RU2413523C2

RU2413523C2 - Method of treating posttraumatic encephalopathy

Info

Publication number: RU2413523C2
Application number: RU2009119560/15A
Authority: RU
Inventors: Юрий Аскольдович Романов (RU); Юрий Аскольдович Романов; Владимир Николаевич Смирнов (RU); Владимир Николаевич Смирнов; Сергей Дмитриевич Прошкин (RU); Сергей Дмитриевич Прошкин; Юрий Израилевич Поляков (RU); Юрий Израилевич Поляков; Святослав Всеволодович Медведев (RU); Святослав Всеволодович Медведев; Михаил Александрович Пальцев (RU); Михаил Александрович Пальцев; Геннадий Тихонович Сухих (RU); Геннадий Тихонович Сухих; Валерий Григорьевич Савченко (RU); Валерий Григорьевич Савченко
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "КриоЦентр"
Priority date: 2009-05-25
Filing date: 2009-05-25
Publication date: 2011-03-10
Also published as: RU2009119560A

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention refers to medicine, namely to neuropathology, and concerns treating posttraumatic encephalopathy. That is ensured by intravenous introduction of an effective amount of nuclear cells of umbilical blood prepared by sedimentation or gradient centrifugation of sampled umbilical blood with separating the nuclear cells in the form of packed cells to be resuspended in cooled plasma with a cryoprotector added, freezing and cryogenic storage.

EFFECT: invention provides effective therapy of posttraumatic encephalopathy with lower risk of immune-associated diseases due to the fact that the method for preparing the nuclear cells of umbilical blood eliminates cultivation thereof with a foreign serum added.

8 cl, 6 ex

Description

Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION

Изобретение относится к медицине и касается использования стволовых клеток пуповинной крови для лечения неврологических патологических состояний, в частности, посттравматической энцефалопатии.The invention relates to medicine and relates to the use of cord blood stem cells for the treatment of neurological pathological conditions, in particular post-traumatic encephalopathy.

Уровень техникиState of the art

Стволовые клетки пуповинной крови представляют собой уникальную клеточную популяцию, отличающуюся от клеток, получаемых из других источников, в том числе эмбриональных, фетальных и «взрослых» стволовых клеток. Уникальность клеток пуповинной крови заключается в том, что это единственный тип клеток постнатального происхождения, способный при трансплантации экспериментальным животным поддерживать кроветворение и формировать полноценную иммунную систему человека, благодаря образованию В- и Т-лимфоцитов и дендритных клеток, формированию первичных и вторичных лимфоидных органов и продукции функциональных иммунных ответов [Traggai E, Chicha L, Mazzuchelli L, et al. Development of a human adaptive immune system in cord blood cell-transplanted mice. Science 2004; 304: 14-107].Cord blood stem cells are a unique cell population that differs from cells obtained from other sources, including embryonic, fetal and “adult” stem cells. The uniqueness of cord blood cells lies in the fact that this is the only type of cells of postnatal origin, capable of supporting blood formation during transplantation to experimental animals and forming a full-fledged human immune system, due to the formation of B and T lymphocytes and dendritic cells, the formation of primary and secondary lymphoid organs and production functional immune responses [Traggai E, Chicha L, Mazzuchelli L, et al. Development of a human adaptive immune system in cord blood cell-transplanted mice. Science 2004; 304: 14-107].

Гемопоэтические стволовые клетки (CD34+) и эндотелиальные клетки-предшественники (CD133+) являются наиболее представленными клеточными популяциями, найденными в пуповинной крови. Высокое содержание гемопоэтических клеток-предшественников позволяет эффективно использовать трансплантацию клеток пуповинной крови в качестве альтернативы трансплантации костного мозга при острых и хронических лейкозах, лимфомах, анемии Фанкони и других гематологических заболеваниях [Barker J. Umbilical cord blood (UCB) transplantation: An alternative to the use of unrelated volunteer donors? Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2007: 55-61].Hematopoietic stem cells (CD34 +) and endothelial progenitor cells (CD133 +) are the most represented cell populations found in cord blood. The high content of hematopoietic progenitor cells allows the use of cord blood cell transplantation as an alternative to bone marrow transplantation in acute and chronic leukemia, lymphomas, Fanconi anemia and other hematological diseases [Barker J. Umbilical cord blood (UCB) transplantation: An alternative to the use of unrelated volunteer donors? Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2007: 55-61].

Помимо гемопоэтических в пуповинной крови содержатся и другие типы стволовых клеток, включая эмбрионально-подобные клетки, эпителиальные клетки-предшественники, мезенхимальные стволовые клетки и неограниченные соматические стволовые клетки [Harris David Т., Rogers I. Umbilical Cord Blood: A Unique Source of Pluripotent Stem Cells for Regenerative Medicine, Current Stem Cell Research & Therapy, 2007, 2, 301-309].In addition to hematopoietic, umbilical cord blood also contains other types of stem cells, including embryo-like cells, epithelial progenitor cells, mesenchymal stem cells and unlimited somatic stem cells [Harris David T., Rogers I. Umbilical Cord Blood: A Unique Source of Pluripotent Stem Cells for Regenerative Medicine, Current Stem Cell Research & Therapy, 2007, 2, 301-309].

Плюрипотентные свойства стволовых клеток пуповинной крови продемонстрированы в целом ряде исследований in vitro и in vivo. В условиях культивирования стволовые клетки пуповинной крови способны дифференцироваться в остеобласты, хондробласты, адипоциты и нервные клетки, а также в эндотелиальные и мышечные клетки, гепатоциты и инсулин-продуцирующие клетки [Kogler, G., Sensken, S., & Wernet, P. (2006) Comparative generation and characterization of pluripotent unrestricted somatic stem cells with mesenchymal stem cells from human cord blood. Experimental Hematology, 34(11), 1589-95 и Tondreau Т, Meuleman N, Delforge A, et al. Mesenchymal stem cells derived from CD133-positive cells in mobilized blood and cord blood: proliferation, expression and plasticity. Stem Cells, 2005; 23: 1105-1112].The pluripotent properties of cord blood stem cells have been demonstrated in a number of in vitro and in vivo studies. Under cultivation, cord blood stem cells are able to differentiate into osteoblasts, chondroblasts, adipocytes and nerve cells, as well as endothelial and muscle cells, hepatocytes and insulin-producing cells [Kogler, G., Sensken, S., & Wernet, P. ( 2006) Comparative generation and characterization of pluripotent unrestricted somatic stem cells with mesenchymal stem cells from human cord blood. Experimental Hematology, 34 (11), 1589-95 and Tondreau T, Meuleman N, Delforge A, et al. Mesenchymal stem cells derived from CD133-positive cells in mobilized blood and cord blood: proliferation, expression and plasticity. Stem Cells, 2005; 23: 1105-1112].

Стволовые клетки пуповинной крови обладают способностью к хоумингу и при трансплантации экспериментальным животным могут улучшать течение ряда заболеваний, включая диабет, сердечно-сосудистые и неврологические и офтальмологические заболевания, болезни опорно-двигательного аппарата и т.д.Cord blood stem cells are capable of homing and, during transplantation, experimental animals can improve the course of a number of diseases, including diabetes, cardiovascular and neurological and ophthalmological diseases, diseases of the musculoskeletal system, etc.

Диабет 1 типа встречается в среднем у одного из 300 новорожденных и обнаруживается более чем у 8 млн взрослого населения России. Диабет 1 типа обусловлен иммунной деструкцией бета-клеток в панкреатических островках, ответственных за продукцию инсулина. Результатом является неконтролируемый уровень глюкозы в крови. Осложнения при диабете включают кардиомиопатию, поражения коронарных артерий и периферических сосудов, неврологические расстройства и т.д. При попытках лечения диабета 1 типа были разработаны хирургические методы по трансплантации поджелудочной железы или отдельных островков, имевшие ограниченный успех вследствие иммунного отторжения, отсутствия совместимых доноров и многочисленных осложнений. В этой связи особые надежды были возложены на использование клеточных технологий, основанных на применении стволовых клеток из различных источников и направленных на восстановление функции инсулин-продуцирущей ткани поджелудочной железы. В исследовании, проведенном Haller и соавт., были констатированы значительное улучшение в конролируемом уровне глюкозы и более продолжительная продукция инсулина по сравнению с другими детьми со сходным прогнозом в ответ на использование клеток пуповинной крови [Haller MJ, Cooper SC, Brusco T, et al. Autologous cord blood transfusion associated with prolonged honeymoon in a child with type 1 diabetes. Diabetes 2005; 53 (Suppl 1): Poster A485]. Протоколы клинических исследований были разработаны на основе данных, полученных на модели диабета 1 типа, согласно которым у опытных животных наблюдался пониженный уровень глюкозы и инсулина в крови и увеличенный период жизни по сравнению с контрольными животными [Ende N, Chen R, Reddi AS. Effect of human umbilical cord blood cells on glycemia and insulinitis in type 1 diabetic mice. Biochem Biophys Res Commun 2004; 325: 665-669 и Ende N, Chen R, Mack R. NOD/Ltf type I diabetes in mice and the effect of stem cells (Berashis) derived from human umbilical cord blood. J. Med 2002; 33: 181-187].Type 1 diabetes occurs on average in one in 300 newborns and is found in more than 8 million adults in Russia. Type 1 diabetes is caused by immune destruction of beta cells in pancreatic islets responsible for insulin production. The result is an uncontrolled blood glucose level. Complications of diabetes include cardiomyopathy, damage to the coronary arteries and peripheral vessels, neurological disorders, etc. In attempts to treat type 1 diabetes, surgical methods have been developed for transplantation of the pancreas or individual islets, which have had limited success due to immune rejection, the absence of compatible donors and numerous complications. In this regard, special hopes were placed on the use of cellular technologies based on the use of stem cells from various sources and aimed at restoring the function of insulin-producing pancreatic tissue. A study by Haller et al. Found a significant improvement in controlled glucose levels and longer insulin production compared to other children with a similar prognosis in response to the use of cord blood cells [Haller MJ, Cooper SC, Brusco T, et al. Autologous cord blood transfusion associated with prolonged honeymoon in a child with type 1 diabetes. Diabetes 2005; 53 (Suppl 1): Poster A485]. Clinical trial protocols were developed on the basis of data obtained on a type 1 diabetes model, according to which experimental animals had a lower level of glucose and insulin in the blood and an increased life span compared to control animals [Ende N, Chen R, Reddi AS. Effect of human umbilical cord blood cells on glycemia and insulinitis in type 1 diabetic mice. Biochem Biophys Res Commun 2004; 325: 665-669 and Ende N, Chen R, Mack R. NOD / Ltf type I diabetes in mice and the effect of stem cells (Berashis) derived from human umbilical cord blood. J. Med 2002; 33: 181-187].

Хотя механизмы действия стволовых клеток пуповинной крови в лечении диабета неизвестны, предполагают, что при инфузии in vivo стволовые клетки дифференцируются в секретирующие инсулин клетки панкреатических островков [Haller MJ, Cooper SC, Brusco T, et al. Autologous cord blood transfusion associated with prolonged honeymoon in a child with type 1 diabetes. Diabetes 2005; 53 (Suppl 1): Poster A485], что было подтверждено в исследованиях in vitro [Sun В, Roh K-H, Lee S-R, Lee Y-S, Kang K-S. Induction of human umbilical cord blood-derived stem cells with embryonic stem cell phenotypes into insulin producing islet-like structures. Biochem Biophys Res Commun 2007, 354: 919-923].Although the mechanisms of the action of cord blood stem cells in treating diabetes are unknown, it is suggested that stem cells differentiate into pancreatic islet-secreting insulin cells during in vivo infusion [Haller MJ, Cooper SC, Brusco T, et al. Autologous cord blood transfusion associated with prolonged honeymoon in a child with type 1 diabetes. Diabetes 2005; 53 (Suppl 1): Poster A485], which was confirmed in in vitro studies [Sun B, Roh K-H, Lee S-R, Lee Y-S, Kang K-S. Induction of human umbilical cord blood-derived stem cells with embryonic stem cell phenotypes into insulin producing islet-like structures. Biochem Biophys Res Commun 2007, 354: 919-923].

Использование мононуклеарных клеток пуповинной крови в лечении хронического гепатита или цирроза печени описано в патенте RU 2295351.The use of cord blood mononuclear cells in the treatment of chronic hepatitis or cirrhosis is described in patent RU 2295351.

Недостатком способа является обязательное HLA-типирование и, более того, для достижения клинического эффекта стволовые клетки пуповинной крови донора должны отличаться от клеток реципиента не менее чем по четырем антигенам из набора антигенов HLA-A, HLA-B, HLA-DR.The disadvantage of this method is the obligatory HLA typing and, moreover, in order to achieve a clinical effect, the stem cells of the cord blood of a donor must differ from the recipient cells by at least four antigens from the set of antigens HLA-A, HLA-B, HLA-DR.

Что касается возможности использования стволовых клеток пуповинной крови в репарации костной и хрящевой ткани, то, в отличие от стволовых клеток костного мозга, их потенциальная роль в ортопедии не исследована. Наиболее распространенными ортопедическими нарушениями являются повреждения суставов, включая повреждения хрящей, связок и/или сухожилий, а также переломы. Стволовые клетки пуповинной крови способны к дифференцировке в костные клетки in vitro при индукции ударной волной [Wang FS, Yang KD, Wang CJ, et al. Shockwave stimulates oxygen radical-mediated osteogenesis of the mesenchymal cells from human umbilical cord blood. J Bone Mineral Res 2004; 19: 973-979]. Возможность использования клеток пуповинной крови при переломах была продемонстрирована на моделях животных с переломами бедра. Также была показана способность этих клеток дифференцироваться в клетки хрящевой ткани [Szivek JA, Wiley D, Сох L, Harris D, Margolis DS, Grana WA. Stem cells grown in dynamic culture on micropatterned surfaces can be used to engineer cartilage-like tissue. Abstract, Orthopaedic Research Society meeting, San Diego, CA, 2006].As for the possibility of using cord blood stem cells in the repair of bone and cartilage tissue, unlike bone marrow stem cells, their potential role in orthopedics has not been studied. The most common orthopedic disorders are joint damage, including damage to cartilage, ligaments and / or tendons, as well as fractures. Cord blood stem cells are capable of differentiating into bone cells in vitro upon shock wave induction [Wang FS, Yang KD, Wang CJ, et al. Shockwave stimulates oxygen radical-mediated osteogenesis of the mesenchymal cells from human umbilical cord blood. J Bone Mineral Res 2004; 19: 973-979]. The ability to use cord blood cells for fractures has been demonstrated in animal models with hip fractures. The ability of these cells to differentiate into cartilage cells was also shown [Szivek JA, Wiley D, Cox L, Harris D, Margolis DS, Grana WA. Stem cells grown in dynamic culture on micropatterned surfaces can be used to engineer cartilage-like tissue. Abstract, Orthopedic Research Society meeting, San Diego, CA, 2006].

Способность стволовых клеток пуповинной крови давать начало эпителиальной ткани открывает возможность их клинического применения в регенеративной медицине при заболеваниях глаз (роговица), кожи (заживление ран) и других органов (например, легкие и пищеварительный тракт). Внешний слой глаза состоит из центральной роговицы, лимбуса и склеры. Эпителий роговицы способен к быстрой регенерации и может быть использован как собственный источник стволовых клеток при регенерации. Дефицит эпителиальных клеток роговицы является важной причиной потери зрения, происходящей от химического или термического поражения, синдрома Стивенса-Джонсона, рубцовых изменений, аниридии, хронической розацеи, кератоконъюнктивита. При нарушении эпителия роговицы четкое изображение не может быть сфокусировано на сетчатке глаза. Аутологичная трансплантация эпителиальных стволовых клеток роговицы была успешна у пациентов с односторонним заболеванием. Однако получение клеток из функционального здорового глаза создает риск потери зрения для здорового глаза. Дополнительно, в билатеральных условиях аутологичная трансплантация недоступна, а аллотрансплантация стволовых клеток роговичного эпителия требует иммуносупрессивной терапии с возможными системными побочными эффектами, в результате чего средняя продолжительность выживания такого аллотрансплантата не превышает 2 лет. Повреждения роговицы тяжелой степени, требующие вмешательства, не являются исключением, составляя до 37% всех случаев потери зрения [Germain L, Auger FA, Grandbois E, et al. Reconstructed human cornea produced in vitro by tissue engineering. Pathobiology 1999, 67: 140-147 и Germain L, Carrier P, Auger FA, Salesse C, Guerin S L. Can we produce a human corneal equivalent by tissue engineering? Prog Retinal Eye Res 2000; 19(5): 497-527].The ability of cord blood stem cells to give rise to epithelial tissue opens up the possibility of their clinical use in regenerative medicine for diseases of the eyes (cornea), skin (wound healing) and other organs (for example, the lungs and digestive tract). The outer layer of the eye consists of a central cornea, limbus and sclera. The corneal epithelium is capable of rapid regeneration and can be used as an own source of stem cells during regeneration. Deficit of corneal epithelial cells is an important cause of vision loss resulting from chemical or thermal damage, Stevens-Johnson syndrome, cicatricial changes, aniridia, chronic rosacea, keratoconjunctivitis. If the corneal epithelium is disturbed, a clear image cannot be focused on the retina. Autologous transplantation of corneal epithelial stem cells has been successful in patients with unilateral disease. However, obtaining cells from a functional healthy eye poses a risk of loss of vision for a healthy eye. Additionally, autologous transplantation is not available under bilateral conditions, and corneal epithelial stem cell allotransplantation requires immunosuppressive therapy with possible systemic side effects, as a result of which the average survival time of such an allograft does not exceed 2 years. Severe corneal lesions requiring intervention are no exception, accounting for up to 37% of all cases of vision loss [Germain L, Auger FA, Grandbois E, et al. Reconstructed human cornea produced in vitro by tissue engineering. Pathobiology 1999, 67: 140-147 and Germain L, Carrier P, Auger FA, Salesse C, Guerin S L. Can we produce a human corneal equivalent by tissue engineering? Prog Retinal Eye Res 2000; 19 (5): 497-527].

Исследователи группы Николса [Harris DT, Не X, Camacho D, Gonzalez V, Nicols JC, The Potential of Cord Blood Stem Cells for Use in Tissue Engineering of the Eye, Stem Cells & Regenerative Medicine, Jan 23-25, 2006, San Francisco, Abstract и Nichols JC, He X, Harris DT. Differentiation of Cord Blood Stem Cells Into Corneal Epithelium. Invest Ophmalmol Vis Sci 2005; 46: E-Abstract 4772] использовали СD34-положительные стволовые клетки пуповинной крови как источник ткани для реконструкции поверхности глаза. Гистологические и иммуногистохимические исследования эпителия, образованного из клеток пуповинной крови, выявили, что слой дифференцированных клеток был морфологически не отличим от эпителия роговицы. Новообразованные клетки были также способны экспрессировать специфический маркер эпителия роговицы - цитокератин k3. При трансплантации стволовых клеток кроликам была восстановлена роговица с образованием оптически ясной поверхности. Способность стволовых клеток пуповинной крови дифференцироваться в эпителиальные клетки роговицы предполагает возможность их использования для ускорения заживления ран различной этиологии, например, диабетических язв. Согласно этой гипотезе, в 2004 г. было показано, что аллогенные стволовые клетки пуповинной крови способны инициировать восстановление раневых повреждений кожи [Valbonesi M, Giannini G, Migliori F, Dalla Costa R, Dejana AM. Cord blood (CB) stem cells for wound repair. Preliminary report of 2 cases. Transfus Apher Sci 2004; 30(2): 153-156]. Клетки-предшественники были смешаны с аутологичным фибриновым матриксом и в концентрации 3×10⁴ введены в область, прилежащую к повреждениям. Спустя 3-7 месяцев после инъекции наблюдалось значительное заживление повреждений кожи у обоих пациентов.Nichols Group Researchers [Harris DT, Not X, Camacho D, Gonzalez V, Nicols JC, The Potential of Cord Blood Stem Cells for Use in Tissue Engineering of the Eye, Stem Cells & Regenerative Medicine, Jan 23-25, 2006, San Francisco , Abstract and Nichols JC, He X, Harris DT. Differentiation of Cord Blood Stem Cells Into Corneal Epithelium. Invest Ophmalmol Vis Sci 2005; 46: E-Abstract 4772] used CD34-positive cord blood stem cells as a source of tissue for reconstructing the surface of the eye. Histological and immunohistochemical studies of the epithelium formed from umbilical cord blood cells revealed that the layer of differentiated cells was morphologically indistinguishable from corneal epithelium. Newly formed cells were also able to express a specific marker of corneal epithelium - cytokeratin k3. During stem cell transplantation, the cornea was restored to rabbits to form an optically clear surface. The ability of cord blood stem cells to differentiate into corneal epithelial cells suggests the possibility of using them to accelerate wound healing of various etiologies, for example, diabetic ulcers. According to this hypothesis, in 2004 it was shown that allogeneic cord blood stem cells are capable of initiating the restoration of wound skin lesions [Valbonesi M, Giannini G, Migliori F, Dalla Costa R, Dejana AM. Cord blood (CB) stem cells for wound repair. Preliminary report of 2 cases. Transfus Apher Sci 2004; 30 (2): 153-156]. Precursor cells were mixed with an autologous fibrin matrix and introduced at a concentration of 3 × 10 ⁴ into the area adjacent to the lesions. 3-7 months after the injection, significant healing of skin lesions was observed in both patients.

Сердечно-сосудистые заболевания являются одной из основных причин смертности и нетрудоспособности населения. Клетки сердечной ткани имеют ограниченную способность к регенерации, и использование стволовых клеток могло бы быть эффективной заменой традиционных методов терапии.Cardiovascular diseases are one of the main causes of mortality and disability in the population. Cardiac tissue cells have a limited ability to regenerate, and the use of stem cells could be an effective substitute for traditional therapies.

На моделях животных получены данные, свидетельствующие о миграции стволовых клеток к поврежденной ткани миокарда, увеличении плотности капилляров в участке повреждения и улучшении функции сердца [Botta R, Gao E, Stassi G, et al. Heart infarct in NOD-SCID mice: therapeutic vasculogenesis by transplantation of human CD34+ cells ad low dose D34+KDR+ cells. FASEB J 2004; 18: 1392-1394; Henning RJ, Abu-Ali H, Balis JU, et al. Human umbilical cord blood mononuclear cells for treatment of acute myocardial infarction. Cell Transplant 2004; 13: 729-739; Chen HK, Hung HF, Shyu KG, et al. Combined cord blood cells and gene therapy enhances angiogenesis and improves cardiac performance in mouse after acute myocardial infarction. Eur J Clin Invest 2005; 35: 677-686; Hirata Y, Sata M, Motomura N, et al. Human umbilical cord blood cells improve cardiac function after myocardial infarction. Biochem Biophys Res Commun 2005; 327: 609-614; Kim ВО, Tian H, Prasongsukarn K, et al. Cell transplantation improves ventricular function after a myocardial infarction: a preclinical study of human unrestricted somatic stem cells in a porcine model. Circulation 2006; 112 (9 suppl): 196-204 и Leor J, Guetta E, Feinberg MS, et al. Human umbilical cord blood-derived CD133+ cells enhance function and repair of the infracted myocardium. Stem Cells 2006; 24(3): 772-780].In animal models, data have been obtained indicating the migration of stem cells to damaged myocardial tissue, an increase in the density of capillaries in the lesion site and an improvement in heart function [Botta R, Gao E, Stassi G, et al. Heart infarct in NOD-SCID mice: therapeutic vasculogenesis by transplantation of human CD34 + cells ad low dose D34 + KDR + cells. FASEB J 2004; 18: 1392-1394; Henning RJ, Abu-Ali H, Balis JU, et al. Human umbilical cord blood mononuclear cells for treatment of acute myocardial infarction. Cell Transplant 2004; 13: 729-739; Chen HK, Hung HF, Shyu KG, et al. Combined cord blood cells and gene therapy enhances angiogenesis and improves cardiac performance in mouse after acute myocardial infarction. Eur J Clin Invest 2005; 35: 677-686; Hirata Y, Sata M, Motomura N, et al. Human umbilical cord blood cells improve cardiac function after myocardial infarction. Biochem Biophys Res Commun 2005; 327: 609-614; Kim BO, Tian H, Prasongsukarn K, et al. Cell transplantation improves ventricular function after a myocardial infarction: a preclinical study of human unrestricted somatic stem cells in a porcine model. Circulation 2006; 112 (9 suppl): 196-204 and Leor J, Guetta E, Feinberg MS, et al. Human umbilical cord blood-derived CD133 + cells enhance function and repair of the infracted myocardium. Stem Cells 2006; 24 (3): 772-780].

Gaballa с соавторами [Furfaro MEK, Gaballa MA. Do adult stem cells ameliorate the damaged myocardium? Is human cord blood a potential source of stem cells? Curr Vascular Pharm 2007; 5: 27-44] на модели инфаркта миокарда у крыс показали, что СВ34-положительные клетки пуповинной крови индуцируют формирование кровеносных сосудов, уменьшают размеры инфаркта, восстанавливают функцию сердца. Полагают, что эти эффекты обусловлены высвобождением ангиогенных факторов и факторов роста (например, VEGF, EGF, ангиопоэтин-1,2 и др.), индуцируемых гипоксией.Gaballa et al. [Furfaro MEK, Gaballa MA. Do adult stem cells ameliorate the damaged myocardium? Is human cord blood a potential source of stem cells? Curr Vascular Pharm 2007; 5: 27-44] on a model of myocardial infarction in rats showed that CB34-positive cells of umbilical cord blood induce the formation of blood vessels, reduce the size of the heart attack, restore heart function. It is believed that these effects are due to the release of angiogenic factors and growth factors (e.g., VEGF, EGF, angiopoietin-1,2, etc.) induced by hypoxia.

Способность плюрипотентных клеток пуповинной крови формировать кровеносные сосуды и восстанавливать миокард показана в исследованиях по восстановлению сердечной функции после инфаркта миокарда с использованием CD34+, CD133+/CD45-клеток на различных моделях у животных [Botta R, Gao E, Stassi G, et al. Heart infarct in NOD-SCID mice: therapeutic vasculogenesis by transplantation of human CD34+ cells ad low dose CD34+KDR+ cells. FASEB J 2004; 18: 1392-1394; Kim ВО, Tian H, Prasongsukarn K, et al. Cell transplantation improves ventricular function after a myocardial infarction: a preclinical study of human unrestricted somatic stem cells in a porcine model. Circulation 2006; 112 (9 suppl): 196-204; Leor J, Guetta E, Feinberg MS, et al. Human umbilical cord blood derived CD133+ cells enhance function and repair of the infracted myocardium. Stem Cells 2006; 24(3): 772-780 и Bonnano G, Mariotti A, Procoli A, et al. Human cord blood CD133+ cells imunoselected by a clinical-grade apparatus differentiate in vitro into endothelial- and cardiomyocyte-like cells. Transfusion 2007; 47: 280-289].The ability of pluripotent cord blood cells to form blood vessels and restore myocardium has been shown in studies on the restoration of cardiac function after myocardial infarction using CD34 +, CD133 + / CD45 cells in various animal models [Botta R, Gao E, Stassi G, et al. Heart infarct in NOD-SCID mice: therapeutic vasculogenesis by transplantation of human CD34 + cells ad low dose CD34 + KDR + cells. FASEB J 2004; 18: 1392-1394; Kim BO, Tian H, Prasongsukarn K, et al. Cell transplantation improves ventricular function after a myocardial infarction: a preclinical study of human unrestricted somatic stem cells in a porcine model. Circulation 2006; 112 (9 suppl): 196-204; Leor J, Guetta E, Feinberg MS, et al. Human umbilical cord blood derived CD133 + cells enhance function and repair of the infracted myocardium. Stem Cells 2006; 24 (3): 772-780 and Bonnano G, Mariotti A, Procoli A, et al. Human cord blood CD133 + cells imunoselected by a clinical-grade apparatus differentiate in vitro into endothelial- and cardiomyocyte-like cells. Transfusion 2007; 47: 280-289].

Цереброваскулярные заболевания находятся на одном из первых мест по причине смертности, не включая индивидуумов, выживших после инсульта, но с последствиями, проявляющимися в течение оставшегося периода жизни.Cerebrovascular diseases are in one of the first places due to mortality, not including individuals who survived after a stroke, but with consequences that manifest over the remaining period of life.

Церебральная ишемия является наиболее превалирующей причиной инсультов. В относительно молодом возрасте вследствие пластичности мозга достаточно большая часть мозга может быть удалена (в случае опухолей или гемисферектомии при серьезных повреждениях) без неврологических повреждений или с незначительным периодом восстановления. Эти данные предполагают, что чем моложе нервные клетки, которые могли бы быть продуцированы путем дифференциации из стволовых клеток, тем больше возможность регенерации поврежденного мозга.Cerebral ischemia is the most prevalent cause of strokes. At a relatively young age, due to the plasticity of the brain, a sufficiently large part of the brain can be removed (in the case of tumors or hemispherectomy with serious damage) without neurological damage or with a short recovery period. These data suggest that the younger the nerve cells that could be produced by differentiation from stem cells, the greater the possibility of regeneration of the damaged brain.

В течение всей жизни человека постоянно существует риск неврологических заболеваний и травм. Так, высока частота встречаемости церебрального паралича у новорожденных. От повреждений спинного мозга страдают как дети, так и взрослые. Риск эмболических и геморрагических инсультов увеличивается среди индивидуумов, достигших 40 лет. И, наконец, после 40 лет и в пожилом возрасте высока частота нейродегенеративных заболеваний, как, например, болезнь Паркинсона [Harris, D.Т., Badowski, M., Ahmad, N., & Gaballa, M. (2008). The potential of cord blood stem cells for use in regenerative medicine. Expert Opinion on iological Therapy, 7(9), 1311-1322 и Harris, D.Т., & Rogers, I. (2007). Umbilical cord blood: a unique source of pluripotent stem cells for regenerative medicine. Current Stem Cell Research & Therapy, 2, 301-309]. Традиционные методы терапии, применяемые относительно неврологических заболеваний и травм, неэффективны, что ложится бременем на общество. Использование стволовых клеток в случае неврологических заболеваний или травм открыло бы возможности замещения или регенерации поврежденных тканей спинного или головного мозга. Тем не менее успех зависит от выбора источника стволовых клеток и соответствующего их применения.Throughout a person’s life there is always a risk of neurological diseases and injuries. So, the incidence of cerebral palsy in newborns is high. Both children and adults suffer from spinal cord injuries. The risk of embolic and hemorrhagic strokes increases among individuals over the age of 40. And finally, after 40 years and in old age, the incidence of neurodegenerative diseases is high, such as Parkinson's disease [Harris, D.T., Badowski, M., Ahmad, N., & Gaballa, M. (2008). The potential of cord blood stem cells for use in regenerative medicine. Expert Opinion on iological Therapy, 7 (9), 1311-1322 and Harris, D.T., & Rogers, I. (2007). Umbilical cord blood: a unique source of pluripotent stem cells for regenerative medicine. Current Stem Cell Research & Therapy, 2, 301-309]. Traditional therapies used in relation to neurological diseases and injuries are ineffective, which places a burden on society. The use of stem cells in the event of neurological diseases or injuries would open up the possibility of replacing or regenerating damaged tissues of the spinal cord or brain. Nevertheless, success depends on the choice of the source of stem cells and their corresponding application.

В отличие от многих других патологических состояний, которые были оценены на возможность терапии стволовыми клетками пуповинной крови, восстановление неврологических повреждений имеет намного более сложную этиологию.Unlike many other pathological conditions that were evaluated for the possibility of cord blood stem cell therapy, the restoration of neurological damage has a much more complicated etiology.

Однако на моделях животных для инсульта, бокового амиотрофического склероза, болезни Паркинсона, церебрального паралича и повреждений спинного мозга инфузия стволовых клеток пуповинной крови приводила к заметному улучшению поведения по сравнению с контрольными животными. Тот же эффект наблюдался у животных с неврологическими повреждениями, обусловленными травмами мозга [Chen J, Sanberg PR, Li Y, et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats. Stroke 2001; 32:2682-2688; Willing AE, Lixian J, Milliken M, et al. Intravenous versus intrastriatal cord blood administration in a rodent model of stroke. J Neurosci Res 2003; 73(3): 296-307; Borlongan CV, Hadman M, Sanberg CD, Sanberg PR. Central Nervous System Entry of Peripherally Injected Umbilical Cord Blood Cells Is Not Required for Neuroprotection in Stroke. Stroke 2004; 35: 2385-2389; Newman MB, Willing AE, Manressa JJ, Sanberg CD, Sanberg PR. Cytokines produced by cultured human umbilical cord blood (HUCB) cells: implications for brain repair. Exp Neurol 2006, 199(1): 201-208; Vendrame M, Cassady J, Newcomb J, et al. Infusion of human umbilical cord blood cells in a rat model of stroke dose dependently rescues behavioral deficits and reduces infarct volume. Stroke 2004; 35: 2390-2395; Xiao J, Nan Z, Motooka Y, Low WC. Transplantation of a novel cell line population of umbilical cord blood stem cells ameliorates neurological deficits associated with ischemic brain injury. Stem Cells Dev 2005; 14: 722-733; Newcomb JD, Ajrno CT, Sanberg CD, et al. Timing of Cord Blood Treatment After Experimental Stroke Determines Therapeutic Efficacy. Cell Transplant 2006; 15: 213-223; Nan Z, Grande A, Sanberg CD, Sanberg PR, Low WC. Infusion of Human Umbilical Cord Blood Ameliorates Neurologic Deficits in Rats with Hemorrhagic Brain Injury. Ann NY Acad Sci 2005,1049(1): 84-96; Bliss T, Guzman R, Daadi M, Steinberg GK. Cell transplantation therapy for stroke. Stroke 2007; 38: 817-826; Saporta S, Kim JJ, Willing AE, et al. Human umbilical cord blood stem cells infusion in spinal cord injury: engraftment and beneficial influence on behavior. J Hematother Stem Cell Res 2003; 12: 271-278; Kuh SU, Cho YE, Yoon DH, et al. Functional recovery after human umbilical cord blood cells transplantation with brain derivedneurotropic factor into the spinal cord injured rats. Acta Neurochir (Wein) 2005; 14: 985-992; Kang KS, Kim SW, Oh YH, et al. Thirty-seven-year old spinal cord-injured female patient, transplanted of multipotent stem cells from human UC blood with improved sensory perception and mobility, both functionally and morphologically: A case study. Cytotherapy 2005; 7: 368-373; Lu D, Sanberg PR, Mahmood A, et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces neurological deficit in the rat after traumatic brain injury Cell Transplant 2002; 11: 275-281; Meier C. Middleanis J, Wasielewski B, et al. Spastic paresis after perinatal brain damage in rats is reduced by human cord blood mononuclear cells. Ped Res 2006; 59: 244-249; Ende N, Chen R. Parkinson's Disease Mice and Human Umbilical Cord Blood. J Med 2002; 33: 173-80; Gaebuzova-Davis S, Willing AE, Zigova T, et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood cells in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis: distribution, migration, and differentiation. J Hematother Stem Cell Res 2003; 12: 255-270].However, in animal models for stroke, amyotrophic lateral sclerosis, Parkinson's disease, cerebral palsy and spinal cord injuries, cord blood stem cell infusion led to a marked improvement in behavior compared to control animals. The same effect was observed in animals with neurological damage due to brain injuries [Chen J, Sanberg PR, Li Y, et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats. Stroke 2001; 32: 2682-2688; Willing AE, Lixian J, Milliken M, et al. Intravenous versus intrastriatal cord blood administration in a rodent model of stroke. J Neurosci Res 2003; 73 (3): 296-307; Borlongan CV, Hadman M, Sanberg CD, Sanberg PR. Central Nervous System Entry of Peripherally Injected Umbilical Cord Blood Cells Is Not Required for Neuroprotection in Stroke. Stroke 2004; 35: 2385-2389; Newman MB, Willing AE, Manressa JJ, Sanberg CD, Sanberg PR. Cytokines produced by cultured human umbilical cord blood (HUCB) cells: implications for brain repair. Exp Neurol 2006, 199 (1): 201-208; Vendrame M, Cassady J, Newcomb J, et al. Infusion of human umbilical cord blood cells in a rat model of stroke dose dependently rescues behavioral deficits and reduces infarct volume. Stroke 2004; 35: 2390-2395; Xiao J, Nan Z, Motooka Y, Low WC. Transplantation of a novel cell line population of umbilical cord blood stem cells ameliorates neurological deficits associated with ischemic brain injury. Stem Cells Dev 2005; 14: 722-733; Newcomb JD, Ajrno CT, Sanberg CD, et al. Timing of Cord Blood Treatment After Experimental Stroke Determines Therapeutic Efficacy. Cell Transplant 2006; 15: 213-223; Nan Z, Grande A, Sanberg CD, Sanberg PR, Low WC. Infusion of Human Umbilical Cord Blood Ameliorates Neurologic Deficits in Rats with Hemorrhagic Brain Injury. Ann NY Acad Sci 2005,1049 (1): 84-96; Bliss T, Guzman R, Daadi M, Steinberg GK. Cell transplantation therapy for stroke. Stroke 2007; 38: 817-826; Saporta S, Kim JJ, Willing AE, et al. Human umbilical cord blood stem cells infusion in spinal cord injury: engraftment and beneficial influence on behavior. J Hematother Stem Cell Res 2003; 12: 271-278; Kuh SU, Cho YE, Yoon DH, et al. Functional recovery after human umbilical cord blood cells transplantation with brain derivedneurotropic factor into the spinal cord injured rats. Acta Neurochir (Wein) 2005; 14: 985-992; Kang KS, Kim SW, Oh YH, et al. Thirty-seven-year old spinal cord-injured female patient, transplanted of multipotent stem cells from human UC blood with improved sensory perception and mobility, both functionally and morphologically: A case study. Cytotherapy 2005; 7: 368-373; Lu D, Sanberg PR, Mahmood A, et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces neurological deficit in the rat after traumatic brain injury Cell Transplant 2002; 11: 275-281; Meier C. Middleanis J, Wasielewski B, et al. Spastic paresis after perinatal brain damage in rats is reduced by human cord blood mononuclear cells. Ped Res 2006; 59: 244-249; Ende N, Chen R. Parkinson's Disease Mice and Human Umbilical Cord Blood. J Med 2002; 33: 173-80; Gaebuzova-Davis S, Willing AE, Zigova T, et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood cells in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis: distribution, migration, and differentiation. J Hematother Stem Cell Res 2003; 12: 255-270].

Jang et al. [Jang YK, Park JJ, Lee MC, et al. Retinoic acid-mediated induction of neurons and glial cells from human umbilical cord-derived hematopoietic stem cells. J Neurosci Res 2004; 75: 573-584] продемонстрировали, что CD133+ стволовые клетки пуповинной крови при воздействии ретиноевой кислоты дифференцируются в нервные (астроциты и олигодендроциты) и глиальные клетки с нейромаркерами, включая тубулин, нейроспецифическую энолазу, NeuN, ассоциированный с микротубулином белок-2 (МАР2) и кислый глиальный фибриллярный белок (GFAP), являющийся астроцитоспецифичным маркером.Jang et al. [Jang YK, Park JJ, Lee MC, et al. Retinoic acid-mediated induction of neurons and glial cells from human umbilical cord-derived hematopoietic stem cells. J Neurosci Res 2004; 75: 573-584] have demonstrated that, when exposed to retinoic acid, CD133 + cord blood cells differentiate into nerve (astrocytes and oligodendrocytes) and glial cells with neuromarkers, including tubulin, neurospecific enolase, NeuN, protein-2 associated with microtubulin (MAP2 and acid glial fibrillar protein (GFAP), which is an astrocytospecific marker.

Более того, негемопоэтические стволовые клетки, найденные в пуповинной крови, способны дифференцироваться в астроциты и олигодендроциты [Buzanska L, Jurga M, Stachowiak EK, Stachowiak MK, Domanska-Janik К. Neural stem-like cell line derived from a nonhematopoietic population of human umbilical cord blood. Stem Cells Develop 2006; 15: 391-406]. Таким образом, потомки негемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови также могли бы быть полезны для использования в лечении повреждений мозга и неврологических расстройств.Moreover, non-hematopoietic stem cells found in cord blood can differentiate into astrocytes and oligodendrocytes [Buzanska L, Jurga M, Stachowiak EK, Stachowiak MK, Domanska-Janik K. Neural stem-like cell line derived from a nonhematopoietic population of human umbilical cord blood. Stem Cells Develop 2006; 15: 391-406]. Thus, descendants of non-hematopoietic cord blood stem cells could also be useful in treating brain injuries and neurological disorders.

На модели повреждений спинного мозга у крыс инфузия стволовых клеток пуповинной крови приводила к значительным улучшением на 5-й день после инфузии по сравнению с контрольными животными. Стволовые клетки выявлялись в областях повреждений нервной ткани, но не обнаруживались в неповрежденных областях спинного мозга [Saporta S, Kim JJ, Willing AE, et al. Human umbilical cord blood stem cells infusion in spinal cord injury: engraftment and beneficial influence on behavior. J Hematother Stem Cell Res 2003; 12: 271-278]. Эти данные дополняют результаты исследований о способности клеток пуповинной крови, трансплантированных в спинной мозг животных с травмами, дифференцироваться в нервные клетки различного типа, улучшая регенерацию аксонов и моторную функцию [Kang KS, Kim SW, Oh YH, et al. Thirty-seven-year old spinal cord-injured female patient, transplanted of multipotent stem cells from human UC blood with improved sensory perception and mobility, both functionally and morphologically: A case study. Cytotherapy 2005; 7: 368-373].In a rat spinal cord injury model, umbilical cord blood stem cell infusion resulted in a significant improvement on day 5 after infusion compared to control animals. Stem cells were detected in areas of damage to the nerve tissue, but were not found in the intact areas of the spinal cord [Saporta S, Kim JJ, Willing AE, et al. Human umbilical cord blood stem cells infusion in spinal cord injury: engraftment and beneficial influence on behavior. J Hematother Stem Cell Res 2003; 12: 271-278]. These data supplement the results of studies on the ability of cord blood cells transplanted into the spinal cord of animals with injuries to differentiate into various types of nerve cells, improving axon regeneration and motor function [Kang KS, Kim SW, Oh YH, et al. Thirty-seven-year old spinal cord-injured female patient, transplanted of multipotent stem cells from human UC blood with improved sensory perception and mobility, both functionally and morphologically: A case study. Cytotherapy 2005; 7: 368-373].

В 2001 г. на наиболее распространенной модели инсульта (медиальная закупорка сонной артерии) было продемонстрировано, что инфузия крысам клеток пуповинной крови может улучшить различные физические и поведенческие дефицитные состояния, связанные с болезнью [Chen J, Sanberg PR, Li Y, et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats. Stroke 2001; 32: 2682-2688].In 2001, the most common stroke model (medial carotid obstruction) demonstrated that infusion of cord blood cells into rats could improve various physical and behavioral deficiency conditions associated with the disease [Chen J, Sanberg PR, Li Y, et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats. Stroke 2001; 32: 2682-2688].

Исследования демонстрируют, что прямая инъекция стволовых клеток в мозг не требуется [Willing AE, Lixian J, Milliken M, et al. Intravenous versus intrastriatal cord blood administration in a rodent model of stroke. J Neurosci Res 2003; 73(3): 296-307], и фактически, положительные эффекты можно наблюдать, даже если стволовые клетки не достигают органа-мишени (вероятно, через высвобождение факторов роста и репарации, запускаемое путем аноксии) [Borlongan CV, Hadman M, Sanberg CD, Sanberg PR. Central Nervous System Entry of Peripherally Injected Umbilical Cord Blood Cells Is Not Required for Neuroprotection in Stroke. Stroke 2004; 35: 2385-2389 и Newman MB, Willing AE, Manressa JJ, Sanberg CD, Sanberg PR. Cytokines produced by cultured human umbilical cord blood (HUCB) cells: implications for brain repair. Exp Neurol 2006; 199(1): 201-208].Studies demonstrate that direct injection of stem cells into the brain is not required [Willing AE, Lixian J, Milliken M, et al. Intravenous versus intrastriatal cord blood administration in a rodent model of stroke. J Neurosci Res 2003; 73 (3): 296-307], and in fact, positive effects can be observed even if the stem cells do not reach the target organ (probably through the release of growth and repair factors triggered by anoxia) [Borlongan CV, Hadman M, Sanberg CD , Sanberg PR. Central Nervous System Entry of Peripherally Injected Umbilical Cord Blood Cells Is Not Required for Neuroprotection in Stroke. Stroke 2004; 35: 2385-2389 and Newman MB, Willing AE, Manressa JJ, Sanberg CD, Sanberg PR. Cytokines produced by cultured human umbilical cord blood (HUCB) cells: implications for brain repair. Exp Neurol 2006; 199 (1): 201-208].

Является значительным, что в отличие от использования фармацевтических препаратов, для которых требуется применение в первые несколько часов после инсульта, терапия стволовыми клетками пуповинной крови эффективна до 48 часов после тромботического инцидента [Newcomb JD, Ajrno CT, Sanberg CD, et al. Timing of Cord Blood Treatment After Experimental Stroke Determines Therapeutic Efficacy. Cell Transplant 2006; 15: 213-223]. Преимущества терапии клетками пуповинной крови также показаны на модели геморрагического инсульта [Nan Z, Grande A, Sanberg CD, Sanberg PR, Low WC. Infusion of Human Umbilical Cord Blood Ameliorates Neurologic Deficits in Rats with Hemorrhagic Brain Injury. Ann NY Acad Sci 2005; 1049(1): 84-96].It is significant that, in contrast to the use of pharmaceuticals that require use in the first few hours after a stroke, cord blood stem cell therapy is effective up to 48 hours after a thrombotic incident [Newcomb JD, Ajrno CT, Sanberg CD, et al. Timing of Cord Blood Treatment After Experimental Stroke Determines Therapeutic Efficacy. Cell Transplant 2006; 15: 213-223]. The benefits of cord blood cell therapy are also shown in a hemorrhagic stroke model [Nan Z, Grande A, Sanberg CD, Sanberg PR, Low WC. Infusion of Human Umbilical Cord Blood Ameliorates Neurologic Deficits in Rats with Hemorrhagic Brain Injury. Ann NY Acad Sci 2005; 1049 (1): 84-96].

Были предприняты попытки использовать эмбриональные стволовые клетки и взрослые стволовые клетки костного мозга при ишемических инсультах и паркинсонизме в клинических исследованиях. Так, были предложены способы лечения ишемического инсульта и паркинсонизма с использованием предварительно размноженных в культуре нейрональных стволовых клеток, полученных из ткани переднего мозга или перивентрикулярной области головного мозга абортированных эмбрионов человека (патенты RU 2258521 и RU 2259836). Однако возможность использования эмбриональных стволовых клеток и стволовых клеток костного мозга в терапии ограничена ввиду существенных недостатков.Attempts have been made to use embryonic stem cells and adult bone marrow stem cells for ischemic strokes and parkinsonism in clinical trials. Thus, methods have been proposed for the treatment of ischemic stroke and parkinsonism using pre-propagated neuronal stem cells in culture obtained from the tissue of the forebrain or periventricular region of the brain of aborted human embryos (patents RU 2258521 and RU 2259836). However, the possibility of using embryonic stem cells and bone marrow stem cells in therapy is limited due to significant disadvantages.

Использование фетальных стволовых клеток связано с этическими проблемами, трудностями культивирования клеток и сопряжено с высоким риском контаминации материала бактериальной и/или вирусной микрофлорой. При введении фетальных стволовых клеток путем инфузии без долговременных и дорогостоящих этапов культивирования и дифференциации in vitro возможна злокачественная трансформация эмбриональных клеток, наиболее общей угрозой является образование тератомы. Нежелательной является и длительная иммуносупрессия, которая необходима при использовании эмбриональных клеток из-за угрозы иммунного отторжения. Существенным недостатком способов лечения ишемических инсультов и паркинсонизма, описанных в патентах RU 2258521 и RU 2259836, является и эндолюмбальный способ трансплантации.The use of fetal stem cells is associated with ethical problems, difficulties in cell cultivation and is associated with a high risk of bacterial and / or viral microflora contamination of the material. With the introduction of fetal stem cells by infusion without long-term and expensive stages of cultivation and differentiation in vitro, malignant transformation of embryonic cells is possible, the formation of teratoma is the most common threat. Long-term immunosuppression, which is necessary when using embryonic cells due to the threat of immune rejection, is also undesirable. A significant disadvantage of the methods of treating ischemic strokes and parkinsonism described in the patents RU 2258521 and RU 2259836 is the endolumbar method of transplantation.

Кроме того, пациенты, страдающие от инфаркта миокарда или инсульта, нуждаются в лечении уже в течение нескольких дней, если не часов, а получение необходимых культур фетальных клеток требует длительного времени.In addition, patients suffering from myocardial infarction or stroke need treatment for several days, if not hours, and obtaining the necessary cultures of fetal cells takes a long time.

Способ лечения инсульта на основе трансплантации стволовых клеток костного мозга описан в патенте RU 2283121. Существенным недостатком способа является нейрохирургическое вмешательство: интрацеребральное стереотаксическое введение стволовых клеток под нейронавигационным контролем в область поражения функционально важных структур (в зависимости от клинических проявлений). При выявлении дефицита перфузии вещества головного мозга эта операция дополняется наложением экстра-иптракраниального микроанастомоза.A method for the treatment of stroke based on bone marrow stem cell transplantation is described in patent RU 2283121. A significant drawback of the method is neurosurgical intervention: intracerebral stereotactic injection of stem cells under neuronavigation control into the affected area of functionally important structures (depending on clinical manifestations). If a deficiency of perfusion of the substance of the brain is detected, this operation is supplemented by the imposition of extra-iptracranial microanastomosis.

Хотя костный мозг является источником гемопоэтических, мезенхимальных и эндотелиальных стволовых клеток, большинство стволовых клеток костного мозга получают от взрослых доноров, что ограничивает их пластичность. Клетки пуповинной крови, полученные при рождении, являются уникальным источником плюрипотентных стволовых клеток [Atala et al. Umbilical Cord Blood Current Stem Cell Research & Therapy, 2007, Vol.2, No. 4307]. Более того, клетки пуповинной крови не подвергаются индуцированным окружающей средой эпигенетическим воздействиям.Although bone marrow is a source of hematopoietic, mesenchymal, and endothelial stem cells, most bone marrow stem cells are obtained from adult donors, which limits their plasticity. Umbilical cord blood cells obtained at birth are a unique source of pluripotent stem cells [Atala et al. Umbilical Cord Blood Current Stem Cell Research & Therapy, 2007, Vol. 2, No. 4307]. Moreover, umbilical cord blood cells are not exposed to environmental-induced epigenetic effects.

Использование мононуклеарных клеток пуповинной крови в лечении ишемической болезни сердца, инфаркта миокарда, ишемии мозга, вызванной атеросклерозом или острым нарушением мозгового кровообращения, описано в патенте RU 2284190. Недостатком способа является обязательное HLA-типирование и, более того, для достижения клинического эффекта при ишемических состояниях стволовые клетки пуповинной крови донора должны отличаться от клеток реципиента не менее чем по четырем антигенам из набора антигенов HLA-A, HLA-B, HLA-DR.The use of cord blood mononuclear cells in the treatment of coronary heart disease, myocardial infarction, cerebral ischemia caused by atherosclerosis or acute cerebrovascular accident is described in patent RU 2284190. The disadvantage of this method is the obligatory HLA typing and, moreover, to achieve a clinical effect in ischemic conditions donor cord blood stem cells must differ from the recipient cells in at least four antigens from the set of antigens HLA-A, HLA-B, HLA-DR.

Помимо инсультов на моделях животных показана возможность использования стволовых клеток пуповинной крови в лечении других форм неврологических повреждений. Среди них [Lu et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces neurological deficit in the rat after traumatic brain injury. Cell Transplant 2002; 11: 275-281], на модели крыс было показано, что внутривенное введение мононуклеарных клеток пуповины могло бы быть полезно для лечения травматических повреждений мозга. Причем было продемонстрировано, что клетки пуповинной крови достигают мозга, селективно мигрируют к поврежденной области мозга, экспрессируют нейромаркеры и уменьшают неврологическое повреждение.In addition to strokes in animal models, the possibility of using cord blood stem cells in the treatment of other forms of neurological damage has been shown. Among them [Lu et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces neurological deficit in the rat after traumatic brain injury. Cell Transplant 2002; 11: 275-281], a rat model showed that intravenous administration of umbilical cord mononuclear cells could be useful in treating traumatic brain injuries. Moreover, it was demonstrated that umbilical cord blood cells reach the brain, selectively migrate to the damaged area of the brain, express neuromarkers and reduce neurological damage.

Сходно, трансплантация стволовых клеток пуповинной крови также могла облегчить симптомы церебрального паралича у новорожденных на модели крыс [Meier С, Middleanis J, Wasielewski В, et al. Spastic paresis after perinatal brain damage in rats is reduced by human cord blood mononuclear cells. Ped Res 2006; 59: 244-249].Similarly, cord blood stem cell transplantation could also alleviate the symptoms of cerebral palsy in newborns in a rat model [Meier C, Middleanis J, Wasielewski B, et al. Spastic paresis after perinatal brain damage in rats is reduced by human cord blood mononuclear cells. Ped Res 2006; 59: 244-249].

Регенеративная терапия с использованием стволовых клеток пуповинной крови, фокусируясь на функциональном восстановлении поврежденных тканей, особенно актуальна при травматических повреждениях мозга. С одной стороны, частота черепно-мозговых травм является достаточно высокой (черепно-мозговая травма регистрируется у 4 человек из 1000 населения), с другой стороны, у больных, перенесших черепно-мозговую травму средней степени тяжести, нередко, даже спустя длительное время, сохраняются признаки посттравматического психоорганического синдрома, астенизация, головные боли, вегето-сосудистая дисфункция, нарушения статики, координации и другая неврологическая симптоматика (Лихтерман Л.Б., Фраерман А.П., Хитрин Л.Х., 1979 г. Фазность клинического течения черепно-мозговой травмы, Горький, 1979, с.168-178; Е.Н.Клигуненко, Л.А.Дзяк, В.И.Гришин, О.А.Зозуля, 2004 г.; Дмитриева А.С., Клименко Т.В., 1998 г.)Regenerative therapy using cord blood stem cells, focusing on the functional restoration of damaged tissues, is especially relevant for traumatic brain injuries. On the one hand, the incidence of traumatic brain injuries is quite high (traumatic brain injury is registered in 4 out of 1000 people), on the other hand, in patients who have suffered a moderate head injury, often, even after a long time, they persist signs of post-traumatic psycho-organic syndrome, asthenia, headaches, vegetative-vascular dysfunction, disturbances in statics, coordination, and other neurological symptoms (Likhterman L.B., Fraerman A.P., Khitrin L.Kh., 1979 Clinical phase brain injury, Gorky, 1979, p.168-178; E.N. Kligunenko, L.A. Dzyak, V.I. Grishin, O.A.Zozulya, 2004; Dmitrieva A.S., Klimenko T.V., 1998)

В основе всех проблем психического и неврологического дефицита при посттравматических заболеваниях головного мозга лежит нарушение работы нейронов головного мозга. Динамичности и пластичности нервной системы не хватает для полного самовосстановления. К сожалению, в клинике в настоящее время еще нет эффективных методов для решения этой задачи. В свете сказанного использование стволовых клеток с целью усиления регенерации нервной ткани, стимуляции биологической активности поврежденных нейронов может оказаться весьма плодотворным.At the heart of all the problems of mental and neurological deficit in post-traumatic brain diseases is a violation of the functioning of brain neurons. The dynamism and plasticity of the nervous system is not enough for complete self-healing. Unfortunately, the clinic currently does not yet have effective methods for solving this problem. In light of the foregoing, the use of stem cells in order to enhance the regeneration of nerve tissue, stimulating the biological activity of damaged neurons can be very fruitful.

Однако клинических исследований эффективности терапии стволовыми клетками пуповинной крови последствий черепно-мозговых травм не проведено. При этом следует отметить, что экспериментальная модель черепно-мозговой травмы у животных может значительно отличаться от реальной клинической ситуации, которая приводит к более выраженным повреждениям головного мозга.However, clinical studies of the effectiveness of cord blood stem cell therapy for the effects of traumatic brain injury have not been conducted. It should be noted that the experimental model of traumatic brain injury in animals can significantly differ from the real clinical situation, which leads to more pronounced brain damage.

Так как стволовые клетки пуповинной крови являются по происхождению аллогенными, при проведении клинических исследований важно определить, произойдет ли иммунное отторжение или возникнут другие проблемы, опосредованные иммунитетом, которые могли бы подвергнуть опасности раннее улучшение.Since cord blood stem cells are allogeneic in origin, it is important in clinical trials to determine whether immune rejection will occur or other immunity-mediated problems that could jeopardize early improvement.

Известен способ лечения бокового амиотрофического склероза и множественного склероза путем введения в кровь ядросодержащих клеток пуповинной крови в количестве не менее 5×10⁹ (WO 2004/071283).There is a method of treating amyotrophic lateral sclerosis and multiple sclerosis by introducing into the blood nucleic acid cells of umbilical cord blood in an amount of at least 5 × 10 ⁹ (WO 2004/071283).

При осуществлении способа, описанного в WO 2004/071283, не требуется предварительного подавления иммунного ответа или HLA-типирования донора и реципиента, однако для его осуществления необходимы чрезвычайно большие количества клеток. Количество ядросодержащих клеток в одной порции пуповинной крови не превышает 2,8×10⁹. Этого количества недостаточно для осуществления способа. Таким образом, требуется не только одномоментное введение в организм аллогенных клеток, но и клеток от нескольких разных доноров. При этом резко возрастает риск аллергических, в том числе анафилактических реакций, а также риск развития других иммунопатологических состояний, включая иммунодепрессию.The method described in WO 2004/071283 does not require preliminary suppression of the immune response or HLA typing of the donor and recipient, but extremely large numbers of cells are necessary for its implementation. The number of nucleated cells in one portion of cord blood does not exceed 2.8 × 10 ⁹ . This amount is not enough to implement the method. Thus, not only simultaneous introduction of allogeneic cells into the body is required, but also cells from several different donors. In this case, the risk of allergic, including anaphylactic reactions, as well as the risk of developing other immunopathological conditions, including immunosuppression, sharply increases.

Кроме того, одновременная иммунизация клетками различных доноров приводит к невозможности повторного применения способа у того же больного. Применение способа в 5 случаях из 10 привела к токсическим и аллергическим реакциям с развитием у всех больных иммуносупрессии в течение 7-30 дней после введения. Попытка повторного применения способа приводила к токсико-аллергической реакции у большинства пациентов.In addition, the simultaneous immunization with cells of various donors makes it impossible to reapply the method in the same patient. Application of the method in 5 cases out of 10 led to toxic and allergic reactions with the development of immunosuppression in all patients within 7-30 days after administration. An attempt to re-use the method led to a toxic-allergic reaction in most patients.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Авторами настоящего изобретения впервые предложен способ лечения посттравматической энцефалопатии путем внутривенной инфузии ядросодержащих клеток пуповинной крови человека без риска возникновения иммунопатологических состояний, не требующий HLA-типирования, и без ограничений повторного применения способа в случае клинических показаний.The authors of the present invention for the first time proposed a method for the treatment of post-traumatic encephalopathy by intravenous infusion of nucleated cells of human umbilical cord blood without the risk of immunopathological conditions, not requiring HLA typing, and without limiting the re-use of the method in case of clinical indications.

Настоящее изобретение обеспечивает способ лечения посттравматической энцефалопатии, предусматривающий введение пациенту ядросодержащих клеток пуповинной крови в терапевтически эффективном количестве, которое, в зависимости от веса пациента и клинической картины, составляет от 1×10⁸ до 5×10⁸ и, предпочтительно, от около 2,2×10⁸ до около 2,8×10⁸ ядросодержащих клеток на одно введение. Таким образом, эффективное количество ядросодержащих клеток в соответствии с предложенным способом, по крайней мере, на порядок меньше, чем требуемое количество ядросодержащих клеток пуповинной крови согласно способу лечения бокового амиотрофического склероза и множественного склероза, раскрытого в публикации WO 2004/071283.The present invention provides a method for the treatment of post-traumatic encephalopathy, comprising administering to the patient nucleic acid cells of umbilical cord blood in a therapeutically effective amount, which, depending on the weight of the patient and the clinical picture, is from 1 × 10 ⁸ to 5 × 10 ⁸ and, preferably, from about 2, 2 × 10 ⁸ to about 2.8 × 10 ⁸ nucleated cells per administration. Thus, the effective number of nucleated cells in accordance with the proposed method is at least an order of magnitude smaller than the required number of nucleated cells in cord blood according to the method for treating amyotrophic lateral sclerosis and multiple sclerosis disclosed in WO 2004/071283.

Более того, неожиданным открытием авторов настоящего изобретения оказалось, что заявленный способ высокоэффективен при однократном введении пациентам клеток пуповинной крови. В специфическом варианте воплощения способа предусматривается повторное введение препарата, что, например, значительно превышает эффективность способа лечения ишемии мозга, вызванной атеросклерозом или острым нарушением мозгового кровообращения, описанного в патенте RU 2284190, согласно которому предусматривается повторное введение пациентам мононуклеарных клеток пуповинной крови до 10 раз.Moreover, by the unexpected discovery of the authors of the present invention it turned out that the claimed method is highly effective in a single injection of cord blood cells to patients. In a specific embodiment of the method, re-administration of the drug is provided, which, for example, significantly exceeds the effectiveness of the method for treating cerebral ischemia caused by atherosclerosis or acute cerebrovascular accident described in patent RU 2284190, according to which the re-introduction of mononuclear cord blood cells to patients up to 10 times is provided.

В одном из аспектов изобретения способ применяется для лечения пациентов, перенесших черепно-мозговую травму средней степени тяжести, последствия которой могут включать посттравматический психоорганический синдром, астенизацию, головные боли, вегето-сосудистую дисфункцию, нарушения статики, координации и другую неврологическую симптоматику.In one aspect of the invention, the method is used to treat patients who have suffered a moderate brain injury, the consequences of which may include post-traumatic psycho-organic syndrome, asthenization, headaches, vegetative-vascular dysfunction, dysfunction, static and other neurological symptoms.

Другой аспект изобретения касается использования ядросодержащих клеток пуповинной крови при травмах мозга тяжелой степени, последствиями которых, в частности, являются психические расстройства, эпилептические припадки, грубые двигательные и речевые нарушения.Another aspect of the invention relates to the use of nucleated cord blood cells for severe brain injuries, the consequences of which, in particular, are mental disorders, epileptic seizures, gross motor and speech disorders.

Осуществление изобретенияThe implementation of the invention

Настоящее изобретение основано на неожиданном открытии, что ядросодержащие клетки пуповинной крови могут быть введены пациентам с посттравматической энцефалопатией без риска возникновения иммунного отторжения и приводить к значительному улучшению симптомов последствий черепно-мозговых травм.The present invention is based on the unexpected discovery that umbilical cord blood cells can be administered to patients with post-traumatic encephalopathy without the risk of immune rejection and lead to a significant improvement in symptoms of the effects of traumatic brain injury.

Предложенный способ лечения посттравматической энцефалопатии предусматривает введение пациенту путем внутривенной инфузии ядросодержащих клеток пуповинной крови. Количество вводимых клеток составляет от 1×10⁸ до 5×10⁸ и, предпочтительно, от около 2,2×10⁸ до около 2,8×10⁸ ядросодержащих клеток на одно введение.The proposed method for the treatment of post-traumatic encephalopathy provides for the introduction to the patient by intravenous infusion of nucleated cord blood cells. The number of introduced cells is from 1 × 10 ⁸ to 5 × 10 ⁸ and, preferably, from about 2.2 × 10 ⁸ to about 2.8 × 10 ⁸ nucleated cells per administration.

В одном из вариантов изобретения осуществляют одноразовое введение препарата пациенту.In one embodiment of the invention, a single administration of the drug to the patient is carried out.

В другом варианте осуществления изобретения введение ядросодержащих клеток пуповинной крови осуществляют повторно с интервалом 1-4 недель в количестве от 1×10⁸ до 5×10⁸ и, предпочтительно, от около 2,2×10⁸ до около 2,8×10⁸ ядросодержащих клеток на одно введение.In another embodiment, the introduction of umbilical cord blood cells is repeated at intervals of 1-4 weeks in an amount of from 1 × 10 ⁸ to 5 × 10 ⁸ and, preferably, from about 2.2 × 10 ⁸ to about 2.8 × 10 ⁸ nucleated cells per administration.

Для получения препарата клеток пуповинной крови для использования согласно способу образцы пуповинной крови подвергают седиментации или градиентному центрифугированию, отбирая ядросодержащие клетки с последующим ресуспендированием в охлажденной плазме с добавлением диметилсульфоксида. Полученный материал распределяют в криопробирки, подвергают программному замораживанию, после чего переносят в карантинный сосуд Дюара в пары жидкого азота. По истечении карантинного срока хранения при условии отрицательных результатов тестирования на гемотрансмиссивные инфекции и посева в аэробных/анаэробных условиях образцы переносят на постоянное хранение в сосуд Дюара с жидким азотом.To obtain a cord blood cell preparation for use according to the method, cord blood samples are sedimented or gradient centrifuged to select nucleated cells, followed by resuspension in chilled plasma with the addition of dimethyl sulfoxide. The resulting material is distributed in cryovials, subjected to program freezing, and then transferred to a quarantine Duar in pairs of liquid nitrogen. At the end of the quarantine shelf life, subject to negative test results for blood-borne infections and inoculation under aerobic / anaerobic conditions, the samples are transferred for permanent storage to a Dewar vessel with liquid nitrogen.

Используемая технология получения концентрата стволовых клеток пуповинной крови является стабильно воспроизводимой и высокоэффективной, позволяющей обеспечить высокую жизнеспособность клеток как сразу после выделения, так и после замораживания и последующего оттаивания.The technology used to obtain umbilical cord blood stem cell concentrate is stably reproducible and highly effective, which ensures high cell viability both immediately after isolation and after freezing and subsequent thawing.

Препарат представляет собой стерильную суспензию отмытых от криопротектора живых ядросодержащих клеток пуповинной крови человека в количестве не менее 100 млн в 100 мл физиологического раствора с добавлением реополиглюкина и человеческого сывороточного альбумина и предназначен для внутривенной инфузии через систему для переливания крови и кровезаменяющих растворов (капельницу), а также струйным способом.The preparation is a sterile suspension of not less than 100 million live human cord-containing cells of umbilical cord blood washed from a cryoprotectant in 100 ml of physiological saline supplemented with reopoliglyukin and human serum albumin and is intended for intravenous infusion through a system for blood transfusion and blood substitute solutions (dropper), and also in a jet way.

В одном специфическом варианте осуществления способа используют ядросодержащие клетки пуповинной крови, отмытые от криопротектора.In one specific embodiment of the method, umbilical cord blood cells washed from a cryoprotectant are used.

В другом специфическом варианте осуществления способа используют ядросодержащие клетки пуповинной крови без отмывки от криопротектора.In another specific embodiment of the method, umbilical cord blood cells are used without washing from the cryoprotectant.

Посттравматическая энцефалопатия в основном является последствием черепно-мозговых травм средней и тяжелой степени.Post-traumatic encephalopathy is mainly a consequence of moderate to severe traumatic brain injuries.

При черепно-мозговой травме легкой степени тяжести прогноз, как правило, благоприятный при соблюдении одних только режимных требований и лечебных рекомендаций. Практически полное выздоровление наступает через 2-3 недели после получения травмы, и в дальнейшем такие больные не нуждаются в наблюдении и лечении. При сотрясениях головного мозга, приводящих к черепно-мозговой травме легкой степени тяжести, данные магнитно-резонансной томографии (МРТ) не выявляют какой-либо паренхиматозной очаговой патологии. Компьютерная томография у больных не обнаруживает травматических отклонений в состоянии вещества мозга и ликворосодержащих внутричерепных пространств, но может быть выявлена зона пониженной плотности в веществе мозга, соответствующая отеку мозга (Корниенко В.Н., Васин Н.Я., Кузьменко В.А. Компьютерная томография в диагностике черепно-мозговой травмы. М.: "Медицина", 1987; Корниенко В.Н., Лихтерман Л.Б., Кузьменко В.А., Туркин A.M. Компьютерная томография. В книге: Черепно-мозговая травма. Клиническое руководство, Москва: "Антидор", 1998, Т.1, с.472-495). Отек может быть локальным, долевым или полушарным и проявляется умеренным объемным эффектом в виде сужения ликворных пространств. Эти изменения, обнаруживаемые в первые часы после травмы, обычно достигают максимума на 3-и сутки и исчезают через 2 недели. Таким образом, морфологические изменения в этом случае носят обратимый характер, и за восстановлением морфологии следует полное клиническое выздоровление.In case of mild traumatic brain injury, the prognosis is, as a rule, favorable when observing only regime requirements and medical recommendations. Almost complete recovery occurs within 2-3 weeks after receiving an injury, and in the future, such patients do not need observation and treatment. When concussions of the brain leading to traumatic brain injury of mild severity, magnetic resonance imaging (MRI) data do not reveal any parenchymal focal pathology. Computed tomography in patients does not detect traumatic abnormalities in the state of the substance of the brain and liquor-containing intracranial spaces, but a zone of reduced density in the substance of the brain can be detected, corresponding to cerebral edema (Kornienko V.N., Vasin N.Ya., Kuzmenko V.A. tomography in the diagnosis of traumatic brain injury. M: Medicine, 1987; Kornienko VN, Likhterman LB, Kuzmenko VA, Turkin AM Computed tomography. In the book: Craniocerebral trauma. Clinical guidance Moscow: "Antidor", 1998, Vol. 1, pp. 472-495). Edema can be local, lobar or hemispheric and manifests itself with a moderate volumetric effect in the form of a narrowing of the cerebrospinal fluid. These changes, detected in the first hours after the injury, usually reach a maximum on the 3rd day and disappear after 2 weeks. Thus, the morphological changes in this case are reversible, and the restoration of morphology is followed by a complete clinical recovery.

У больных, перенесших черепно-мозговую травму средней степени тяжести, нередко, даже спустя длительное время, сохраняются признаки посттравматического психоорганического синдрома, астенизация, головные боли, вегето-сосудистая дисфункция, нарушения статики, координации и другая неврологическая симптоматика (Актуальные вопросы нейротравматологии, под ред. А.Н.Коновалова, М.). Эти расстройства значительно ухудшают качество жизни, затрудняют социально-трудовую адаптацию, заставляют пациентов повторно обращаться к врачу. Но, как правило, врачебные рекомендации ограничиваются общеукрепляющей терапией, которая дает лишь временный эффект.In patients who have suffered a moderate head injury, often, even after a long time, signs of post-traumatic psycho-organic syndrome, asthenia, headaches, vegetative-vascular dysfunction, disturbances in statics, coordination, and other neurological symptoms persist (Actual issues of neurotraumatology, ed. A.N. Konovalova, M.). These disorders significantly worsen the quality of life, impede social and labor adaptation, and force patients to consult a doctor again. But, as a rule, medical recommendations are limited to general strengthening therapy, which gives only a temporary effect.

При ушибах головного мозга, приводящих к черепно-мозговой травме средней степени тяжести, всегда имеется участок анатомической деструкции мозга (контузионный очаг). Нарушение целостности мозговой ткани может распространяться и только на кору, и на кору и подкорковые структуры и сопровождается различной степенью выраженности кровоизлияниями в размозженные участки ткани мозга (Зотов Ю.В., Щедренок В.В. Хирургия травматических внутричерепных гематом и очагов размозжений головного мозга. Л. 1984; Зотов Ю.В., Касумов Р.Д., Исмаил Тауфик. Очаги размозжения головного мозга. С.-Петербург, 1996, с.252). Картина компьютерной томографии при ушибе головного мозга средней степени тяжести в большинстве наблюдений представлена очаговыми изменениями в виде мелких кровоизлияний в зоне ушиба, умеренным геморрагическим пропитыванием ткани мозга без грубой ее деструкции. Через 3-4 месяца зона поражения замещается глиальным или глиомезодермальным рубцом (Лихтерман Л.Б., Фраерман А.П., Хитрин Л.Х. Фазность клинического течения черепно-мозговой травмы. Горький, 1979, с.168-178).With bruises of the brain leading to a traumatic brain injury of moderate severity, there is always a site of anatomical destruction of the brain (contusion focus). Violation of the integrity of the brain tissue can spread only to the cortex, and to the cortex and subcortical structures and is accompanied by a varying degree of severity of hemorrhage in the crushed areas of the brain tissue (Zotov Yu.V., Schedrenok V.V. Surgery of traumatic intracranial hematomas and foci of brain crushing. L. 1984; Zotov Yu.V., Kasumov R.D., Ismail Taufik. Centers of brain crush. St. Petersburg, 1996, p. 252). The picture of computed tomography with a bruise of the brain of moderate severity in most cases is represented by focal changes in the form of minor hemorrhages in the bruised area, moderate hemorrhagic impregnation of brain tissue without its rough destruction. After 3-4 months, the affected area is replaced by a glial or gliomesodermal scar (Likhterman LB, Fraerman A.P., Khitrin L.Kh. Phase of the clinical course of traumatic brain injury. Gorky, 1979, p.168-178).

В одном из вариантов осуществления предложенный способ терапии клетками пуповинной крови направлен на лечение поражений головного мозга, причиной которых являются ушибы головного мозга средней степени тяжести. Клиническая картина острого периода ушиба головного мозга средней степени тяжести (первые 4-5 недель) характеризуется выключением сознания после травмы продолжительностью не более двух часов. Возможны преходящие расстройства жизненно важных функций: брадикардия или тахикардия, повышение АД, тахипноэ, субфебрилитет. Часто выявляются оболочечные и стволовые симптомы. Отчетливо проявляется очаговая симптоматика, характер которой обусловлен локализацией ушиба мозга; зрачковые и глазодвигательные нарушения, парезы конечностей, расстройства чувствительности, речи и др. Из психических нарушений могут отмечаться аффективные расстройства - эмоциональная несдержанность, плаксивость, дисфория, астенический синдром, нарушения памяти - ретроградная, антероградная и конградная амнезия, дефицит внимания (Лихтерман Л.Б., Фраерман А.П., Хитрин Л.Х. Фазность клинического течения черепно-мозговой травмы, Горький, 1979, с.168-178). Отмечается следующая динамика обратного развития патологических симптомов: в течение 3-4 суток после травмы общемозговые явления нарастают. Состояние больных в этот период - средней тяжести. Через 2 недели оно улучшается, общемозговые и менингеальные симптомы снижаются. Остаются выраженными вегетативные расстройства; субъективные и объективные признаки без существенных изменений. К четвертой неделе из субъективных признаков остаются: умеренная головная боль, головокружение, шум в ушах, двоение предметов, явления астении и вегето-сосудистой неустойчивости (Лихтерман Л.Б., Фраерман А.П., Хитрин Л.Х. Фазность клинического течения черепно-мозговой травмы, Горький, 1979, с.168-178).In one embodiment, the proposed method for the treatment of cord blood cells is directed to treating brain lesions caused by brain injuries of moderate severity. The clinical picture of the acute period of brain contusion of moderate severity (the first 4-5 weeks) is characterized by a loss of consciousness after an injury lasting no more than two hours. Transient disorders of vital functions are possible: bradycardia or tachycardia, increased blood pressure, tachypnea, subfebrile condition. Often, shell and stem symptoms are detected. Focal symptoms are clearly manifested, the nature of which is due to the localization of a brain contusion; pupillary and oculomotor disturbances, paresis of the extremities, disorders of sensitivity, speech, etc. Affective disorders — emotional restraint, tearfulness, dysphoria, asthenic syndrome, memory impairment — retrograde, anterograde and congrad amnesia, attention deficit (Likhterman L.B. ., Fraerman A.P., Khitrin L.Kh. Phase of clinical course of traumatic brain injury, Gorky, 1979, p.168-178). The following dynamics of the reverse development of pathological symptoms is noted: within 3-4 days after the injury, cerebral phenomena increase. The condition of patients in this period is moderate. After 2 weeks, it improves, cerebral and meningeal symptoms are reduced. Vegetative disorders remain pronounced; subjective and objective signs without significant changes. By the fourth week of the subjective signs remain: moderate headache, dizziness, tinnitus, double objects, asthenia and vegetative-vascular instability (Likhterman L.B., Fraerman A.P., Khitrin L.Kh. Phase of the clinical course of the cranial brain injury, Gorky, 1979, p.168-178).

Подострый период ушиба головного мозга (до 4 месяцев) характеризуется церебрастеническими нарушениями с раздражительностью, сензитивностью, ранимостью, слезливостью, повышенной истощаемостью, снижением работоспособности. Больные жалуются на нарушения сна, непереносимость жары и духоты, ощущение дурноты при езде в транспорте, незначительное снижение памяти. Возможно появление истероформных реакций, умеренных аффективных нарушений. При объективном исследовании выявляется незначительная рассеянная неврологическая симптоматика, вазо-вегетативные нарушения (Лихтерман Л.Б., Фраерман А.П., Хитрин Л.Х. Фазность клинического течения черепно-мозговой травмы, Горький, 1979, с.168-178). Отдаленные последствия черепно-мозговой травмы средней степени тяжести могут проявляться до 2 лет и более.The subacute period of brain contusion (up to 4 months) is characterized by cerebrosthenic disorders with irritability, sensitivity, vulnerability, tearfulness, increased exhaustion, and decreased performance. Patients complain of sleep disturbances, intolerance to heat and stuffiness, a feeling of lightheadedness while riding in vehicles, a slight decrease in memory. Perhaps the appearance of hysteroform reactions, moderate affective disorders. An objective study reveals a slight diffuse neurological symptoms, vaso-vegetative disorders (Likhterman L.B., Fraerman A.P., Khitrin L.Kh. Phase of the clinical course of traumatic brain injury, Gorky, 1979, p.168-178). The long-term consequences of a moderate traumatic brain injury can occur up to 2 years or more.

В другом варианте осуществления предложенный способ направлен на лечение черепно-мозговой энцефалопатии, обусловленной черепно-мозговой травмой тяжелой степени. При травме мозга тяжелой степени, которая может быть обусловлена ушибами мозга тяжелой степени, диффузным аксональным повреждением и сдавлением мозга, прогноз часто неблагоприятный, смертность достигает 15-30%. Среди выживших значительна инвалидизация, ведущими причинами которой являются психические расстройства, эпилептические припадки, грубые двигательные и речевые нарушения (Маневич В.Н. Маневич А.З., Потапов А.А., Брагина Н.Н. Патофизиологические основы интенсивной терапии тяжелой черепно-мозговой травмы, Вест. АМН СССР, №6, с.60, 1986). Такие нарушения требуют длительной комплексной специфической терапии. Даже при благоприятном течении посттравматического процесса период восстановления обычно растягивается на многие месяцы, а иногда и годы. При компьютерной томографии при тяжелых ушибах выявляет свежие сгустки крови, отечную и/или размозженную ткань мозга с формированием на месте пораженного участка зон атрофии или кистозных полостей (Корниенко В.Н., Васин Н.Я. и Кузьменко В.А., 1987 г. Компьютерная томография в диагностике черепно-мозговой травмы. М.: "Медицина", 1987).In another embodiment, the proposed method is directed to the treatment of traumatic brain encephalopathy due to severe traumatic brain injury. In severe brain injury, which can be caused by severe brain injuries, diffuse axonal damage and compression of the brain, the prognosis is often unfavorable, mortality reaches 15-30%. Among the survivors there is significant disability, the leading causes of which are mental disorders, epileptic seizures, gross motor and speech disorders (Manevich V.N. Manevich A.Z., Potapov A.A., Bragina N.N. Pathophysiological basis of intensive care for severe cranial brain injury, Vestnik AMS USSR, No. 6, p. 60, 1986). Such disorders require long-term comprehensive specific therapy. Even with the favorable course of the post-traumatic process, the recovery period usually stretches for many months, and sometimes years. When computed tomography with severe bruises reveals fresh blood clots, swollen and / or crushed brain tissue with the formation of atrophy or cystic cavities in place of the affected area (Kornienko V.N., Vasin N.Ya. and Kuzmenko V.A., 1987 Computed tomography in the diagnosis of traumatic brain injury. M: "Medicine", 1987).

При осуществлении заявленного способа введение концентрата стволовых клеток пуповинной крови не сопровождалось какими-либо реакциями со стороны сердечно-сосудистой, дыхательной или иммунной систем.In the implementation of the inventive method, the introduction of a cord blood stem cell concentrate was not accompanied by any reactions from the cardiovascular, respiratory or immune systems.

В вариантах осуществления предложенного способа, направленных на лечение черепно-мозговой энцефалопатии, обусловленной черепно-мозговыми травмами как средней, так и тяжелой степени, у всех пациентов после введения клеток наблюдалась отчетливая тенденция к быстрой (в течение трех месяцев) редукции всех структурных компонентов астенического синдрома: повышенной утомляемости, истощаемости, аффективной лабильности, гиперестезии, явлений вегетативной дисфункции, сонливости. Существенно повысился уровень психической активности. Через три месяца после введения стволовых клеток пуповинной крови у больных с парезом отмечен практически полный его регресс. У больных с афазическими нарушениями отмечено существенное улучшение речевых функций: регрессировали элементы моторной афазии, ускорился темп речи.In embodiments of the proposed method aimed at the treatment of craniocerebral encephalopathy caused by traumatic brain injuries of both moderate and severe degrees, a clear tendency to rapid (within three months) reduction of all structural components of asthenic syndrome was observed in all patients after cell administration : increased fatigue, exhaustion, affective lability, hyperesthesia, the phenomena of autonomic dysfunction, drowsiness. Significantly increased the level of mental activity. Three months after the introduction of cord blood stem cells in patients with paresis, almost complete regression was noted. In patients with aphasic disorders, a significant improvement in speech functions was noted: elements of motor aphasia regressed, the speed of speech accelerated.

Таким образом, у пациентов с различной неврологической симптоматикой, страдающих от последствий черепно-мозговой травм как средней, так и тяжелой степени, произошло очевидное улучшение состояния. Полученные данные свидетельствуют о том, что терапия стволовыми клетками пуповинной крови при посттравматической энцефалопатии в соответствии с предложенным способом неожиданно приводит к быстрым антиастеническому и ноотропному эффектам, сопровождающимся ускоренным восстановлением когнитивных и «инструментальных» корковых функций.Thus, in patients with various neurological symptoms, suffering from the effects of traumatic brain injury, both moderate and severe, there was an obvious improvement. The data obtained indicate that cord blood stem cell therapy with post-traumatic encephalopathy in accordance with the proposed method unexpectedly leads to rapid anti-asthenic and nootropic effects, accompanied by accelerated restoration of cognitive and "instrumental" cortical functions.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.The invention is illustrated by the following examples.

Пример 1. Заготовка пуповинной крови и выделение ядросодержащих клеток.Example 1. Harvesting umbilical cord blood and the selection of nucleated cells.

Заготовка пуповинной крови проводилась в стерильные емкости (системы для заготовки донорской крови), содержащие изотонический антикоагулянт, с соблюдением предосторожностей, исключающих инфицирование материала в процессе забора и транспортировки. Материал доставлялся в лабораторно-производственный комплекс в изотермическом транспортном контейнере при комнатной температуреHarvesting of cord blood was carried out in sterile containers (systems for the collection of donated blood) containing an isotonic anticoagulant, with the observance of precautions that exclude infection of the material during collection and transportation. The material was delivered to a laboratory-production complex in an isothermal transport container at room temperature

(+18…+22 град Цельсия).(+ 18 ... + 22 degrees Celsius).

Все процедуры по выделению ядросодержащих клеток пуповинной крови выполнялись в соответствии с национальным стандартом Российской Федерации ГОСТ Р 52249-2004 «Правила производства и контроля качества лекарственных средств» с использованием медицинской технологии, разработанной авторами изобретения.All procedures for the isolation of umbilical cord blood cells were performed in accordance with the national standard of the Russian Federation GOST R 52249-2004 "Rules for the production and quality control of drugs" using medical technology developed by the inventors.

После измерения объема пуповинной крови отбирают аликвоты для проведения гематологического анализа (содержание форменных элементов до выделения, группа крови, резус-фактор).After measuring the volume of umbilical cord blood, aliquots are selected for hematological analysis (the content of the formed elements before isolation, blood type, Rh factor).

Для получения ядросодержащих клеток способом седиментации в контейнер с кровью добавляют 6% раствор гидроксиэтилкрахмала (ГЭК) из расчета 1 объем ГЭК к 4 объемам крови и перемешивают в течение 10-15 минут. Содержимое контейнера переносят в пробирки объемом 50 мл, центрифугируют 5 минут при 90 g при отключенном торможении и оставляют на 10-15 минут для формирования видимого раздела между обогащенной лейкоцитами плазмой и осадком эритроцитов. Обогащенную лейкоцитами плазму отбирают в отдельные пробирки и центрифугируют 10 минут при 600 g для осаждения клеточных элементов. Полученные клеточные осадки объединяют и ресуспендируют в плазме. Остаток плазмы переносят в отдельную пробирку и устанавливают в контейнер со льдом.To obtain nucleated cells by sedimentation, a 6% solution of hydroxyethyl starch (HES) is added to the blood container at the rate of 1 volume of HES to 4 volumes of blood and mixed for 10-15 minutes. The contents of the container are transferred into 50 ml tubes, centrifuged for 5 minutes at 90 g with the braking disabled, and left for 10-15 minutes to form a visible section between the white blood-rich plasma and the erythrocyte sediment. Plasma-rich white blood cells are collected in separate tubes and centrifuged for 10 minutes at 600 g to precipitate cell elements. The resulting cell pellets are combined and resuspended in plasma. The remainder of the plasma is transferred to a separate tube and placed in an ice container.

При использовании автоматического сепаратора клеток "SEPAX" после добавления расчетного количества ГЭК мешок с кровью подсоединяют к набору для сепарации через стерильный порт и проводят сепарацию в соответствии с инструкцией на прибор.When using the SEPAX automatic cell separator, after adding the calculated amount of HES, the blood bag is connected to the separation kit through a sterile port and the separation is carried out in accordance with the instructions for the device.

Для получения ядросодержащих клеток способом градиентного центрифугирования кровь распределяют в пробирки объемом 50 мл и центрифугируют 10 минут при 600g для осаждения форменных элементов.To obtain nucleated cells by gradient centrifugation, the blood is distributed into 50 ml tubes and centrifuged for 10 minutes at 600 g to precipitate the cells.

Полученную плазму отбирают в чистую пробирку и помещают на лед. К клеточным осадкам добавляют фосфатно-солевой раствор Хенска или Эрла и ресуспендируют. В стерильные пробирки на 50 мл добавляют по 20 мл раствора фиколла. Клеточные суспензии наслаивают на раствор фиколла и центрифугируют 30 минут при 400-500 g. Интерфазное мононуклеарное кольцо отбирают и переносят в чистые пробирки. В каждую пробирку добавляют фосфатно-солевой раствор до 50 мл, ресуспендируют и центрифугируют 10 минут при 600 g. Процедуру отмывки повторяют дважды. Клеточные осадки последовательно ресуспендируют в охлажденной плазме.The resulting plasma is collected in a clean tube and placed on ice. Hensk or Earl phosphate-saline is added to the cell pellets and resuspended. In sterile 50 ml tubes add 20 ml of ficoll solution. Cell suspensions are layered on a ficoll solution and centrifuged for 30 minutes at 400-500 g. The interphase mononuclear ring is selected and transferred to clean tubes. Up to 50 ml of phosphate-saline solution is added to each tube, resuspended and centrifuged for 10 minutes at 600 g. The washing procedure is repeated twice. Cell pellets are subsequently resuspended in chilled plasma.

Аликвоты клеточных суспензий используют для постановки тестов на стерильность, выявления возбудителей гемотрансмиссивных инфекционных заболеваний, подсчета числа клеток и их жизнеспособности по тесту с трипановым синим, определения содержания CD34/CD45-позитивных клеток методом проточной цитометрии.Aliquots of cell suspensions are used for staging sterility tests, identifying pathogens of blood-borne infectious diseases, counting the number of cells and their viability using the trypan blue test, and determining the content of CD34 / CD45-positive cells by flow cytometry.

К оставшемуся объему плазмы добавляют диметилсульфоксид (ДМСО) до конечной концентрации 20%. К суспензии клеток капельно при постоянном перемешивании добавляют равный объем плазмы с ДМСО. Полученный материал распределяют в криопробирки, подвергают программному замораживанию, после чего переносят в карантинный сосуд Дюара в пары жидкого азота. По истечении карантинного срока хранения при условии отрицательных результатов тестирования на гемотрансмиссивные инфекции и посева в аэробных/анаэробных условиях образцы переносят на постоянное хранение в сосуд Дюара с жидким азотом.Dimethyl sulfoxide (DMSO) is added to the remaining plasma volume to a final concentration of 20%. An equal volume of plasma with DMSO is added dropwise to the cell suspension with constant stirring. The resulting material is distributed in cryovials, subjected to program freezing, and then transferred to a quarantine Duar in pairs of liquid nitrogen. At the end of the quarantine shelf life, subject to negative test results for blood-borne infections and inoculation under aerobic / anaerobic conditions, the samples are transferred for permanent storage to a Dewar vessel with liquid nitrogen.

Образцы пуповинной/плацентарной крови тестируются на предмет выявления возбудителей гемотрансмиссивных инфекционных заболеваний: вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1/2, антиген/антитела), вирусов гепатитов В (HBs Ag, anti-HBc-total) и С (anti-HCV-total), вируса Т-клеточного лейкоза (anti-HTLV-1/2), вирусов простого герпеса 1 и 2 типа (anti-HSV IgM), цитомегаловируса (anti-CMV IgM), возбудителей токсоплазмоза (anti-Toxo IgM), сифилиса (Syphilis PRP), бактериальных и грибковых агентов.Samples of umbilical cord / placental blood are tested for pathogens of blood-borne infectious diseases: human immunodeficiency virus (HIV-1/2, antigen / antibodies), hepatitis B viruses (HBs Ag, anti-HBc-total) and C (anti-HCV-total ), T-cell leukemia virus (anti-HTLV-1/2), herpes simplex viruses type 1 and 2 (anti-HSV IgM), cytomegalovirus (anti-CMV IgM), toxoplasmosis pathogens (anti-Toxo IgM), syphilis ( Syphilis PRP), bacterial and fungal agents.

Статистический анализ результатов выделения концентрата стволовых клеток пуповинной крови (Таблица 1) свидетельствует о высокой эффективности и воспроизводимости используемой технологии, включая высокую жизнеспособность выделенных клеток до и после пробного замораживания/оттаивания.A statistical analysis of the results of the isolation of cord blood stem cell concentrate (Table 1) indicates the high efficiency and reproducibility of the technology used, including the high viability of the isolated cells before and after trial freezing / thawing.

Таблица 1.
Результаты анализа концентрата стволовых клеток пуповинной крови человека при выделении путем градиентного центрифугирования, седиментации или автоматической сепарации.Table 1.
The results of the analysis of human cord blood stem cell concentrate upon isolation by gradient centrifugation, sedimentation or automatic separation. № п.п.No. p.p. ПоказательIndicator Значение, среднее ±SDMean ± SD ГрадиентGradient СедиментацияSedimentation Автоматическая сепарацияAutomatic separation 1.one. Число образцов, включенных в анализThe number of samples included in the analysis 50Р50P 500к500k 500500 Содержание ядерных клеток до выделения, ×10⁹ The content of nuclear cells before isolation, × 10 ⁹ 1.15±0.51.15 ± 0.5 2.2. Выход ядерных клеток, % от исходногоThe output of nuclear cells,% of the original 50.5±12.250.5 ± 12.2 81.03±2.9981.03 ± 2.99 83.0±11.583.0 ± 11.5 3.3. Степень освобождения от эритроцитов, %The degree of release from red blood cells,% 97.82±0.1997.82 ± 0.19 71.94±3.3371.94 ± 3.33 79.2±12.079.2 ± 12.0 4.four. Жизнеспособность клеток перед замораживанием, %Cell viability before freezing,% 99.999.9 99.999.9 99.999.9 5.5. Соотношение клеточных популяций по данным проточной цитометрии, %The ratio of cell populations according to flow cytometry,% 5.1.5.1. лимфоцитыlymphocytes 51.3±10.951.3 ± 10.9 30.6±1.9830.6 ± 1.98 38.0±9.038.0 ± 9.0 5.2.5.2. моноцитыmonocytes 13.8±3.813.8 ± 3.8 10.04±0.4510.04 ± 0.45 11.7±2.011.7 ± 2.0 5.3.5.3. гранулоцитыgranulocytes 25.1±11.025.1 ± 11.0 55.93±1.9755.93 ± 1.97 43.6±8.643.6 ± 8.6 5.4.5.4. гемопоэтические предшественники (CD34⁺/CD45⁺, протокол ISHAGE), %hematopoietic precursors (CD34 ⁺ / CD45 ⁺ , ISHAGE protocol),% 0.46±0.260.46 ± 0.26 0.28±0.030.28 ± 0.03 0.36±0.220.36 ± 0.22 6.6. Выход гемопоэтических предшественников, %The output of hematopoietic precursors,% 85.0±23.085.0 ± 23.0 93.0±19.193.0 ± 19.1 91.4±18.991.4 ± 18.9 7.7. Жизнеспособность клеток после размораживания, %Cell viability after thawing,% 90.8±10.190.8 ± 10.1 87.12±4.787.12 ± 4.7 83.7±7.183.7 ± 7.1

Пример 2. Приготовление лекарственной формы препарата криоконсервированных клеток пуповинной крови для проведения клинических исследований.Example 2. Preparation of a dosage form of a preparation of cryopreserved umbilical cord blood cells for clinical trials.

Препарат представляет собой стерильную суспензию отмытых от криопротектора живых ядросодержащих клеток пуповинной крови человека в количестве не менее 100 млн в 50-100 мл физиологического раствора с добавлением реополиглюкина и человеческого сывороточного альбумина и предназначен для внутривенной инфузии через систему для переливания крови и кровезаменяющих растворов (капельницу), а также струйным способом.The preparation is a sterile suspension of at least 100 million live human cord-containing cells of umbilical cord blood washed from a cryoprotectant in 50-100 ml of physiological saline supplemented with reopoliglyukin and human serum albumin and is intended for intravenous infusion through a system for blood transfusion and blood substitute solutions (dropper) as well as in an inkjet manner.

В процессе размораживания клеточной суспензии извлекают необходимое количество криопробирок с замороженными клетками из криогенного хранилища и оставляют на 5 минут при комнатной температуре.In the process of thawing the cell suspension, the required number of cryovials with frozen cells is removed from the cryogenic storage and left for 5 minutes at room temperature.

Не снимая защитной упаковки, помещают криопробирки в водяную баню (+37 град Цельсия) и размораживают содержимое до исчезновения кристаллов льда. Регулярно перемешивают содержимое переворачиванием пробирок. Вскрывают криопробирки, отвинтив крышку с внутренней резьбой.Without removing the protective packaging, cryovials are placed in a water bath (+37 degrees Celsius) and the contents are thawed until ice crystals disappear. Stir the contents regularly by turning the tubes. Open cryovials by unscrewing the cap with a female thread.

С помощью пипеточного дозатора или дозатора с наконечником на 1 мл переносят содержимое каждой криопробирки в пробирки на 50 мл.Using a pipette dispenser or a dispenser with a 1 ml tip, transfer the contents of each cryovial to 50 ml tubes.

Капельно при перемешивании (первые 10 мл), затем струйно добавляют охлажденный раствор для отмывки до конечного объема 45 мл. Ресуспендируют содержимое повторным пипетированием и закрывают пробирки крышками.Dropwise with stirring (the first 10 ml), then a cooled solution is washed down to wash to a final volume of 45 ml. Resuspend the contents by repeated pipetting and close the tubes with caps.

Центрифугируют 10 минут при 600 g и удаляют надосадочную жидкость с помощью пипеточного дозатора или аспирационной пипетки и медицинского отсасывателя. Оставляют на дне каждой пробирки около 1 мл жидкости.Centrifuge for 10 minutes at 600 g and remove the supernatant using a pipette dispenser or an aspiration pipette and a medical aspirator. About 1 ml of liquid is left at the bottom of each tube.

Последовательно ресуспендируют клеточные осадки в 10 мл охлажденного раствора для отмывки, избегая вспенивания суспензии. С помощью микродозатора переносят 100-200 мкл клеточной суспензии в микропробирку для последующей оценки жизнеспособности и подсчета числа клеток. С помощью шприца на 20 или 50 мл, снабженного иглой, переносят оставшуюся клеточную суспензию во флакон или полимерный контейнер. С помощью шприца на 50 мл добавляют во флакон (полимерный контейнер) физиологический раствор с реополиглюкином и альбумином до конечного объема 100 мл. Определяют содержание и жизнеспособность клеток в суспензии, используя материал из микропробирки.The cell pellets are subsequently resuspended in 10 ml of chilled wash solution, avoiding foaming of the suspension. Using a microdoser, 100-200 μl of the cell suspension is transferred into a microtube for subsequent assessment of viability and counting the number of cells. Using a 20 or 50 ml syringe equipped with a needle, the remaining cell suspension is transferred to a vial or polymer container. Using a 50 ml syringe, physiological saline with reopoliglucin and albumin is added to the final volume of 100 ml in a vial (polymer container). Determine the content and viability of cells in suspension using microtube material.

Время с момента приготовления лекарственной формы (переноса отмытых клеток во флакон или полимерный контейнер) до начала инфузии не должно превышать 4 (четырех) часов. Транспортировка флакона (полимерного контейнера) к месту проведения инфузии проводится при температуре +2-4 град. Цельсия (на льду) в термоконтейнере.The time from the preparation of the dosage form (transfer of the washed cells to the vial or polymer container) to the start of the infusion should not exceed 4 (four) hours. Transportation of the bottle (polymer container) to the place of infusion is carried out at a temperature of + 2-4 degrees. Celsius (on ice) in a thermal container.

Пример 3. Лечение посттравматической энцефалопатии у пациентов, перенесшим травму головного мозга тяжелой степени.Example 3. Treatment of post-traumatic encephalopathy in patients who have suffered a severe brain injury.

Проводились исследования заявленного способа лечения по отношению к пациентам, перенесших тяжелую черепно-мозговую травму. Возраст больных колебался от 21 года до 50 лет. Срок после травмы составлял от 3 до 5 месяцев. У пациентов проявлялась стойкая, значительно выраженная астеническая симптоматика с отчетливым адинамическим компонентом, эмоциональной и сенсорной гиперестезией, локальными двигательными нарушениями, поражениями отдельных видов чувствительности, очаговыми корковыми расстройствами, такими как афазия, апраксия, алексия и др.Studies have been conducted of the claimed method of treatment in relation to patients after severe traumatic brain injury. The age of patients ranged from 21 years to 50 years. The period after the injury ranged from 3 to 5 months. Patients showed persistent, significantly expressed asthenic symptoms with a distinct adynamic component, emotional and sensory hyperesthesia, local locomotor disturbances, lesions of certain types of sensitivity, focal cortical disorders such as aphasia, apraxia, alexia, etc.

Трое больных перенесли ушиб головного мозга тяжелой степени со сдавлением, внутричерепной гематомой. Этим больным были выполнены трепанации черепа, удаление гематом. У 2 других больных по данным компьютерной томографии было отмечено формирование очагов ушиба в височных областях, субарахноидальные кровоизлияния.Three patients suffered a severe brain contusion with compression, intracranial hematoma. These patients underwent craniotomy, removal of hematomas. In 2 other patients, according to computed tomography, the formation of foci of injury in the temporal areas, subarachnoid hemorrhages was noted.

Все больные находились в компенсированном состоянии, у всех в психоневрологическом статусе отмечался астенический синдром разной степени выраженности. У двух больных через 5 месяцев после травмы имелся умеренно выраженный левосторонний гемипарез, речевые нарушения.All patients were in a compensated state, all in neuropsychiatric status showed asthenic syndrome of varying severity. Two patients, 5 months after the injury, had moderate left-sided hemiparesis, speech impairment.

Пациентам была проведена однократная или двукратная капельная внутривенная инфузия отмытых от криопротектора, совместимых по группе крови и резус-фактору клеток пуповинной крови в количестве предпочтительно от около 2,2×10⁸ до около 2,8×10⁸ ядросодержащих клеток на одно введение, что в среднем составляет около 250 млн клеток на одно введение. Введение концентрата стволовых клеток пуповинной крови не сопровождалось какими-либо реакциями со стороны сердечно-сосудистой и дыхательной систем, лишь у одного пациента имело место кратковременное повышение температуры до субфебрильных значений.Patients underwent single or double drip intravenous infusion washed from a cryoprotectant, compatible by blood group and Rh factor of umbilical cord blood cells in an amount of preferably from about 2.2 × 10 ⁸ to about 2.8 × 10 ⁸ nucleated cells per administration, which averages around 250 million cells per administration. The introduction of cord blood stem cell concentrate was not accompanied by any reactions from the cardiovascular and respiratory systems, only one patient had a short-term increase in temperature to subfebrile values.

У всех пациентов после введения клеток наблюдалась отчетливая тенденция к быстрой (в течение трех месяцев) редукции всех структурных компонентов астенического синдрома: повышенной утомляемости, истощаемости, аффективной лабильности, гиперестезии, явлений вегетативной дисфункции, сонливости. Существенно повысился уровень инициативы и психической активности.In all patients, after the introduction of the cells, a distinct tendency was observed towards a rapid (within three months) reduction of all structural components of the asthenic syndrome: increased fatigue, exhaustion, affective lability, hyperesthesia, the phenomena of autonomic dysfunction, and drowsiness. Significantly increased the level of initiative and mental activity.

Через три месяца после введения клеток пуповинной крови у двух больных с парезом отмечен практически полный его регресс. У больного с афазическими нарушениями отмечено существенное улучшение речевых функций: регрессировали элементы моторной афазии, ускорился темп речи.Three months after the introduction of cord blood cells in two patients with paresis, almost complete regression was observed. A patient with aphasic impairment noted a significant improvement in speech functions: elements of motor aphasia regressed, and the pace of speech accelerated.

Возросли темп и успешность выполнения функциональных и нейропсихологических заданий, которые так или иначе связаны с деятельностью теменно-затылочных отделов независимо от реальной локализации мозгового поражения. Так, пациенты стали легче справляться с заданиями на пространственную организацию движений, стали лучше справляться с арифметическими задачами и т.п. Выявленная тенденция к понижению показателя астении, тревоги и соматических симптомов тревоги свидетельствует об улучшении психологического самочувствия пациентов, два из которых вернулись к трудовой деятельности.The pace and success of performing functional and neuropsychological tasks that are somehow related to the activity of the parietal-occipital departments, regardless of the actual localization of brain damage, have increased. So, patients have become easier to cope with tasks for the spatial organization of movements, they have become better at coping with arithmetic tasks, etc. The identified tendency to lower the rate of asthenia, anxiety and somatic symptoms of anxiety indicates an improvement in the psychological well-being of patients, two of whom returned to work.

Таким образом, у пациентов исследуемой группы произошло очевидное улучшение состояния. Полученные данные свидетельствуют о том, что терапия клетками пуповинной крови приводит к антиастеническому и ноотропному эффектам, сопровождающимся ускоренным восстановлением когнитивных и «инструментальных» корковых функций.Thus, in the patients of the study group there was an obvious improvement. The data obtained indicate that cord blood cell therapy leads to antiasthenic and nootropic effects, accompanied by accelerated restoration of cognitive and “instrumental” cortical functions.

Пример 4. Лечение посттравматической энцефалопатии с выраженным астеническим синдромом, речевыми нарушениями и очаговой неврологической симптоматикой.Example 4. Treatment of post-traumatic encephalopathy with severe asthenic syndrome, speech disorders and focal neurological symptoms.

Больной Р., 21 год, в результате дорожно-транспортного происшествия получил травму головы. В тяжелом состоянии был доставлен в нейрохирургическое отделение городской больницы. В течение 2-х недель находился в реанимационном отделении в тяжелом состоянии: нарушение сознания до комы I, сформировался глубокий правосторонний гемипарез. Затем был отправлен в стационар с диагнозом «Ушиб головного мозга тяжелой степени, ушибленная рана теменно-височной области справа». На фоне проводимой инфузионной сосудистой, ноотропной терапии состояние постепенно улучшилось, вернулось сознание, однако длительное время сохранялись грубые речевые нарушения (в остром периоде в течение месяца совсем не мог говорить, вместо артикулированной речи издавал «мычащие» звуки), выраженный правосторонний гемипарез, слабость и утомляемость. В дальнейшем получал лечение амбулаторно, неврологическая симптоматика регрессировала лишь частично. Тем не менее больной вернулся к труду, но даже с легкой работой справлялся с трудом, быстро уставал. Имелись жалобы на нарушение речи, снижение памяти, «замедленность» мышления, неловкость и слабость движений в левых конечностях, утомляемость.Patient R., 21 years old, received a head injury as a result of a traffic accident. In serious condition he was taken to the neurosurgical department of the city hospital. For 2 weeks he was in the intensive care unit in serious condition: impaired consciousness until coma I, a deep right-sided hemiparesis was formed. Then he was sent to a hospital with a diagnosis of "A severe brain injury, a bruised wound of the parietal-temporal region on the right." Against the background of vascular, nootropic infusion therapy, the condition gradually improved, consciousness returned, but gross speech disorders persisted for a long time (in the acute period for a month I could not speak at all, made “bellowing sounds” instead of articulated speech), pronounced right-sided hemiparesis, weakness and fatigue. Subsequently, he received treatment on an outpatient basis, neurological symptoms regressed only partially. Nevertheless, the patient returned to work, but even with light work he coped with difficulty, quickly tired. There were complaints of speech impairment, memory loss, "slowdown" of thinking, awkwardness and weakness of movements in the left limbs, fatigue.

В психоневрологическом статусе имелись умеренно выраженные речевые и мнестические нарушения, отчетливый правосторонний гемипарез, больше выраженный в верхней конечности. Осмотр нейропсихолога выявил нарушения высших корковых функций, проявляющиеся преимущественно когнитивными расстройствами по правополушарному типу.In the neuropsychiatric status, there were moderately expressed speech and mnestic disorders, a distinct right-sided hemiparesis, more pronounced in the upper limb. An examination by a neuropsychologist revealed violations of higher cortical functions, manifested mainly by cognitive impairments of the right hemisphere type.

На компьютерных томограммах признаков патологии головного мозга не выявлено. На серии позитронно-эмиссионных томограмм при исследовании метаболизма глюкозы выявлены очаговые и диффузные изменения в правом полушарии. В полюсе правой височной доли определялось легкое снижение метаболизма глюкозы (до 13% по сравнению с контралатеральным участком). В парасагиттальных участках больших полушарий на стыке лобных и теменных долей уровень фиксации препарата снижен на 20% по сравнению с аналогичными отделами лобных долей без асимметрии. Диффузный гипометаболизм глюкозы отмечен в правом зрительном бугре. По данным электроэнцефалографии (ЭЭГ) очаговой, патологической, типичной эпилептиформной активности не выявлено.Computer tomograms showed no signs of brain pathology. On a series of positron emission tomograms in the study of glucose metabolism, focal and diffuse changes in the right hemisphere were revealed. In the pole of the right temporal lobe, a slight decrease in glucose metabolism was determined (up to 13% compared with the contralateral section). In the parasagittal sections of the cerebral hemispheres at the junction of the frontal and parietal lobes, the level of fixation of the drug is reduced by 20% compared with similar sections of the frontal lobes without asymmetry. Diffuse glucose hypometabolism is noted in the right visual tubercle. According to electroencephalography (EEG) focal, pathological, typical epileptiform activity was not detected.

Результаты дуплексного исследования свидетельствуют о легком снижении скорости кровотока по правой задней мозговой артерии, умеренном нарушении сосудистого тонуса и цереброваскулярной реактивности.The results of a duplex study indicate a slight decrease in the speed of blood flow in the right posterior cerebral artery, moderate impairment of vascular tone and cerebrovascular reactivity.

Пациенту было проведено лечение заявленным способом. Клетки пуповинной крови вводились в количестве 260 млн однократно путем внутривенной инфузии. Процедуру перенес хорошо, нежелательных явлений не было.The patient was treated with the claimed method. Umbilical cord blood cells were injected in an amount of 260 million once by intravenous infusion. The procedure was well tolerated, there were no adverse events.

За прошедшие после введения три месяца был отмечен практически полный регресс явлений пареза в правых конечностях, улучшение речевых функций (увеличился темп речи, она стала более плавной). Пациент вернулся к обычному ритму своей трудовой деятельности, явления астении исчезли полностью.Over the past three months after the introduction, an almost complete regression of the phenomena of paresis in the right extremities, improvement of speech functions (the rate of speech increased, it became smoother) was noted. The patient returned to the usual rhythm of his labor activity, asthenia phenomena completely disappeared.

По результатам психологического исследования у больного вырос объем долговременной памяти, снизился уровень истощаемости, увеличилась скорость выполнения заданий.According to the results of a psychological study, the patient's volume of long-term memory increased, the level of exhaustion decreased, and the speed of completing tasks increased.

Изменений биоэлектрической активности мозга за период наблюдения выявлено не было.No changes in the bioelectric activity of the brain during the observation period were detected.

При сравнении с результатом предыдущего дуплексного исследования отмечается положительная динамика в виде нормализации периферического сопротивления (индексов резистентности) в артериях основания мозга и увеличения кровотока по артериям основания мозга.When compared with the result of the previous duplex study, there is a positive trend in the form of normalization of peripheral resistance (resistance indices) in the arteries of the base of the brain and an increase in blood flow through the arteries of the base of the brain.

Изменения в клинических и биохимических анализах крови, иммунограмме не выходят за рамки нормальных показателей.Changes in clinical and biochemical blood tests, immunograms do not go beyond the normal range.

Таким образом, у пациента произошло очевидное улучшение состояния. Полученные данные свидетельствуют о том, что терапия стволовыми клетками пуповинной крови приводит к антиастеническому и ноотропному эффектам, сопровождающимся ускоренным восстановлением когнитивных и «инструментальных» корковых функций.Thus, the patient experienced a clear improvement. The data obtained indicate that cord blood stem cell therapy leads to antiasthenic and nootropic effects, accompanied by an accelerated restoration of cognitive and “instrumental” cortical functions.

Пример 5. Лечение посттравматической энцефалопатии с умеренно выраженным астеническим синдромом.Example 5. Treatment of post-traumatic encephalopathy with mild asthenic syndrome.

Больной А., 40 лет, травму получил в результате удара по голове. Отмечалась кратковременная утрата сознания, затем в течение нескольких дней беспокоили тошнота, рвота, постепенно нарастающая интенсивная головная боль. При обследовании на магнитно-резонансной томограмме была выявлена субдуральная гематома справа.Patient A., 40 years old, was injured as a result of a blow to the head. Short-term loss of consciousness was noted, then for several days they were disturbed by nausea, vomiting, and gradually growing intense headache. An examination on a magnetic resonance imaging revealed a subdural hematoma on the right.

У больного была выполнена операция трепанации черепа и удаления гематомы. Послеоперационное течение гладкое. На фоне проводимой инфузионной сосудистой, антибактериальной, ноотропной терапии состояние постепенно улучшилось. В компенсированном состоянии был выписан на амбулаторное лечение, получал стандартную медикаментозную терапию, но неврологическая симптоматика сохранялась.The patient underwent surgery for craniotomy and removal of the hematoma. The postoperative course is smooth. Against the background of the ongoing infusion vascular, antibacterial, nootropic therapy, the condition gradually improved. In a compensated condition, he was discharged for outpatient treatment, received standard medication, but neurological symptoms persisted.

Изменения в неврологическом статусе при поступлении были представлены главным образом умеренно выраженными астеническими нарушениями. Больной предъявлял жалобы на периодические головные боли, выраженную утомляемость, снижение трудоспособности, наличие трепанационного дефекта в правой лобно-теменно-височной области.Changes in the neurological status upon admission were mainly represented by moderately severe asthenic disorders. The patient complained of recurrent headaches, severe fatigue, decreased ability to work, and the presence of a trepanation defect in the right frontotoparietal-temporal region.

При обследовании на серии компьютерных томограмм признаков патологии головного мозга не выявлено, в височно-теменной области справа определялся трепанационный костный дефект 7,5 см в диаметре, через который незначительно пролабировало вещество головного мозга (до 5 мм).When examining a series of computed tomograms, there were no signs of brain pathology, a trepanation bone defect of 7.5 cm in diameter was detected in the temporoparietal region on the right, through which the substance of the brain slightly prolapsed (up to 5 mm).

При дуплексном исследовании - протяженность и диаметр экстракраниальных артерий в норме, кровоток достаточный. На серии томограмм (15 срезов) головного мозга при исследовании метаболизма глюкозы в конвекситальной коре правой теменной доли выявлен мелкий очаг гипометаболизма глюкозы (снижение до 21%) диаметром 6 мм, соответствующий внутримозговой гематоме, выявленной на МРТ. Вокруг указанного очага в коре правой теменной доли регистрируется зона диффузного снижения уровня потребления глюкозы на 16% (по сравнению с контралатеральным участком). В конвекситальной коре заднего отдела правой височной доли гипометаболизм глюкозы составляет 14%. Снижение уровня фиксации препарата в мозжечке по сравнению с лобной долей также составляет 14% (с учетом физиологической вариабельности). В остальных отделах коры больших полушарий и подкорковых структурах изменений метаболизма глюкозы не выявлено. Диагноз: Травматическая болезнь головного мозга, нарушение энергетического метаболизма в конвекситальной коре теменной и заднего отдела височной долей правого большого полушария, а также в мозжечке.In a duplex study, the extent and diameter of extracranial arteries is normal, blood flow is sufficient. A series of tomograms (15 slices) of the brain in the study of glucose metabolism in the convexital cortex of the right parietal lobe revealed a small focus of glucose hypometabolism (decrease to 21%) with a diameter of 6 mm, corresponding to intracerebral hematoma detected on MRI. Around the indicated focus in the cortex of the right parietal lobe, a zone of diffuse decrease in glucose consumption by 16% is recorded (compared with the contralateral site). In the convexital cortex of the posterior part of the right temporal lobe, glucose metabolism is 14%. The decrease in the level of fixation of the drug in the cerebellum compared with the frontal lobe is also 14% (taking into account physiological variability). In the remaining parts of the cerebral cortex and subcortical structures, no changes in glucose metabolism were detected. Diagnosis: Traumatic brain disease, impaired energy metabolism in the convexital cortex of the parietal and posterior temporal lobes of the right cerebral hemisphere, as well as in the cerebellum.

При лечении заявленным способом клетки пуповинной крови были введены пациенту в количестве 256 млн клеток однократно путем внутривенной инфузии. Процедуру перенес хорошо, нежелательных явлений не было.In the treatment of the claimed method, umbilical cord blood cells were introduced to the patient in an amount of 256 million cells once by intravenous infusion. The procedure was well tolerated, there were no adverse events.

Через 3 месяца состояние больного существенно улучшилось - явления астенизации значительно уменьшились, головные боли прекратились практически полностью, пациент стал строить планы на дальнейшую жизнь, собирается вернуться к трудовой деятельности.After 3 months, the patient's condition improved significantly - asthenization phenomena significantly decreased, headaches stopped almost completely, the patient began to make plans for his future life, he was going to return to work.

По результатам психологического исследования у больного объем кратковременной и долговременной памяти сохранился на уровне нормы, уменьшилось количество ошибок и время при выполнении заданий.According to the results of a psychological study, the patient’s volume of short-term and long-term memory remained at the normal level, the number of errors and time during tasks were reduced.

Патологических изменений биоэлектрической активности мозга за период наблюдения также выявлено не было.Pathological changes in the bioelectric activity of the brain during the observation period were also not detected.

Полученные данные свидетельствуют о том, что терапия стволовыми клетками пуповинной крови приводит к антиастеническому и ноотропному эффектам, сопровождающимся ускоренным восстановлением когнитивных и «инструментальных» корковых функций.The data obtained indicate that cord blood stem cell therapy leads to antiasthenic and nootropic effects, accompanied by an accelerated restoration of cognitive and “instrumental” cortical functions.

Пример 6. Лечение посттравматической энцефалопатии с выраженным астеническим синдромом, личностными изменениями по типу лобного амотивационного синдрома.Example 6. Treatment of post-traumatic encephalopathy with severe asthenic syndrome, personality changes in the type of frontal amotivation syndrome.

Больной Ц., 47 лет, с травмой головы был доставлен в больницу в состоянии средней тяжести с жалобами на сильные головные боли и нарушение сознания. При обследовании на компьютерных томограммах была выявлена внутримозговая гематома правой височной доли, субарахноидальное кровоизлияние, пластинчатая субдуральная гематома. После трепанации черепа и удаления гематомы, и на фоне проводимой инфузионной сосудистой, антибактериальной, ноотропной терапии состояние несколько улучшилось, но без существенного эффекта. У больного имелись выраженные астенические нарушения, апатия, вялость, быстрая утомляемость, подавленное настроение, снижение аппетита, бессонница, снижение веса, большую часть времени больной проводил в постели.Patient C., 47 years old, with a head injury was taken to hospital in a moderate state with complaints of severe headaches and impaired consciousness. Examination using computed tomograms revealed intracerebral hematoma of the right temporal lobe, subarachnoid hemorrhage, lamellar subdural hematoma. After trepanation of the skull and removal of the hematoma, and against the background of ongoing infusion vascular, antibacterial, nootropic therapy, the condition improved slightly, but without a significant effect. The patient had severe asthenic disturbances, apathy, lethargy, fatigue, depressed mood, decreased appetite, insomnia, weight loss, the patient spent most of the time in bed.

На компьютерных томограммах были выявлены признаки дисциркуляторной энцефалопатии и рубцово-атрофические изменения правой височной доли.Computer tomograms revealed signs of discirculatory encephalopathy and scar-atrophic changes in the right temporal lobe.

Результаты дуплексного исследования свидетельствовали об атеросклеротическом поражении брахицефальных артерий. Также выявлены признаки локальных гемодинамических нарушений в бассейне основной артерии и эхографические признаки системного нарушения церебральной гемодинамики в виде снижения цереброваскулярной реактивности с дефицитом реакции вазодилатации и легкого затруднения венозного оттока из полости черепа по яремным венам и позвоночным сплетениям.The results of a duplex study indicated atherosclerotic lesions of the brachycephalic arteries. Signs of local hemodynamic disturbances in the basin of the main artery and echographic signs of a systemic disturbance of cerebral hemodynamics in the form of a decrease in cerebrovascular reactivity with a deficiency of the vasodilation reaction and slight obstruction of the venous outflow from the cranial cavity through the jugular veins and vertebral plexuses were also revealed.

Клетки пуповинной крови вводились пациенту согласно заявленному способу в количестве 273 млн и 253 млн путем внутривенной инфузии двукратно с интервалом в 3 недели. Общее количество введенных клеток составило 526 млн. Побочных явлений не наблюдалось.Umbilical cord blood cells were injected into the patient according to the claimed method in the amount of 273 million and 253 million by intravenous infusion twice with an interval of 3 weeks. The total number of introduced cells was 526 million. No side effects were observed.

При осмотре через три месяца отмечено полное восстановление психических функций, отсутствие астении и признаков интеллектуально-мнестических нарушений.When viewed after three months, a complete restoration of mental functions was noted, the absence of asthenia and signs of intellectual and mnestic disorders.

При сравнении с результатами дуплексного исследования сосудов, проведенного до лечения заявленным способом, отмечалось легкое увеличение резерва вазодилатации. Клинические, иммунологические и биохимические анализы крови - в пределах нормы.When comparing with the results of a duplex vascular study carried out before treatment by the claimed method, a slight increase in the reserve of vasodilation was noted. Clinical, immunological and biochemical blood tests are within normal limits.

По результатам психологического исследования после двукратного введения клеток пуповинной крови наблюдалась отчетливая тенденция к ускорению темпа психической деятельности больного, существенное повышение продуктивности модальностно-неспецифических свойств памяти и внимания (включая понижение истощаемости, улучшение селективности, концентрации, переключаемости).According to the results of a psychological study, after a double injection of umbilical cord blood cells, there was a clear tendency to accelerate the pace of the patient’s mental activity, a significant increase in the productivity of modal-nonspecific properties of memory and attention (including lowering exhaustion, improving selectivity, concentration, switchability).

Результаты оценки электрофизиологического состояния мозга больного путем ЭЭГ с исследованием когнитивных потенциалов продемонстрировали, что после первого введения стволовых клеток пуповинной крови средняя частота альфа-колебаний сдвигалась в высокочастотную область, а после повторного введения уменьшалась амплитуда колебаний.The results of the assessment of the electrophysiological state of the patient's brain by EEG with the study of cognitive potentials demonstrated that after the first injection of cord blood stem cells, the average frequency of alpha vibrations shifted to the high-frequency region, and after repeated administration, the amplitude of vibrations decreased.

Результаты исследования энергетического метаболизма мозга больного с использованием позитронно-эмиссионной томографии выявили снижение степени гипометаболизма глюкозы на 9-3% в конвекситальной коре правой теменной доли, где был выявлен гипометаболизм глюкозы (14-7%) при первичном исследовании. Кроме того, наблюдалось отчетливое уменьшение функционального истончения коры.The results of a study of the energy metabolism of the patient’s brain using positron emission tomography revealed a decrease in the degree of glucose hypometabolism by 9-3% in the convexital cortex of the right parietal lobe, where glucose hypometabolism (14-7%) was revealed in the initial study. In addition, there was a distinct decrease in functional thinning of the cortex.

Таким образом, в результате проведенной терапии согласно заявленному способу наблюдалось значительное восстановление психических функций у пациента. Положительная клиническая динамика сопровождалась положительной динамикой электрофизиологических и метаболических процессов в головном мозге.Thus, as a result of the therapy according to the claimed method, a significant restoration of mental functions in the patient was observed. Positive clinical dynamics were accompanied by positive dynamics of electrophysiological and metabolic processes in the brain.

Claims

1. A method for the treatment of post-traumatic encephalopathy, characterized in that the cord-containing umbilical cord blood cells obtained by sedimentation or gradient centrifugation of cord blood samples are introduced by intravenous infusion to the patient, taking the cord-containing cells in the form of a cell pellet followed by resuspension in chilled plasma with the addition of cryoprotectant, cryogenic storage.

2. The method according to claim 1, characterized in that the number of introduced cells is from 1 · 10 ⁸ to 5 · 10 ⁸ nucleated cells per administration.

3. The method according to claim 2, characterized in that the number of introduced cells is preferably from about 2.2 · 10 ⁸ to about 2.8 · 10 ⁸ nucleated cells per administration.

4. The method according to claim 1, characterized in that the introduction of nucleated cells of umbilical cord blood is carried out repeatedly with an interval of 1-4 weeks.

5. The method according to claim 4, characterized in that the number of introduced cells is from 1 · 10 ⁸ to 5 · 10 ⁸ nucleated cells per patient.

6. The method according to claim 4, characterized in that the number of introduced cells is preferably from about 2.2 · 10 ⁸ to about 2.8 · 10 ⁸ nucleated cells per administration.

7. The method according to claim 1, characterized in that the use of nucleated cells of umbilical cord blood, washed from the cryoprotectant.

8. The method according to claim 1, characterized in that the use of nucleated cells of umbilical cord blood without washing from the cryoprotectant.