RU2416197C1 - Method of cryopreservation of hematopoietic stem cells of umbilical blood - Google Patents
Method of cryopreservation of hematopoietic stem cells of umbilical blood Download PDFInfo
- Publication number
- RU2416197C1 RU2416197C1 RU2009146082/21A RU2009146082A RU2416197C1 RU 2416197 C1 RU2416197 C1 RU 2416197C1 RU 2009146082/21 A RU2009146082/21 A RU 2009146082/21A RU 2009146082 A RU2009146082 A RU 2009146082A RU 2416197 C1 RU2416197 C1 RU 2416197C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sample
- stem cells
- temperature
- freezing
- speed
- Prior art date
Links
Abstract
Description
Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови относится к области медицины, в частности к трансфузиологии.The method of cryopreservation of hematopoietic cord blood stem cells relates to medicine, in particular to transfusion.
Клеточные технологии на основе применения стволовых клеток развиваются во всем мире достаточно интенсивно. Медицинские центры различных стран все чаще используют аутологичные и аллогенные гемопоэтические и мезенхимальные стволовые клетки в практическом здравоохранении. Пуповинная кровь является одним из четырех основных источников получения стволовых клеток. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток из пуповинной крови развивается наиболее быстрыми темпами. Только в одном американском Регистре (National Marrow Donor Program) на 2008 г. хранится 50000 образцов стволовых клеток, полученных из пуповинной крови. Медицинские научные центры специально изучают и исследуют возможности оптимальной транспортировки и криоконсервации клеток, полученных из пуповинной крови. Теоретически с момента замораживания стволовые клетки и клетки-предшественники находятся в жидком азоте при температуре -196°С и могут оставаться в этом состоянии достаточно долго. После 15 лет хранения размороженные гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) восстанавливались в среднем на 84%. Сохранность функциональности этих размороженных клеток - предшественников доказывается пролиферативной способностью гемопоэтических стволовых клеток. Клетки CD34+CD38-, изолированные из размороженных единиц пуповинной крови, после 15 летней заморозки способны к более чем 250 - кратному размножению и более того, приживление происходит с такой же частотой, как клетки CD34+ из свежевыделенной пуповинной крови. Итак, установлено, что гемопоэтические стволовые клетки, полученные из пуповинной крови, приживаются при трансплантации у людей-реципиентов.Cellular technologies based on the use of stem cells are developing all over the world quite intensively. Medical centers in various countries are increasingly using autologous and allogeneic hematopoietic and mesenchymal stem cells in practical health care. Cord blood is one of the four main sources of stem cell production. Hematopoietic stem cell transplantation from umbilical cord blood develops most rapidly. The 2008 National Marrow Donor Program alone holds 50,000 stem cell samples obtained from cord blood. Medical research centers specifically study and investigate the possibilities of optimal transportation and cryopreservation of cells obtained from cord blood. Theoretically, from the moment of freezing, stem cells and progenitor cells are in liquid nitrogen at a temperature of -196 ° C and can remain in this state for a long time. After 15 years of storage, thawed hematopoietic stem cells (HSCs) were restored on average by 84%. The preservation of the functionality of these thawed progenitor cells is proved by the proliferative ability of hematopoietic stem cells. CD34 + CD38 - cells isolated from thawed units of cord blood, after 15 years of freezing, are capable of more than 250-fold reproduction and, moreover, engraftment occurs at the same frequency as CD34 + cells from freshly isolated cord blood. So, it has been established that hematopoietic stem cells obtained from cord blood take root during transplantation in human recipients.
В технологии консервирования гемопоэтических стволовых клеток известны способы их криоконсервирования, например, см. п. РФ №2233589, A01N 1/02, дата публикации патента 10.08.2004 г. «Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток человека», который включает добавление в суспензию клеток криопротектора диметилсульфоксид (ДМСО), трехэтапное замораживание суспензии с последующим оттаиванием. На первом этапе осуществляют замораживание до температур (-8,5)-(-10,5)°С со скоростью 0,7-1,2°С с применением сидинга (кристаллизации) при температурах (-3,5)-(-4)°С с концентрацией криопротектора 0,4-1,45 моль/л; на втором этапе охлаждают до температур (-30)-(-40)°С со скоростью 1,0-4,5°С; после второго этапа осуществляют температурную остановку при температурах (-30)-(-40)°С в течение 3-5 минут, а на третьем этапе охлаждают со скоростью 10-12°С/мин до (-130)-(196)°С. Подбор значений температур и скоростей охлаждений подобраны эмпирическим лабораторным путем. Гемопоэтические стволовые клетки получены из разных материалов: кордовой крови, эмбриональной печени, периферической крови, костного мозга.In the technology for preserving hematopoietic stem cells, methods for their cryopreservation are known, for example, see paragraphs of the Russian Federation No. 2233589, A01N 1/02, patent publication date 08/10/2004, “Method for the cryopreservation of human hematopoietic stem cells”, which includes adding a cryoprotectant to the suspension of cells dimethyl sulfoxide (DMSO), three-stage freezing of the suspension, followed by thawing. At the first stage, freezing is carried out to temperatures (-8.5) - (- 10.5) ° С at a rate of 0.7-1.2 ° С using siding (crystallization) at temperatures (-3.5) - (- 4) ° C with a cryoprotectant concentration of 0.4-1.45 mol / L; in the second stage, it is cooled to temperatures (-30) - (- 40) ° C at a speed of 1.0-4.5 ° C; after the second stage, a temperature stop is carried out at temperatures of (-30) - (- 40) ° C for 3-5 minutes, and in the third stage they are cooled at a speed of 10-12 ° C / min to (-130) - (196) ° FROM. The selection of temperatures and cooling rates are selected empirically by laboratory methods. Hematopoietic stem cells are obtained from different materials: cord blood, embryonic liver, peripheral blood, bone marrow.
Недостатками такого решения способа криоконсервирования ГСК являются: способ не технологичен, проведен в лаборатории на стадии эксперимента, т.к. пробирки из-за малого объема годятся только для лабораторных исследований, концентрация криопротектора - ДМСО через проценты составляет 3,12-11,3%, согласно современным источникам наиболее эффективная концентрация раствора ДМСО для обеспечения жизнеспособности стволовых клеток составляет 10%, поэтому 3,12 слишком мало, а диапазон концентраций слишком неопределенный, одного криопротектора - ДМСО недостаточно, он токсичен, кроме того, используется нестерильный раствор ДМСО, его надо разводить, но для клинического использования нельзя увеличивать из-за контаминации, градации и скорости охлаждения неэффективны, недостаточная стерилизация, т.к. на этапах замораживания вносится дополнительный лед для кристаллизации (сидинг), не указан как получена клеточная взвесь и что она собой представляет, разброс температур (-130)-(-196)°С в конечной точке охлаждения увеличивает время заморозки.The disadvantages of this solution to the method of cryopreservation of HSCs are: the method is not technological, carried out in the laboratory at the experiment stage, because due to the small volume, the tubes are suitable only for laboratory studies, the concentration of cryoprotectant - DMSO through percentages is 3.12-11.3%, according to modern sources, the most effective concentration of DMSO solution for ensuring the viability of stem cells is 10%, therefore 3.12 is too is small, and the concentration range is too uncertain, one cryoprotectant - DMSO is not enough, it is toxic, in addition, a non-sterile solution of DMSO is used, it must be diluted, but for clinical use it cannot be increased due to contamination, gradation and cooling rate are ineffective, insufficient sterilization, because at the stages of freezing, additional ice is introduced for crystallization (siding), it is not indicated how the cell suspension was obtained and what it is, the temperature spread (-130) - (- 196) ° С at the final cooling point increases the freezing time.
Наиболее близким техническим решением осуществления криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток, полученных из пуповинной крови, является способ, указанный в статье авторов: Абдулкадыров К.М., Романенко НА., Старков Н.Н., Сельцер А.В. «Заготовка и хранение пуповинной крови». Материал научно-практической конференции, Санкт-Петербург 2000 г., http.www.gemabank.ru/pub/n1/html/. Способ криоконсервации ГСК пуповинной крови заключается в следующем. Клеточную взвесь ядросодержащих стволовых клеток получали путем седиментации эритроцитов пуповинной крови с использованием желатина с последующим отмыванием. Потом клеточную взвесь разливали по пробиркам для криоконсервирования по 1,5 мл в каждую и охлаждали до температуры +4°С. Приготавливали ограждающий раствор - криопротектор 10% ДМСО и охлаждали в ледяной бане до температуры +4°С. Замораживание проводили в аппарате замораживания по 3-х этапной программе. На первом этапе клеточную взвесь ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками и с криопротектором охлаждали с температуры +4°С до -20°С со скоростью 1°С/мин; на втором этапе - снижение температур с -20°С до -40°С со скоростью 2°С/мин. И на третьем этапе осуществляли снижение температур с -40°С до -80°С со скоростью 4°С/мин с последующим погружением пробирок с клеточной взвесью в жидкий азот (t=-196°C).The closest technical solution for the implementation of cryopreservation of hematopoietic stem cells obtained from umbilical cord blood is the method specified in the article of the authors: Abdulkadyrov K.M., Romanenko NA., Starkov N.N., Seltzer A.V. "Procurement and storage of cord blood." Material of the scientific-practical conference, St. Petersburg 2000, http.www.gemabank.ru/pub/n1/html/. The method of cryopreservation of HSC cord blood is as follows. A cell suspension of nucleated stem cells was obtained by sedimentation of cord blood red blood cells using gelatin, followed by washing. Then the cell suspension was poured into cryopreservation tubes of 1.5 ml each and cooled to a temperature of + 4 ° C. Prepared enclosing solution - cryoprotectant 10% DMSO and cooled in an ice bath to a temperature of + 4 ° C. Freezing was carried out in a freezing apparatus according to a 3-stage program. At the first stage, the cell suspension of nucleated cells with hematopoietic stem cells and with a cryoprotector was cooled from a temperature of + 4 ° C to -20 ° C at a rate of 1 ° C / min; at the second stage - temperature reduction from -20 ° С to -40 ° С at a speed of 2 ° С / min. And at the third stage, temperatures were lowered from -40 ° C to -80 ° C at a rate of 4 ° C / min, followed by immersion of the tubes with cell suspension in liquid nitrogen (t = -196 ° C).
Недостатками такого способа криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови являются: способ для промышленного производства неотработан, нетехнологичен, пробирками можно пользоваться только при лабораторных исследованиях, отнимает много времени сам технологический процесс в подготовке к замораживанию, получение ядросодержащих клеток получено лабораторным путем, на данное время от желатина в качестве седиментирующего средства отказались, в программе глубокого криогенного замораживания отсутствует обход точки кристаллизации, что увеличивает жизнеспособность стволовых клеток, использование в качестве криопротектора раствора RPM1 в крупносерийном производстве при получении гемопоэтических стволовых клеток и при криогенном их замораживании неэффективно.The disadvantages of this method of cryopreservation of hematopoietic umbilical cord blood stem cells are: the method for industrial production is untrained, low-tech, tubes can only be used in laboratory tests, the process itself takes a lot of time in preparation for freezing, the production of nucleated cells is obtained by laboratory tests, at this time from gelatin refused as a sedimentation agent, there is no workaround in the deep cryogenic freezing program ki crystallization that increases the viability of the stem cells, use as RPM1 cryoprotectant solution into the preparation of large-scale production of hematopoietic stem cells and for cryogenic freezing them ineffective.
Техническим результатом предложенного решения является: повышение технологичности криоконсервирования с использованием современного промышленного оборудования, повышение стерильности гемопоэтических стволовых клеток в процессе замораживания, повышения сохранности и, следовательно, жизнеспособности ГСК.The technical result of the proposed solution is: increasing the adaptability of cryopreservation using modern industrial equipment, increasing the sterility of hematopoietic stem cells during freezing, increasing the safety and, therefore, viability of HSCs.
Этот результат достигается тем, что в способе криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови, включающем добавление ограждающего раствора криопротектора диметилсульфоксид в концентрацию взвеси ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками, подготовку к замораживанию, включающую охлаждение взвеси со стволовыми клетками в камере охлаждения до температуры +4°С и многоэтапное замораживание взвеси со стволовыми клетками, при этом в качестве криопротектора используют раствор 55% диметилсульфоксида с 5% декстран 40, который вносят во взвесь лейкоцитарного концентрата со стволовыми клетками, размещенными в криопакете, механически перемешивают в аппарате для перемешивания и добавления криоконсерванта Coolmix AS-210 при температуре +4°С, выпускают воздух из криопакета и часть концентрата взвеси, закрывают пакет, запаивают и помещают его в термоусадочный пакет и осуществляют программное многоэтапное замораживание, на первом этапе которого смесь концентрата взвеси со стволовыми клетками и криопротектором - образец замораживания выдерживают 10' при температуре +4°С, затем охлаждают со скоростью 1°С/мин до температуры -12°С, далее охлаждают со скоростью -15°С/мин до температуры -60°С, после оттаивания образца со скоростью 15°С/мин до температуры -18°С, охлаждают образец со скоростью 1°С/мин до -60°С и в конце программы замораживания образец охлаждают со скоростью -3°С до температуры -100°С, после окончания программы замораживания образец, помещенный в криокоробку, размещают в карантинный дьюар с жидким азотом до определения результатов тестов на наличие или отсутствие инфекционных агентов и бактериологической и грибковой контаминации, по истечении карантинного срока хранения образец с гемопоэтическими стволовыми клетками, полученными из пуповинной крови, переносят на длительное хранение при температуре не менее This result is achieved by the fact that in the method of cryopreservation of hematopoietic cord blood stem cells, comprising adding a dimethyl sulfoxide cryoprotectant enclosing solution to a suspension concentration of nucleated cells with hematopoietic stem cells, preparation for freezing, including cooling the suspension with stem cells to 4 ° C in a chamber + 4 ° C in a chamber + 4 ° C and multi-stage freezing of suspension with stem cells, while a solution of 55% dimethyl sulfoxide is used as a cryoprotectant with 5% dextran 40, which is added to a suspension of a leukocyte concentrate with stem cells placed in a cryopackage, mechanically mixed in a device for mixing and adding a Coolmix AS-210 cryopreservative at a temperature of + 4 ° C, air is released from the cryopackage and part of the suspension concentrate is closed bag, sealed and placed in a heat-shrink bag and carry out software multi-stage freezing, at the first stage of which a mixture of suspension concentrate with stem cells and a cryoprotectant - the sample is frozen 10 'at a temperature of + 4 ° C, then cooled at a speed of 1 ° C / min to a temperature of -12 ° C, then cooled at a speed of -15 ° C / min to a temperature of -60 ° C, after thawing a sample at a speed of 15 ° C / min to a temperature of -18 ° C, cool the sample at a speed of 1 ° C / min to -60 ° C and at the end of the freezing program, the sample is cooled at a speed of -3 ° C to a temperature of -100 ° C, after the end of the freezing program, the sample placed in a cryobox, placed in a quarantine dewar with liquid nitrogen until the test results for the presence or absence of infectious agents are determined and bacteriological and fungal contamination, after a quarantine shelf life the sample with hematopoietic stem cells obtained from cord blood is transferred to long-term storage at a temperature of at least
-150°С в дьюар с жидким азотом при условии отрицательных результатов тестирования, в случае положительных результатов тестов на инфекции, бактериальную и/или грибковую контаминацию образец с гемопоэтическими стволовыми клетками переносят в дьюар для инфекционного материала длительного хранения.-150 ° С in a dewar with liquid nitrogen under the condition of negative test results; in case of positive results of tests for infection, bacterial and / or fungal contamination, a sample with hematopoietic stem cells is transferred to a dewar for infectious material with long-term storage.
Сущность изобретения заключается в совокупности существенных признаков, достаточной для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата.The invention consists in the combination of essential features sufficient to achieve the technical result provided by the invention.
Существенными признаками предложенного способа, совпадающими с известными признаками, являются: А - добавление ограждающего раствора криопротектора диметилсульфоксид в концентрацию взвеси ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками; Б - подготовка к замораживанию, включающая охлаждение взвеси со стволовыми клетками в камере охлаждения до температуры +4°С; В - многоэтапное замораживание взвеси со стволовыми клетками.The essential features of the proposed method, which coincide with the known features, are: A - addition of a cryoprotectant dimethyl sulfoxide enclosing solution to the concentration of suspension of nucleated cells with hematopoietic stem cells; B - preparation for freezing, including cooling the suspension with stem cells in the cooling chamber to a temperature of + 4 ° C; B - multi-stage suspension suspension with stem cells.
Существенными отличительными признаками способа криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови являются: Г - в качестве криопротектора используют раствор 55% диметилсульфоксида с 5% декстран 40, который вносят во взвесь лейкоцитарного концентрата со стволовыми клетками, размещенными в криопакете; Д - смесь в криопакете механически перемешивают в аппарате для перемешивания и добавления криоконсерванта Coolmix AS-210 при температуре +4°С, выпускают воздух из криопакета и часть концентрата взвеси, закрывают пакет, запаивают и помещают его в термоусадочный пакет; Е - осуществляют программное замораживание, на первом этапе которого смесь концентрата взвеси со стволовыми клетками и криопротектором - образец замораживания выдерживают 10' при температуре +4°С, затем охлаждают со скоростью 1°С/мин до температуры -12°С, далее охлаждают со скоростью -15°С/мин до температуры -60°С, после оттаивания образца со скоростью 15°С/мин до температуры -18°С, охлажадают образец со скоростью 1°С/мин до температуры -100°С; Ж - после окончания программы замораживания образец, помещенный в криокоробку, размещают в карантинный дьюар с жидким азотом до определения результатов тестов на наличие или отсутствие инфекционных агентов и бактериологической и грибковой контаминации; И - по истечении карантинного срока хранения образец с гемопоэтическими стволовыми клетками, полученными из пуповинной крови, переносят на длительное хранение при температуре не менее -150°С в дьюар с жидким азотом при условии отрицательных результатов тестирования, в случае положительных результатов тестов на инфекции, бактериальную и/или грибковую контаминацию образец с гемопоэтическими стволовыми клетками переносят в дьюар для инфекционного материала длительного хранения.Salient features of the method of cryopreservation of hematopoietic cord blood stem cells are: D - a solution of 55% dimethyl sulfoxide with 5% dextran 40 is used as a cryoprotectant, which is added to a suspension of leukocyte concentrate with stem cells placed in a cryopackage; D - the mixture in the cryopackage is mechanically mixed in the apparatus for mixing and adding the Coolmix AS-210 cryopreservative at a temperature of + 4 ° С, air is released from the cryopackage and part of the suspension concentrate, the bag is closed, sealed and placed in a heat-shrink bag; E - carry out program freezing, at the first stage of which a suspension concentrate mixture with stem cells and a cryoprotectant — the freezing sample is held for 10 'at a temperature of + 4 ° С, then it is cooled at a rate of 1 ° С / min to a temperature of -12 ° С, then it is cooled with at a rate of -15 ° C / min to a temperature of -60 ° C, after thawing the sample at a speed of 15 ° C / min to a temperature of -18 ° C, cool the sample at a rate of 1 ° C / min to a temperature of -100 ° C; G - after the end of the freezing program, a sample placed in a cryobox is placed in a quarantine dewar with liquid nitrogen until the test results for the presence or absence of infectious agents and bacteriological and fungal contamination are determined; And - after the expiration of the quarantine shelf life, a sample with hematopoietic stem cells obtained from cord blood is transferred to long-term storage at a temperature of at least -150 ° C in a dewar with liquid nitrogen, provided that the test results are negative, in case of positive results of the infection tests, bacterial and / or fungal contamination, a sample with hematopoietic stem cells is transferred to a dewar for long-term infectious material.
Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови заключается в следующем. Перед замораживанием проводят подготовку клеточной взвеси, являющейся лейкоцитарным концентратом (ядросодержащими клетками) с гемопоэтическими стволовыми клетками пуповинной крови, полученными в результате сепарации по схеме Sepax S100 (Швейцария) с использованием седементирующего средства гидроксиэтилкрахмала (ГЭК). Для сохранения максимального количества ГСК при замораживании в фазе кристаллизации используют протектор, обладающий ограждающей способностью, диметилсульфоксид. Для уменьшения токсичности этого раствора в него добавляют раствор декстран 40. В качестве криопротектора взят раствор 55% демитилсульфоксида с 5% декстран 40, которые вводят в клеточную взвесь с гемопоэтическими стволовыми клетками, механически перемешивают в аппарате для перемешивания CoolMix AS-210 (Швейцария) и охлаждают его до температуры +4°С. По окончании перемешивания из криопакета с содержимым выпускают воздух и часть клеточной взвеси, закрывают его и запаивают в нескольких местах трубку, идущую к нему, через 1 см, создавая спутники.The method of cryopreservation of hematopoietic cord blood stem cells is as follows. Before freezing, a cell suspension is prepared, which is a leukocyte concentrate (nucleated cells) with hematopoietic cord blood stem cells obtained by separation according to the Sepax S100 scheme (Switzerland) using a hydroxyethyl starch (HES) sedimentation agent. To preserve the maximum amount of HSC during freezing in the crystallization phase, a tread having a protective ability, dimethyl sulfoxide, is used. To reduce the toxicity of this solution, a solution of dextran 40 is added to it. A solution of 55% demythyl sulfoxide with 5% dextran 40, which is introduced into the cell suspension with hematopoietic stem cells, is mechanically mixed in a CoolMix AS-210 stirrer (Switzerland) and taken as a cryoprotectant cool it to a temperature of + 4 ° C. At the end of mixing, air and part of the cell suspension are released from the cryopackage with the contents, they are closed and the tube going to it is sealed in several places after 1 cm, creating satellites.
Криопакет с клеточной взвесью, стволовыми клетками и криопротектором маркируют индивидуальным штрих-кодом с указанной концентрацией содержимого, условием хранения, состава криопротектора, даты криозамораживания и названия банка, осуществляющего и сохраняющего стволовые клетки.A cryopackage with a cell suspension, stem cells and a cryoprotectant is marked with an individual barcode with the indicated concentration of the contents, storage conditions, cryoprotectant composition, cryoprotection date and name of the bank that carries out and stores the stem cells.
Затем криопакет с содержимым упаковывают в специальный термоусадочный пакет - «CryoFlex», (Nunc, Дания), помещают его с криопакетом в кассету для программного замораживания и размещают в программный замораживатель - Planer Kryo 560-16 («Planer Plc.», Великобритания). Замораживание осуществляют по специальной схеме для работы с программным замораживателем Planer Kryo 560-16. Стартовую температуру в замораживателе устанавливают равной +4°С и удерживают в течение 10 минут. На первом этапе замораживания лейкоцитарный концентрат со стволовыми клетками и криопротекторами, называемый образцом, охлаждают до температуры -12°С со скоростью 1°С/мин. На втором этапе охлаждения образец охлаждают до -60°С со скоростью -15°С/мин. В этот период происходит выброс латентного тепла, что приводит к кратковременному повышению температуры - процесс оттаивания, до температуры -18°С со скоростью 15°С/мин. Это дает возможность обойти точку кристаллизации для увеличения жизнеспособности гемопоэтических стволовых клеток, как в процессе замораживания, так и после их размораживания (окончательного оттаивания). На третьем этапе после оттаивания образец охлаждается со скоростью 1°С/мин до температуры -60°С и в конце процесса замораживания на 4-м этапе образец охлаждается со скоростью -3°С/мин до температуры охлаждения -100°С. Данные по процедуре замораживания регистрируют в протоколе программного замораживания образца со стволовыми клетками. После замораживания в программном замораживателе криопакет с образцом помещают в криокоробку и размещают последнюю в карантинный дьюар с жидким азотом до определения результатов тестов на наличие или отсутствие инфекционных агентов, бактериологической и грибковой контаминации. По истечении карантинного срока хранения образец со стволовыми клетками помещают на длительное хранение в дьюар с жидким азотом при температуре не менее -150°С при условии отрицательных результатов тестирования; в случае положительных результатов тестов на инфекции и бактериальную и/или грибковую контаминацию образец со стволовыми клетками переносят в специальный дьюар для инфекционного материала длительного хранения.Then the cryopackage with the contents is packaged in a special shrink bag - “CryoFlex”, (Nunc, Denmark), put it with the cryopackage in the cassette for program freezing and placed in the program freezer - Planer Kryo 560-16 (“Planer Plc.”, Great Britain). Freezing is carried out according to a special scheme for working with the Planer Kryo 560-16 software freezer. The starting temperature in the freezer is set equal to + 4 ° C and held for 10 minutes. At the first stage of freezing, the leukocyte concentrate with stem cells and cryoprotectants, called the sample, is cooled to a temperature of -12 ° C at a rate of 1 ° C / min. In the second cooling step, the sample is cooled to -60 ° C at a rate of -15 ° C / min. During this period, latent heat is released, which leads to a short-term temperature increase - the thawing process, to a temperature of -18 ° C at a speed of 15 ° C / min. This makes it possible to bypass the crystallization point to increase the viability of hematopoietic stem cells, both during freezing and after thawing (final thawing). In the third stage, after thawing, the sample is cooled at a rate of 1 ° C / min to a temperature of -60 ° C and at the end of the freezing process at the 4th stage, the sample is cooled at a rate of -3 ° C / min to a cooling temperature of -100 ° C. Data on the freezing procedure is recorded in the protocol of program freezing of the sample with stem cells. After freezing in a program freezer, a cryopackage with a sample is placed in a cryobox and placed in a quarantine dewar with liquid nitrogen until the test results for the presence or absence of infectious agents, bacteriological and fungal contamination are determined. At the end of the quarantine shelf life, the sample with stem cells is placed for long-term storage in a dewar with liquid nitrogen at a temperature of at least -150 ° C, subject to negative test results; in case of positive results of tests for infections and bacterial and / or fungal contamination, the sample with stem cells is transferred to a special dewar for infectious material of long-term storage.
Результаты всех исследований, характеризующие образец, заготовленной клеточной взвеси с гемопоэтическими стволовыми клетками пуповинной крови, а также все действия, осуществляемые с образцом, т.е. изъятие образца, изменение локализации образца, вносят в базу данных предприятия «ООО Покровский Банк Стволовых клеток» под единым идентификационным номером образца, а также в базу данных Freezer Work.The results of all studies characterizing the sample of the prepared cell suspension with hematopoietic cord blood stem cells, as well as all actions carried out with the sample, i.e. sampling, changing the localization of the sample, is entered into the database of the company “Pokrovsky Bank of Stem Cells” LLC under the unified identification number of the sample, as well as into the database of Freezer Work.
Использование технического решения «Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови» по сравнению с прототипом позволяет повысить стерильность гемопоэтических стволовых клеток при замораживании, повысить сохранность стволовых клеток и их жизнеспособность при криоконсервировании благодаря тому, что в качестве криопротектора используют раствор 55% ДМСО с 5% декстран 40, что позволяет снизить токсичность ограждающего раствора, внесенные во взвесь лейкоцитарного концентрата с гемопоэтическими стволовыми клетками с тщательным механическим перемешиванием, а также благодаря тому, что в многоэтапном замораживании осуществляют термическую ступеньку - оттаивание, что позволяет обойти точку кристаллизации образца замораживания. При получении лейкоцитарного концентрата со стволовыми клетками использование седементирующего средства гидроксиэтилкрахмала (заменителя крови) позволяет более качественно отделить лейкоциты от эритроцитов и плазмы. Использование современного лицензионного технического промышленного оборудования иностранного производства: США, Швейцарии, Великобритании, Японии, Германии, Швеции, Дании и т.д. позволяет повысить технологичность процесса криоконсервирования, затратить меньше времени, повысить в конечном итоге получение более качественного конечного продукта. Например, аппарат для перемешивания и добавления криоконсерванта - Coolmix AS-210 (Швейцария) позволяет равномерно охлаждать стволовые клетки в процессе добавления криопротектора с одновременным осуществлением постоянного перемешивания лейкоцитарного концентрата со стволовыми клетками в криопакете при постоянной температуре и капельном добавлении ограждающего раствора смеси ДМСО с декстраном 40. Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови был многократно осуществлен (более 400 раз) на активно развивающемся предприятии «ООО Покровский банк стволовых клеток» и показал качественные результаты.Using the technical solution "Method of cryopreservation of hematopoietic cord blood stem cells" in comparison with the prototype allows to increase the sterility of hematopoietic stem cells when frozen, to increase the safety of stem cells and their viability during cryopreservation due to the fact that a solution of 55% DMSO with 5% dextran is used as a cryoprotectant 40, which allows to reduce the toxicity of the enclosing solution introduced into the suspension of leukocyte concentrate with hematopoietic stem cells with thorough mechanical stirring, and also due to the fact that in a multi-stage freezing, a thermal step is performed - thawing, which allows you to bypass the crystallization point of the freezing sample. When receiving a leukocyte concentrate with stem cells, the use of a sedimenting agent hydroxyethyl starch (a blood substitute) allows for better separation of leukocytes from red blood cells and plasma. Using modern licensed technical industrial equipment of foreign manufacture: USA, Switzerland, Great Britain, Japan, Germany, Sweden, Denmark, etc. allows you to increase the manufacturability of the cryopreservation process, spend less time, ultimately increase the receipt of a better final product. For example, the apparatus for mixing and adding a cryopreservative - Coolmix AS-210 (Switzerland) allows you to evenly cool stem cells during the addition of a cryoprotectant, while constantly mixing the leukocyte concentrate with stem cells in a cryopackage at a constant temperature and adding dropwise an enclosing solution of a DMSO mixture with dextran 40 The method of cryopreservation of hematopoietic cord blood stem cells has been repeatedly implemented (more than 400 times) on an actively developing I plant "LLC Pokrovsky stem cell bank" and showed qualitative results.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009146082/21A RU2416197C1 (en) | 2009-12-11 | 2009-12-11 | Method of cryopreservation of hematopoietic stem cells of umbilical blood |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009146082/21A RU2416197C1 (en) | 2009-12-11 | 2009-12-11 | Method of cryopreservation of hematopoietic stem cells of umbilical blood |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2416197C1 true RU2416197C1 (en) | 2011-04-20 |
Family
ID=44051081
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009146082/21A RU2416197C1 (en) | 2009-12-11 | 2009-12-11 | Method of cryopreservation of hematopoietic stem cells of umbilical blood |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2416197C1 (en) |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103004751A (en) * | 2012-12-18 | 2013-04-03 | 中南大学 | Hematopoietic stem cell cryopreserving method and protective agent |
| RU2547426C1 (en) * | 2013-12-16 | 2015-04-10 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-Производственное Объединение "Тюменькриобанк" | Method for cryopreservation of haemopoietic umbilical stem cells |
| RU2554405C2 (en) * | 2012-03-22 | 2015-06-27 | Борис Лаврович Макеев | Method for cryogenic preservation of haematopoietic umbilical cord stem cells |
| CN104770363A (en) * | 2015-04-21 | 2015-07-15 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | Cryopreservation solution and cryopreservation method for mesenchymal stem cells |
| CN105028389A (en) * | 2015-07-08 | 2015-11-11 | 苏州苏大赛尔免疫生物技术有限公司 | Erythrocyte preservative solution |
| CN105028388A (en) * | 2015-07-08 | 2015-11-11 | 深圳爱生再生医学科技有限公司 | Preserving fluid and preparation method therefor |
| RU2569834C1 (en) * | 2014-12-17 | 2015-11-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России" | Method for cryopreservation of haemopoietic stem cells |
| RU2624214C1 (en) * | 2016-04-28 | 2017-07-03 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Method for cryopreservation of haemopoietic stem cells |
| RU2707921C1 (en) * | 2018-12-10 | 2019-12-02 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Method for unrestricted freezing peripheral blood precursor cells at minus 80 °c under protection of dimethylsulphoxid |
| RU2743816C1 (en) * | 2020-03-05 | 2021-02-26 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр гематологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ гематологии" Минздрава России) | Method for obtaining cryopreserved mononuclear cells |
| US11484025B2 (en) | 2012-11-30 | 2022-11-01 | Pharmacosmos Holding A/S | Cryoprotecting agent, cryoprotecting and cryopreserved compositions, uses thereof, and methods of cryopreservation |
-
2009
- 2009-12-11 RU RU2009146082/21A patent/RU2416197C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| АБДУЛКАДЫРОВ К.М. и др. Заготовка и хранение пуповинной крови. Материал научно-практической конференции. - СПб., 2000.www/gemabank.ru/pub/nl/html/. * |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2554405C2 (en) * | 2012-03-22 | 2015-06-27 | Борис Лаврович Макеев | Method for cryogenic preservation of haematopoietic umbilical cord stem cells |
| US11484025B2 (en) | 2012-11-30 | 2022-11-01 | Pharmacosmos Holding A/S | Cryoprotecting agent, cryoprotecting and cryopreserved compositions, uses thereof, and methods of cryopreservation |
| CN103004751A (en) * | 2012-12-18 | 2013-04-03 | 中南大学 | Hematopoietic stem cell cryopreserving method and protective agent |
| RU2547426C1 (en) * | 2013-12-16 | 2015-04-10 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-Производственное Объединение "Тюменькриобанк" | Method for cryopreservation of haemopoietic umbilical stem cells |
| RU2569834C1 (en) * | 2014-12-17 | 2015-11-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России" | Method for cryopreservation of haemopoietic stem cells |
| CN104770363A (en) * | 2015-04-21 | 2015-07-15 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | Cryopreservation solution and cryopreservation method for mesenchymal stem cells |
| CN104770363B (en) * | 2015-04-21 | 2017-03-15 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | A kind of frozen stock solution of mescenchymal stem cell and cryopreservation methods |
| CN105028389A (en) * | 2015-07-08 | 2015-11-11 | 苏州苏大赛尔免疫生物技术有限公司 | Erythrocyte preservative solution |
| CN105028388A (en) * | 2015-07-08 | 2015-11-11 | 深圳爱生再生医学科技有限公司 | Preserving fluid and preparation method therefor |
| RU2624214C1 (en) * | 2016-04-28 | 2017-07-03 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Method for cryopreservation of haemopoietic stem cells |
| RU2707921C1 (en) * | 2018-12-10 | 2019-12-02 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Method for unrestricted freezing peripheral blood precursor cells at minus 80 °c under protection of dimethylsulphoxid |
| RU2743816C1 (en) * | 2020-03-05 | 2021-02-26 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр гематологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ гематологии" Минздрава России) | Method for obtaining cryopreserved mononuclear cells |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2416197C1 (en) | Method of cryopreservation of hematopoietic stem cells of umbilical blood | |
| AU2009228056B2 (en) | Materials and methods for hypothermic collection of whole blood | |
| CN108617638B (en) | Tissue and/or cell cryopreservation protective solution and preparation and application thereof | |
| JP6531256B2 (en) | Method for cryopreservation of cord blood and peripheral blood and solution for cryopreservation | |
| CN104145943A (en) | Cryopreservation protection liquid for Wharton jelly tissues of human umbilical cord and preparation and application of cryopreservation protection liquid | |
| EP4228406A1 (en) | Systems and methods for extraction and cryopreservation of bone marrow | |
| RU2554405C2 (en) | Method for cryogenic preservation of haematopoietic umbilical cord stem cells | |
| RU2624214C1 (en) | Method for cryopreservation of haemopoietic stem cells | |
| CN103004751B (en) | Hematopoietic stem cell cryopreserving method and protective agent | |
| Sugrue et al. | The effect of overnight storage of leukapheresis stem cell products on cell viability, recovery, and cost | |
| JP7072147B2 (en) | Mesenchymal stem cell frost protection solution and its use | |
| Harris | Optimizing cord blood sample cryopreservation | |
| RU2795058C1 (en) | Method for washing cryopreserved-thawed platelets from the enclosing solution | |
| Shu et al. | Progress in cryopreservation of stem cells and immune cells for cytotherapy | |
| Weinberg | Cryopreservation techniques and freezing solutions | |
| Pavel et al. | A freezing protocol for hematopoietic stem cells | |
| RU2263448C1 (en) | Method of cryopreservation of umbilical blood | |
| RU2720771C1 (en) | Method for unregulated freezing of peripheral blood precursor cells at temperature of minus 80 °c with gemgel solution | |
| RU2711152C1 (en) | Method for unstructured freezing peripheral blood precursor cells at minus 80 °c with a hemicolite solution | |
| Raj et al. | A PILOT STUDY ON CRYOPRESERVATION OF CANINE PLATELETS | |
| RU2547426C1 (en) | Method for cryopreservation of haemopoietic umbilical stem cells | |
| RU2655222C2 (en) | Method for adipose tissue preparation for cryopreservation | |
| Leemhuis et al. | Hematopoietic progenitor cells: biology and processing | |
| Shamkhi et al. | Trehalose and ascorbic acid improves the cryopreser-vation of umbilical cord blood hematopoietic stem cells (CD34+) with low concentrations of dimethyl-sulfoxide | |
| CN116889226A (en) | NK cell cryopreservation liquid |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20121212 |