RU2410663C1

RU2410663C1 - Method of preparing cell preparations for fluorescent in situ hybridisation

Info

Publication number: RU2410663C1
Application number: RU2009134364/15A
Authority: RU
Inventors: Ваник Абрамович Овсепян (RU); Ваник Абрамович Овсепян
Priority date: 2009-09-14
Filing date: 2009-09-14
Publication date: 2011-01-27

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention relates to field of technology, namely, to clinical-diagnostic study. Method includes application of cell suspension in volume 5 mcl, prepared by standard method, on the bottom of holes, formed by miscroscope slide surface and 8 round holes with diametre 9 mm, by hermetic attachment to the glass of parafilm strip with size 26×56 mm². Strip is attached by rolling out by means of roller, distance between holes being 4 mm, and from microscope slide edge - 2 mm.

EFFECT: application of claimed method makes it possible to prepare preparation with multiple isolated zones of simultaneous hybridisation, which increases accuracy of FISH-studies.

1 dwg, 1 ex

Description

Изобретение относится к приготовлению препаратов фиксированных клеток для флуоресцентной in situ гибридизации нуклеиновых кислот (fluorescent in situ hybridization - FISH), применяемой в научных и клинико-диагностических исследованиях.The invention relates to the preparation of fixed cell preparations for fluorescent in situ hybridization of nucleic acids (fluorescent in situ hybridization - FISH), used in scientific and clinical diagnostic studies.

В основе метода FISH лежит гибридизация in situ между созданным по специальным технологиям ДНК-зондом (нуклеотидная последовательность ограниченного размера) и комплементарным ему участком ДНК мишени в препаратах фиксированных метафазных или интерфазных клеток. Визуализация ДНК-зондов, гибридизованных с соответствующим участком ДНК мишени, осуществляют с помощью люминесцентного микроскопа. Клинико-диагностические исследования обычно проводят с помощью стандартизованных коммерческих ДНК-зондов и в соответствии с протоколами, рекомендуемыми фирмами-производителями этих зондов.The FISH method is based on in situ hybridization between a DNA probe created by special technologies (a nucleotide sequence of a limited size) and a portion of the target DNA complementary to it in preparations of fixed metaphase or interphase cells. Visualization of DNA probes hybridized with the corresponding portion of the target DNA is carried out using a luminescent microscope. Clinical diagnostic studies are usually performed using standardized commercial DNA probes and in accordance with the protocols recommended by the manufacturers of these probes.

Высокие трудоемкость и себестоимость FISH-анализа препятствуют более широкому его применению в клинико-диагностической практике, несмотря на постоянно растущую потребность в данном анализе. Одним из способов устранения отмеченных недостатков является получение препаратов с множественными зонами одновременной гибридизации на одном предметном стекле благодаря миниатюризации отдельной зоны.The high complexity and cost of FISH analysis hinder its wider use in clinical diagnostic practice, despite the ever-growing need for this analysis. One of the ways to eliminate the noted drawbacks is to obtain preparations with multiple zones of simultaneous hybridization on a single glass slide due to the miniaturization of a separate zone.

Известен способ приготовления препаратов для одновременного FISH-анализа большого числа (до 9) пациентов. Авторы способа достигают этого результата благодаря использованию трафарета с размерами 22×22 мм² и 9 круглыми отверстиями. Чтобы не происходила контаминация между фиксированными образцами от разных пациентов, авторы наносят через каждое отверстие в трафарете крайне малый объем суспензии фиксированных интерфазных клеток - по 0,2 мкл с клеточностью примерно 2500 клеток/мкл. Одним из недостатков способа является то, что ввиду очень малых объемов наносимой суспензии и соответственно малых размеров пятен способ пригоден исключительно для интерфазной FISH. Другой недостаток связан с отсутствием возможности разграничить пятна от различных пациентов визуально без микроскопа (например, с помощью маркера или алмазного карандаша), что не позволяет проводить гибридизацию в разных пятнах с различающимися ДНК-зондами. Данная особенность обуславливает еще один недостаток, а именно способ не дает возможности варьировать объем наносимой гибридизационной смеси в зависимости от числа пятен. К числу недостатков следует отнести также то, что ввиду исключительно малого объема наносимых суспензий клеток фиксатор быстро испаряется, что, как правило, ухудшает качество гибридизационного сигнала. (Lymphoma: Methods and Protocols (Methods in Molecular Medicine, Vol.115, Walker JM, series editor) Humana Press; Totowa, NJ 2005, P.93-108).A known method of preparation of drugs for the simultaneous FISH analysis of a large number (up to 9) of patients. The authors of the method achieve this result through the use of a stencil with dimensions of 22 × 22 mm ² and 9 round holes. To prevent contamination between fixed samples from different patients, the authors put through each hole in the stencil an extremely small volume of a suspension of fixed interphase cells - 0.2 μl with a cellularity of about 2500 cells / μl. One of the disadvantages of the method is that due to the very small volumes of the applied suspension and, accordingly, the small size of the spots, the method is suitable exclusively for interphase FISH. Another drawback is the lack of the ability to distinguish spots from different patients visually without a microscope (for example, using a marker or diamond pencil), which does not allow hybridization in different spots with different DNA probes. This feature causes another drawback, namely, the method does not allow you to vary the volume of the applied hybridization mixture depending on the number of spots. Among the disadvantages, it is also worth noting that, due to the extremely small volume of applied cell suspensions, the fixator quickly evaporates, which, as a rule, affects the quality of the hybridization signal. (Lymphoma: Methods and Protocols (Methods in Molecular Medicine, Vol. 115, Walker JM, series editor) Humana Press; Totowa, NJ 2005, P.93-108).

Известен другой способ приготовления препаратов с множественными зонами гибридизации на стекле с тефлоновым покрытием и прозрачными окошками. Недостатком способа является наличие оптической аберрации при микроскопировании, вызванной толщиной указанного покрытия. Такая аберрация ограничивает сферу применения способа. В частности, последний непригоден для FISH-анализа с помощью транслокационных зондов, которые формируют так называемые слитные (сливные) сигналы при наличии соответствующей транслокации в исследуемых клетках (Duongruitai N., Warren A.D, Olli H.T. Microbial Populations Identified by Fluorescence In Situ Hybridization in a Constructed Wetland Treating Acid Coal Mine Drainage. J. ENVIRON. QUAL., vol.35, 2006, P.1329-1337).There is another way to prepare preparations with multiple hybridization zones on glass with Teflon coating and transparent windows. The disadvantage of this method is the presence of optical aberration during microscopy caused by the thickness of the specified coating. Such aberration limits the scope of the method. In particular, the latter is unsuitable for FISH analysis using translocation probes, which form the so-called fused (drain) signals in the presence of appropriate translocation in the studied cells (Duongruitai N., Warren AD, Olli HT Microbial Populations Identified by Fluorescence In Situ Hybridization in a Constructed Wetland Treating Acid Coal Mine Drainage. J. ENVIRON. QUAL., Vol. 35, 2006, P.1329-1337).

В качестве прототипа изобретения выбран стандартный способ приготовления препарата культивированных или некультивированных фиксированных клеток, в соответствии с которым на поверхность предметного стекла наносят несколько капель суспензии фиксированных клеток, полученной из клинического образца (костный мозг, периферическая кровь) пациента (Czepulkowski В. Analyzing Chromosomes BIOS Scientific Publishers Limited, 2001, P.47, P.173). Недостатком способа является то, что он не обеспечивает возможности приготовления препаратов с множественными изолированными зонами одновременной гибридизации с участием фиксированных клеток от разных пациентов и/или различных ДНК-зондов.As a prototype of the invention, a standard method for preparing a preparation of cultured or uncultured fixed cells was selected, according to which several drops of a suspension of fixed cells obtained from a clinical sample (bone marrow, peripheral blood) of a patient (Czepulkowski B. Analyzing Chromosomes BIOS Scientific Publishers Limited, 2001, P.47, P.173). The disadvantage of this method is that it does not provide the possibility of preparing preparations with multiple isolated zones of simultaneous hybridization involving fixed cells from different patients and / or different DNA probes.

Техническая задача изобретения - устранение указанного недостатка.The technical task of the invention is the elimination of this drawback.

Технический результат заключается в повышении пропускной способности используемых технических средств, производительности труда при выполнении больших серий FISH-исследований, а также в снижении себестоимости 1 исследования.The technical result consists in increasing the throughput of the used technical means, labor productivity when performing large series of FISH studies, as well as in reducing the cost of 1 study.

Данный технический результат достигнут тем, что разработан способ приготовления препаратов культивированных или некультивированных фиксированных клеток, который включает нанесение их суспензии на дно лунок, сформированных поверхностью предметного стекла и 8 круглыми отверстиями диаметром 9 мм в герметично прилепленной к стеклу полоске парафильма размерами 26×56 мм² благодаря ее раскатыванию вдоль предметного стекла в течение 3-5 с с помощью валика на нагревательном столике с температурой 60°С.This technical result is achieved in that the developed method of preparing drugs cultivated or uncultivated fixed cells, which comprises applying to their suspension on the bottom of the wells formed by the slide surface and 8 round holes with a diameter of 9 mm in a hermetically sticky to the glass strip of parafilm dimensions of 26 × 56 mm ² due to its rolling along the slide for 3-5 s using a roller on a heating table with a temperature of 60 ° C.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что благодаря герметичному прилипанию полоски парафильма с 8 отверстиями к предметному стеклу удается создать изолированные зоны одновременной гибридизации между ДНК мишени от разных пациентов и/или различными ДНК-зондами на одном предметном стекле.The essence of the invention lies in the fact that due to the tight adhesion of the parafilm strip with 8 holes to the slide, it is possible to create isolated zones of simultaneous hybridization between the target DNA from different patients and / or different DNA probes on the same slide.

Способ осуществляют следующим образом.The method is as follows.

В полоске парафильма с коммерческим бумажным покрытием и размерами 26×56 мм² вырезают 8 отверстий диаметром 9 мм с помощью сверла, предварительно подложив несколько листов бумаги под полоску. Для фиксации последней, а также самого сверла используют трафарет из пластика или металла с отверстиями указанного диаметра. Кратчайшее расстояние между отверстиями составляет 4 мм, а от края предметного стекла 2 мм. Накладывают полоску парафильма с бумажным покрытием и отверстиями на предметное стекло с матовым маркировочным окошком так, чтобы его край, разделяющий матовую и прозрачную поверхности, совпал с одним из поперечных краев полоски. Ставят предметное стекло на нагревательный столик с температурой 60°С и раскатывают валиком в течение 3-5 с, чтобы повысить степень адгезии парафильма к стеклу. Предметное стекло с парафильмово-бумажным покрытием и 8 окошками схематично представлено на чертеже.In a strip of parafilm with commercial paper coating and dimensions of 26 × 56 mm ^2, 8 holes with a diameter of 9 mm are cut with a drill, having previously placed several sheets of paper under the strip. To fix the latter, as well as the drill itself, a stencil made of plastic or metal with holes of the specified diameter is used. The shortest distance between the holes is 4 mm, and from the edge of the slide 2 mm. A strip of parafilm with paper coating and holes is placed on a glass slide with an opaque marking window so that its edge separating the opaque and transparent surfaces coincides with one of the transverse edges of the strip. Put a glass slide on a heating table with a temperature of 60 ° C and roll it for 3-5 s to increase the degree of adhesion of parafilm to the glass. Parafilm-paper coated glass slide with 8 windows is shown schematically in the drawing.

Необходимость вышеуказанного этапа, связанного с раскатыванием полоски парафильма с помощью валика, обусловлено тем, что при недостаточной степени адгезии происходит просачивание суспензии клеток из одного окошка в другое, что вызывает их взаимную контаминацию. После прилепления полоски парафильма к предметному стеклу на дно каждой лунки наносят по 5 мкл суспензии фиксированных клеток, приготовленной стандартным способом из образцов разных пациентов или одного и того же пациента, если FISH-анализ проводится с помощью большого количества различных зондов. Для FISH-анализа используют как свежеприготовленные суспензии фиксированных клеток, так и хранящиеся при -20°С. В последнем случае, когда срок хранения превышает 24 ч до приготовления препаратов, клетки предварительно переводят в свежий фиксатор. Это осуществляют следующим образом. Суспензию фиксированных клеток центрифугируют при 200 g в течение 10 мин, удаляют супернатант и суспендируют в свежеприготовленном фиксаторе (смесь метанола и уксусной кислоты в соотношении, равном 3:1). Указанную процедуру повторяют дважды.The need for the above stage associated with the rolling of a parafilm strip using a roller is due to the fact that, with an insufficient degree of adhesion, a suspension of cells seeps from one window to another, which causes their mutual contamination. After sticking strips of parafilm to a glass slide, 5 μl of a suspension of fixed cells prepared in the standard way from samples of different patients or the same patient is applied to the bottom of each well if a FISH analysis is carried out using a large number of different probes. For FISH analysis, both freshly prepared suspensions of fixed cells and those stored at -20 ° C are used. In the latter case, when the shelf life exceeds 24 hours before preparation of the preparations, the cells are previously transferred to a fresh fixative. This is as follows. The suspension of fixed cells is centrifuged at 200 g for 10 min, the supernatant is removed and suspended in a freshly prepared fixative (mixture of methanol and acetic acid in a ratio of 3: 1). The specified procedure is repeated twice.

После нанесения суспензий клеток оставляют препараты сохнуть на воздухе. Затем на обратной стороне предметных стекол обводят отверстия в полоске парафильма нефлуоресцирующим маркером либо обозначают их местоположение с помощью алмазного карандаша. Проверяют плотность клеток с помощью фазово-контрастной микроскопии. Удаляют полоску парафильма с предметного стекла. На каждое клеточное пятно наносят по 1,2-1,4 мкл свежеприготовленной гибридизационной смеси, содержащей ингредиенты в пропорциях, рекомендуемой фирмой-производителем ДНК-зонда. Накрывают каждое пятно круглым покровным стеклом диаметром 10 мм и наносят по его краям резиновый клей. Вышеуказанный объем наносимой гибридизационной смеси позволяет в 7-8 раз сократить используемые материалы по сравнению с их количеством, расходуемым в соответствии с протоколом, в частности, фирмы-производителя ДНК-зондов «Vysis/Abbott Laboratories», располагающей в настоящее время наиболее полной коллекцией ДНК-зондов для диагностики онкологических и хромосомных болезней. Согласно данному протоколу на предметное стекло наносится 10 мкл гибридизационной смеси.After applying cell suspensions, the preparations are allowed to air dry. Then, the holes in the parafilm strip are surrounded by a non-fluorescent marker on the reverse side of the glass slides or their location is indicated with a diamond pencil. Check cell density using phase contrast microscopy. Remove the parafilm strip from the slide. 1.2-1.4 μl of a freshly prepared hybridization mixture containing the ingredients in the proportions recommended by the manufacturer of the DNA probe is applied to each cell stain. Each spot is covered with a round coverslip with a diameter of 10 mm and rubber glue is applied along its edges. The above volume of the applied hybridization mixture allows to reduce the materials used by 7-8 times compared with the amount consumed in accordance with the protocol, in particular, the manufacturer of DNA probes Vysis / Abbott Laboratories, which currently has the most complete DNA collection probes for the diagnosis of cancer and chromosomal diseases. According to this protocol, 10 μl of the hybridization mixture is applied to a glass slide.

Дальнейшие процедуры одновременной денатурации ДНК-зонда и ДНК мишени, гибридизации, отмывки и визуализации проводят стандартным способом в соответствии с протоколом фирмы-производителя зонда (зондов). В частности, вышеотмеченная компания «Vysis/Abbott Laboratories» рекомендует осуществлять одновременную денатурацию ДНК-зонда и ДНК мишени, а также их последующую гибридизацию в специально разработанной для этой цели системе для денатурации-гибридизации (гибридайзере) «HY-Brite» или «ThermoBrite» («Vysis/Abbott Laboratories») емкостью 12 предметных стекол, чтобы повысить производительность труда и одновременно стандартизовать выполнение указанных процедур. Постгибридизационную отмывку данная фирма предписывает выполнять в так называемых сосудах Коплина, причем одновременно не более 4 предметных стекол с гибридизационными препаратами из-за возможного охлаждения отмывочного раствора ниже допустимой температуры.Further procedures for the simultaneous denaturation of the DNA probe and target DNA, hybridization, washing and visualization are carried out in a standard way in accordance with the protocol of the manufacturer of the probe (probes). In particular, the aforementioned company Vysis / Abbott Laboratories recommends the simultaneous denaturation of the DNA probe and target DNA, as well as their subsequent hybridization in the HY-Brite or ThermoBrite system for the denaturation-hybridization (hybridizer) specially developed for this purpose ("Vysis / Abbott Laboratories") with a capacity of 12 slides to increase productivity and at the same time standardize the performance of these procedures. This company prescribes posthybridization washing in the so-called Koplin vessels, at the same time no more than 4 slides with hybridization preparations due to the possible cooling of the washing solution below the permissible temperature.

Простые арифметические расчеты показывают, что уже загрузка гибридайзера всего 2 предметными стеклами с 8 препаратами в каждом из них повышает пропускную способность прибора (количество выполненных денатураций-гибридизаций в единицу времени) в 1,3 раза по сравнению с его загрузкой 12 предметными стеклами с одним препаратом в каждом из них. При загрузке 4 предметными стеклами с 8 препаратами в каждом из них пропускная способность прибора возрастает в примерно 2,7 раза по сравнению с его обычной полной загрузкой. Загрузка 12 предметными стеклами с 8 препаратами в каждом из них увеличивает пропускную способность прибора в 8 раз по сравнению с его обычной предельной загрузкой. Наш опыт показывает, что одновременная постановка денатурации-гибридизации на 3-4 предметных стеклах с 8 препаратами на каждом из них не вызывает особых затруднений при 8-часовом рабочем дне.Simple arithmetic calculations show that loading a hybridizer with only 2 slides with 8 drugs in each of them increases the throughput of the device (the number of denaturation-hybridizations performed per unit time) by 1.3 times compared to loading 12 slides with one drug in each of them. When loading 4 slides with 8 drugs in each of them, the throughput of the device increases by about 2.7 times compared to its usual full load. Download 12 slides with 8 drugs in each of them increases the throughput of the device by 8 times compared with its usual maximum load. Our experience shows that the simultaneous formulation of denaturation-hybridization on 3-4 glass slides with 8 drugs on each of them does not cause any particular difficulties with an 8-hour working day.

Пропускная способность используемых технических средств, а также производительность труда возрастают также на этапе отмывки. Как следует из расчетов, загрузка сосуда Коплина одним предметным стеклом с 8 изолированными зонами одновременной гибридизации позволяет повысить пропускную способность (количество отмытых препаратов в единицу времени) сосуда и производительность труда (количество отмытых препаратов в единицу времени) на этапе отмывки в 2 раза по сравнению с полной загрузкой сосуда 4 предметными стеклами с одной зоной гибридизации на каждом из них. Полная же загрузка 4 предметными стеклами с 8 изолированными зонами одновременной гибридизации позволяет повысить производительность труда вместе с пропускной способностью сосуда Коплина в 8 раз по сравнению с обычной полной загрузкой сосуда.The throughput of the used technical means, as well as labor productivity, also increase at the washing stage. As follows from the calculations, loading a Koplin vessel with one slide with 8 isolated zones of simultaneous hybridization allows to increase the vessel throughput (number of washed preparations per unit time) of the vessel and labor productivity (number of washed preparations per unit time) at the washing stage by 2 times compared to full loading of the vessel with 4 slides with one hybridization zone on each of them. A full load of 4 slides with 8 isolated zones of simultaneous hybridization can increase labor productivity along with the throughput of the Koplin vessel by 8 times compared to the usual full load of the vessel.

Пример. Для верификации диагноза хронический миелолейкоз (ХМЛ) или оценки эффективности его терапии с помощью FISH-анализа были использованы свежеприготовленные или хранящиеся при -20°С суспензии фиксированных клеток, полученных стандартным способом из образцов костного мозга или периферической крови соответственно 16 и 8 больных. Клетки костного мозга у всех больных были предварительно культивированы в течение 24-48 ч в соответствии с общепринятой методикой. Во всех случаях, когда срок хранения при -20°С превышал 24 ч до приготовления препаратов для FISH-анализа, клетки переводили в свежий фиксатор. Для получения препаратов фиксированных клеток приготовили 3 стекла с парафильмово-бумажным покрытием и 8 круглыми окошками диаметром 9 мм. Внесли по 5 мкл суспензии фиксированных клеток от каждого больного в отдельную лунку. После высыхания препаратов проверили плотность клеток на дне лунок с помощью фазово-контрастной микроскопии. Обвели нефлуоресцирующим маркером отверстия с обратной стороны предметных стекол. Удалили полоски парафильма с них. Приготовили гибридизационную смесь объемом 28,9 мкл, включающую 2,9 мкл транслокационного двухцветного зонда LSI BCR/ABL с двойным слиянием («Vysis-Abbott Diagnostics»), 20,2 мкл гибридизационного буфера и 5,8 мкл дистиллированной воды (пропорции ингредиентов гибридизационной смеси соответствуют рекомендациям фирмы-производителя зонда и буфера). Внесли по 1,2 мкл гибридизационной смеси в каждую лунку. Накрыли каждую смесь круглым покровным стеклом диаметром 10 мм и герметизировали его края резиновым клеем. Поставили все 3 предметных стекла на нагревательный столик гибридайзера «HYBrite». Все дальнейшие процедуры денатурации, гибридизации, отмывки и визуализации (с помощью контрастирующего красителя DAPI) выполняли в соответствии с рекомендациями фирмы «Vysis/Abbott Laboratories» и инструкциями к гибридайзеру. Проводили гибридизацию в течение 18 ч. После отмывки и последующей сушки наносили 25 мкл контрастирующего красителя DAPI и накрывали каждое предметное стекло покровным стеклом размерами 24×60 мм². Оценивали не менее 5 метафазных клеток или не менее 200 интерфазных ядер с помощью люминесцентного микроскопа. У 9 диагностических больных присутствовали метафазные пластинки в приготовленных препаратах. У 7 их этих больных была выявлена специфическая для ХМЛ t(9;22): ish t(9;22)(ABL1+,BCR+;BCR+,ABL1+)[5]. У 2 диагностических больных в исследованных метафазных клетках не было обнаружено t(9;22): ish 9q34(ABL1×2),22q11.2(BCR×2)[11]. У 15 больных был проведен интерфазный FISH-анализ. У 11 из них картина флуоресцентных гибридизационных сигналов соответствовала норме: nuc ish(ABL1,BCR)×2[400]. У 4 больных обнаружили аберрантные клетки: nuc ish(ABL1×3), (BCR×3), (ABL1 con BCR×2)[100].Example. To verify the diagnosis of chronic myelogenous leukemia (CML) or to evaluate the effectiveness of its therapy using the FISH analysis, we used freshly prepared or stored at -20 ° C suspensions of fixed cells obtained in a standard way from bone marrow or peripheral blood samples of 16 and 8 patients, respectively. Bone marrow cells in all patients were pre-cultured for 24-48 hours in accordance with generally accepted methods. In all cases, when the shelf life at -20 ° С exceeded 24 h before preparation of preparations for FISH analysis, the cells were transferred to a fresh fixative. To obtain fixed cell preparations, 3 glasses with a parafilm-paper coating and 8 round windows with a diameter of 9 mm were prepared. 5 μl of a suspension of fixed cells from each patient were added to a separate well. After the preparations dried, the cell density at the bottom of the wells was checked using phase contrast microscopy. The non-fluorescent marker was circled around the holes on the back of the slides. The strips of parafilm were removed from them. A 28.9 μl hybridization mixture was prepared, including 2.9 μl LSI BCR / ABL double-fusion translocation probe (Vysis-Abbott Diagnostics), 20.2 μl hybridization buffer and 5.8 μl distilled water (proportions of hybridization ingredients mixtures correspond to the recommendations of the manufacturer of the probe and buffer). 1.2 μl of the hybridization mixture was added to each well. Each mixture was covered with a round coverslip with a diameter of 10 mm and sealed its edges with rubber glue. We put all 3 glass slides on the heating table of the HYBrite hybridizer. All further denaturation, hybridization, washing and visualization procedures (using a DAPI contrasting dye) were performed in accordance with the recommendations of Vysis / Abbott Laboratories and the instructions for the hybridizer. Hybridization was carried out for 18 hours. After washing and subsequent drying, 25 μl of a DAPI contrasting dye was applied and each slide was covered with a 24 × 60 mm ² coverslip. At least 5 metaphase cells or at least 200 interphase nuclei were evaluated using a luminescent microscope. In 9 diagnostic patients metaphase plates were present in the prepared preparations. In 7 of these patients, CML-specific t (9; 22) was revealed: ish t (9; 22) (ABL1 +, BCR +; BCR +, ABL1 +) [5]. In 2 diagnostic patients, t (9; 22) were not found in the metaphase cells studied: ish 9q34 (ABL1 × 2), 22q11.2 (BCR × 2) [11]. 15 patients underwent interphase FISH analysis. In 11 of them, the pattern of fluorescent hybridization signals corresponded to the norm: nuc ish (ABL1, BCR) × 2 [400]. In 4 patients, aberrant cells were found: nuc ish (ABL1 × 3), (BCR × 3), (ABL1 con BCR × 2) [100].

При проведении вышеописанной серии диагностических исследований применение разработанного способа приготовления препаратов клеток для FISH-анализа позволило сэкономить время на этапе денатурации-гибридизации с использованием гибридайзера в 2 раза, а на этапе отмывки - в 6 раз. Кроме того, данный способ обеспечил экономию дорогостоящих реагентов в более чем 8 раз.When carrying out the above series of diagnostic studies, the use of the developed method for preparing cell preparations for FISH analysis allowed to save time at the denaturation-hybridization stage using a hybridizer 2 times, and at the washing stage 6 times. In addition, this method has provided cost-effective reagents savings of more than 8 times.

Claims

The method of preparation of fixed cell preparations for FISH analysis, which consists in the fact that a suspension of cultured or uncultured fixed cells is applied to the surface of a glass slide, characterized in that 8 round holes with a diameter of 9 mm are cut into a parafilm strip measuring 26 × 56 mm ² using a drill then put a strip of parafilm on a glass slide with an opaque marking window so that its edge separating the opaque and transparent surfaces coincides with one of the transverse edges of the strip, When this shortest distance between holes is 4 mm, from the edge of the slide 2 mm, then rolled roller after attachment strip of parafilm to the slide at the bottom of each well was applied to 5 .mu.l suspension of fixed cells prepared in a standard way.