RU2412716C1

RU2412716C1 - Method of separating leukocyte concentrate, which contains hemopoetic stem cells, from umbilical cord blood

Info

Publication number: RU2412716C1
Application number: RU2009137166/15A
Authority: RU
Inventors: Александр Борисович Смолянинов (RU); Александр Борисович Смолянинов; Елена Александровна Котелевская (RU); Елена Александровна Котелевская; Александра Андреевна Айзенштадт (RU); Александра Андреевна Айзенштадт; Шерзод Фархадович Адылов (RU); Шерзод Фархадович Адылов; Ксения Владимировна Коровина (RU); Ксения Владимировна Коровина; Дмитрий Александрович Иволгин (RU); Дмитрий Александрович Иволгин
Original assignee: Александр Борисович Смолянинов; ООО "Покровский банк стволовых клеток"
Priority date: 2009-10-07
Filing date: 2009-10-07
Publication date: 2011-02-27

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: method related to field of medicine, namely to transfusiology. Method includes collecting umbilical cord blood (UCB) into container, weighing it with calculation of its volume, determining type of human leukocyte antigen for comparing hypocompatibility, presence or absence of infection, introduction into packet with UCB, anticoagulant and hydroxyethyl starch, mechanical mixing of packet content in various planes, incubation after mixing at room temperature with separation of erythrocyte mass (EM) by sedimentation, placement of centrifuge chamber in separator, connecting to it on symmetry axis main pipeline, the latter being connected via distribution unit via pipelines to sacks for collection of blood components and to packet with mixture of UCB, anticoagulant and hydroxyethyl starch. After that, chamber is filled with packet content, and mixture is subjected to separation, with its separation into EM, plasma and leukocyte concentrate with their distribution into corresponding sacks and into empty packet. After separation, viability and amount of SC are determined, they are checked on biological inoculation of sample of plasma and EM mixture, dose of plasma is tested for detection of antibodies, hemotransmissive infections, dose of EM is used to determine blood group and Rhesus factor.

EFFECT: method application makes it possible to increase quality and reliability of determining SM from various biological contaminations.

1 dwg

Description

Способ выделения из пуповинной крови лейкоцитарного концентрата, содержащего гемопоэтические стволовые клетки, относится к области медицины - к трансфузиологии.A method for isolating a leukocyte concentrate containing hematopoietic stem cells from umbilical cord blood relates to the field of medicine - transfusiology.

Клеточная терапия - это современный метод лечения самых разнообразных заболеваний. Применение в клинической практике инновационных клеточных технологий направлено на улучшение качества жизни и увеличении продолжительности жизни населения. Применение новых клеточных технологий в здравоохранении разрешено Росздравнадзором лицензией № 99-1-001458 от 12.05.2005 г. Стволовые клетки - это универсальные предшественники клеток всех органов человека, а также клеток крови. Они способны делиться при определенных условиях и превращаться в любой вид ткани. Это свойство используется, когда необходимы, например, замена и восстановление функций кроветворной ткани. Выделяют два основных типа стволовых клеток: гемопоэтические и мезенхимальные. Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) превращаются во взрослые клетки крови, переносят кислород и питательные вещества к тканям и отвечают за иммунитет и невосприимчивость к различным заболеваниям. Мезенхимальные стволовые клетки дают начало всем «высокоспециализированным» клеткам органов человеческого организма. В настоящее время существуют методы выделения стволовых клеток из костного мозга, периферической крови, пуповинной крови, жировой ткани, пульпы зуба. В течение всей жизни человек стареет и подвергается неблагоприятным воздействиям внешней среды и экологии. Такие факторы, как радиация, концерогенные вещества, воздействуют на весь организм и все его клетки. Стволовые клетки, полученные из пуповинной крови, намного моложе однотипных клеток из костного мозга, т.к. они сохранены в самом начале жизни и более защищены от вредных воздействий, количество делений клеток ограничено. Стволовые клетки пуповинной крови собирают на одном из ранних этапов жизни человека, поэтому способность этих клеток делиться и превращаться в нужные организму клетки, а также их пролиферативная способность выше. Пуповинная кровь собирается легко и быстро. Сам по себе процесс сбора пуповинной крови прост, занимает не более 10 минут, не вызывает дискомфорта и безопасен как для матери, так и для ребенка, т.к. при этом с ними нет контакта.Cell therapy is a modern method of treating a wide variety of diseases. The use of innovative cellular technologies in clinical practice is aimed at improving the quality of life and increasing the life expectancy of the population. The use of new cellular technologies in healthcare is permitted by Roszdravnadzor under license No. 99-1-001458 dated 05/12/2005. Stem cells are universal precursors of cells of all human organs, as well as blood cells. They are able to divide under certain conditions and turn into any kind of tissue. This property is used when, for example, replacement and restoration of the functions of the hematopoietic tissue is necessary. There are two main types of stem cells: hematopoietic and mesenchymal. Hematopoietic stem cells (HSCs) are transformed into adult blood cells, carry oxygen and nutrients to tissues and are responsible for immunity and immunity to various diseases. Mesenchymal stem cells give rise to all "highly specialized" cells of the organs of the human body. Currently, there are methods for isolating stem cells from bone marrow, peripheral blood, umbilical cord blood, adipose tissue, and tooth pulp. Throughout life, a person ages and is exposed to the adverse effects of the environment and ecology. Factors such as radiation, concertogenic substances affect the entire body and all its cells. Stem cells obtained from cord blood are much younger than the same cells from bone marrow, because they are preserved at the very beginning of life and are more protected from harmful effects, the number of cell divisions is limited. Cord blood stem cells are harvested at one of the early stages of a person’s life, therefore the ability of these cells to divide and turn into cells necessary for the body, as well as their proliferative ability, is higher. Cord blood is collected quickly and easily. The umbilical cord blood collection process itself is simple, takes no more than 10 minutes, does not cause discomfort and is safe for both the mother and the child, as there is no contact with them.

Пуповинную кровь собирает акушерка после отсечения пуповины, ее можно собирать как после самостоятельных родов, так и после кесарева сечения. Когда ребенок родится, акушерка пережимает и перерезает пуповину, затем вводят в нее иглу от системы, куда поступает кровь. Собранную кровь помещают в контейнер для транспортировки. В нем кровь защищена от ударов, вибрации, резких перепадов температуры и в полной сохранности вместе с сопроводительной документацией доставляется в хранилище. Доставка осуществляется в течение 24 часов, что позволяет провести сбор крови практически в любом городе РФ. Перед помещением в хранилище пуповинная кровь ребенка должна быть обработана. Кровь взвешивают, подсчитывают количество стволовых клеток. Затем стволовые клетки выделяют из пуповинной крови и добавляют к ним криопротектор - раствор, который предохраняет клетки от разрушения при размораживании. Выделенные стволовые клетки помещают в мешки, разработанные специально для долгосрочного хранения при низких температурах, и три криопробирки - «спутника». Каждому образцу присваивают уникальный индентификационный номер. Используемая маркировка гарантирует неприкосновенность стволовых клеток ребенка. Стволовые клетки ребенка будут храниться в запаянном стерильном и герметичном мешке в условиях глубокого холода, см. «Клиническая гематология. Справочник. Спутник врача» под ред. Абдулкадырова К.М., СПб., «ПИТЕР», 2006 г., стр.365-398.Cord blood is collected by the midwife after cutting off the umbilical cord; it can be collected both after independent delivery and after cesarean section. When the baby is born, the midwife pinches and cuts the umbilical cord, then a needle is inserted into it from the system where the blood enters. The collected blood is placed in a container for transportation. In it, blood is protected from shock, vibration, sudden changes in temperature and, in complete safety, together with the accompanying documentation is delivered to the store. Delivery is carried out within 24 hours, which allows blood collection in almost any city of the Russian Federation. Before being placed in storage, the umbilical cord blood of a child must be processed. Blood is weighed, the number of stem cells is counted. Then, stem cells are isolated from umbilical cord blood and a cryoprotectant is added to them - a solution that protects cells from destruction during thawing. Isolated stem cells are placed in bags designed specifically for long-term storage at low temperatures, and three cryovials - "satellite". Each sample is assigned a unique identification number. The labeling used guarantees the integrity of the baby’s stem cells. The baby’s stem cells will be stored in a sealed sterile and airtight bag in deep cold conditions, see Clinical Hematology. Directory. Doctor’s companion, ed. Abdulkadyrova K.M., St. Petersburg., “PETER”, 2006, pp. 365-398.

Недостатками указанного выше способа выделения гемопоэтических стволовых клеток из пуповинной крови являются: способ технологически неэффективен, отсутствуют действия по определению качества пуповинной крови выделенных стволовых клеток, отсутствуют проверки на определение возможных или их отсутствие биологических загрязнений и инфицированности, отсутствуют действия и количественные значения, позволяющие осуществить технологический процесс получения гемопоэтических стволовых клеток.The disadvantages of the above method for the isolation of hematopoietic stem cells from umbilical cord blood are: the method is technologically ineffective, there are no actions to determine the quality of the cord blood of the extracted stem cells, there are no checks to determine the possible or their absence of biological contamination and infection, there are no actions and quantitative values that allow the technological the process of obtaining hematopoietic stem cells.

В трансфузиологии известна методика выделения гемопоэтических стволовых клеток из пуповинной крови, см. http://www.gemabank, ru/pub/nl.htmal-cma, авторов: К.М.Абдулкадыров, Н.А.Романенко, Н.Н.Старков, А.В.Сельцер «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии». Заготовка и хранение пуповинной крови. Материалы научно-практической конференции, Санкт-Петербург, 2000 г. Сбор пуповинной крови производят при физиологических родах после рождения ребенка и отделения его от последа. После этого производят пункцию вены пуповинного канатика. Процедура сбора пуповинной крови длится не более 10 минут. После сбора крови контейнер с пуповинной кровью взвешивают для определения массы собранной крови. Перерасчет массы крови на объем осуществляют делением массы на плотность пуповинной крови с раствором антикоагулянта («глюгицир» - раствор гидроцитрата натрия), которая составляет 104-105 г в 100 мл. Далее в крови определяют содержание лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов, гемоглобина, а также осуществляют бактериологический посев на стерильность. Выделения эритроцитов и лейкоцитов осуществляют посредством седементации в 10% растворе гидроксиэтилкрахмала в соотношении его с пуповинной кровью 1:4, отмывании от гидроксиэтилкрахмала и сепарации со скоростью 1500 об/мин в течение 10 минут. Получение ядросодержащих клеток осуществляют в градиенте плотности фиколла посредством сепарации и раствора гидроксиэтилкрахмала.In transfusiology, a known technique for the isolation of hematopoietic stem cells from umbilical cord blood, see http: //www.gemabank, ru / pub / nl.htmal-cma, authors: K.M. Abdulkadyrov, N.A. Romanomanko, N.N. Starkov, A.V. Seltser "Actual problems of hematology and transfusiology." Harvesting and storage of cord blood. Materials of the scientific-practical conference, St. Petersburg, 2000. Cord blood is collected during physiological delivery after the birth of the child and separation from the placenta. After this, a puncture of a cord cord vein is performed. The umbilical cord blood collection procedure lasts no more than 10 minutes. After collecting the blood, the cord blood container is weighed to determine the mass of the collected blood. Recalculation of blood mass by volume is carried out by dividing the mass by the density of umbilical cord blood with an anticoagulant solution ("glucicir" - sodium hydrogen citrate solution), which is 104-105 g in 100 ml. Next, the blood determines the content of leukocytes, red blood cells, platelets, hemoglobin, and also carry out bacteriological culture on sterility. The allocation of red blood cells and white blood cells is carried out by sedimentation in a 10% solution of hydroxyethyl starch in a ratio of 1: 4 to umbilical cord blood, washing off hydroxyethyl starch and separating at a speed of 1500 rpm for 10 minutes. Obtaining nucleated cells is carried out in a density gradient of ficoll by separation and a solution of hydroxyethyl starch.

Недостатками такого способа выделения гемопоэтических стволовых клеток из пуповинной крови являются: недостаточное качество, количество и надежность проверок пуповинной крови, т.к. отсутствуют проверки на наличие HLA - типирования гистосовместимости пуповинной крови, отсутствует тест на выявление антител T.pallidum в плазме пуповинной крови, отсутствуют контрольные действия и проверки с плазмой пуповинной крови и отсутствует проверка на гемотрансмиссивные инфекции; полученные фракции ядросодержащих клеток в градиенте плотности фиколла могут нанести вред здоровью человека, приведенное соотношение седементирующегго средства - гидроксиэтилкрахмала 1:4 недостаточно эффективно, супернатант отбирают пипеткой, открытая система может привести к инфекции, технология способа выявления гемопоэтических стволовых клеток практически и промышленно не отработана и неэффективна.The disadvantages of this method of isolation of hematopoietic stem cells from cord blood are: insufficient quality, quantity and reliability of cord blood tests, because there are no tests for the presence of HLA - typing of histocompatibility of cord blood, there is no test for detection of T. pallidum antibodies in cord blood plasma, there are no control actions and tests with cord blood plasma and there is no check for blood-borne infections; the obtained fractions of nucleated cells in the density gradient of ficoll can be harmful to human health, the ratio of the sedimenting agent to hydroxyethyl starch is not enough 1: 4, the supernatant is taken with a pipette, the open system can lead to infection, the technology for detecting hematopoietic stem cells is practically and industrially not developed and ineffective .

Техническим результатом предлагаемого способа выделения гемопоэтических клеток из пуповинной крови является: повышение качества и надежности от различной инфекционности и биологических загрязнений, собранных и выделенных из пуповинной крови стволовых клеток, содержащихся в лейкоцитарном концентрате, повышении технологичности получения гемопоэтических стволовых клеток CD34+CD45^dim.The technical result of the proposed method for the isolation of hematopoietic cells from umbilical cord blood is: improving the quality and reliability of various infectiousness and biological contaminants collected and extracted from cord blood of stem cells contained in leukocyte concentrate, increasing the manufacturability of hematopoietic stem cells CD34 + CD45 ^dim .

Этот результат достигается тем, что в способе выделения из пуповинной крови лейкоцитарного концентрата, содержащего гемопоэтические стволовые клетки, заключающемся в сборе крови из пуповины в контейнер, взвешивании массы собранной крови с подсчетом ее объема, учитывая массу антикоагулянта, проведении анализа пуповинной крови на бактериологический посев, осуществлении сепарации посредством центрифугирования, разделяя пуповинную кровь на эритроцитарную массу и лейкоцитарный концентрат с гемопоэтическми стволовыми клетками посредством седементирующего средства раствором гидроксиэтилкрахмала, после взвешивания контейнера, выполненного в виде пакета, с пуповинной кровью в ламинарном боксе, предварительно облученном ультрафиолетовым излучением, отбирают из пакета 1,5 мл пуповинной крови для обследования ее на гемоанализаторе, определяя тип человеческого лейкоцитарного антигена для сопоставления гистосовместимости, на отсутствие или наличие инфицирования, вновь взвешивают массу пуповинной крови в пакете и определяют ее объем по формуле V₁=((M_пk-M_ak)/P_cp)+V_ak, где М_пк - масса пуповинной крови, г, с пакетом, в котором она размещена, М_ак - масса антикоагулянта, г, с пакетом, в котором он размещен, P_cp - среднее значение плотности крови, г/мл, V_ak - объем антикоагулянта, мл, причем антикоагулянт взят в виде цитрат-фосфат-декстроза-аденин с массой, равной 54,4 г, вместе с пакетом, в котором он размещен, среднее значение плотности крови взято равным 1,05 г/мл, а объем антикоагулянта - 35 мл, после перемешивания пуповинной крови с антикоагулянтом, внесенным в пакет с пуповинной кровью, в последний вводят седементирующее средство в виде 6% раствора гидроксиэтилкрахмала в объеме, рассчитанном по формуле V₂=0,2V₁, помещают пакет со смесью пуповинной крови, антикоагулянтом и гидроксиэтилкрахмалом на площадку шейкера, осуществляют орбитальное механическое перемешивание содержимого пакета со скоростью 30 об/мин, наклоняя площадку шейкера в разных плоскостях к горизонту, и проводят инкубацию смеси с пуповинной кровью в течение 10 минут при комнатной температуре, отделяя эритроцитарную массу седементированием в пакете смеси с пуповинной кровью, затем помещают центрифужную камеру в сепаратор, подсоединяют к ней по вертикальной оси симметрии магистральный трубопровод, подсоединяя последний через оптический сенсор к распределительному узлу, от которого подводят трубопроводы к мешкам для сбора компонентов крови и к пакету со смесью, наполняют камеру смесью пуповинной крови, антикоагулянта и гидроксиэтилкрахмала из пакета и осуществляют сепарацию размещенных в центрифужной камере смеси с пуповинной кровью антикоагулянтом и гидроксиэтилкрахмалом центрифугированием со скоростью от 1700 до 8000 об/мин в течение времени от 10 до 40 минут, разделяя содержимое пакета с пуповинной кровью на эритроцитарную массу, плазму и лейкоцитарный концентрат и распределяя их посредством оптического сенсора через трубопроводы к своим мешкам, после окончания сепарации отбирают 0,5 мл фракции лейкоцитарного концентрата для определения жизнеспособности и количества гемопоэтических стволовых клеток CD34+CD45^dim на проточном цитофлуориметре, из мешков с плазмой и эритроцитарной массой отбирают по 2,5 мл, смешивают эти дозы в пробирке и проверяют эту смесь на бактериальный посев, для выявления антител T.pallidum в плазме отбирают 0,1 мл плазмы, также отбирают из мешка с плазмой 1 мл плазмы в пробирку с маркировкой «плазма ребенка» для исследования на гемотрансмиссивные инфекции, а из мешка с эритроцитарной массой отбирают 1 мл для определения группы крови и резус-фактора.This result is achieved by the fact that in the method of isolating a leukocyte concentrate containing hematopoietic stem cells from umbilical cord blood, which involves collecting blood from the umbilical cord into a container, weighing the mass of collected blood with the calculation of its volume, taking into account the mass of the anticoagulant, analyzing the cord blood for bacteriological culture, separation by centrifugation, separating umbilical cord blood into erythrocyte mass and leukocyte concentrate with hematopoietic stem cells by After sedimentation with a hydroxyethyl starch solution, after weighing the container in the form of a bag with umbilical cord blood in a laminar box previously irradiated with ultraviolet radiation, 1.5 ml of umbilical cord blood is taken from the packet for examination on a blood analyzer, determining the type of human leukocyte antigen for comparing histos , for the absence or presence of infection, again weigh the mass of cord blood in the bag and determine its volume by the formula V ₁ = ((M _pk -M _ak ) / P _cp ) + V _ak , where M _pc is the mass of cord blood, g, with the packet in which it is placed, M _ak is the mass of the anticoagulant, g, with the packet in which it is placed, P _cp is the average value of the blood density, g / ml, V _ak is the volume of the anticoagulant, ml moreover, the anticoagulant is taken in the form of citrate-phosphate-dextrose-adenine with a mass of 54.4 g, together with the package in which it is placed, the average blood density is taken to be 1.05 g / ml, and the volume of the anticoagulant is 35 ml , after mixing the umbilical cord blood with an anticoagulant in the umbilical cord package, a sedimentation medium is introduced into the latter in the form of a 6% solution of hydroxyethyl starch in a volume calculated by the formula V ₂ = 0.2V ₁ , place a bag of a mixture of cord blood, an anticoagulant and hydroxyethyl starch on a shaker pad, orbitally mix the contents of the packet at a speed of 30 rpm, tilting the pad shakers in different planes to the horizon, and the mixture with umbilical cord blood is incubated for 10 minutes at room temperature, separating the erythrocyte mass by sedimentation in a packet of cord blood mixture, then centered the old chamber into the separator, the main pipeline is connected to it along the vertical axis of symmetry, connecting the latter through an optical sensor to the distribution unit, from which the pipelines to the bags for collecting blood components and to the bag with the mixture are connected, the chamber is filled with a mixture of umbilical cord blood, anticoagulant and hydroxyethyl starch from package and carry out the separation of the mixture in the centrifuge chamber with cord blood with an anticoagulant and hydroxyethyl starch by centrifugation at a speed of 1700 to 8000 rpm in t the passage of time from 10 to 40 minutes, dividing the contents of the umbilical cord package into red blood cells, plasma and leukocyte concentrate and distributing them through an optical sensor through the pipelines to their bags, after the separation is completed, 0.5 ml of the leukocyte concentrate fraction is taken to determine the viability and quantity CD34 + CD45 ^dim hematopoietic stem cells by flow cytometry, of bags of plasma and red cell mass are selected by 2.5 mL, mix these dosage in vitro and this mixture is checked for bacteria For the detection of T. pallidum antibodies in plasma, 0.1 ml of plasma is taken, 1 ml of plasma is also taken from a plasma bag in a tube labeled “plasma of a child” for testing for blood-borne infections, and 1 ml is taken from a bag with red blood cells to determine the blood group and Rh factor.

Сущность изобретения заключается в совокупности существенных признаков, достаточной для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата.The invention consists in the combination of essential features sufficient to achieve the technical result provided by the invention.

Существенными признаками предложенного способа, совпадающими с известными признаками, являются: А - сбор крови из пуповины в контейнер; Б - взвешивание массы собранной крови с подсчетом ее объема, учитывая массу антикоагулянта; В - проведение анализа на бактериологический посев; Г - осуществление сепарации посредством центрифугирования, разделяя пуповинную кровь на эритроцитарную массу и лейкоцитарный концентрат с гемопоэтическими стволовыми клетками посредством седементирующего средства раствором гидроксиэтилкрахмала.The essential features of the proposed method, which coincide with the known features, are: A - collection of blood from the umbilical cord into the container; B - weighing the mass of collected blood with the calculation of its volume, taking into account the mass of the anticoagulant; B - analysis for bacteriological culture; G - the implementation of the separation by centrifugation, dividing the umbilical cord blood into an erythrocyte mass and a leukocyte concentrate with hematopoietic stem cells by means of a sedimentation agent with a hydroxyethyl starch solution.

Существенными отличительными признаками способа выделения из пуповинной крови лейкоцитарного концентрата, содержащего гемопоэтические стволовые клетки, являются: Д - после взвешивания контейнера, выполненного в виде пакета, с пуповинной кровью в ламинарном боксе, предварительно облученном ультрафиолетовым излучением, отбирают из пакета 1,5 мл пуповинной крови для обследования ее на гемоанализаторе, определяя тип человеческого лейкоцитарного антигена для сопоставления гистосовместимости, на отсутствие или наличия инфицирования; Е - вновь взвешивают массу пуповинной крови в пакете и определяют ее объем по формуле V₁=((M_nk-M_ak)/P_cp)+V_ak, где М_пк - масса пуповинной крови, г, с пакетом, в котором она размещена, М_ак - масса антикоагулянта, г, с пакетом, в котором он размещен, P_cp - среднее значение плотности крови, г/мл, V_ак - объем антикоагулянта, мл, причем антикоагулянт взят в виде цитрат-фосфат-декстроза-аденин с массой, равной 54,4 г вместе с пакетом, в котором он размещен, среднее значение плотности крови равно 1,05 г/мл, а объем антикоагулянта - 35 мл; Ж - после перемешивания пуповинной крови с антикоагулянтом, внесенным в пакет с пуповинной кровью, в последний вводят седементирующее средство в виде 6% раствора гидроксиэтилкрахмала в объеме, рассчитанным по формуле V₂=0,2V₁; И - помещают пакет со смесью пуповинной крови, антикоагулянтом и гидроксиэтилкрахмалом на площадку шейкера, осуществляют орбитальное механическое перемешивание содержимого пакета со скоростью 30 об/мин, наклоняя площадку шейкера в разных плоскостях к горизонту; К - проводят инкубацию смеси с пуповинной кровью в течение 10 минут при комнатной температуре, отделяя эритроцитарную массу седементированием в пакете смеси с пуповинной кровью; Л - помещают центрифужную камеру в сепаратор, подсоединяют к ней по вертикальной оси симметрии магистральный трубопровод, подсоединяя последний через оптический сенсор к распределительному узлу, от которого подводят трубопроводы к мешкам для сбора компонентов крови и к пакету со смесью, наполняют камеру смесью пуповинной крови, антикоагулянта и гидроксиэтилкрахмала из пакета; М - осуществляют сепарацию размещенных в центрифужной камере смеси с пуповинной кровью со скоростью от 1700 до 8000 об/мин в течение времени от 10 до 40 минут, разделяя пуповинную кровь на эритроцитарную массу, плазму и лейкоцитарный концентрат и распределяя их посредством оптического сенсора через трубопроводы к своим мешкам; Н - после окончания сепарации отбирают 0,5 мл фракции лейкоцитарного концентрата для определения жизнеспособности и количества гемопоэтических стволовых клеток CD34+CD45^dim на проточном цитофлуориметре; О - из мешков с плазмой и эритроцитарной массой отбирают по 2,5 мл, смешивают эти дозы в пробирке и проверяют эту смесь на биологический посев; П - для выявления антител T.pallidum в плазме отбирают 1 мл плазмы; Р - из мешка с плазмой отбирают 1 мл плазмы в пробирку с маркировкой «плазма ребенка» для исследования на гемотрасмиссивные инфекции; С - из мешка с эритроцитарной массой отбирают 1 мл для определения группы крови и резус-фактора.Salient features of the method for isolating leukocyte concentrate containing hematopoietic stem cells from umbilical cord blood are: D - after weighing the container, made in the form of a packet, with umbilical cord blood in a laminar box previously irradiated with ultraviolet radiation, 1.5 ml of umbilical cord blood is taken from the packet to examine it on a blood analyzer, determining the type of human leukocyte antigen to compare histocompatibility, the absence or presence of infection; E - again weigh the mass of umbilical cord blood in the packet and determine its volume by the formula V ₁ = ((M _nk -M _ak ) / P _cp ) + V _ak , where M _pc is the mass of cord blood, g, with the packet in which it placed, M _ak is the mass of the anticoagulant, g, with the package in which it is placed, P _cp is the average value of the blood density, g / ml, V _ak is the volume of the anticoagulant, ml, and the anticoagulant is taken in the form of citrate-phosphate-dextrose-adenine with a mass equal to 54.4 g, together with the package in which it is placed, the average value of the blood density is 1.05 g / ml, and the volume of the anticoagulant is 35 ml; G - after mixing the umbilical cord blood with an anticoagulant in the umbilical cord package, a sedimenting agent is introduced into the latter in the form of a 6% hydroxyethyl starch solution in a volume calculated by the formula V ₂ = 0.2V ₁ ; And - place the bag with a mixture of umbilical cord blood, an anticoagulant and hydroxyethyl starch on the shaker pad, orbitally mix the contents of the pack at a speed of 30 rpm, tilting the shaker pad in different planes to the horizon; K - incubate the mixture with umbilical cord blood for 10 minutes at room temperature, separating the erythrocyte mass by sedimentation in a packet of the mixture with umbilical cord blood; L - place the centrifuge chamber in the separator, connect the main pipeline to it along the vertical axis of symmetry, connecting the latter through the optical sensor to the distribution unit, from which the pipelines to the bags for collecting blood components and to the bag are connected, fill the chamber with a mixture of umbilical cord blood, anticoagulant and hydroxyethyl starch from the bag; M - carry out the separation of the mixture with umbilical cord blood placed in a centrifuge chamber at a speed of 1700 to 8000 rpm for a time of 10 to 40 minutes, separating the cord blood into an erythrocyte mass, plasma and leukocyte concentrate and distributing them through an optical sensor through pipelines to to your bags; N - after the separation is completed, 0.5 ml of the leukocyte concentrate fraction is taken to determine the viability and number of hematopoietic stem cells CD34 + CD45 ^dim on a flow cytometer; О - 2.5 ml are taken from bags with plasma and erythrocyte mass, these doses are mixed in a test tube and this mixture is checked for biological culture; P - to identify antibodies T.pallidum in plasma, 1 ml of plasma is taken; P - 1 ml of plasma is taken from a plasma bag into a test tube labeled “plasma of a child” for testing for blood-borne infections; C - 1 ml is taken from a bag with an erythrocyte mass to determine the blood group and Rh factor.

Способ выделения из пуповинной крови лейкоцитарного концентрата, содержащего гемопоэтические стволовые клетки, осуществляется следующим образом. Из пуповины ребенка, отделенной при физиологических родах из ее вены пункцией шприцем осуществляют сбор пуповинной крови в стерильный специальный контейнер, имеющий входной и выходной порты, выполненный из пластического материала, предназначенный для хранения пуповинной крови. Записывают все данные матери и ребенка в протокол индентификации образца пуповинной крови. Все дальнейшие действия производят в ламинарном боксе (“Termo Scientific" Hera Safe KS Heraeus, США), представляющем закрытый шкаф с прозрачными стенками и отверстиями в одной стенке для того, чтобы можно было бы просунуть руки в перчатках, с использованием ультрафиолетового излучения лампой 15 Вт фирмы «OSRAM» для обеззараживания внутреннего объема. Салфеткой, смоченной 70% этиловьм спиртом, протирают пакет с пуповинной кровью и пакет с антикоагулянтом. Антикоагулянт выбран в виде цитрат-фосфат-декстроза-аденин с массой, равной 54,4 г, вместе с пакетом, в котором он размещен. Взвешивают пакет с пуповинной кровью на прецизионных электронных весах «ACCULAR» VIC 120d3 интерфейс RS-232 - VICON США. После перемешивания пуповинной крови в пакете (ручным действием) отбирают из пакета через его порт 1,5 мл пуповинной крови для исследования ее на гемоанализаторе и HLA типирования, определяя тип человеческого лейкоцитарного антигена для сопоставления гистосовместимости, на отсутствие или наличие инфицирования. Вновь взвешивают пакет с массой пуповинной крови и рассчитывают объем V₁ собранной пуповинной крови по формуле V₁=((M_пk-M_ak)/P_cp)+V_ak, где М_пк - масса пуповинной крови, г, с пакетом, в котором она размещена, М_ак - масса антикоагулянта, г, с пакетом, в котором он размещен, равная 54,4 г, Р_кр - среднее значение плотности крови, г/мл, и равное 1,05 г/мл, V_ak - объем антикоагулянта, мл, равный 35 мл. После определения объема V₂ 6% гидроксиэтилкрахмала - седементирующего средства, с помощью которого оседает эритроцитарная масса, по формуле V₂=0,2V₁ вводят его в пакет с пуповинной кровью. Осторожно покачивая руками, перемешивают пакет с пуповинной кровью и раствором гидроксиэтилкрахмала и помещают этот пакет на площадку шейкера (мешалка) (Multi Bio 3D (Biosan, Швейцария)). С помощью последнего осуществляют механическое орбитальное перемешивание содержимого пакета с пуповинной кровью, антикоагулянтом и гидроксиэтилкрахмалом со скоростью 30 об/мин, наклоняя площадку шейкера в разных плоскостях к горизонту, угол наклона равен 7°, равномерно покачивая площадку шейкера вокруг координатных осей - (3 степени свободы). Инкубируют пакет с содержимым в течение 10 минут при комнатной температуре (+18-20°С). С помощью гидроксиэтилкрахмала в пакете оседают эритроциты. Центрифужную камеру 1 устанавливают в сепаратор 2 (Sepax, Швейцария), подсоединяют к ней по вертикальной оси симметрии магистральный трубопровод 3, подсоединяя последний через оптический сенсор 4 к распределительному узлу 5, от которого подводят трубопроводы 6 к мешкам 7, 8 для сбора компонентов крови и к пакету 9 со смесью 10. Наполняют центрифужную камеру 1 из пакета 9 смесью 10 пуповинной крови, антикоагулянта и гидроксиэтилкрахмала. Закрывают центрифужную камеру 1 и осуществляют сепарацию размещенных в центрифужной камере 1 смеси с пуповинной кровью, антикоагулянтом и гидроксиэтилкрахмалом, центрифугированием, т.е. вращением камеры вокруг вертикальной оси со скоростью вращения 1700-8000 об/мин в течение времени от 10 до 40 минут, разделяя пуповинную кровь на плазму, эритроцитарную массу и лейкоцитарный концентрат. Скорость и время вращения можно варьировать в зависимости от веса пакета с пуповинной кровью. По магистральному трубопроводу 3, через оптический сенсор 4 и распределительное устройство 5 плазму, эритроцитарную массу и лейкоцитарный концентрат распределяют по своим мешкам 7, 8, 9. Эритроцитарной массой наполняют опустевший от смеси пакет-мешок 9. После окончания сепарации отсоединяют каждый мешок от своих трубопроводов и запаивают отверстия их трубопроводов. В ламинарном боксе отбирают шприцем 0,5 мл лейкоцитарного концентрата в маркированную микропробирку для подсчета жизнеспособности и количества гемопоэтических стволовых клеток CD34+CD45^dim на проточном цитофлуориметре. Из мешка с плазмой отбирают для проведения исследований 5 мл плазмы в стерильную маркированную пробирку. Из этого количества берут 2,5 мл плазмы и из другого мешка - 2,5 мл эритроцитарной массы, смешивают эти дозы и проверяют эту смесь на бактериальный посев. Для проведения теста на выявление антител T.pallidum в плазме отбирают в пробирку Эппендорфф 0,1 мл плазмы. В маркированную пробирку «плазма ребенка» отбирают 1 мл плазмы для проверки на гемотрансмиссивную инфекцию. Из мешка с эритроцитарной массой отбирают 1 мл для определения группы крови и резус-фактора.The method of isolation from umbilical cord blood leukocyte concentrate containing hematopoietic stem cells is as follows. From the umbilical cord of a child, separated during physiological delivery from her vein, a cord is punctured by a syringe and the cord blood is collected in a sterile special container having inlet and outlet ports made of plastic material designed to store cord blood. Record all the data of the mother and the child in the protocol for identifying a cord blood sample. All further actions are carried out in a laminar box (“Termo Scientific” Hera Safe KS Heraeus, USA), which is a closed cabinet with transparent walls and holes in one wall so that you can stick your hands in gloves using a 15 W UV lamp OSRAM company for disinfection of the internal volume. A cloth moistened with 70% ethyl alcohol is used to wipe the cord blood bag and the anticoagulant bag. The anticoagulant was selected as a citrate-phosphate-dextrose-adenine with a mass of 54.4 g, together with a bag in which The cord blood bag is weighed on a precision electronic balance "ACCULAR" VIC 120d3 RS-232 interface - VICON USA. After stirring the cord blood in the bag (manually), 1.5 ml of cord blood are taken from the bag through its port for examination it on a blood analyzer and HLA typing, determining the type of human leukocyte antigen to compare histocompatibility, for the absence or presence of infection. Again weigh the package with the mass of cord blood and calculate the volume V _{1 of the} collected cord blood according to the formula V ₁ = ((M _pc -M _ak ) / P _cp ) + V _ak , where M _pc is the mass of cord blood, g, with the package, in where it is located, M _ak - the mass of the anticoagulant, g, with the package in which it is placed, equal to 54.4 g, P _cr - the average value of blood density, g / ml, and equal to 1.05 g / ml, V _ak - anticoagulant volume, ml, equal to 35 ml. After determining the volume of V ₂ 6% hydroxyethyl starch - a sedimentation agent with which the erythrocyte mass settles, according to the formula V ₂ = 0.2V ₁ enter it into a package with umbilical cord blood. Gently shaking their hands, mix the package with cord blood and a solution of hydroxyethyl starch and place this package on the platform of the shaker (mixer) (Multi Bio 3D (Biosan, Switzerland)). Using the latter, the contents of the packet with umbilical cord blood, anticoagulant and hydroxyethyl starch are mechanically mixed at a speed of 30 rpm, tilting the shaker area in different planes to the horizontal, the angle of inclination is 7 °, uniformly swinging the shaker area around the coordinate axes - (3 degrees of freedom ) Incubate the bag with the contents for 10 minutes at room temperature (+ 18-20 ° C). Using hydroxyethyl starch, red blood cells settle in a bag. The centrifuge chamber 1 is installed in the separator 2 (Sepax, Switzerland), the main pipeline 3 is connected to it along the vertical axis of symmetry, connecting the latter through the optical sensor 4 to the distribution unit 5, from which the pipelines 6 are connected to the bags 7, 8 for collecting blood components and to package 9 with mixture 10. Fill the centrifuge chamber 1 of package 9 with a mixture of 10 cord blood, an anticoagulant and hydroxyethyl starch. The centrifuge chamber 1 is closed and the mixture placed in the centrifuge chamber 1 is separated with umbilical cord blood, an anticoagulant and hydroxyethyl starch, centrifugation, i.e. by rotating the chamber around a vertical axis with a rotation speed of 1700-8000 rpm for a time of 10 to 40 minutes, separating the umbilical cord blood into plasma, erythrocyte mass and leukocyte concentrate. The speed and time of rotation can vary depending on the weight of the cord blood bag. Through the main pipeline 3, through the optical sensor 4 and switchgear 5, the plasma, erythrocyte mass and leukocyte concentrate are distributed into their bags 7, 8, 9. The bag-bag 9 empty from the mixture is filled with the erythrocyte mass. After the separation is completed, each bag is disconnected from its pipelines and solder the holes of their pipelines. In a laminar box, 0.5 ml of leukocyte concentrate is taken with a syringe into a labeled microtube to calculate the viability and number of hematopoietic stem cells CD34 + CD45 ^dim on a flow cytometer. 5 ml of plasma are taken from a plasma bag for testing in a sterile labeled tube. From this quantity take 2.5 ml of plasma and from another bag - 2.5 ml of erythrocyte mass, mix these doses and check this mixture for bacterial culture. To test for the detection of T.pallidum antibodies in plasma, 0.1 ml of plasma is taken into an Eppendorff tube. In a labeled tube "baby plasma" take 1 ml of plasma to check for blood-borne infection. From a bag of red blood cells 1 ml is taken to determine the blood group and Rh factor.

Следовательно, перед хранением гемопоэтических стволовых клеток в лейкоцитарном концентрате, полученных из пуповинной крови, их подвергают бактериологическому и вирусологическому контролю на наличие грибкового инфицирующего материала. Полученный в результате обработки пуповинной крови материал (плазму, эритроцитарную массу и лейкоцитарный концентрат) исследуют на определение группы крови и резус-фактора, проверяют на стерильность, жизнеспособность, выявление ряда инфекций: ВИЧ, гепатит В и С, сифилис, определение количества гемопоэтических стволовых клеток - CD34+CD45^dim.Therefore, before storing hematopoietic stem cells in leukocyte concentrate obtained from cord blood, they are subjected to bacteriological and virological monitoring for the presence of fungal infectious material. The material obtained from the processing of umbilical cord blood (plasma, erythrocyte mass and leukocyte concentrate) is examined for determination of blood group and Rh factor, checked for sterility, viability, detection of a number of infections: HIV, hepatitis B and C, syphilis, determination of the number of hematopoietic stem cells - CD34 + CD45 ^dim .

Использование технического решения «Способ выделения из пуповинной крови лейкоцитарного концентрата», содержащего гемопоэтические стволовые клетки по сравнению с прототипом, позволяет повысить качество и надежность от инфицированности и биозагрязнений в выявленных и собранных в лейкоцитарном концентрате гемопоэтических стволовых клеток, благодаря тому, что пуповинную кровь проверяют на определение типа человеческого лейкоцитарного антигена для определения гистосовместимости, на отсутствие или наличия инфицирования плазмы, выделенной из пуповинной крови, определения теста антитела T.pallidum, определения на гемотрансмиссивные инфекции, проверки на вирусологический контроль. Выделение гемопоэтических стволовых клеток проводят на высококачественном эффективном сертифицированном оборудовании производителей различных стран: Швейцария, США, Дания, Германия и т.д. Технологический процесс выделения гемопоэтических стволовых клеток осуществляют коммерческой организацией «ООО Покровский банк стволовых клеток», имеющей лицензии №78-01-000356 от 10.10.2008 г. и № ФС-99-01-005911 от 20.01.2009 г. на базе государственной Покровской больницы г.Санкт-Петербург. Все технологии, используемые в этой организации, отвечают международным требованиям и стандартам, предъявляемыми к банкам стволовых клеток, полученных из пуповинной крови. В настоящее время около 80 разных болезней, включая онкологические заболевания, лейкозы, лимфомы и специфические нарушения иммунной системы, дают положительный ответ на лечение стволовыми клетками.Using the technical solution "Method for the isolation of leukocyte concentrate from umbilical cord blood" containing hematopoietic stem cells compared to the prototype, improves the quality and reliability of infection and bio-contamination in hematopoietic stem cells detected and collected in leukocyte concentrate, due to the fact that the cord blood is checked for determination of the type of human leukocyte antigen to determine histocompatibility, for the absence or presence of plasma infection, from umbilical cord blood, test determination of T. pallidum antibody, determination of blood-borne infections, tests for virological control. Isolation of hematopoietic stem cells is carried out on high-quality effective certified equipment from manufacturers in various countries: Switzerland, USA, Denmark, Germany, etc. The hematopoietic stem cell isolation process is carried out by the commercial organization Pokrovsky stem cell bank LLC, which has licenses No. 78-01-000356 dated 10.10.2008 and No. FS-99-01-005911 dated January 20, 2009 based on the state Pokrovskaya St. Petersburg hospitals. All technologies used in this organization meet international requirements and standards for stem cell banks obtained from cord blood. Currently, about 80 different diseases, including oncological diseases, leukemia, lymphomas and specific disorders of the immune system, give a positive response to stem cell treatment.

Claims

A method for isolating a leukocyte concentrate containing hematopoietic stem cells from umbilical cord blood, which consists in collecting blood from the umbilical cord into a container, weighing the mass of collected blood with the calculation of its volume, taking into account the mass of the anticoagulant, analyzing the cord blood for bacteriological culture, separating by centrifugation, separating the umbilical cord blood for erythrocyte mass and leukocyte concentrate with hematopoietic stem cells using a sedimentation solution Rum hydroxyethyl starch, characterized in that after weighing the container, made in the form of a package, with umbilical cord blood in a laminar box, previously irradiated with ultraviolet radiation, 1.5 ml of cord blood is taken from the packet for examination on a blood analyzer, determining the type of human leukocyte antigen to compare histocompatibility in the absence or presence of infection, re-weighed weight of the cord blood in the packet and determine its volume according to the formula V ₁ = ((M -M _AK _nk) / P _cp) + V _AK where, M _nk - weight Umbilic oh blood, z, with the package in which it is located, M _ac - mass anticoagulant g, with the package in which it is housed, P _cp - average blood density, g / ml, V _AK - volume of anticoagulant ml, wherein the anticoagulant is taken in the form of citrate-phosphate-dextrose-adenine with a mass of 54.4 g together with the package in which it is placed, the average blood density is 1.05 g / ml, and the volume of the anticoagulant is 35 ml, after mixing the umbilical cord blood with an anticoagulant introduced in a package with umbilical cord blood, a sedimentation agent is introduced into the latter in the form of a 6% solution ora of hydroxyethyl starch in a volume calculated by the formula V ₂ = 0.2V ₁ , place the bag with a mixture of cord blood, an anticoagulant and hydroxyethyl starch on the shaker pad, orbitally mix the contents of the packet at a speed of 30 rpm, tilting the shaker pad in different planes to horizon, and the mixture with umbilical cord blood is incubated for 10 min at room temperature, the erythrocyte mass is separated by sedimentation in a packet of cord blood mixture, then the centrifuge chamber is placed in sep a radiator, connect the main pipeline to it along the vertical axis of symmetry, connecting the latter through an optical sensor to the distribution unit, from which the pipelines are connected to the bags for collecting blood components and to the bag with the mixture, the chamber is filled with a mixture of cord blood, anticoagulant and hydroxyethyl starch from the bag and carried out separation of the mixture with cord blood, anticoagulant and hydroxyethyl starch placed in a centrifuge chamber by centrifugation at a speed of 1700 to 8000 rpm for a time of 10 up to 40 min, dividing the umbilical cord blood into erythrocyte mass, plasma and leukocyte concentrate and distributing them through an optical sensor through the pipelines to their bags, after the separation is completed, 0.5 ml of the leukocyte concentrate fraction is taken to determine the viability and number of hematopoietic stem cells CD34 + CD45 ^dim 2.5 ml are taken from plasma bags and red blood cells on a flow cytofluorimeter, the doses are mixed in vitro and the mixture is checked for bacterial culture to detect T. pallidum antibodies plasma collected, 0.1 ml of plasma, are also withdrawn from the bag with the plasma 1 mL plasma to a test tube labeled "plasma child" for research on bloodborne infections, from a bag of erythrocyte mass is taken for determination of 1 ml of blood type and Rh factor.