromal cells of adipose tissue under conditions of induction of osteogenic differentiation when cultured in medium AdvanceSTEM ^TM (HyClone) / Antibiotic / Antimycotic Solution 100x (HyClone) with the addition of fetal bovine serum (HyClone) (Adv + FBS) or autologous patient serum (Adv + auto), or in DMEM (HyClone) / Antibiotic / Antimycotic Solution 100x (HyClone) supplemented with fetal bovine serum (HyClone) (DMEM + FBS) or autologous patient blood serum (DMEM + auto).

Осуществление изобретения.The implementation of the invention.

При осуществлении изобретения помимо методов, подробно раскрытых в нижеследующих примерах, были использованы хорошо известные специалистам методики по культивированию клеток.When carrying out the invention, in addition to the methods described in detail in the following examples, well-known cell culture techniques were used.

Пример 1. Получение первичной культуры СКЖТ человека.Example 1. Obtaining a primary culture of human gastrointestinal tract.

Выделение клеток проводили согласно ранее опубликованному протоколу (Zuk et al., 2001) с некоторыми модификациями. Для получения первичной культуры клеток СКЖТ человека использовали подкожный жир, полученный в результате удаления интактного жирового отложения при проведении пластических/косметических операций. Выделение клеток осуществляли в стерильных условиях ламинарного бокса. Ткань измельчали сосудистыми ножницами до консистенции суспензии мелких (размером не более нескольких кубических миллиметров) кусочков и смешивали с растворами ферментов коллагеназы I типа (200 ед/мл, Worthington Biochemical, США) и диспазы (40 ед/ мл Invitrogen Corporation, Германия) при соотношении объема ткани (в мл) к объему ферментативного раствора (в мл) 1:2. Образец инкубировали при 37°С в течение 30 мин при постоянном покачивании; по окончании инкубации к нему добавляли равный объем среды AdvanceSTEM^TM (HyClone) (# SH30879.01) и центрифугировали при 200g в течение 10 мин.Cell isolation was performed according to a previously published protocol (Zuk et al., 2001) with some modifications. To obtain the primary cell culture of human gastrointestinal tract, subcutaneous fat obtained by removing intact fat deposits during plastic / cosmetic operations was used. Cell isolation was carried out under sterile conditions in a laminar box. The tissue was crushed with vascular scissors to a consistency of a suspension of small pieces (no larger than several cubic millimeters) and mixed with solutions of type I collagenase enzymes (200 units / ml, Worthington Biochemical, USA) and dispase (40 units / ml Invitrogen Corporation, Germany) at a ratio tissue volume (in ml) to the volume of the enzymatic solution (in ml) 1: 2. The sample was incubated at 37 ° C for 30 min with constant swaying; at the end of the incubation, an equal volume of AdvanceSTEM ^™ (HyClone) medium (# SH30879.01) was added to it and centrifuged at 200 g for 10 min.

Белесый поверхностный слой, представленный зрелыми адипоцитами и кусочками ферментативно необработанной ткани, удаляли, а осадок, состоящий из стромальных клеток жировой ткани (СКЖТ), а также остатков соединительной ткани и клеток крови, суспендировали в лизирующем буфере для эритроцитов. Полученную смесь инкубировали 2-3 минуты в 37°С при перемешивании, после чего к образцу добавляли равный объем среды AdvanceSTEM^TM (HyClone) (# SH30879.01) и фильтровали через нейлоновые мембраны (BD Falcon Cell Stainer # 352340) с размером пор 40 микрон. Для очищения популяции стромальных клеток от клеток крови и клеточного дебриса на конечном этапе суспензию центрифугировали при 200g 5 мин. Супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в среде AdvanceSTEM^TM (HyClone) (# SH30879.01)/ Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) (# SV30079.01). Затем высаживали клетки на чашки Петри (Corning) диаметром 60 мм в количестве 1×10⁵ клеток СКЖТ на каждую чашку и культивировали в 4 мл среды AdvanceSTEM^TM (HyClone) (# SH30879.01) / Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) (# SV30079.01) с добавлением либо ФБС (фетальной бычьей сыворотки) (HyClone), либо аутологичной сыворотки крови пациента (донора жировой ткани) (см. пример 2). На следующий день среду культивирования меняли на свежую среду этого же состава и выращивали клетки в CO₂ - инкубаторе (5% СО₂; 95% воздуха) при 37°С. Смену среды проводили каждые 2-3 дня; при достижении монослоя клетки пассировали с использованием HyQTase (HyClone) (# SV30030.01).The whitish surface layer, represented by mature adipocytes and pieces of enzymatically untreated tissue, was removed, and the precipitate, consisting of stromal cells of adipose tissue (SCLC), as well as residues of connective tissue and blood cells, was suspended in erythrocyte lysis buffer. The resulting mixture was incubated for 2-3 minutes at 37 ° C with stirring, after which an equal volume of AdvanceSTEM ^™ (HyClone) medium (# SH30879.01) was added to the sample and filtered through nylon membranes (BD Falcon Cell Stainer # 352340) with a pore size of 40 micron. To purify the stromal cell population from blood cells and cell debris at the final stage, the suspension was centrifuged at 200 g for 5 min. The supernatant was removed and the pellet was resuspended in AdvanceSTEM ^™ (HyClone) (# SH30879.01) / Antibiotic / Antimycotic Solution 100x (HyClone) (# SV30079.01). Then cells were planted on Petri dishes (Corning) with a diameter of 60 mm in an amount of 1 × 10 ⁵ cells of SCLT for each dish and cultured in 4 ml of AdvanceSTEM ^™ (HyClone) medium (# SH30879.01) / Antibiotic / Antimycotic Solution 100x (HyClone) ( # SV30079.01) with the addition of either PBS (fetal bovine serum) (HyClone) or autologous blood serum of the patient (adipose tissue donor) (see example 2). The next day, the culture medium was changed to fresh medium of the same composition and cells were grown in a CO ₂ incubator (5% CO ₂ ; 95% air) at 37 ° C. A change of medium was carried out every 2-3 days; upon reaching the monolayer, the cells were passaged using HyQTase (HyClone) (# SV30030.01).

Пример 2. Выделение аутологичной сыворотки крови пациента.Example 2. The selection of autologous blood serum of the patient.

Забор крови осуществляется на базе медицинских учреждений, имеющих соответствующие медицинские лицензии. Забор крови в количестве 80 мл осуществляли в пробирки с гелем для получения сыворотки крови (Vacuette # 455071 BD, США). При формировании кровяного сгустка пробирки с кровью центрифугировали при 400 rcf в течение 10 минут. Дальнейшее получение сыворотки осуществляли в стерильных условиях ламинарного бокса. Сыворотку (желтый супернатант) отбирали в пробирку и последовательно фильтровали через фильтры 0,45 микрон (Millipore) 0,22 микрона (Millipore). Далее сыворотку использовали для культивирования СКЖТ или замораживали и хранили при температуре -20°С.Blood sampling is carried out on the basis of medical institutions that have appropriate medical licenses. Blood sampling in an amount of 80 ml was carried out in test tubes with a gel to obtain blood serum (Vacuette # 455071 BD, USA). When forming a blood clot, blood tubes were centrifuged at 400 rcf for 10 minutes. Further serum production was carried out under sterile conditions in a laminar box. Serum (yellow supernatant) was collected in a test tube and sequentially filtered through 0.45 micron (Millipore) 0.22 micron (Millipore) filters. Next, the serum was used for cultivation of SCLC or frozen and stored at a temperature of -20 ° C.

Пример 3. Сравнительная оценка пролиферации клеток СКЖТ при культивировании в средах AdvanceSTEM^TM и DMEM.Example 3. Comparative evaluation of cell proliferation of SSC during cultivation in environments of AdvanceSTEM ^TM and DMEM.

Культуру клеток СКЖТ в количестве 1×10⁶ высевали на чашки Петри диаметром 60 мм и культивировали в среде AdvanceSTEM^TM (HyClone)/Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) или DMEM (HyClone)/Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone)c добавлением 10% ФБС (фетальной бычьей сыворотки) (HyClone) или 10% аутологичной сыворотки крови пациента. Каждые 24 часа клетки снимали с чашки с помощью 0,25% раствора трипсина (ПанЭко) и производили подсчет абсолютного числа клеток с помощью прибора для подсчета количества клеток Countess^TM Automated Counter (Invitrogen). Общая длительность эксперимента составляла 120 часов. Статистическую обработку проводили с использованием программы Microsoft Office Excel 2003.A 1 × 10 ⁶ SCLC cell culture was seeded onto 60 mm diameter Petri dishes and cultured in AdvanceSTEM ^™ (HyClone) / Antibiotic / Antimycotic Solution 100x (HyClone) or DMEM (HyClone) / Antibiotic / Antimycotic Solution 100x (HyClone) supplemented 10% FBS (fetal bovine serum) (HyClone) or 10% autologous patient serum. Every 24 hours, cells were removed from the plate using 0.25% trypsin solution (PanEco) and the absolute number of cells was counted using a Countess ^™ Automated Counter (Invitrogen) cell counting device. The total duration of the experiment was 120 hours. Statistical processing was performed using Microsoft Office Excel 2003.

При подсчете клеток, культивируемых в различных средах, было установлено, что максимальный уровень пролиферации демонстрируют клетки, выращиваемые в среде AdvanceSTEM^TM с аутологичной сывороткой (Adv + auto на фиг.1). При этом показатель пролиферативной активности клеток, культивируемых по изобретению, достоверно отличается от соответствующего показателя клеток, выращиваемых как в той же питательной среде с ФБС (Adv + FBS на фиг.1), так и в среде DMEM с АС (прототип, DMEM + auto на фиг.1).When counting cells cultured in various media, it was found that the maximum level of proliferation was demonstrated by cells grown in AdvanceSTEM ^™ medium with autologous serum (Adv + auto in FIG. 1). Moreover, the proliferative activity index of cells cultured according to the invention significantly differs from the corresponding indicator of cells grown both in the same nutrient medium with PBS (Adv + FBS in Fig. 1) and in DMEM medium with AS (prototype, DMEM + auto figure 1).

Поскольку известно, что избыточное стимулирование пролиферации может приводить к повышению уровня апоптоза клеток в культуре, представлялось необходимым получить ответ на вопрос, является ли сочетание среды AdvanceSTEM с аутологичной сывороткой оптимальным для получения культуры СКЖТ с этой точки зрения. Для этой цели была проведена оценка уровня апоптоза и распределения клеток СКЖТ по фазам клеточного цикла методом проточной цитометрии.Since it is known that excessive stimulation of proliferation can lead to an increase in the level of cell apoptosis in culture, it seemed necessary to answer the question whether the combination of AdvanceSTEM medium with autologous serum is optimal for obtaining a culture of SQT from this point of view. For this purpose, the level of apoptosis and the distribution of SQW cells by the phases of the cell cycle were estimated by flow cytometry.

Пример 4. Оценка уровня апоптоза и распределения клеток СКЖТ по фазам клеточного цикла методом проточной цитометрии.Example 4. Evaluation of the level of apoptosis and the distribution of SQW cells by the phases of the cell cycle by flow cytometry.

Для сравнительного анализа пролиферативной активности и уровня апоптоза в культуре клеток СКЖТ, культивированных в среде AdvanceSTEM^TM (HyClone)/ Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) с добавлением ФБС (фетальной бычьей сыворотки) (HyClone) или аутологичной сыворотки крови пациента, было проведено исследование с использованием проточной цитометрии. Клетки СКЖТ снимали с чашек с помощью реагента HyQTase (HyClone), который затем удаляли центрифугированием. Затем суспензию клеток фиксировали ледяным 70% этанолом в течение 2 часов при -20°С и окрашивали в течение 30 минут при комнатной температуре раствором йодистого пропидия (PI на ФСБ, 50 мкг/мл, Invitrogen), содержащего 200 мкг/мл РНКазы-А (Invitrogen) и 0,1% Тритона Х-100. Содержание ДНК в клетках определяли методом проточной цитометрии с помощью клеточного сортера MoFlo (DakoCytomation, Форт Коллинз, США) по флуоресценции йодистого пропидия в диапазоне длин волн 600-625 нм (при возбуждении длиной волны 488 нм) согласно ранее описанному методу (Traganos, 2004). Эксперимент повторяли 2 раза. На фиг.2 представлены результаты одного из экспериментов в виде гистограмм распределения клеток в соответствии с интенсивностью флуоресценции PI, которая пропорциональна количеству ДНК в клетке.For a comparative analysis of proliferative activity and apoptosis level in a culture of cells of gastrointestinal tract cells cultured in AdvanceSTEM ^™ (HyClone) / Antibiotic / Antimycotic Solution 100x (HyClone) supplemented with PBS (fetal bovine serum) (HyClone) or autologous patient blood serum, a study was conducted using flow cytometry. SCLC cells were removed from the plates using a HyQTase reagent (HyClone), which was then removed by centrifugation. The cell suspension was then fixed with ice-cold 70% ethanol for 2 hours at -20 ° C and stained for 30 minutes at room temperature with a solution of propidium iodide (PI on PBS, 50 μg / ml, Invitrogen) containing 200 μg / ml RNase-A (Invitrogen) and 0.1% Triton X-100. The DNA content in the cells was determined by flow cytometry using a MoFlo cell sorter (DakoCytomation, Fort Collins, USA) according to the fluorescence of propidium iodide in the wavelength range of 600-625 nm (when excited with a wavelength of 488 nm) according to the previously described method (Traganos, 2004) . The experiment was repeated 2 times. Figure 2 presents the results of one of the experiments in the form of histograms of the distribution of cells in accordance with the intensity of fluorescence PI, which is proportional to the amount of DNA in the cell.

Апоптотические клетки идентифицировали при помощи Аннексина V, конъюгированного с фикоэритрином (AnV-PE, BD Biosciences, США). AnV селективно связывается с фосфатидилсерином, который в процессе апоптоза перераспределяется с внутренней стороны плазматической мембраны на внешнюю и оказывается доступным для AnV. Для идентификации таких клеток использовали 7-аминоактиномицин D (7-AAD, Beckman Coulter, Франция), окрашивающий ядра мертвых клеток. Для окраски клеток с помощью AnV-PE и 7-AAD клетки снимали с субстрата HyQTase (HyClone) и ресуспендировали в 200 мкл буфера для связывания AnV (BD Biosciences), после чего добавляли 5 мкл AnV-PE и 10 мкл 7-AAD. Клетки инкубировали 15 мин в темноте, после чего центрифугировали при 200g 5 мин, ресуспендировали в 200 мкл фосфатно-солевого буфера и анализировали с помощью проточного цитофлуориметра-клеточного сортера MoFlo (DakoCytomation, Форт Коллинз, США). Флуоресценцию AnV-PE и 7-AAD возбуждали на длине волны 488 нм и анализировали в диапазоне длин волн 565-595 нм и 650-690 нм соответственно.Apoptotic cells were identified using annexin V conjugated with phycoerythrin (AnV-PE, BD Biosciences, USA). AnV selectively binds to phosphatidylserine, which during apoptosis is redistributed from the inside of the plasma membrane to the outside and is available for AnV. To identify such cells, 7-aminoactinomycin D (7-AAD, Beckman Coulter, France), staining the nuclei of dead cells, was used. To stain the cells with AnV-PE and 7-AAD, the cells were removed from the HyQTase substrate (HyClone) and resuspended in 200 μl of AnV binding buffer (BD Biosciences), after which 5 μl of AnV-PE and 10 μl of 7-AAD were added. Cells were incubated for 15 min in the dark, after which they were centrifuged at 200 g for 5 min, resuspended in 200 μl of phosphate-saline buffer and analyzed using a MoFlo flow cytofluorimeter-cell sorter (DakoCytomation, Fort Collins, USA). The fluorescence of AnV-PE and 7-AAD was excited at a wavelength of 488 nm and analyzed in the wavelength range of 565-595 nm and 650-690 nm, respectively.

С помощью метода окрашивания ДНК в клетках СКЖТ флуоресцентным красителем йодистым пропидием и последующего однопараметрического анализа гистограммы распределения ДНК с использованием проточной цитометрии было показано, что средний процент клеток СКЖТ, находящихся в фазах G₂/M клеточного цикла, для среды AdvanceSTEM^TM (HyClone) с добавлением ФБС (фиг.2 Б) составляет 20,60±1,38 (М±m), тогда как для среды AdvanceSTEM^TM (HyClone) с добавлением АС (фиг.2 Г) аналогичный показатель равен 15,89±1,11 (М±m). При анализе данных проточной цитометрии с помощью программы Summit 4.3 (Dako Colorado, США) было установлено, что различия между показателями статистически недостоверны (р>0,05) по U-критерию Манна - Уитни. Не было выявлено достоверных различий ни по количеству клеток, находящихся в S-фазе клеточного цикла (для клеток СКЖТ, культивированных в среде AdvanceSTEM^TM с добавлением ФБС, этот показатель составлял 17,96±1,25 (М±m), а для клеток, культивированных в среде AdvanceSTEM^TM с добавлением АС - 20,77±3,53 (М±m)), ни по количеству клеток, находящихся в G₀/G₁ фазах. Вместе с тем были определены достоверные отличия в уровне апоптических клеток: в случае СКЖТ, культивированных в среде AdvanceSTEM^TM с добавлением ФБС (фиг.2А), этот показатель составлял 2,23±0,3 (М±m), в то время как для клеток, культивированных в среде AdvanceSTEM^TM с добавлением аутологичной сыворотки крови пациента (фиг.2В), аналогичный показатель составлял 1,28±0,5 (М±m). Сходные результаты были получены при сравнении уровня пролиферации и апоптоза методом проточной цитометрии клеток, культивированных в среде DMEM с добавлением аутологичной сыворотки или ФБС: наблюдалось некоторое снижение уровня апоптоза при культивировании с использованием АС по сравнению с ФБС и незначительное увеличение количества клеток, находящихся в фазах G₂/M клеточного цикла (данные не представлены).Using the method of staining DNA in cells of SCJT with fluorescent dye iodide propidium and subsequent one-parameter analysis of the histogram of DNA distribution using flow cytometry, it was shown that the average percentage of cells of SCJT located in the phases G ₂ / M of the cell cycle for AdvanceSTEM ^™ (HyClone) medium with the addition of PBS (Fig. 2 B) is 20.60 ± 1.38 (M ± m), whereas for the AdvanceSTEM ^™ (HyClone) medium with the addition of AS (Fig. 2 G), the similar indicator is 15.89 ± 1.11 (M ± m). When analyzing flow cytometry data using the Summit 4.3 program (Dako Colorado, USA), it was found that the differences between the indicators were statistically unreliable (p> 0.05) according to the Mann - Whitney U-test. No significant differences were found either in the number of cells in the S phase of the cell cycle (for SCLC cells cultured in AdvanceSTEM ^TM supplemented with PBS, this indicator was 17.96 ± 1.25 (M ± m), and for cells cultured in AdvanceSTEM ^TM medium with the addition of AS - 20.77 ± 3.53 (M ± m)), nor by the number of cells in the G ₀ / G ₁ phases. At the same time, significant differences in the level of apoptotic cells were determined: in the case of gastrointestinal tract cultured in AdvanceSTEM ^TM medium supplemented with PBS (Fig. 2A), this indicator was 2.23 ± 0.3 (M ± m), while for cells cultured in AdvanceSTEM ^™ medium supplemented with autologous patient blood serum (Fig. 2B), a similar indicator was 1.28 ± 0.5 (M ± m). Similar results were obtained when comparing the level of proliferation and apoptosis by flow cytometry of cells cultured in DMEM supplemented with autologous serum or PBS: there was a slight decrease in apoptosis when cultured using AS compared with PBS and a slight increase in the number of cells in G phases ₂ / M cell cycle (data not shown).

Таким образом, в ходе исследования было выявлено достоверное снижение числа клеток, находящихся в апоптозе, в случае использования среды AdvanceSTEM^TM с добавлением аутологичной сыворотки крови пациента по сравнению с культивированием в присутствии ФБС. Показатели распределения клеток по фазам клеточного цикла в исследованных культурах достоверно не различались. Из полученных данных можно сделать вывод о том, что сочетание компонентов среды AdvanceSTEM^TM с аутологичной сывороткой крови пациента эффективно стимулирует пролиферацию СКЖТ в культуре без повышения уровня апоптоза.Thus, during the study, a significant decrease in the number of cells in apoptosis was revealed in the case of using AdvanceSTEM ^TM medium with the addition of autologous blood serum of the patient compared to cultivation in the presence of PBS. The distribution of cells by the phases of the cell cycle in the studied cultures did not significantly differ. From the obtained data, it can be concluded that the combination of the components of the AdvanceSTEM ^™ medium with autologous blood serum of the patient effectively stimulates the proliferation of gastrointestinal tract in culture without increasing apoptosis.

Пример 5. Подтверждение мультипотентности клеток СКЖТ, культивированных с использованием среды AdvanceSTEM^TM и аутологичной сыворотки крови пациента.Example 5. Confirmation of the multipotency of cells of gastrointestinal tract cultured using medium AdvanceSTEM ^TM and autologous blood serum of the patient.

Известно, что популяция стромальных клеток, выделяемых из подкожной жировой клетчатки и культивируемых с использованием фетальной бычьей сыворотки, содержит мезенхимные стволовые клетки, обладающие мультипотентными свойствами, то есть способностью дифференцироваться в нескольких направлениях (Zuk et al., 2002). Для проверки мультипотентности, получаемой при культивировании с использованием AdvanceSTEM^TM с аутологичной сывороткой, СКЖТ 2-4 пассажей помещали в среду для индукции адипоцитарной, хондрогенной, эндотелиальной или остеогенной дифференцировки.It is known that a population of stromal cells isolated from subcutaneous adipose tissue and cultured using fetal bovine serum contains mesenchymal stem cells that have multipotent properties, that is, the ability to differentiate in several directions (Zuk et al., 2002). To test the multipotency obtained by culturing using AdvanceSTEM ^™ with autologous serum, SCLT of 2-4 passages was placed in the medium for induction of adipocytic, chondrogenic, endothelial or osteogenic differentiation.

Адипоцитарная дифференцировкаAdipocytic differentiation

Клетки снимали с чашек Петри раствором HyQ^®Tase (HyClone) и высевали на 12 луночные планшеты, предназначенные для культивирования клеток (без покрытия) в концентрации 60 - 100 тыс/мл. Клетки инкубировали в среде AdvanceSTEM^TM/ Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) с добавлением аутологичной сыворотки крови пациента до получения монослоя. Затем среду культивирования удаляли и клетки последовательно инкубировали в средах для индукции адипогенной дифференцировки Adipogenesis Induction Medium (#SCR020FR, Chemicon) и Adipogenesis Maintenance Medium (#SCR020FR, Chemicon) согласно протоколу производителя. Клетки культивировали 21 день, меняя среду в соответствии с протоколом производителя. По окончании эксперимента монослой клеток фиксировали 4% параформальдегидом в PBS 30-40 мин при комнатной температуре, отмывали PBS и водой. Монослой клеток окрашивали Oil Red О Solution (#SCR020FR, Chemicon) no стандартной методике (50 мин при комнатной температуре) для выявления в адипоцитах липидных капель. Затем клетки отмывали и докрашивали ядра гематоксилином. В качестве положительного контроля использовали клетки СКЖТ, культивированные в среде AdvanceSTEM^TM/ Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) с добавлением ФБС (HyClone), которые индуцировали в направлении адипоцитарной дифференцировки аналогичным образом; в качестве отрицательного контроля использовали СКЖТ, культивированные в AdvanceSTEM^TM с ФБС без дальнейшей индукции дифференцировки. Эксперимент был повторен 3 раза с использованием СКЖТ, полученных от разных доноров.Cells were removed from Petri dishes with HyQ ^® Tase solution (HyClone) and plated on 12 well plates intended for cell cultivation (without coating) at a concentration of 60-100 thousand / ml. Cells were incubated in AdvanceSTEM ^™ / Antibiotic / Antimycotic Solution 100x (HyClone) supplemented with autologous patient blood serum until a monolayer was obtained. The culture medium was then removed and the cells were sequentially incubated in adipogenetic differentiation induction media Adipogenesis Induction Medium (# SCR020FR, Chemicon) and Adipogenesis Maintenance Medium (# SCR020FR, Chemicon) according to the manufacturer's protocol. Cells were cultured for 21 days, changing the medium in accordance with the manufacturer's protocol. At the end of the experiment, the cell monolayer was fixed with 4% paraformaldehyde in PBS for 30-40 min at room temperature, washed with PBS and water. The cell monolayer was stained with Oil Red О Solution (# SCR020FR, Chemicon) using a standard technique (50 min at room temperature) to detect lipid droplets in adipocytes. Then the cells were washed and stained with hematoxylin nuclei. As a positive control, cells were used SCLC, cultured in medium AdvanceSTEM ^™ / Antibiotic / Antimycotic Solution 100x (HyClone) with the addition of PBS (HyClone), which were induced in the direction of adipocytic differentiation in a similar way; as a negative control, SCLCs cultured in AdvanceSTEM ^™ with PBS without further induction of differentiation were used. The experiment was repeated 3 times using SCLC obtained from different donors.

Через 21 день культивирования СКЖТ в средах для индукции адипогенной дифференцировки клетки содержали большое количество липидных капель разного размера красного цвета, выявляемых при окраске Oil Red О Solution (#SCR020FR, Chemicon) (фиг.3А). При анализе СКЖТ, культивированных без индукции адипогенной дифференцировки, иногда встречались отдельные клетки, содержащие мелкие капли, окрашенные Oil Red, что свидетельствует о возможности спонтанной дифференцировки в адипогенном направлении в культуре. В случае положительного контроля (СКЖТ, культивированные с добавлением ФБС) интенсивность окрашивания культуры с использованием Oil Red не отличалась от клеток, культивированных с добавлением аутологичной сыворотки крови пациента. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при культивировании СКЖТ в среде по изобретению они в полной мере сохраняют способность к адипоцитарной дифференцировке при индукции в соответствующих условиях.After 21 days of culturing SQL in adipogenic differentiation induction media, the cells contained a large number of lipid droplets of various sizes of red, detected by Oil Red O Solution staining (# SCR020FR, Chemicon) (Fig. 3A). In the analysis of gastrointestinal tract, cultured without induction of adipogenic differentiation, sometimes isolated cells containing small droplets stained with Oil Red were found, which indicates the possibility of spontaneous differentiation in the adipogenic direction in culture. In the case of a positive control (SCLC cultured with PBS), the staining intensity of the culture using Oil Red did not differ from the cells cultured with the addition of autologous blood serum of the patient. The results obtained indicate that when culturing SQT in the medium according to the invention, they fully retain the ability to adipocytic differentiation upon induction under appropriate conditions.

Хондрогенная дифференцировкаChondrogenic differentiation

Клетки снимали с чашек Петри раствором HyQ^®Tase (HyClone) и высевали на 12 луночные планшеты, предназначенные для культивирования клеток (без покрытия) в концентрации 60-100 тыс/мл. Клетки инкубировали в среде AdvanceSTEM^TM (HyClone)/ Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) с добавлением аутологичной сыворотки крови пациента до получения монослоя. Затем среду культивирования удаляли, клетки снимали с чашек Петри раствором HyQ^®Tase (HyClone) и центрифугировали в 1,5 мл пробирках по 2 млн клеток в пробирке при 200 g в течение 10 минут. Супернатант удаляли и добавляли к осадку клеток 1,5 мл среды для хондрогенной дифференцировки AdvanceSTEM^TM Chondrogenic differentiation Medium (#SH30889.02, HyClone). Клетки инкубировали 28 дней, меняя среду каждые 3 дня в соответствии с протоколом производителя. В качестве положительного контроля использовали клетки СКЖТ, культивированные в среде AdvanceSTEM^TM (HyClone)/Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) с добавлением ФБС (HyClone), которые индуцировали в направлении хондрогенной дифференцировки таким же образом; в качестве отрицательного контроля использовали СКЖТ, выращенные в среде с добавлением ФБС, без дальнейшей индукции дифференцировки. По окончании эксперимента клетки, культивированные в среде для индукции хондрогенной дифференцировки, формировали плотные образования на дне пробирки. Полученные клеточные агрегаты замораживали в среде Tissue-Tek® О.С.Т. Compound и резали на криостате Microm HM 525 (Leica, Германия). Толщина срезов составляла 6-8 микрон. Срезы фиксировали 4% параформальдегидом и окрашивали гематоксилином Карачи (Bio-Optica, Italy) или толуидиновым синим (Bio-Optica, Italy) для выявления структур, характерных для хрящевой ткани. Эксперимент был повторен 3 раза с использованием СКЖТ, полученных от разных доноров.Cells were removed from Petri dishes with a solution of HyQ ^® Tase (HyClone) and plated on 12 well plates designed for cell cultivation (without coating) at a concentration of 60-100 thousand / ml. Cells were incubated in AdvanceSTEM ^™ (HyClone) / Antibiotic / Antimycotic Solution 100x (HyClone) medium supplemented with autologous patient serum until a monolayer was obtained. Then the culture medium was removed, the cells were removed from Petri dishes with a solution of HyQ ^® Tase (HyClone) and centrifuged in 1.5 ml tubes of 2 million cells in a tube at 200 g for 10 minutes. The supernatant was removed and 1.5 ml AdvanceSTEM ^™ Chondrogenic differentiation Medium chondrogenic differentiation medium (# SH30889.02, HyClone) was added to the cell pellet. Cells were incubated for 28 days, changing the medium every 3 days in accordance with the manufacturer's protocol. As a positive control, SCLC cells cultured in AdvanceSTEM ^™ (HyClone) / Antibiotic / Antimycotic Solution 100x (HyClone) medium supplemented with PBS (HyClone), which were induced in the direction of chondrogenic differentiation in the same way, were used; as a negative control, we used SCLC grown in a medium supplemented with PBS without further induction of differentiation. At the end of the experiment, cells cultured in a medium for the induction of chondrogenic differentiation formed dense formations at the bottom of the tube. The resulting cell aggregates were frozen in Tissue-Tek® O.S.T. Compound and cut on a Microm HM 525 cryostat (Leica, Germany). The thickness of the sections was 6-8 microns. Sections were fixed with 4% paraformaldehyde and stained with Karachi hematoxylin (Bio-Optica, Italy) or toluidine blue (Bio-Optica, Italy) to reveal structures characteristic of cartilage tissue. The experiment was repeated 3 times using SCLC obtained from different donors.

Через 28 дней культивирования в среде для индукции хондрогенной дифференцировки клеток, при окрашивании гематоксилином Карачи или толуидиновым синим, наблюдалось формирование плотных структур на дне пробирки, характерных для новообразующегося хряща с хондроцитами (фиг.3Б). В случае положительного контроля (СКЖТ, культивированных с добавлением ФБС) наблюдалось формирование аналогичных структур. В случае отрицательного контроля СКЖТ не формировали плотных образований и оставались в виде отдельных клеток. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при культивировании с использованием аутологичной сыворотки крови пациента СКЖТ в полной мере сохраняют способность дифференцироваться в хондрогенном направлении в условиях соответствующей индукции.After 28 days of cultivation in a medium for the induction of chondrogenic differentiation of cells, when stained with Karachi hematoxylin or toluidine blue, the formation of dense structures at the bottom of the tube characteristic of the emerging cartilage with chondrocytes was observed (Fig.3B). In the case of a positive control (SCLC cultured with the addition of PBS), the formation of similar structures was observed. In the case of a negative control, SCLC did not form dense formations and remained as separate cells. The results obtained indicate that, when cultured using autologous blood serum of the patient, SZHT fully retain the ability to differentiate in the chondrogenic direction under conditions of appropriate induction.

Эндотелиальная дифференцировка.Endothelial differentiation.

Клетки снимали с чашек Петри раствором HyQ^®Tase (HyClone) и высевали на 12-луночные планшеты, предназначенные для культивирования клеток (без покрытия) в концентрации 60-100 тыс/мл. Клетки инкубировали в среде AdvanceSTEM^TM (HyClone)/ Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) с добавлением аутологичной сыворотки крови пациента до получения монослоя. Затем среду культивирования удаляли и добавляли среду для индукции эндотелиальной дифференцировки следующего состава: ЕВМ^®-2 с набором факторов роста (Endothelial Cell Basal Medium-2, Clonetics®, Lonza #CC3202). Клетки культивировали 14 дней в среде для индукции эндотелиальной дифференцировки, при этом среду культивирования меняли на свежую ежедневно в соответствии с протоколом производителя. По окончании эксперимента клетки фиксировали. Клетки, вступившие в эндотелиальную дифференцировку, выявляли иммуноцитохимически с помощью антител против CD31 человека - маркера зрелых эндотелиальных клеток. Для этого клетки промывали теплым фосфатно-солевым буфером (ФСБ: 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 4,3 мМ Na₂HPO₄*2H₂O, 1,4 мМ KH₂PO₄), фиксировали в 4% формалином на ФСБ в течение 15 мин и отмывали в ФСБ 3 раза по 10 мин. Для предотвращения неспецифического связывания стекла с клетками инкубировали в 10% растворе нормальной сыворотки донора вторых антител на 1% БСА (бычий сывороточный альбумин) в ФСБ в течение 40 мин. После этого наносили первые антитела против CD31 (PECAM-1) (mouse antirat, Pharmingen 22711D) в концентрации, рекомендованной производителем, разведенные на 1% БСА, и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Клетки отмывали от первых антител в ФСБ 3 раза по 10 мин и наносили вторые антитела, меченные флуорохромом Alexa Fluor® 488 (Molecular Probes, A-21203), и инкубировали в течение 40-50 мин, отмывали в ФСБ 3 раза по 10 минут и докрашивали ядра DAPI (Molecular Probes, США) в концентрации 1 мкл/1 мл ФСБ в течение 20 минут. Затем клетки промывали 3 раза по 10 минут в ФСБ и заключали в водорастворимой специализированной среде для заключения иммунофлуоресцентных препаратов (Polysciences, Inc США). Препараты анализировали при помощи флуоресцентного микроскопа Leica AF600 LX (Германия). В качестве положительного контроля использовали клетки СКЖТ, культивированные в среде AdvanceSTEM^TM (HyClone)/Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) с добавлением ФБС (HyClone), которые индуцировали в направлении эндотелиальной дифференцировки тем же способом, что и опытные; в качестве отрицательного контроля использовали СКЖТ, культивированные в среде с использованием ФБС, без дальнейшей индукции дифференцировки. Эксперимент был повторен 3 раза с использованием СКЖТ, полученных от разных доноров.Cells were removed from Petri dishes with HyQ ^® Tase solution (HyClone) and plated on 12-well plates intended for cell cultivation (without coating) at a concentration of 60-100 thousand / ml. Cells were incubated in AdvanceSTEM ^™ (HyClone) / Antibiotic / Antimycotic Solution 100x (HyClone) medium supplemented with autologous patient serum until a monolayer was obtained. Then, the culture medium was removed and medium was added to induce endothelial differentiation of the following composition: EBM ^® -2 with a set of growth factors (Endothelial Cell Basal Medium-2, Clonetics®, Lonza # CC3202). Cells were cultured for 14 days in an environment for the induction of endothelial differentiation, while the culture medium was changed to fresh daily in accordance with the manufacturer's protocol. At the end of the experiment, the cells were fixed. Cells that entered the endothelial differentiation were detected immunocytochemically using antibodies against human CD31, a marker of mature endothelial cells. For this, the cells were washed with warm phosphate-saline buffer (FSB: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na ₂ HPO ₄ * 2H ₂ O, 1.4 mM KH ₂ PO ₄ ), fixed in 4% formalin on the FSB for 15 minutes and washed in the FSB 3 times for 10 minutes. To prevent non-specific binding of glass to cells, they were incubated in a 10% solution of normal serum of the donor of the second antibodies in 1% BSA (bovine serum albumin) in FSB for 40 min. After that, the first anti-CD31 antibodies (PECAM-1) (mouse antirat, Pharmingen 22711D) were applied at the concentration recommended by the manufacturer, diluted in 1% BSA and incubated for 1 hour at room temperature. Cells were washed from the first antibodies in the FSB 3 times for 10 minutes and the second antibodies were labeled with Alexa Fluor® 488 fluorochrome (Molecular Probes, A-21203) and incubated for 40-50 minutes, washed in the FSB 3 times for 10 minutes and stained DAPI nuclei (Molecular Probes, USA) at a concentration of 1 μl / 1 ml of FSB for 20 minutes. Then the cells were washed 3 times for 10 minutes in PBS and enclosed in a water-soluble specialized medium for the conclusion of immunofluorescence preparations (Polysciences, Inc USA). The preparations were analyzed using a Leica AF600 LX fluorescence microscope (Germany). As a positive control, we used SCJT cells cultured in AdvanceSTEM ^™ (HyClone) / Antibiotic / Antimycotic Solution 100x (HyClone) medium supplemented with PBS (HyClone), which were induced in the direction of endothelial differentiation in the same way as the experimental ones; as a negative control, SKZhT cultured in the medium using PBS without further induction of differentiation were used. The experiment was repeated 3 times using SCLC obtained from different donors.

Через две недели индукции в опыте были обнаружены тубулярные структуры и островки клеток, несущие CD31-маркер зрелых эндотелиоцитов (фиг.3Г). Полученные результаты свидетельствуют о том, что при культивировании СКЖТ в AdvanceSTEM^TM с АС они полностью сохраняют свой потенциал к дифференцировке в эндотелиальном направлении.After two weeks of induction, tubular structures and islets of cells bearing a CD31 marker of mature endotheliocytes were detected in the experiment (Fig. 3G). The results obtained indicate that when culturing SQT in AdvanceSTEM ^™ with AS they completely retain their potential for differentiation in the endothelial direction.

Остеогенная дифференцировкаOsteogenic differentiation

Клетки снимали с чашек Петри раствором HyQ^®Tase (HyClone) и высевали на 12-луночные планшеты, предназначенные для культивирования клеток (без покрытия) в концентрации 60-100 тыс/мл. Клетки инкубировали в среде AdvanceSTEM^TM (HyClone)/ Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) с добавлением аутологичной сыворотки крови пациента до получения монослоя. Затем среду культивирования удаляли и добавляли среду для индукции остеогенной дифференцировки. В качестве остеогенной среды использовали среду культивирования AdvanceSTEM^TM (HyClone)/ Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) с добавлением компонентов коммерческого кита AdvanceSTEM Osteogenic Differentiation Kit (#SH30877.KT, HyClone), согласно инструкции производителя. Клетки культивировали 14-17 дней, меняя среду каждые 2-3 дня. По окончании индукции остеогенной дифференцировки монослой клеток фиксировали 70% этанолом в течение 1 часа при комнатной температуре, отмывали и окрашивали Ализариновым красным (Alizarin Red Solution, Chemicon) no стандартной методике (30 мин при комнатной температуре) для выявления отложений кальция в остеоцитах, согласно инструкции производителя. В качестве положительного контроля использовали клетки СКЖТ, культивированные в среде AdvanceSTEM^TM (HyClone)/ Antibiotic/Antimycotic Solution 100x (HyClone) с добавлением ФБС (HyClone), которые индуцировали в направлении остеогенной дифференцировки тем же способом, что и опытные; в качестве отрицательного контроля использовали СКЖТ, выращенные в среде AdvanceSTEM^TM с добавлением ФБС, без дальнейшей индукции дифференцировки. Эксперимент был повторен 3 раза с использованием СКЖТ, полученных от разных доноров.Cells were removed from Petri dishes with HyQ ^® Tase solution (HyClone) and plated on 12-well plates intended for cell cultivation (without coating) at a concentration of 60-100 thousand / ml. Cells were incubated in AdvanceSTEM ^™ (HyClone) / Antibiotic / Antimycotic Solution 100x (HyClone) medium supplemented with autologous patient serum until a monolayer was obtained. Then the culture medium was removed and medium was added to induce osteogenic differentiation. AdvanceSTEM ^™ (HyClone) / Antibiotic / Antimycotic Solution 100x (HyClone) cultivation medium was used as the osteogenic medium with the addition of components of the commercial AdvanceSTEM Osteogenic Differentiation Kit (# SH30877.KT, HyClone), according to the manufacturer's instructions. Cells were cultured for 14-17 days, changing the environment every 2-3 days. At the end of the osteogenic differentiation induction, the cell monolayer was fixed with 70% ethanol for 1 hour at room temperature, washed and stained with Alizarin Red Solution, Chemicon according to the standard procedure (30 min at room temperature) to detect calcium deposits in osteocytes, according to the instructions manufacturer. As a positive control, we used SCJT cells cultured in AdvanceSTEM ^™ (HyClone) / Antibiotic / Antimycotic Solution 100x (HyClone) medium supplemented with PBS (HyClone), which were induced in the direction of osteogenic differentiation in the same way as the experimental ones; as a negative control, we used SCLC grown in AdvanceSTEM ^TM medium supplemented with PBS without further induction of differentiation. The experiment was repeated 3 times using SCLC obtained from different donors.

Через 14-17 дней культивирования в среде для индукции остеогенной дифференцировки опытные СКЖТ формировали плотный монослой клеток, большая часть которых при окраске Ализариновым красным содержала отложения кальция в виде крупных агрегатов оранжево-красного цвета, расположеных между слоем клеток и чашкой Петри (фиг.3В). Полученные результаты свидетельствуют о том, что при культивировании СКЖТ в AdvanceSTEM^TM с АС они в полной мере сохраняют способность дифференцироваться в остеогенном направлении при индукции в соответствующей среде.After 14-17 days of cultivation in an environment for the induction of osteogenic differentiation, the experimental SCLs formed a dense monolayer of cells, most of which, when stained with Alizarin red, contained calcium deposits in the form of large orange-red aggregates located between the cell layer and the Petri dish (Fig.3B) . The results obtained indicate that during the cultivation of gastrointestinal tract in AdvanceSTEM ^™ with AS, they fully retain the ability to differentiate in the osteogenic direction by induction in the appropriate medium.

Таким образом, при культивировании СКЖТ в среде AdvanceSTEM^TM (HyClone)/ Antibiotic/Antimycotic Solution 100x (HyClone) в сочетании с аутологичной сывороткой крови пациента клетки демонстрируют характерные для мезенхимных стволовых клеток мультипотентные свойства, выражающиеся в их способности при индукции в соответствующих средах дифференцироваться по меньшей мере в четырех исследованных направлениях: адипогенном, хондрогенном, эндотелиальном и остеогенном.Thus, when culturing SQL in AdvanceSTEM ^™ (HyClone) / Antibiotic / Antimycotic Solution 100x (HyClone) medium in combination with the patient’s autologous blood serum, the cells exhibit multipotent properties characteristic of mesenchymal stem cells, which are expressed in their ability to differentiate by induction in the corresponding media according to in at least four areas studied: adipogenic, chondrogenic, endothelial and osteogenic.

Пример 6. Оценка способности СКЖТ, культивированных с использованием сред разного состава, к остеогенной дифференцировке.Example 6. Evaluation of the ability of gastrointestinal tract, cultured using media of different compositions, to osteogenic differentiation.

При проведении предварительной серии экспериментов по изучению способности к различным видам дифференцировки клеток, культивированных согласно методике, предлагаемой в прототипе, нами был отмечен недостаточно высокий потенциал этих клеток в плане индукции к остеогенной дифференцировке. В связи с этим было проведено более детальное исследование зависимости способности СКЖТ к остеогенной дифференцировке от используемой при их культивировании среды.When conducting a preliminary series of experiments to study the ability of different types of differentiation of cells cultured according to the methodology proposed in the prototype, we noted an insufficiently high potential of these cells in terms of induction to osteogenic differentiation. In this regard, a more detailed study was conducted of the dependence of the ability of SCJT for osteogenic differentiation on the medium used in their cultivation.

Клетки культивировали до 2-го пассажа в средах AdvanceSTEM^TM (HyClone)/Antibiotic/Antimycotic Solution 100x (HyClone) и DMEM (HyClone)/ Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) с добавлением в каждом случае 10% аутологичной сыворотки или 10% ФСБ. Затем клетки высаживали на 8-луночные стеклянные плашки (Lab-Tek Chamber Slide, Nalge Nunc Int.) и на следующий день меняли среду культивирования на среду для индукции остеогенной дифференцировки. После 7 дней индукции оценивали уровень дифференцировки клеток, а также их пролиферативную активность методом двойного иммунофлуоресцентного окрашивания. Для иммунофлуоресцентного анализа клетки фиксировали в 4% растворе формалина (Sigma, США) на PBS (фосфатно-солевой буфер) в течение 2 мин при комнатной температуре с последующей 3-кратной отмывкой в PBS. После отмывки клетки покрывали 1% раствором БСА (бычий сывороточный альбумин) с 10% козьей сывороткой в течение 30 мин и инкубировали при комнатной температуре с кроличьими антителами против остеокальцина (Santa Cruz, #sc-30044) - маркера остеогенной дифференцировки и мышиными антителами против Ki-67 (BD, # 550609) - маркера пролиферирующих клеток в течение 1 часа. В качестве отрицательного контроля использовался 1% раствор БСА с 10% козлиной сывороткой. После отмывки в PBS клетки в течение 30 мин при комнатной температуре инкубировали в растворе PBS с флуоресцентно меченными вторичными козьими антителами (1:100) против иммуноглобулинов мыши (Alexa 488, Molecular Probes, США) или против иммуноглобулина кролика (Alexa 568, Molecular Probes, США).Cells were cultured before passage 2 in AdvanceSTEM ^™ (HyClone) / Antibiotic / Antimycotic Solution 100x (HyClone) and DMEM (HyClone) / Antibiotic / Antimycotic Solution 100x (HyClone) media supplemented with 10% autologous serum or 10% FSB in each case . Then the cells were plated on 8-well glass plates (Lab-Tek Chamber Slide, Nalge Nunc Int.) And the next day the culture medium was changed to medium for the induction of osteogenic differentiation. After 7 days of induction, the level of cell differentiation was assessed, as well as their proliferative activity by double immunofluorescence staining. For immunofluorescence analysis, the cells were fixed in 4% formalin solution (Sigma, USA) on PBS (phosphate-buffered saline) for 2 min at room temperature, followed by 3-fold washing in PBS. After washing, the cells were coated with 1% BSA solution (bovine serum albumin) with 10% goat serum for 30 min and incubated at room temperature with rabbit anti-osteocalcin antibodies (Santa Cruz, # sc-30044), a marker of osteogenic differentiation and mouse anti-Ki antibodies -67 (BD, # 550609) - a marker of proliferating cells for 1 hour. A 1% BSA solution with 10% goat serum was used as a negative control. After washing in PBS, the cells were incubated for 30 min at room temperature in a PBS solution with fluorescently labeled secondary goat antibodies (1: 100) against mouse immunoglobulins (Alexa 488, Molecular Probes, USA) or against rabbit immunoglobulin (Alexa 568, Molecular Probes, USA).

Полученные результаты представлены на фиг.4 и фиг.5. Остеогенную дифференцировку через 7 дней наблюдали только в культуре СКЖТ, культивированных в AdvanceSTEM^TM с добавлением аутологичной сыворотки (фиг.4). Во всех остальных случаях (AdvanceSTEM^TM с 10% ФБС, DMEM с 10% аутологичной сывороткой и DMEM с 10% ФБС) отчетливые признаки остеогенной дифференцировки появлялись только на 21 день. Кроме того, только в условиях культивирования AdvanceSTEM^TM с 10% аутологичной сывороткой в культуре сохранялся высокий уровень пролиферации при индукции остеогенной дифференцировки. При всех вариантах культивирования, кроме AdvanceSTEM^TM с 10% АС на 7 день индукции остеогенной дифференцировки обнаруживались лишь отдельные Ki-67 - позитивные клетки (фиг.4), являющиеся свидетельством того, что популяция представляет собой культуру переживающих дифференцирующихся клеток с низким уровнем клеточных делений.The results are presented in figure 4 and figure 5. Osteogenic differentiation after 7 days was observed only in the culture of SCLT cultured in AdvanceSTEM ^™ with the addition of autologous serum (figure 4). In all other cases (AdvanceSTEM ^™ with 10% FBS, DMEM with 10% autologous serum, and DMEM with 10% FBS), clear signs of osteogenic differentiation appeared only on day 21. In addition, only under cultivation of AdvanceSTEM ^™ with 10% autologous serum in the culture, a high level of proliferation was maintained during the induction of osteogenic differentiation. In all cultivation variants, except AdvanceSTEM ^™ with 10% AS on the 7th day of induction of osteogenic differentiation, only individual Ki-67 positive cells were detected (Fig. 4), which indicates that the population is a culture of surviving differentiating cells with a low level of cell divisions .

В количественном отношении пролиферацию клеток в дифференцирующейся культуре оценивали способом, описанным в примере 3. Из данных, приведенных на фиг.5, с очевидностью следует, что доля пролиферирующих СКЖТ (%Ki-67 позитивных клеток) в культуре, индуцированной к остеогенной дифференцировке, для клеток, культивированных в AdvanceSTEM^TM с аутологичной сывороткой (Adv + auto на фиг.5) в несколько раз выше, чем для клеток, выращенных в любой другой среде (в сравнении с той же средой, с добавлением 10% ФБС - примерно в 5 раз; в сравнении с DMEM в сочетании с АС (прототип) - примерно в 4 и в сравнении с DMEM в комбинации с ФБС - примерно в 8 раз). При этом особое внимание обращает на себя факт 4-кратного увеличения данного показателя в сравнении с прототипом (рост доли Ki-67 позитивных клеток от 10 до 40%), который является неожиданным, поскольку сама по себе замена питательной среды (DMEM - в прототипе на AdvanceSTEM^TM - в изобретении) не предполагает такого значительного роста пролиферативной активности, что с очевидностью следует из оценки результатов аналогичной замены при культивировании с использованием ФБС (сравни 2-й и 4-й столбики на фиг.5). Соответственно, может быть сделан вывод о том, что неожиданно высокий уровень пролиферации в условиях индукции остеогенной дифференцировки достигается только благодаря предлагаемой нами в изобретении комбинации питательной среды и сыворотки.In quantitative terms, cell proliferation in a differentiating culture was evaluated by the method described in example 3. From the data shown in Fig. 5, it clearly follows that the proportion of proliferating SLCT (% Ki-67 positive cells) in the culture induced to osteogenic differentiation, for cells cultured in AdvanceSTEM ^™ with autologous serum (Adv + auto in FIG. 5) are several times higher than for cells grown in any other medium (compared to the same medium supplemented with 10% FBS - approximately 5 times ; in comparison with DMEM in combination with AS (protot n) - about 4 and in comparison with DMEM combined with PBS - about 8 times). In this case, the fact of a 4-fold increase in this indicator in comparison with the prototype (an increase in the proportion of Ki-67 positive cells from 10 to 40%), which is unexpected since the replacement of the nutrient medium in itself (DMEM in the prototype by AdvanceSTEM ^™ - in the invention) does not imply such a significant increase in proliferative activity, which obviously follows from the evaluation of the results of a similar replacement during cultivation using PBS (compare the 2nd and 4th columns in figure 5). Accordingly, it can be concluded that an unexpectedly high level of proliferation under conditions of induction of osteogenic differentiation is achieved only due to the combination of culture medium and serum that we propose in the invention.

Таким образом, сочетание основной питательной среды AdvanceSTEM^TM (HyClone)/ Antibiotic/Antimycotic Solution 100x (HyClone) и аутологичной сыворотки крови пациента при культивировании СКЖТ согласно настоящему изобретению обеспечивает: а) более высокую пролиферативную активность клеток в культуре без отрицательного влияния на уровень апоптоза; б) получение культуры с лучшими, чем в прототипе, показателями сохранения мультипотентных свойств, в частности, обладающей значительно более высоким потенциалом в плане индукции остеогенной дифференцировки и способности клеток к пролиферации в этих условиях, чем культура, выращенная в среде DMEM + AC.Thus, the combination of the main nutrient medium AdvanceSTEM ^™ (HyClone) / Antibiotic / Antimycotic Solution 100x (HyClone) and the patient’s autologous blood serum during culturing of gastrointestinal tract according to the present invention provides: a) a higher proliferative activity of cells in the culture without negatively affecting the level of apoptosis; b) obtaining a culture with better than in the prototype indicators of the preservation of multipotent properties, in particular, with a significantly higher potential in terms of inducing osteogenic differentiation and the ability of cells to proliferate under these conditions than a culture grown in DMEM + AC.

Получаемая способом по изобретению культура плюрипотентных клеток может в дальнейшем эффективно и безопасно использоваться в клинике для лечения целого ряда заболеваний человека: сердечно-сосудистых заболеваний, повреждений нервной системы различного генеза, урологических, гинекологических заболеваний и бесплодия, заболеваний пародонта, дефектов костного аппарата, заболеваний суставов, лечения обширных ожогов, а также для коррекции возрастных изменений и кожных дефектов в дерматокосметологии.The pluripotent cell culture obtained by the method according to the invention can be effectively and safely used in the clinic for the treatment of a number of human diseases: cardiovascular diseases, damage to the nervous system of various origins, urological, gynecological and infertility diseases, periodontal diseases, bone defects, joint diseases , treatment of extensive burns, as well as for the correction of age-related changes and skin defects in dermatocosmetology.

Источники информацииInformation sources

Claims

1. Medium for the cultivation of stromal cells from human adipose tissue, which includes the main nutrient medium for the cultivation of undifferentiated mesenchymal stem cells with the addition of antibiotics and antimycotics, and 10% autologous blood serum, characterized in that it contains the medium as the specified nutrient medium AdvanceSTEM ^TM (HyClone).

2. A method of cultivating stromal cells from human adipose tissue, comprising the use for growing these cells of the medium described in claim 1.